導(dǎo)語：細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)初試分析一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

摘要：為了使教學(xué)工作緊跟科學(xué)發(fā)展前沿與熱點(diǎn)，該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)引入DNA損傷修復(fù)內(nèi)容，并使所提出的問題均具有開放性，旨在全方位鍛煉學(xué)生的自主性與創(chuàng)新性，提高細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果。

關(guān)鍵詞：研究熱點(diǎn)；學(xué)科問題；DNA損傷修復(fù)；創(chuàng)新性；自主性

實(shí)驗(yàn)教學(xué)是細(xì)胞生物學(xué)課程體系的重要組成部分，是對(duì)細(xì)胞生物學(xué)理論課程的重要支撐，有助于學(xué)生掌握理論基礎(chǔ)知識(shí)，訓(xùn)練探索科學(xué)的方法，激發(fā)學(xué)習(xí)興趣，培養(yǎng)手腦并用能力及實(shí)事求是的科學(xué)作風(fēng)和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度。因此，不斷改進(jìn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)方法和教學(xué)內(nèi)容，是相關(guān)課程實(shí)驗(yàn)教學(xué)教師應(yīng)長(zhǎng)期關(guān)注和探討的課題。進(jìn)入21世紀(jì)以來，生命科學(xué)取得了巨大進(jìn)步和迅速發(fā)展，已經(jīng)成為自然科學(xué)的前沿學(xué)科。大量研究成果的出現(xiàn)及相關(guān)知識(shí)和信息的井噴式增長(zhǎng)，不斷地革新著我們對(duì)生命的理解和認(rèn)識(shí)[1-4]。這些不斷出現(xiàn)的新成果和新知識(shí)，不僅為生物學(xué)教學(xué)工作注入源源不斷的素材，也是對(duì)教學(xué)工作者的挑戰(zhàn)，只有及時(shí)更新和完善教學(xué)內(nèi)容和教學(xué)方法，才能使教學(xué)工作跟上生命科學(xué)發(fā)展的步伐[5-7]。為了跟蹤生命科學(xué)研究前沿，將當(dāng)前生命科學(xué)研究熱點(diǎn)引入課堂，將大大提升學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性。筆者在細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容中引入“DNA損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)”，取得了良好的教學(xué)成果。

1將科學(xué)研究熱點(diǎn)與一流教學(xué)平臺(tái)結(jié)合

DNA損傷修復(fù)是細(xì)胞內(nèi)DNA分子在受到外源或內(nèi)源損傷后，在多種蛋白共同作用下自我修復(fù)從而恢復(fù)結(jié)構(gòu)的過程。DNA損傷修復(fù)研究對(duì)研究基因組不穩(wěn)定性及腫瘤的發(fā)生與發(fā)展具有重要的指導(dǎo)意義，其中關(guān)鍵信號(hào)分子的靶向小分子藥物研究，對(duì)于腫瘤治療具有極其重要的臨床意義。例如，在臨床中運(yùn)用PARP1抑制劑來抑制PARP1介導(dǎo)的DNA修復(fù)，對(duì)于腫瘤尤其是BRCA1/2基因突變引起的腫瘤，具有極好的治療效果，已在臨床上廣泛使用[8-9]。由于DNA損傷修復(fù)研究在腫瘤研究和腫瘤治療過程中具有重要作用，已成為各國重點(diǎn)投入的熱點(diǎn)研究學(xué)科。2015年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予托馬斯•林道爾（TomasLindahl）、保羅•莫德里奇（PaulModrich）和阿奇茲•?？ǎˋzizSancar），就是表彰他們?cè)贒NA修復(fù)機(jī)制方面的研究貢獻(xiàn)。將DNA損傷修復(fù)研究引入細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)，能夠使學(xué)生切身體會(huì)和感受生命科學(xué)研究的前沿科學(xué)問題，激發(fā)他們探究生命奧秘的信心。我校生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心是我國首批建設(shè)的國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，擁有一流的實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)備和實(shí)驗(yàn)教學(xué)隊(duì)伍。在多年的教學(xué)過程中，中心改變了實(shí)驗(yàn)教學(xué)依附于理論課教學(xué)的模式，全面整合教學(xué)內(nèi)容，強(qiáng)化基本實(shí)驗(yàn)技能訓(xùn)練，以能力培養(yǎng)為主線，重點(diǎn)培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)研究能力和科學(xué)思維能力，以及良好的科學(xué)研究素養(yǎng)。中心目前已建成多個(gè)綜合型實(shí)驗(yàn)教學(xué)實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)設(shè)備先進(jìn)、功能齊全，除了完成基本教學(xué)任務(wù)外，已經(jīng)具備供學(xué)生進(jìn)行系統(tǒng)性科學(xué)實(shí)驗(yàn)探索的能力，是本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革工作的堅(jiān)實(shí)保障。

