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【關鍵詞】再灌注損傷Changesofnitricoxidesynthesisincardiacischemiareperfusioninjury【Abstract】AIM:Toinvestigatetheexpressionandfunctionofendothelialnitricoxidesynthase(eNOS)andinducibleNOS(iNOS)duringischemiareperfusioninjury(IRI)inrathearts.METHODS:IRIwasinducedbyclampingtheleftanteriordescending(LAD)ofcoronaryarteryfor1h,followedbyreperfusion.Nitricoxidesynthase(NOS)activitiesofheartswasassayedatvarioustimepointsandNOSproteinlevelsaswellasNOSmRNAexpressionweredeterminedbyWesternblotandRTPCRmethodsrespectively.RESULTS:eNOSactivity,proteinlevelandmRNAexpressionallincreasedafter26hofIRIanddecreasedafter3dofIRIandthengraduallyreturnedtobasallevelafter21d.iNOSwasexpressedafter12hofIRIandreachedthepeaklevelatday3afterIRIandthendecreasedtobasallevel.CONCLUSION:TheexpressionofiNOSishighwhilethatofeNOSislowduringcardiacischemiareperfusioninjury.ProperregulationofeNOSandiNOSexpressionmaybetherapeuticallyhelpfulintreatingpatientswithcardiacischemiareperfusioninjury.【Keywords】reperfusioninjury;nitricoxidesynthase;heart【摘要】目的：研究大鼠心臟缺血再灌注損傷(IRI)過程中一氧化氮合酶(NOS)的變化規(guī)律及其作用.方法：制作SD大鼠心臟IRI動物模型,用同位素法測定正常及IRI心組織的NOS活性；用Western印跡和逆轉錄PCR法分析eNOS和iNOS在IRI過程中蛋白和基因表達的變化.結果：心臟eNOS活性、蛋白和mRNA表達水平，在缺血再灌注2~6h后均增高，3天后降低，21天后逐漸恢復到正常水平.心臟iNOS活性、蛋白和mRNA表達水平，在缺血再灌注12h后開始表達，3天達高峰，然后逐漸降至正常水平.結論：單純缺血并不引起NOS活性的明顯變化,再灌注損傷使NOS的mRNA表達增加,酶的合成增多,活性增高.【關鍵詞】再灌注損傷；一氧化氮合酶；心臟0引言一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS)在心肌缺血再灌注中起著極其重要的作用［1］.一氧化氮合酶(nitricoxidesynthesis,NOS)可分為原生型(cNOS)和誘生型(iNOS).cNOS依存在的部位分為神經(jīng)型(nNOS)和內皮型(eNOS).心臟組織內的NOS同功酶有兩種,即eNOS和iNOS.參與炎性反應及急性排斥反應等病理過程［2］.我們研究eNOS和iNOS在心臟IRI中的變化規(guī)律及其作用,為其防治提供理論基礎.1材料和方法1.1材料SD大鼠購自華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心；iNOSAssayKit購自南京建成生物技術研究所；一抗羊抗大鼠iNOS或eNOSmAb購自武漢博士德公司；HRP標記的兔抗羊IgG二抗購自Sigma公司；Trizol裂解液、Oligo(dT)、TaqDNA聚合酶和逆轉錄酶(AMVRT)均為美國Gibco公司產(chǎn)品；eNOS和iNOS引物及內參照由上海博亞生物技術公司合成.冠狀動脈阻斷再灌注模型制備［3］后在不同的再灌注時間點處死大鼠,收集心臟標本,液氮急凍,-70℃保存?zhèn)溆?1.2方法取雄性200～220gSD大鼠120只,隨機分為缺血再灌注（IRI）組和假手術（對照,Control）組，每組60只，在再灌注不同時間點（0,0.5,1,2,6,12h和1,3,7,14,21,30d）處死大鼠，每組每個時間點各5只.1.2.1NOS活性的測定IRI組大鼠取左室缺血區(qū)心肌0.2g,對照組大鼠取左室相應區(qū)心肌0.2g,采用iNOSAssayKit進行測定.