導(dǎo)語(yǔ)：如何才能寫(xiě)好一篇細(xì)胞自噬，這就需要搜集整理更多的資料和文獻(xiàn)，歡迎閱讀由公務(wù)員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

細(xì)胞內(nèi)損傷物質(zhì)的積累是所有衰老細(xì)胞的普遍特征，能導(dǎo)致生命有機(jī)體生存能力降低。細(xì)胞自噬能夠降解受損蛋白質(zhì)和衰老或損傷細(xì)胞器等細(xì)胞結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞內(nèi)主要的異化途徑，參與衰老以及與衰老相關(guān)的各種病理過(guò)程。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，衰老進(jìn)程中，細(xì)胞自噬活動(dòng)下調(diào)，而對(duì)各種長(zhǎng)壽突變體的研究表明自噬活動(dòng)是壽命延長(zhǎng)所必需的，多種自噬相關(guān)基因或蛋白直接受長(zhǎng)壽途徑的調(diào)節(jié)〔1～5〕，這些發(fā)現(xiàn)都支持細(xì)胞自噬是各種真核生物衰老非常重要的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 衰老進(jìn)程中自噬活動(dòng)下調(diào)

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，與年齡相關(guān)的細(xì)胞自噬活動(dòng)下降能影響細(xì)胞功能，引起各種衰老表現(xiàn)。在哺乳動(dòng)物衰老過(guò)程中巨自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬活動(dòng)(CMA)下降〔6，7〕，CMA的效率降低，將受損蛋白結(jié)合在溶酶體膜上及轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入溶酶體的活動(dòng)明顯減弱。CMA是通過(guò)以熱休克蛋白70(HSP70)為主的分子伴侶，特異性的識(shí)別結(jié)合被降解的蛋白，然后在溶酶體膜上的受體LAMP2A(Lamp2A)作用下，轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體內(nèi)進(jìn)行降解的過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)衰老過(guò)程中CMA效率的降低是由于溶酶體膜上的受體LAMP2A表達(dá)隨著衰老進(jìn)程進(jìn)行性地減少造成的。進(jìn)一步的研究表明〔7〕，在轉(zhuǎn)基因鼠中阻止衰老引起的LAMP2A的表達(dá)減少，即使在老齡的細(xì)胞中，CMA依然保持活躍的功能，尤其重要的是，CMA功能的維持與減低細(xì)胞內(nèi)有害蛋白的積累和改善肝功能密切相關(guān)。除了CMA，衰老過(guò)程中哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞的巨自噬活動(dòng)可能也受到抑制，大量的研究表明，衰老能夠影響巨自噬活動(dòng)，尤其是影響巨自噬對(duì)功能缺陷的線粒體的降解〔3，8〕。對(duì)線蟲(chóng)的研究發(fā)現(xiàn)兩種自噬基因沉默的野生型線蟲(chóng)和DAF2突變體的壽命會(huì)縮短〔9〕。另外，對(duì)其他真核生物，如酵母、果蠅等的研究也觀察到了自噬對(duì)衰老的調(diào)節(jié)作用〔10〕。對(duì)擬南芥研究發(fā)現(xiàn)，剔除自噬相關(guān)基因(Atg)Atg7、Atg4和Atg9，植物能正常生長(zhǎng)，但是卻加速葉片衰老，增強(qiáng)對(duì)病原菌和碳饑餓的超敏反應(yīng)〔11〕。

2 自噬活動(dòng)增強(qiáng)具有抗衰老作用

細(xì)胞自噬通過(guò)保證細(xì)胞蛋白質(zhì)組穩(wěn)定和細(xì)胞器更新能阻止或者減緩細(xì)胞衰老進(jìn)程。有研究認(rèn)為抗脂藥物的抗衰老作用可能是基于細(xì)胞自噬活動(dòng)的增強(qiáng)〔12〕。用雷帕霉素或者海藻糖處理增強(qiáng)自噬的降解作用，可能對(duì)帕金森綜合征等蛋白沉積性疾病模型具有治療作用〔13〕。最近研究表明，一種p62蛋白在通過(guò)自噬攝取泛素化蛋白聚合物的過(guò)程中具有關(guān)鍵作用，p62能與聚泛素化蛋白結(jié)合形成聚合物，也能與自噬效應(yīng)蛋白LC3 （LC3）相互作用，介導(dǎo)自噬對(duì)蛋白聚合物的攝取。p62缺乏能引起小鼠肝細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞蛋白聚合物的沉積〔14〕。