2教學(xué)改革目標(biāo)

（1）培養(yǎng)學(xué)生提出問題和解決問題的能力。鑒于本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)所提出的問題是開放性的，在課程前期主要是讓學(xué)生按照教師提出的實(shí)驗(yàn)方法學(xué)習(xí)DNA損傷修復(fù)研究的主要手段。在學(xué)生理解相關(guān)的基本原理并掌握主要研究方法之后，重點(diǎn)引導(dǎo)學(xué)生自己尋找課題，解決關(guān)于DNA損傷修復(fù)方面的科學(xué)問題。這一學(xué)習(xí)過程有助于培養(yǎng)學(xué)生提出科學(xué)問題并用所學(xué)知識(shí)加以解決的能力。（2）在教學(xué)中添加研究元素。原有的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)主要是使學(xué)生了解和掌握一些經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和手段，每個(gè)實(shí)驗(yàn)都相對(duì)獨(dú)立。本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)則使學(xué)生在掌握DNA損傷修復(fù)經(jīng)典研究技術(shù)的基礎(chǔ)上，能夠解決一個(gè)自己感興趣的科學(xué)問題。使學(xué)生由被動(dòng)接受知識(shí)變?yōu)橹鲃?dòng)解決問題，提高學(xué)生的學(xué)習(xí)主動(dòng)性和積極性。（3）引入細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)教學(xué)內(nèi)容。目前，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究是生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)，而原有實(shí)驗(yàn)教學(xué)基本不包括細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的實(shí)驗(yàn)。本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)將使學(xué)生直觀感受細(xì)胞在受到損傷信號(hào)后所發(fā)生的變化，并檢測(cè)DNA修復(fù)蛋白在DNA損傷位點(diǎn)的遷移及所形成的foci結(jié)構(gòu)。

