導(dǎo)語(yǔ)：法醫(yī)學(xué)精斑檢驗(yàn)方法分析一文來(lái)源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢(xún)客服老師，歡迎參考。

摘要：精斑是性犯罪現(xiàn)場(chǎng)中最常見(jiàn)和最重要的生物檢材。精斑檢驗(yàn)分為精斑的確證檢驗(yàn)和后續(xù)精斑的個(gè)人識(shí)別檢驗(yàn)。精斑檢驗(yàn)可以為偵查提供方向和線(xiàn)索，為訴訟提供證據(jù)，是法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的重點(diǎn)。大多數(shù)傳統(tǒng)的精斑檢驗(yàn)方法，如酸性磷酸酶檢驗(yàn)、碘化鉀結(jié)晶實(shí)驗(yàn)和精斑ABO血型測(cè)定等，具有一定局限性。因此尋找快速、靈敏度高、不破壞DNA、適用于微量陳舊和污染檢材的精斑檢驗(yàn)方法一直是法醫(yī)學(xué)精斑檢驗(yàn)的研究熱點(diǎn)和方向。隨著技術(shù)發(fā)展，有研究將免疫熒光染色和激光顯微切割技術(shù)等生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于精斑檢驗(yàn)并取得成功。新一代測(cè)序技術(shù)不斷發(fā)展并逐步應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)的精斑檢驗(yàn)的個(gè)人識(shí)別檢測(cè)當(dāng)中，為法醫(yī)學(xué)精斑檢驗(yàn)技術(shù)開(kāi)辟了新的途徑。

關(guān)鍵詞：性犯罪;精斑檢驗(yàn);個(gè)人識(shí)別;精斑;DNA;分型;新一代測(cè)序

精斑是精液射出于體外后浸潤(rùn)或附著于某些載體上隨時(shí)間變化逐漸干燥形成的一類(lèi)生物斑痕斑跡［1］。傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法有光譜法、酶催化法、化學(xué)法和傳統(tǒng)免疫學(xué)法等。光譜法包括交替光源照射法、拉曼光譜法等；酶催化法包括酸性磷酸酶檢驗(yàn)、乳酸脫氫酶試驗(yàn)等；化學(xué)法包括苦味酸結(jié)晶試驗(yàn)和碘化鉀結(jié)晶試驗(yàn)等；傳統(tǒng)免疫學(xué)法有前列腺特異性抗原檢測(cè)。這些方法操作簡(jiǎn)便，但靈敏度和特異性有限，對(duì)檢材完整性要求高，檢驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定且影響后續(xù)DNA檢測(cè)。現(xiàn)代的精斑檢驗(yàn)方法主要分為生物化學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。

1生物化學(xué)方法

1.1免疫熒光染色和激光顯微切割技術(shù)檢測(cè)目前大多對(duì)精子的可視化方法是基于組織學(xué)染色，但這些方法對(duì)精子并不特異，而且染色會(huì)導(dǎo)致DNA損傷。2009年Vandewoestyne等［2］發(fā)現(xiàn)一種新的精子染色方法，即使用4,6-二氨基-2-苯基吲哚等對(duì)精子頭部進(jìn)行特異性免疫熒光染色［3］，經(jīng)室溫自然干燥后，使用激光顯微切割技術(shù)（lasercapturemicrodissection,LCM）切割并捕獲熒光標(biāo)記的精子。該技術(shù)是目前最先進(jìn)、自動(dòng)化程度最高的組織純化病理技術(shù)，可以精確分離精子和陰道上皮細(xì)胞。基于該檢測(cè)技術(shù)目前已研發(fā)出成品試劑盒，如Hy-LiterTMPI試劑盒。但是該方法切割精子過(guò)程易受設(shè)備功率、環(huán)境濕度和溫度以及精子細(xì)胞的數(shù)量等因素影響。1.2精液蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要是通過(guò)雙向電泳技術(shù)，在檢測(cè)親脂性蛋白質(zhì)、相對(duì)分子質(zhì)量過(guò)大或過(guò)小和微量蛋白上效果不理想。二維微量高效液相系統(tǒng)（2D-HPLC）、多維蛋白鑒定技術(shù)的發(fā)展解決了傳統(tǒng)方法的局限性，在不破壞DNA結(jié)構(gòu)和節(jié)約樣本的基礎(chǔ)上，可以識(shí)別混合物中的特定成份，已應(yīng)用在唾液和精液檢測(cè)。精斑檢測(cè)主要利用精子表面蛋白質(zhì)質(zhì)譜、精漿蛋白質(zhì)質(zhì)譜和差異蛋白質(zhì)質(zhì)譜等進(jìn)行檢測(cè)。2013年Yang等［4］用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀檢測(cè)出48個(gè)精液特有蛋白，如精囊蛋白（SEMG1/2）、PSA、前列腺磷酸酶（SAP）、半胱氨酸分泌蛋白等。但是部分蛋白質(zhì)，如SEMG2等，不存在于無(wú)精癥患者的精液中，不適用該方法。1.3免疫磁珠法檢測(cè)通過(guò)將特異性的抗體與磁珠進(jìn)行結(jié)合，利用磁性分離技術(shù)達(dá)到對(duì)精液和陰道分泌液混合斑中精子進(jìn)行捕獲和檢測(cè)。目前，精子特異性抗原對(duì)應(yīng)的單克隆抗體及多克隆抗體的免疫磁珠結(jié)合的技術(shù)發(fā)展也已經(jīng)很成熟。2011年國(guó)內(nèi)學(xué)者利用抗SPAG8抗體和人精子魚(yú)精蛋白抗體成功對(duì)精子細(xì)胞進(jìn)行的捕獲和分離。免疫磁珠法具備了抗原抗體的較高特異性和其本身的固化性等優(yōu)點(diǎn)，具有較好的法醫(yī)物證學(xué)進(jìn)行精斑檢驗(yàn)的應(yīng)用前景。