心組織NOS活性的測定采用3［H］精氨酸同位素法［4］,心組織在4℃含有1mmol/Lleupeptin,2mmol/Laprotonin,1mmol/Lphenylemthylsulfonylfluoride,1mmol/LDTT,1ml/LTritonX100的30mmol/LHEPES緩沖液中勻漿,反應液為30mmol/LHEPES緩沖液(pH7.4),含1mmol/LCaCl2,100mmol/LNADPH,300mmol/Ltetrahydrobiopterin,1mmol/Ldithiothreitol,以40mmol/LL3H精氨酸(37kBq/反應液)為反應底物,在37℃下反應30min,用200μL含100mmol/LEGTA的終止液終止反應,反應體系過5cm的Dowex離子交換層析柱,加閃爍液后讀取放射性記數(shù).蛋白定量用Bradford法,NOS活性用每克蛋白秒fmol（即fkat/g）表示.1.2.2Western印記檢測iNOS和eNOS蛋白表達IRI組大鼠取左室缺血區(qū)心肌0.2g,對照組大鼠取左室相應區(qū)心肌0.2g,以5∶1(V/m)比例置勻漿緩沖液（含50mmol/LTrispH7.5,150mmol/LNaCl,5g/Lαcholatesodium,1g/LSDS,2mmol/LEDTA,10g/LTritonX100,100mL/L甘油，1mmol/LPMSF,2mg/Laprotinin）勻漿破碎組織.勻漿液于4℃10000g離心15min，收集上清液并用dyebinding(BioRad)方法以牛血清清蛋白為標準測定蛋白濃度.取含30mg總蛋白的各組標本勻漿上清液點樣進行75g/LSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離Mr135000的iNOS及150000的eNOS蛋白.Mr標準采用預染的彩虹重組蛋白(AmershamInternationalplc,Buckinghamshire,England).電泳后的凝膠通過Western印記裝置（BioRad）電轉移蛋白質至hybondC膜(AmershamPharmaciaBiotech,Buckinghamshire,England).轉移膜經(jīng)封閉、與1∶500稀釋的iNOS或eNOSmAb4℃孵育過夜、洗滌、與1∶5000稀釋的HRP標記的兔抗羊IgG室溫孵育1h和第2次洗滌，最后用ECLWestern印記熒光檢測系統(tǒng)(AmershamLifeSciences,ArlingtonHeights,IL)顯色、曝光于X光底片(Fuji,Tokyo,Japan)和顯影、定影.將感光X光片上蛋白條帶應用HPIAS2000型圖像分析系統(tǒng)(同濟千屏影像工程公司生產(chǎn))掃描測定光密度(OD)定量.1.2.3RTPCR檢測iNOS和eNOS的轉錄IRI組大鼠取左室缺血區(qū)心肌0.2g,對照組大鼠取左室相應區(qū)心肌0.2g,采用Trizol試劑提取總RNA，以thermoscriptTMRTPCR系統(tǒng)進行逆轉錄和PCR反應.PCR反應采取等量逆轉錄cDNA模板，分別以iNOS,eNOS,βactin特異性引物進行PCR反應.擴增iNOS的引物對為：sense：5′TGGCTTGCCCTTGGAAGTTTCTC3′,antisense:5′TCCAGGCCATCTTGGTGGCAAGA3′，預計擴增產(chǎn)物為574bpiNOScDN段，PCR反應條件為95℃5min；95℃30s，60℃45s，72℃1min，共30個循環(huán)；72℃10min.擴增eNOS的引物對為：sense:5′TACGGAGCAGCAAATCCAC3′,antisense:5′CAGGCTGCAGTCCTTTGATC3′，預計擴增產(chǎn)物812bp，PCR反應條件為95℃5min；95℃45s，60℃45s，72℃1.25min，共30個循環(huán)；72℃10min.內對照βactin的擴增引物對為：sense:5′GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3′,antisense:5′CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3′，預計產(chǎn)物為540bp，PCR反應條件為95℃2min；95℃30s，60℃45s，72℃1min，共30個循環(huán)；72℃10min.PCR產(chǎn)物以含0.5mg/L溴乙錠的10g/L瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外光照下觀察電泳條帶,用BioRad凝膠分析系統(tǒng)分析結果，結果以光密度值（OD）表示.統(tǒng)計學處理:數(shù)據(jù)均以x±s表示.應用SPSS11.0軟件進行方差分析,P<0.05為有顯著性差異.2結果2.1心臟IRI時NOS活性的變化單純缺血1h，心臟NOS活性與對照組相比無明顯變化.心臟恢復血供再灌注0.5h后cNOS活性即開始升高,以2～6h最高,與對照組相比,差異有顯著性意義(P<0.01)；但12h后卻迅速下降,3d時活性最低與對照組相比,差異有顯著性意義(P<0.01),以后逐日恢復,21d時心恢復正常.iNOS活性在[1][2]對照組心臟表達微弱,再灌注2h后逐漸升高,12h~3d活性達高峰,與對照組相比差異有顯著性意義(P<0.01),以后逐漸下降,7d后基本恢復正常(Tab1).表1心臟IRI后cNOS和iNOS的活性變化（略）2.2Western印跡IRI組再灌注0.5h后心臟eNOS蛋白質表達即開始升高,2h達到高峰,12h后開始減少,3d時為最低,以后逐漸恢復,21d時恢復至對照組水平,與NOS活性變化相一致.