3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

3.1實(shí)驗(yàn)原理。DNA損傷修復(fù)是指生物細(xì)胞內(nèi)的DNA分子受到內(nèi)源或者外源損傷后結(jié)構(gòu)的恢復(fù)現(xiàn)象，是機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的多種酶和信號(hào)分子共同作用的結(jié)果。當(dāng)DNA發(fā)生損傷時(shí)，組蛋白H2Ax的Ser139位點(diǎn)會(huì)被磷酸化修飾，并且會(huì)將DNA修復(fù)蛋白招募到細(xì)胞核內(nèi)DNA的損傷位點(diǎn)，從而對(duì)DNA損傷進(jìn)行修復(fù)。DNA損傷有多種形式，其中最為嚴(yán)重的一種是DNA雙鏈斷裂（DNAdoublestrandbreak,DSB）。DSB發(fā)生后，細(xì)胞需要快速采取措施停止或推遲細(xì)胞分裂，為DNA修復(fù)提供足夠時(shí)間。真核細(xì)胞主要通過兩種途徑修復(fù)DSB：同源重組（homologuesrecombination，HR）和非同源末端鏈接（nonhomologuesendjoining，NHEJ）。其中，修復(fù)蛋白53BP1能夠在DNA損傷發(fā)生后被快速招募到DNA損傷位點(diǎn)，從而介導(dǎo)NHEJ修復(fù)過程。DNA損傷誘導(dǎo)53BP1的招募，可以通過熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，從而檢測(cè)DNA損傷修復(fù)過程的發(fā)生[10-12]。3.2實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備。HeLa細(xì)胞，2cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，1.5cm細(xì)胞爬片，DMEM培養(yǎng)基，PBS，青霉素和鏈霉素，DAPI染料，熒光顯微鏡，載玻片，喜樹堿（CPT），抗體，抗癌類藥物或者小分子化合物。所需實(shí)驗(yàn)材料由學(xué)生決定，實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心幫助解決。3.3實(shí)驗(yàn)步驟。（1）準(zhǔn)備細(xì)胞（HeLacell），每個(gè)小組2位同學(xué)，準(zhǔn)備3皿細(xì)胞（提前一天種細(xì)胞爬片，由教師負(fù)責(zé)）；（2）DNA損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)原理和研究前沿介紹（在普通實(shí)驗(yàn)室完成）；（3）在細(xì)胞無菌操作室將CPT或各自準(zhǔn)備的化合物按照各組自行設(shè)計(jì)的方案加入細(xì)胞中；（4）將細(xì)胞培養(yǎng)皿交給教師，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h；（5）細(xì)胞培養(yǎng)皿用1mL的PBS洗3次，2min/次；（6）將0.3mL、4%的甲醛（用磷酸鹽緩沖液PBS配置而成），室溫孵育10min；（7）用1mL的PBS洗3次，2min/次；（8）用0.1%的TritonX-100（用PBS配置而成）在室溫孵育5min，300µL/片（注意滴加在蓋玻片上，下同）；（9）用1mL的PBS洗3次，2min/次；（10）用馬血清（用細(xì)胞培養(yǎng)緩沖液PBST配置而成）在室溫孵育15min，300µL/片；（11）一抗抗體1∶500稀釋（用PBST配置而成），200µL/片，室溫孵育1h；（12）用1mL的PBS洗3次，2min/次；（13）二抗抗體1∶100稀釋（用PBST配置而成），200µL/片，室溫孵育40min（此步驟及以后步驟均需要遮光處理）；（14）用1mL的PBST洗3次，1min/次；（15）將50%DAPI溶液（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole)+50%抗熒光淬滅封片劑）25µL滴于潔凈載玻片，反扣；（16）在熒光顯微鏡下觀察。3.4結(jié)果與分析。圖1為CPT誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的觀察，其中上、下兩組分別為對(duì)照組和加入CPT的實(shí)驗(yàn)組，左側(cè)為53BP1熒光顯色圖，右側(cè)為DAPI核酸染色圖。如圖1所示，CPT處理HeLa細(xì)胞2h后，能夠在熒光顯微鏡下觀察到53BP1foci的形成，說明CPT對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷的形成具有很強(qiáng)的作用。在沒有通過CPT處理的HeLa細(xì)胞中，部分細(xì)胞能夠檢測(cè)到53BP1foci的形成，說明在正常的細(xì)胞中，有源發(fā)性的DNA損傷發(fā)生。實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)了其他藥物或化合物，發(fā)現(xiàn)很多化合物都不能促進(jìn)DNA損傷修復(fù)的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)抗腫瘤藥物都能引起細(xì)胞的凋亡或死亡，這些藥物的副作用和藥物作用特異性引起學(xué)生關(guān)注，激發(fā)了他們進(jìn)一步探究的興趣。在本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，學(xué)生基本上都能順利完成所有實(shí)驗(yàn)，取得了比較好的實(shí)驗(yàn)效果。但也有學(xué)生由于所加藥物毒性太大，或藥物濃度過高，導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡，而無法獲得較好的實(shí)驗(yàn)效果。今后將增加細(xì)胞藥物耐受性檢測(cè)，使學(xué)生能夠在適當(dāng)?shù)乃幬餄舛认逻M(jìn)行實(shí)驗(yàn)，從而獲得更好的教學(xué)效果。引入DNA修復(fù)實(shí)驗(yàn)，不僅讓學(xué)生接觸了學(xué)科前沿，而且使學(xué)生又一次得到無菌操作技術(shù)、免疫熒光技術(shù)訓(xùn)練，有助于學(xué)生更好地掌握細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，為未來讀研或快速開展科研打好基礎(chǔ)。

4結(jié)語

本次教學(xué)改革旨在鍛煉學(xué)生自己提出問題、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，并用經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)手段解決問題及對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析的能力，實(shí)現(xiàn)課堂教學(xué)與大學(xué)生創(chuàng)新科研訓(xùn)練培養(yǎng)一體化。同時(shí)，將最前沿的研究熱點(diǎn)和科學(xué)問題帶入課堂，能夠使學(xué)生了解和設(shè)計(jì)相關(guān)研究項(xiàng)目，極大地提高了學(xué)生的課堂參與度與學(xué)習(xí)興趣，獲取了良好的教學(xué)效果。

作者:雷曹琦 謝志雄 李小燕 單位:武漢大學(xué)