線蟲(chóng)是細(xì)胞衰老和長(zhǎng)壽研究常用的模式生物之一〔5〕。研究發(fā)現(xiàn)，線蟲(chóng)DAF2功能缺失突變能夠誘導(dǎo)成蟲(chóng)表現(xiàn)出滯育樣的代謝變化，明顯延長(zhǎng)線蟲(chóng)的壽命。而線蟲(chóng)與哺乳類(lèi)Beclin1基因同源的自噬基因bec1是線蟲(chóng)DAF2功能缺失突變體耐受態(tài)形成和壽命延長(zhǎng)所必需的，顯然線蟲(chóng)耐受態(tài)的形成和壽命的延長(zhǎng)與自噬率的增加有關(guān)〔15〕。在線蟲(chóng)或者哺乳動(dòng)物，限制熱量都是延長(zhǎng)壽命的研究中常用的實(shí)驗(yàn)手段。限制飲食的過(guò)程中能誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，抑制自噬對(duì)進(jìn)食充足線蟲(chóng)的壽命沒(méi)有影響，而影響限制飲食線蟲(chóng)的壽命，自噬對(duì)飲食限制的反應(yīng)受到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，壽命延長(zhǎng)除了需要誘導(dǎo)自噬發(fā)生，還需一種轉(zhuǎn)錄因子DAF16/FoxO的表達(dá)，研究者認(rèn)為自噬為細(xì)胞提供新的物質(zhì)來(lái)源，而轉(zhuǎn)錄因子DAF16/FoxO負(fù)責(zé)將這些原材料轉(zhuǎn)化為保護(hù)性的蛋白以延長(zhǎng)線蟲(chóng)的壽命〔16〕。

另外有研究認(rèn)為自噬激活的水平對(duì)線蟲(chóng)壽命的調(diào)節(jié)具有重要的作用，在生理水平下，能夠促進(jìn)生存，而低于或者超過(guò)生理水平都引起線蟲(chóng)的死亡〔17〕。對(duì)線蟲(chóng)的研究還發(fā)現(xiàn)，在DAF2突變體中自噬的增加能夠增強(qiáng)對(duì)β淀粉樣蛋白的降解，以對(duì)抗衰老過(guò)程線蟲(chóng)細(xì)胞淀粉樣物質(zhì)積累引起的蛋白毒性〔18〕。

3 長(zhǎng)壽途徑與自噬的調(diào)節(jié)

隨著在細(xì)胞水平上自噬對(duì)衰老調(diào)節(jié)作用的認(rèn)識(shí)，人們開(kāi)始進(jìn)一步在分子水平上探討調(diào)節(jié)自噬和衰老的信號(hào)通路之間是否存在聯(lián)系。近年來(lái)，對(duì)于調(diào)節(jié)自噬降解活動(dòng)的信號(hào)通路有了一定的認(rèn)識(shí)，尤其是mTOR信號(hào)通路和Beclin 1的調(diào)節(jié)作用。而且研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)抗逆境和抗衰老進(jìn)程的長(zhǎng)壽途徑，如FoxO3，NFκB，p53 和 SIRT1等對(duì)自噬活動(dòng)也具有有力的調(diào)節(jié)作用。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，連接胰島素、生長(zhǎng)因子等上游信號(hào)對(duì)Atg1復(fù)合物等下游效應(yīng)物的作用，是自噬的負(fù)調(diào)控因子〔19〕。NFκB信號(hào)系統(tǒng)是細(xì)胞對(duì)抗細(xì)胞損傷和環(huán)境傷害的防御機(jī)制誘導(dǎo)的重要信號(hào)通路，研究發(fā)現(xiàn)，NFκB信號(hào)通路通過(guò)激活mTOR激酶而抑制腫瘤壞死因TNFα誘導(dǎo)的自噬，或者通過(guò)下調(diào)Beclin 1和Atg5的表達(dá)抑制巨自噬活動(dòng)。NFκB信號(hào)通路與自噬之間存在交叉對(duì)話，激活NFκB的上游激酶IKKβ和NIK都是自噬作用的靶蛋白〔20，21〕。

SIRT1是哺乳動(dòng)物的一種沉默因子，是酵母Sir2蛋白的同源物，Sir2蛋白是公認(rèn)的酵母抗逆和長(zhǎng)壽因子，轉(zhuǎn)錄因子FoxO家族是調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、增殖和抗逆的重要因素，線蟲(chóng)FoxOs就是調(diào)節(jié)耐受態(tài)形成和壽命極限的主要因素〔15〕。最近的研究發(fā)現(xiàn)STRT1和FoxO3相關(guān)的信號(hào)通路參與對(duì)哺乳動(dòng)物自噬的調(diào)節(jié)。研究表明，在體外培養(yǎng)的細(xì)胞或者轉(zhuǎn)基因鼠體內(nèi)，SIRT1能夠激活自噬作用，SIRT1/轉(zhuǎn)基因鼠的一些表型和Atg5/小鼠相似。研究還發(fā)現(xiàn)，SIRT1與自噬蛋白Atg5，Atg7 和Atg8的去乙?；嘘P(guān)，表明長(zhǎng)壽基因sir2和自噬降解過(guò)程的相關(guān)性。最近有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO3能夠誘導(dǎo)LC3和Bnip3等激活自噬活動(dòng)的蛋白表達(dá)，而促進(jìn)細(xì)胞降解作用，維持生物體的能量代謝〔22〕。