對照組心臟檢測出iNOS蛋白微量表達,但表達量遠低于eNOS,IRI可誘導其表達,在12h后表達逐漸增強,3d時表達最強,隨后逐漸減弱,21d時恢復對照組水平,也與iNOS的活性變化相一致(Fig1,Tab2).表2Western印跡法測定心臟IRI后eNOS和iNOS蛋白表達(略)2.3NOSmRNA的基因表達IRI組心臟再灌注早期(0.5～12h)即可誘導eNOSmRNA表達增強,2h達高峰,此后隨著損傷程度加重,其表達迅速下降.3d低于對照組,以后逐步恢復,21d已相當對照組水平.在對照組心臟iNOSmRNA表達微弱,再灌注12h后開始增強,3d達高峰,21d恢復正常水平(Fig2,Tab3).以上eNOS和iNOSmRNA的消長變化與蛋白質的表達和酶活力的變化一致.表3大鼠心臟IRI后eNOS和iNOSmRNA半定量結果(略)3討論eNOS來源的NO具有舒張心血管,抑制白細胞浸潤和血小板的凝聚作用［5］，從而對心臟可能起到保護作用.Song等［6］的研究表明,在早期eNOS的過量表達對小鼠骨骼肌的IRI具有保護作用,隨著損傷過程的進展,心臟結構和功能的損害不斷加重,eNOS表達也相應迅速下降.這可能由于大量心肌細胞壞死和凋亡,導致eNOS的合成減少有關.eNOS的表達隨著心臟損傷修復和心功能的恢復逐步恢復.NO在心肌再灌注損傷中加重心肌損害.缺血再灌注情況下,多種細胞因子上調巨噬細胞等內的iNOS的mRNA表達,立即產(chǎn)生大量的iNOS和NO.過量的NO與氧迅速反應生成大量的氧自由基如過氧亞硝酸陰離子(ONOO),后者可進一步反應生成HO-,NO2,NO3-等,其結果是引起和加重心肌缺血再灌注損傷［7］.我們發(fā)現(xiàn)，單純缺血1h對心臟NOS活性無明顯影響,再灌注30min后NOS活性即開始升高,2～6h到達高峰,持續(xù)到6h，此后迅速下降,24h降低到正常以下,21d時恢復至正常水平.RTPCR分析發(fā)現(xiàn)eNOS及iNOSmRNA的變化與其蛋白變化相一致.可見在IRI中,早期eNOS的高表達可能參與了早期心血流的調節(jié),對抑制心血管痙攣、減少炎性細胞的浸潤有關；iNOS參與介導了心臟IRI的炎癥損傷.可以設想,在器官保存過程中或移植后早期使用iNOS的抑制劑,將會減少急性心肌壞死和凋亡以及急性排斥反應的發(fā)生,對IRI起到保護作用,促進心功能的恢復，為臨床提供科學的理論依據(jù).【參考文獻】［1］張榮慶，徐凱，程何祥，等.卡維地洛對缺氧心肌細胞NO生成的影響［J］.第四軍醫(yī)大學學報，2002；23（22）：2071-2073.ZhangRQ,XuK,ChengHX,etal.Effectsofcarvedilolonnitricoxideproductionbymyocardialcellsduringanoxia［J］.JFourthMilMedUniv,2002；23（22）：2071-2073.［2］許春梅，董衛(wèi)國，余保平，等.低氧誘導因子1α及誘導型一氧化氮合酶在炎癥性腸病中的表達［J］.第四軍醫(yī)大學學報，2004；25（17）：1558-1561.XuCM,DongWG,YuBP,etal.Expressionofhypoxiainduciblefactor1alpha(HIF1α)andinduciblenitricoxidesynthase(iNOS)genesininflammatoryboweldisease［J］.JFourthMilMedUniv,2004；25（17）：1558-1561.［3］SuzukiM,SasakiN,MikiT,etal.RoleofsarcolemmalK(ATP)channelsincardioprotectionagainstischemia/reperfusioninjuryinmice［J］.JClinInvest,2002;109(4):509-516.［4］CheungF,SiowYL,ChenWZ,etal.InhibitoryeffectofGinkgobllobaextractontheexpressionofinduciblenitricoxidesynthaseinendothelialcells［J］.BiochemPharmacol,1999;58(10):1665-1673.［5］OzakiM,KawashimaS,HiraseT,etal.Overexpressionofendothelialnitricoxidesynthaseinendothelialcellsisprotectiveagainstischemiareperfusioninjuryinmouseskeletalmuscle［J］.AmJPathol,2002;160(4):1335-1344.［6］SongW,LuXR,FengQP.Tumornecrosisfactorαinducesapoptosisviainduciblenitricoxidesynthaseinneonatalmousecardiomyocytes［J］.CardiovascRes,2000;45(3):595-602.［7］項紅軍,趙佐慶,李紀鵬,等.大鼠小腸缺血再灌注后血中NO,SOD濃度及肺中Bax,Bcl2表達的改變［J］.第四軍醫(yī)大學學報，2002；23（21）：1974-1977