2分子生物學(xué)方法

精斑的確證檢驗(yàn)和個(gè)人識(shí)別廣泛應(yīng)用分子生物學(xué)方法。其中mRNA、miRNA、DNA甲基化應(yīng)用于精斑的確證檢驗(yàn)，Y染色體遺傳標(biāo)記（Y-STR和Y-SNP）應(yīng)用于精斑的個(gè)人識(shí)別。2.1精斑的確證檢驗(yàn)2.1.1mRNA檢測(cè)理論上，由于基因的選擇性表達(dá)，通過(guò)特定基因的mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，獲得mRNA的表達(dá)譜，就可確證相應(yīng)體液的存在。KLK3和PRM2基因分別在前列腺組織細(xì)胞和精子細(xì)胞中呈現(xiàn)高水平表達(dá)，而在其他組織器官中不表達(dá)或少有表達(dá)，具有特異性。根據(jù)這兩個(gè)基因的表達(dá)情況，可建立通過(guò)檢測(cè)特異性mRNA標(biāo)記進(jìn)行精斑檢測(cè)的方法及標(biāo)準(zhǔn)。該方法具有操作簡(jiǎn)便、快速，靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但其與DNA分型技術(shù)不兼容。此外，由于RNA不穩(wěn)定，所以陰性結(jié)果也不能排除有精子存在的可能性［5］。2.1.2miRNA檢測(cè)MicroRNA（miRNA）是一類(lèi)真核生物體內(nèi)內(nèi)源性小分子的單鏈RNA，長(zhǎng)度約為18～25nt，它能通過(guò)與靶mRNA堿基配對(duì)引起靶mRNA降解或抑制其翻譯，從而進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控。2009年Hanson等［6］研究發(fā)現(xiàn)miR10b和miR135b在精斑中的表達(dá)量高于其他體液斑跡，而且在有月經(jīng)血痕的混合斑和陰道拭子中也有較高水平的表達(dá)，可用于精斑確證檢驗(yàn)。由于miRNA堿基序列很短，適用于陳舊、易降解的生物檢材的檢測(cè)。但該方法存在miRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系的假陽(yáng)性率和假陰性率高，耗材昂貴，且與DNA分型技術(shù)不兼容等局限性。2.1.3DNA甲基化檢測(cè)DNA甲基化主要見(jiàn)于CpG二核苷酸的胞嘧啶上，其檢測(cè)一般在CpG二核苷酸相對(duì)集中的區(qū)域。眾多表觀遺傳學(xué)研究表明，通過(guò)利用人類(lèi)基因組中組織特異性DNA甲基化的差異位點(diǎn)（tDMRs）可以對(duì)檢材來(lái)源進(jìn)行鑒別。2013年AdamWasserstrom等［7］將5個(gè)具有精液特異性甲基化差異位點(diǎn)和3個(gè)附加作為內(nèi)部參照位點(diǎn)聯(lián)合起來(lái)，研發(fā)出第一個(gè)將tDMRs作為鑒定依據(jù)對(duì)人體組織或體液樣本進(jìn)行精液斑識(shí)別的試劑盒，該方法類(lèi)似于DNA分型技術(shù)。2012年劉峰等［8］采用DNAIQTMSystem試劑盒成功檢驗(yàn)了1例精斑。現(xiàn)階段各類(lèi)研究篩選的位點(diǎn)數(shù)量有限、相關(guān)甲基化差異的多態(tài)性不高，遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足法醫(yī)實(shí)踐中識(shí)別生物斑跡類(lèi)別的需要。因此，未來(lái)需篩選更多適用于各種體液鑒定的DNA甲基化差異性標(biāo)記。2.2精斑的個(gè)人識(shí)別在法醫(yī)學(xué)中，精斑及混合斑個(gè)人識(shí)別檢驗(yàn)常用Y染色體遺傳標(biāo)記，包括Y-STR和Y-SNP。此外，新一代測(cè)序技術(shù)日漸成熟，是目前精斑檢驗(yàn)的研究方向和重點(diǎn)。2.2.1Y-STR檢測(cè)Y-STR在強(qiáng)奸案、輪奸案的混合斑及少精子或無(wú)精子的混合斑中男性個(gè)體DNA檢測(cè)具有重要作用。