機(jī)體細(xì)胞脫離衰老過(guò)程可能會(huì)發(fā)生癌變，p53是一種抑癌基因，它的失活能引起腫瘤發(fā)生。p53對(duì)自噬作用跟細(xì)胞狀態(tài)有關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)，p53能抑制mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)自噬發(fā)生〔23〕，相反另一研究發(fā)現(xiàn)，p53表達(dá)下調(diào)能夠激活細(xì)胞的自噬活動(dòng)〔24〕。對(duì)攜帶p53活性片段的轉(zhuǎn)基因鼠的研究發(fā)現(xiàn)，可能是由于細(xì)胞自噬的抑制和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)而表現(xiàn)出早老癥狀，而攜帶完整的p53及其等位基因和Arf的轉(zhuǎn)基因鼠，能夠激活p53的表達(dá)，使p53表達(dá)適度增加，但是卻表現(xiàn)出衰老延遲。由此推測(cè)可能p53Arf信號(hào)通路誘導(dǎo)p53在特定位置表達(dá)的適度增加能夠抑制mTOR，激活自噬，而p53的過(guò)量表達(dá)或者乙?；黾踊钚栽鰪?qiáng)，卻抑制自噬，表現(xiàn)出早老的癥狀〔25〕。

4 結(jié)論與展望

近年來(lái)人們開(kāi)始關(guān)注自噬對(duì)生物體的生理和病理影響，同時(shí)，對(duì)于衰老過(guò)程的分子調(diào)節(jié)機(jī)制也有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。自噬對(duì)于衰老進(jìn)程以及衰老相關(guān)的疾病都具有調(diào)節(jié)作用，適度激活自噬能夠延緩衰老，而且調(diào)節(jié)自噬和衰老的信號(hào)通路之間存在交叉重疊。對(duì)于二者相關(guān)性的研究有助于延緩衰老，并為蛋白沉積性疾病的治療提供了新的治療方向。雖然，對(duì)于自噬和衰老的相關(guān)性有了一定的認(rèn)識(shí)，但是怎樣在衰老細(xì)胞中誘導(dǎo)適度的自噬活動(dòng)延遲衰老進(jìn)程、氧化應(yīng)激在衰老進(jìn)程中是否對(duì)自噬具有抑制作用、SIRT1是否通過(guò)自噬作用延長(zhǎng)壽命以及增強(qiáng)自噬活動(dòng)的藥物是否對(duì)蛋白沉積性疾病具有療效等很多問(wèn)題仍有待于進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)

1 Eskelinen EL，Saftig P.Autophagy a lysosomal degradation pathway with a central role in health and disease〔J〕.Biochim Biophys Acta，2009；1793:66473.

2 Kirkwood TBL.A systematic look at an old problem〔J〕.Nature，2008；451: 6447.

3 Vellai T.Autophagy genes and aging〔J〕.Cell Death Differ，2009；16: 94102.

4 Vijg J.The role of DNA damage and repair in aging:new approaches to an old problem〔J〕.Mech Aging Dev，2008；129: 498502.

5 Thomas E.Johnson Caenorhabditis elegans 2007:the premier model for the study of aging〔J〕.Exp Gerontol，2008；43: 14.

6 Cuervo AM.Autophagy and aging: keeping that old broom working〔J〕. Trends Genet，2008；24: 60412.

7 Zhang C，Cuervo AM.Restoration of chaperonemediated autophagy in aging liver improves cellular maintenance and hepatic function〔J〕.Nat Med，2008；14: 95965.

8 Yen WL，Klionsky DJ.How to live long and prosper: autophagy，mitochondria，and aging〔J〕.Physiology (Bethesda)，2008；23: 24862.

9 Hars ES，Qi H，Ryazanov AG，et al.Autophagy regulates ageing in C.elegans〔J〕.Autophagy，2007；3: 935.

10 Simonsen A，Cumming RC，Brech A，et al.Finley，promoting basal levels of autophagy in the nervous system enhances longevity and oxidant resistance in adult Drosophila〔J〕.Autophagy，2008；4 (2): 17684.

11 Yoshimoto K，Hanaoka H，Sato S，et al.Processing of ATG8s，ubiquitinlike proteins，and their deconjugation by ATG4s are essential for plant autophagy〔J〕.Plant Cell，2004;16 (11): 296783.

12 Donati A，Annamaria V，Gabriella C，et al.In vivo effect of an antilipolytic drug (3，50dimethylpyrazole) on autophagic proteolysis and autophagyrelated gene expression in rat liver〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2008;366: 78692.

13 Ravikumar B，Vacher C，Berger Z，et al.Inhibition of mTOR induces autophagy and reduces toxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease〔J〕.Nat Genet，2004；36: 58595.

14 Pankiv S，Clausen TH，Lamark T，et al.p62/SQSTM1 binds directly to Atg8/LC3 to facilitate degradation of ubiquitinated protein aggregates by autophagy〔J〕.J Biol Chem，2007；282: 2413145.

15 Braeckman BP，Vanfleteren JR. Genetic control of longevity in C. elegans〔J〕.Exp Gerontol，2007；42: 908.

16 Hansen M，Taubert S，Crawford D，et al.A role for autophagy in the extension of lifespan by dietary restriction in C.elegans〔J〕.PLoS Genet，2008；4: e24.

17 Kang C，Youngjai Y，Avery L，et al.Dual roles of autophagy in the survival of Caenorhabditis elegans during starvation〔J〕.Genes Dev， 2007；21: 216171.

18 Cohen E，Bieschke J，Perciavalle RM，et al.Opposing activities protect against ageonset proteotoxicity〔J〕.Science，2006；313: 160410.

19 Pattingre S，Espert L，BiardPiechaczyk M，et al.Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes〔J〕.Biochimie，2008；90: 31323.

20 DjavaheriMergny M，Javelaud D，Wietzerbin J，et al.NFκB activation represses tumor necrosis factorαinduced autophagy〔J〕.J Biol Chem，2006；281: 3037382.

21 Schlottmann S，Buback F，Stahl B，et al.Prolonged classical NFκB activation prevents autophagy upon E.coli stimulation in vitro: a potential resolving mechanism of inflammation〔J〕.Mediators Inflamm，2008；2008：725854.

22 Lee H，Cao L，Mostoslavsky R，et al.A role for the NADdependent deacetylase Sirt1 in the regulation of autophagy〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2008；105: 33749.

23 Feng Z，Zhang H，Arnold J，et al.The coordinate regulation of the p53 and mTOR pathways in cells〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2005；102: 82049.

篇2

2016年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)日前已經(jīng)揭曉。在273位被提名的科學(xué)家中，日本科學(xué)家大隅良典（日文：大隅良典/おおすみよしのり；英文：Osumi Yoshinori）最后折桂，北京時(shí)間10月3日17：30分，諾貝爾基金會(huì)宣布將2016年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予大隅良典教授，以表彰他在自噬反應(yīng)（autophagy）領(lǐng)域做出的卓越貢獻(xiàn)。

大隅良典，是日本分子細(xì)胞生物學(xué)家。他1945年生于日本福岡縣，1974年獲東京大學(xué)博士學(xué)位。在美國(guó)紐約洛克菲勒大學(xué)度過(guò)三年之后，他回到東京大學(xué)，并于1988年建立了自己的研究團(tuán)隊(duì)?，F(xiàn)年71歲的大隅良典現(xiàn)任日本綜合研究大學(xué)院大學(xué)名譽(yù)教授、基礎(chǔ)生物學(xué)研究所名譽(yù)教授，大隅良典的專(zhuān)長(zhǎng)是生物學(xué)，特別是分子生物學(xué)領(lǐng)域，其最知名的成就，是闡明細(xì)胞自噬的分子機(jī)制和生理功能，是細(xì)胞自噬研究的先驅(qū)。今年7月11日大隅良典在《Developmental Cell 》上宣布：他們成功探明了細(xì)胞自噬（autophagy）的啟動(dòng)機(jī)制，這對(duì)預(yù)防和治療由細(xì)胞自噬引發(fā)的多種疾病有重要意義。

諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)評(píng)選委員會(huì)在10月3日的新聞公報(bào)中指出，大隅良典的研究成果有助于人類(lèi)更好地了解細(xì)胞如何實(shí)現(xiàn)自身的循環(huán)利用。在適應(yīng)饑餓或應(yīng)對(duì)感染等許多生理進(jìn)程中，細(xì)胞自噬機(jī)制都有重要意義，大隅良典的發(fā)現(xiàn)為理解這些意義開(kāi)辟了道路。

細(xì)胞自噬是近年來(lái)熱門(mén)研究領(lǐng)域，詞語(yǔ)“autophagy”源自希臘詞語(yǔ)“auto-”和“phagein”，前者意思是“自我”（self），而后者的意思則是“去吃”（eating），而“自噬”表示的字面意思是就是“自己把自己吃掉”（self-eating），實(shí)則是一種細(xì)胞自身成分降解和循環(huán)的基本過(guò)程。通俗地說(shuō)，細(xì)胞可以通過(guò)降解自身的非必需成分來(lái)提供營(yíng)養(yǎng)和能量，也可以降解一些毒性成分以阻止細(xì)胞損傷和凋亡。

正是通過(guò)大隅良典等科學(xué)家的不懈努力，現(xiàn)如今我們知道：細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的一種高度保守的生命現(xiàn)象，是細(xì)胞在缺氧、饑餓等應(yīng)激條件下通過(guò)自我分解受損、變形或失去功能的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和基因組穩(wěn)定性的一種方式，有利于使細(xì)胞在生長(zhǎng)或環(huán)境改變導(dǎo)致的應(yīng)激和壓力條件下獲得生存優(yōu)勢(shì)。它既是細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制，也是一種與凋亡并列的程序性死亡機(jī)制。