當(dāng)混合斑中男性精子遠(yuǎn)低于女性陰道上皮細(xì)胞成分時(shí)（比例為1∶25～1∶50），以及精液樣本存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、精子拷貝數(shù)低、檢材發(fā)生污染或降解時(shí)，Y-STR檢測(cè)可以排除這些因素對(duì)分型結(jié)果的影響。1999年Honda等［9］利用4個(gè)特異的Y-STR位點(diǎn)，對(duì)保存長(zhǎng)達(dá)25年之久的陰道拭子混合斑檢材進(jìn)行了檢測(cè)，成功發(fā)現(xiàn)了罪犯。在輪奸案中，可利用分型結(jié)果一個(gè)基因座出現(xiàn)的等位基因個(gè)數(shù)推知最少作案人數(shù)，為案件的偵查提供線(xiàn)索。有研究報(bào)道，使用Y-STR檢測(cè)到多個(gè)男性成分的可能性大約是只使用常染色體STR檢測(cè)的三倍［10］。2.2.2Y-SNP檢測(cè)Y-SNP位點(diǎn)在人類(lèi)基因組中分布廣泛，數(shù)目約比Y-STR位點(diǎn)要高出幾個(gè)數(shù)量級(jí)。研究發(fā)現(xiàn)，30～60個(gè)Y-SNP位點(diǎn)即能達(dá)到目前使用的Y-STR位點(diǎn)復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)的識(shí)別率。Y-SNP位點(diǎn)主要用于族源推斷，還可用于個(gè)體識(shí)別。Y-SNP檢驗(yàn)手段主要有多重單堿基延伸SNP分型技術(shù)（SNaPshot）、飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（MassAr⁃ray）、中高通量的SNPstream芯片技術(shù)和高通量的二代測(cè)序技術(shù)（NGS）等。有研究通過(guò)DNA微陣列進(jìn)行SNP分型，發(fā)現(xiàn)了Y-SNP芯片，可用于混合斑及精斑的鑒定。但是目前多個(gè)Y-SNP位點(diǎn)的檢測(cè)體系仍在探索中，在日常檢測(cè)中有局限。2.2.3新一代測(cè)序技術(shù)DNA測(cè)序技術(shù)可以檢測(cè)遺傳標(biāo)記的結(jié)構(gòu)，直觀而全面地展示核酸的深層次分子生物學(xué)信息。在混合斑及精斑檢驗(yàn)中，利用二代測(cè)序?qū)旌螪NA進(jìn)行STR基因座和SNP位點(diǎn)綜合測(cè)序，通過(guò)長(zhǎng)度多態(tài)性和序列多態(tài)性，進(jìn)而推斷混合DNA不同個(gè)體來(lái)源以及輪奸案中最少作案人數(shù)。二代測(cè)序技術(shù)在過(guò)去的二十年里發(fā)展迅速，并逐步實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化。二代測(cè)序有高通量和成本低等優(yōu)勢(shì)，但測(cè)序讀長(zhǎng)較短，且相較于一代測(cè)序而言，二代測(cè)序時(shí)間長(zhǎng)。因此，測(cè)序讀長(zhǎng)長(zhǎng)、時(shí)間短的三代測(cè)序應(yīng)運(yùn)而生，其不依賴(lài)于PCR擴(kuò)增技術(shù)，為單分子測(cè)序。市面上三代測(cè)序平臺(tái)有美國(guó)HeliscopeBioScience公司的SMS技術(shù)和美國(guó)PacificBioscience的SMRT技術(shù)，Vi⁃siGenBiotechnologies公司的FRET技術(shù)以及英國(guó)ONT公司所推出的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)。

3展望

在性犯罪案件中，精斑作為法醫(yī)實(shí)踐中常見(jiàn)的生物物證檢材，其檢驗(yàn)結(jié)果可以為偵查提供線(xiàn)索，為訴訟提供證據(jù)。隨著技術(shù)發(fā)展，二代測(cè)序的應(yīng)用成為未來(lái)精斑個(gè)人識(shí)別技術(shù)發(fā)展的新趨勢(shì)。雖然現(xiàn)在有很多精斑鑒別新技術(shù)，但還需傳統(tǒng)檢測(cè)方法輔助和大量試驗(yàn)。

作者：程媛媛 李樹(shù) 單位：中國(guó)刑事警察學(xué)院法醫(yī)學(xué)系