發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬機(jī)制的艱難歷程

在大隅良典等科學(xué)家的不懈努力下，今天我們對(duì)細(xì)胞自噬有了一定的了解，可是，搞清細(xì)胞自噬機(jī)制卻歷經(jīng)了很多坎坷。

上世紀(jì)中期，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞能將自己內(nèi)部的多余的蛋白質(zhì)和細(xì)胞成分打包在一起用膜包起來(lái)（也被稱(chēng)為“自噬體”），形成囊泡并運(yùn)送到溶酶體（細(xì)胞中的小隔間，可以降解細(xì)胞成分），從而將其降解。打個(gè)比方，就好像打包好自己家的垃圾，通過(guò)垃圾車(chē)?yán)?，送到了垃圾回收站?/p>

研究人員發(fā)現(xiàn)，正常大鼠肝細(xì)胞中存在包含退化細(xì)胞質(zhì)的膜結(jié)構(gòu)，但其豐度在灌注胰高血糖素之后或暴露于有毒物質(zhì)之中時(shí)會(huì)大幅提升。在認(rèn)識(shí)到這種結(jié)構(gòu)具有消化細(xì)胞內(nèi)部分內(nèi)容物的能力后， 1963年，克里斯??？德?迪夫創(chuàng)造了“自噬”這個(gè)詞，并在發(fā)表的文章中廣泛討論了這個(gè)概念。

幾年后，基于電子顯微鏡的觀察結(jié)果，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也存在這種自噬現(xiàn)象。研究人員接下來(lái)發(fā)現(xiàn)：自噬現(xiàn)象本身處于低水平狀態(tài)，但在各種組織包括腦、腸、腎、肺、肝、前列腺、皮膚和甲狀腺的分化和重塑期間，這種現(xiàn)象加劇。此外，除了單細(xì)胞真核生物中存在自噬現(xiàn)象，在阿米巴原蟲(chóng)、眼蟲(chóng)、四膜蟲(chóng)、昆蟲(chóng)和青蛙等后生動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)了這種機(jī)制。

在隨后的幾十年里，該領(lǐng)域的進(jìn)展有限，其作用機(jī)制和規(guī)律并沒(méi)有得到很好的理解。當(dāng)時(shí)人們還弄不明白細(xì)胞為什么要這樣做，以及我們?nèi)祟?lèi)細(xì)胞是否也存在這樣的行為。

直到上世紀(jì)90年代初，近30年過(guò)去，許多根本性問(wèn)題仍無(wú)法確認(rèn)：自噬過(guò)程是如何啟動(dòng)的？自噬體是如何形成的？自噬對(duì)細(xì)胞和有機(jī)體的存活有多重要？自噬在人類(lèi)疾病中扮演什么角色？大隅良典的工作顯著改變了人們對(duì)這一重要細(xì)胞過(guò)程的理解。

相關(guān)專(zhuān)家介紹，大隅良典的重要成就是利用酵母開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞自噬機(jī)制具有決定性意義的基因。基于這一研究成果，他隨后又闡明了自噬機(jī)制的原理，并證明人類(lèi)細(xì)胞也擁有相同的自噬機(jī)制。

20世紀(jì)90年代，大隅良典帶領(lǐng)其研究團(tuán)隊(duì)以酵母菌作為生物細(xì)胞的模板在研究細(xì)胞自噬的啟動(dòng)和進(jìn)展過(guò)程獲得重大突破，證明了酵母菌內(nèi)存在細(xì)胞自噬現(xiàn)象，找到了識(shí)別和描述細(xì)胞自噬過(guò)程中重要基因的方法，并確認(rèn)了細(xì)胞自噬機(jī)制上的15個(gè)起關(guān)鍵作用的基因。

大隅良典用面包酵母作為模型系統(tǒng)研究自噬，在檢驗(yàn)了酵母細(xì)胞中確實(shí)存在自噬現(xiàn)象后，他開(kāi)發(fā)出一種方法，能夠識(shí)別和鑒定涉及這些過(guò)程的關(guān)鍵基因，他將第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的突變基因命名為自噬基因1（APG1），隨后報(bào)告了一系列真核細(xì)胞自噬機(jī)制必不可少的基因，命名為APG1-APG15。隨著在酵母和其他物種中鑒定出的新自噬基因，ATG作為基因縮寫(xiě)命名在此后的學(xué)術(shù)研究中得到統(tǒng)一使用。

1993年，大隅良典發(fā)表了他在酵母15個(gè)基因中的開(kāi)創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)。隨后，他在酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中克隆了這些基因并闡明了編碼蛋白質(zhì)的功能。

在接下來(lái)的幾年中，大隅良典克隆了ATG基因，并描述了一系列蛋白質(zhì)產(chǎn)物的功能，包括在實(shí)驗(yàn)室證明自噬能參與調(diào)解細(xì)胞物質(zhì)合成、降解和重新利用之間的代謝平衡，影響生物生命過(guò)程特別是響應(yīng)饑餓等方面的作用。

基于大隅良典的開(kāi)創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)，自噬在人體生理和疾病中的重要性現(xiàn)在獲得了廣泛認(rèn)可。同時(shí)，大隅良典的先驅(qū)性研究激起科學(xué)家對(duì)自噬的巨大興趣。該領(lǐng)域已成為生物醫(yī)學(xué)研究的最熱門(mén)領(lǐng)域之一，自2000年起相關(guān)出版物的數(shù)量顯著增加。

2001年，東京大學(xué)的生物化學(xué)與分子生物學(xué)教授Noboru Mizushima報(bào)道了Atg5的功能，這被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物分子機(jī)制研究的第一環(huán)。2003年，以酵母的自噬相關(guān)基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了統(tǒng)一命名，以“autophagy”中的字母ATG命名，后面加數(shù)字以區(qū)分不同的基因。2005年，密歇根大學(xué)生物化學(xué)家的Daniel Klionsky創(chuàng)辦了第一本自噬雜志。2016年，東京大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了Atg13在自噬啟動(dòng)復(fù)合物中起到重要調(diào)節(jié)作用。

如何通過(guò)細(xì)胞自噬機(jī)制治療疾病

感謝研究者Yoshinori Ohsumi和其它從事后續(xù)研究的科學(xué)家們，如今我們知道，自噬能夠控制細(xì)胞中重要的生理學(xué)功能，細(xì)胞中的組分需要被降解并且回收利用，而自噬作用就能夠快速提供能量并且為細(xì)胞組分的回收利用提供基本的構(gòu)件，同時(shí)自噬對(duì)于細(xì)胞對(duì)饑餓及其它壓力的反應(yīng)也至關(guān)重要。

自噬過(guò)程是將細(xì)胞內(nèi)代謝廢物以及一些無(wú)用或有損傷的細(xì)胞器裝到其獨(dú)特的運(yùn)輸工具――自噬小體中，然后沿著特定路線送到“垃圾加工廠”――溶酶體中進(jìn)行回收和廢物再利用。

通過(guò)自噬，細(xì)胞可以實(shí)現(xiàn)以下幾種情況的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)：（1）在細(xì)胞能量匱乏時(shí)降解自身的非必需成分來(lái)提供營(yíng)養(yǎng)和能量；（2）降解細(xì)胞內(nèi)的毒性成分以阻止細(xì)胞損傷和凋亡；（3）在饑餓、缺氧或細(xì)胞損傷等特殊情況下啟動(dòng)應(yīng)對(duì)壓力的促存活通路。與細(xì)胞凋亡相比，細(xì)胞自噬更接近于逆境中的自救措施，維持了細(xì)胞的基本生命活動(dòng)。

在細(xì)胞面對(duì)饑餓和其它種類(lèi)的應(yīng)激時(shí)，“自噬”發(fā)揮著不可或缺的作用，好比“食堂”、 “凈化器”、 “兵工廠”、 “垃圾回收站”?！笆程谩保杭?xì)胞自噬能快速提供燃料供應(yīng)能量，或者提供材料來(lái)更新細(xì)胞部件?！皟艋鳌保河醒芯堪l(fā)現(xiàn)，在腫瘤發(fā)展的早期，“自噬作用”通過(guò)減少細(xì)胞內(nèi)“垃圾”（過(guò)氧化物）而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，抑制腫瘤形成。相反自噬功能降低，會(huì)增加致癌風(fēng)險(xiǎn)?！氨S”：在遭受感染之后，細(xì)胞自噬能消滅入侵的細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌活病毒?！袄厥照尽保杭?xì)胞還能利用自噬來(lái)消滅受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，這個(gè)質(zhì)檢過(guò)程對(duì)于抵抗衰老帶來(lái)的負(fù)面影響有舉足輕重的意義。

“自噬”是把雙刃劍，由“自噬基因”來(lái)掌控。如果自噬功能紊亂可能會(huì)引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)疾病、自身免疫病、衰老、感染甚至是惡性腫瘤。而即使自噬功能正常，也可能對(duì)人體不利。當(dāng)癌癥患者接受了放化療后，自噬系統(tǒng)可能救活奄奄一息的癌細(xì)胞，使癌癥無(wú)法根治。偶爾它可能又會(huì)熱心過(guò)度，去除一些重要細(xì)胞，完全不理會(huì)這樣做是否符合生物體的整體利益。所以掌管著“自噬”各個(gè)階段的“自噬基因”就顯得尤為重要了，人們也正在進(jìn)行緊張的研究以開(kāi)發(fā)藥物，希望能夠自由地掌控這把“雙刃劍”。

近年來(lái)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬作用與生物發(fā)育以及許多人類(lèi)疾病，如衰老、腫瘤、感染與免疫、心血管疾病、肌肉病變及神經(jīng)退化性疾病等密切相關(guān)。 應(yīng)該說(shuō)細(xì)胞自噬受到熱捧的一個(gè)很重要原因就在于其與疾病的關(guān)聯(lián)。復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院內(nèi)分泌科的研究指出，作為基礎(chǔ)性研究的“自噬”會(huì)從多方面對(duì)相關(guān)研究產(chǎn)生影響。

針對(duì)癌癥的治療

自噬在治療癌癥的方面有很大前景，如果細(xì)胞的自噬系統(tǒng)出了問(wèn)題，正常細(xì)胞可能會(huì)轉(zhuǎn)化成癌細(xì)胞。如果我們能知道怎么控制細(xì)胞自噬過(guò)程，也許就能讓一些早期癌變的細(xì)胞通過(guò)加劇自噬的程度，讓這些細(xì)胞凋亡以免發(fā)展成為癌癥；另外還可以通過(guò)抑制癌癥細(xì)胞的自噬，配合其他綜合干預(yù)措施后，癌癥細(xì)胞就會(huì)因?yàn)槿狈I(yíng)養(yǎng)而死掉。

針對(duì)包括帕金森癥在內(nèi)的一些神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的治療

人體的神經(jīng)細(xì)胞不可再生，自打出生以后就是那么多，所以神經(jīng)細(xì)胞能不能長(zhǎng)壽，自噬細(xì)胞起到了關(guān)鍵作用。如果不能有效清除垃圾，就有可能造成帕金森氏病、阿爾茲海默癥，這些病都跟神經(jīng)細(xì)胞的不正常死亡有關(guān)。如果有辦法可以控制神經(jīng)細(xì)胞的自噬過(guò)程，那么就可以及時(shí)清除神經(jīng)系統(tǒng)的垃圾，從而延緩、改善甚至逆轉(zhuǎn)疾病。

2013年的一項(xiàng)研究就指出一種與細(xì)胞自噬作用相關(guān)的基因若出現(xiàn)異常，會(huì)導(dǎo)致一種罕見(jiàn)的腦病。這種罕見(jiàn)腦病被稱(chēng)作“伴隨成人期神經(jīng)退行性變性的兒童期靜態(tài)腦病”（SENDA），患者大腦萎縮并伴隨認(rèn)知障礙。當(dāng)時(shí)參與研究的科學(xué)家指出，自噬作用的異常，比如負(fù)責(zé)運(yùn)送蛋白到溶酶體的自噬CMA過(guò)程出了問(wèn)題，都有可能導(dǎo)致認(rèn)知障礙。

針對(duì)糖尿病的治療

有觀點(diǎn)認(rèn)為，絕大多數(shù)1型糖尿病是一種病毒感染后導(dǎo)致的胰島細(xì)胞自噬凋亡，而2型糖尿病則是人體脂肪細(xì)胞受到了某種刺激后出現(xiàn)了一種自噬分化現(xiàn)象，所以如果能夠進(jìn)一步搞清楚自噬調(diào)控機(jī)制，就有可能為防治糖尿病提供嶄新的思路。

針對(duì)病毒和細(xì)菌感染的治療

病毒和細(xì)菌的感染是造成人類(lèi)生病與死亡的主要原因，如果這些“侵略者”在細(xì)胞膜外面，免疫細(xì)胞就可以來(lái)對(duì)付他們，但如果像病毒那樣，入侵到細(xì)胞內(nèi)部了，自噬過(guò)程或能保護(hù)細(xì)胞，集中精力攻擊病毒本身。有研究人員嘗試用自噬機(jī)制治療肺結(jié)核。

抗衰老

人體的衰老目前看來(lái)也是一種自噬受抑制現(xiàn)象，如果能夠激發(fā)或者重建人體細(xì)胞的自噬，那么就能夠完成細(xì)胞層面上的新陳代謝過(guò)程。

細(xì)胞自噬的典型特征是形成自噬體并呈遞給溶酶體，這一過(guò)程在蛋白質(zhì)和細(xì)胞器質(zhì)量控制中起基礎(chǔ)作用并維持了細(xì)胞能量的穩(wěn)態(tài)。一些研究表明，自噬與細(xì)胞衰老密切相關(guān)，參與蛋白酶和自噬相關(guān)調(diào)節(jié)的BAG蛋白家族中BAG3/BAG1比值在復(fù)制性衰老時(shí)增高，且BAG3在細(xì)胞衰老時(shí)能介導(dǎo)自噬的激活。研究還發(fā)現(xiàn)在Ras誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老進(jìn)程中亦可觀察到較高的自噬活性。

細(xì)胞中的受損蛋白質(zhì)積累是生物體衰老的一個(gè)重要特征。而細(xì)胞自噬可以擔(dān)任一個(gè)合格的“質(zhì)檢員”，消滅受損的蛋白質(zhì)，以對(duì)抗衰老帶來(lái)的負(fù)面影響。大隅良典的研究成果讓人們明白了細(xì)胞自噬的關(guān)鍵基因和運(yùn)作機(jī)制，有助于人類(lèi)更好了解細(xì)胞如何實(shí)現(xiàn)自身的循環(huán)利用，從而找到抗衰老的辦法。

自噬作用可能還能延長(zhǎng)壽命

很多人都認(rèn)為，許多疾病的發(fā)病幾率，都會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而升高。這可能是因?yàn)?，年齡增大后，自噬作用的效率降低了。最新研究顯示，如果能阻止自噬作用的效率降低，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)就不會(huì)有受損蛋白或細(xì)胞器的累積。

總之，自噬作用不但是細(xì)胞在養(yǎng)分不足時(shí)產(chǎn)生的應(yīng)急反應(yīng)，也是影響人類(lèi)健康的重要因素。對(duì)于自噬作用，很多科學(xué)家開(kāi)始從多個(gè)角度進(jìn)行研究，對(duì)認(rèn)識(shí)也在不斷深入。了解如何控制自噬作用，對(duì)于治療疾病甚至延緩衰老進(jìn)程，都具有重大意義。

細(xì)胞自噬相關(guān)的增長(zhǎng)點(diǎn)及投資熱點(diǎn)

細(xì)胞自噬概念已經(jīng)提出了相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，自噬機(jī)制的研究一直是生命科學(xué)的熱門(mén)領(lǐng)域，不過(guò)，相關(guān)研究目前在臨床應(yīng)用方面還并不明朗。

雷帕霉素（西羅莫司）現(xiàn)已被科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，是激活細(xì)胞自噬重要的化學(xué)分子，能誘發(fā)細(xì)胞自噬作用。研究表明，雷帕霉素（西羅莫司）能通過(guò)抑制靶蛋白（mTOR），激酶的活性從而激活細(xì)胞自噬。在阿爾茨海默和帕金森病小鼠模型中，應(yīng)用雷帕霉素治療能降低β淀粉樣蛋白的水平、提高對(duì)β淀粉樣蛋白聚集體的清除、抑制Tau蛋白過(guò)磷酸化等，但是目前雷帕霉素（西羅莫司）還沒(méi)有被批準(zhǔn)應(yīng)用于人體細(xì)胞自噬異常相關(guān)適應(yīng)癥。

作為一種有效的自噬誘導(dǎo)劑，雷帕霉素（西羅莫司）通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬從而減輕炎癥反應(yīng)，可能是其可以發(fā)揮免疫抑制的機(jī)制之一。目前雷帕霉素的衍生品已經(jīng)獲得批準(zhǔn)用于治療某些癌癥：腎癌、肺癌和乳腺癌。近10多年來(lái)，研究證明它不僅可延緩與衰老相關(guān)的疾病，如癌癥、心臟病和老年癡呆癥的病程進(jìn)展，延長(zhǎng)壽命，還能推延正常衰老所帶來(lái)的多種影響。

在臨床轉(zhuǎn)化方面，研究人員開(kāi)發(fā)細(xì)胞自噬治療疾病的首個(gè)化學(xué)藥物是雷帕霉素（Rapamycin），這是一種經(jīng)典的自噬誘導(dǎo)劑，可以通過(guò)抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）促進(jìn)自噬的發(fā)生。雷帕霉素（Rapamyein）作為一種免疫抑制藥，當(dāng)人體移植了新的腎臟或其他器官后，會(huì)自然產(chǎn)生排異，而它能抑制這種反應(yīng)。

自1999年，美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)雷帕霉素作為器官移植患者的藥物，迄今已拯救了數(shù)以萬(wàn)計(jì)的移植患者的生命。此外，它還被應(yīng)用于多種用途，如藥廠用于心臟支架的涂層材料上，用于防止產(chǎn)生癲痕組織，出現(xiàn)再狹窄。

作為全球最具權(quán)威性和影響力的獎(jiǎng)項(xiàng)，諾貝爾獎(jiǎng)對(duì)科技發(fā)展的引導(dǎo)作用非常明顯，這對(duì)于著重于相關(guān)技術(shù)研發(fā)的公司來(lái)說(shuō)是個(gè)利好。細(xì)胞自噬相關(guān)藥物雷帕霉素（西羅莫司）生產(chǎn)企業(yè)首先將直接受益。

雷帕霉素原研廠家是惠氏（后被輝瑞收購(gòu)），目前已被批準(zhǔn)用于防止腎移植手術(shù)后的器官排斥反應(yīng)等。國(guó)內(nèi)獲得西羅莫司生產(chǎn)批文的企業(yè)包括華北制藥、浙江醫(yī)藥、華東醫(yī)藥、海正藥業(yè)和福建科瑞藥業(yè)。不過(guò)，據(jù)了解，目前西羅莫司作為一種免疫抑制劑藥物使用，主要是提供給器官移植手術(shù)的器官接受者，西羅莫司現(xiàn)在還沒(méi)有被批準(zhǔn)用于細(xì)胞自噬異常相關(guān)疾病的治療或者預(yù)防。

篇3

[關(guān)鍵詞] 心肌細(xì)胞；心肌肥大；番茄紅素；血管緊張素Ⅱ；自噬相關(guān)基因

[中圖分類(lèi)號(hào)] R542.22 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2013）11（c）-0011-04

The effect of lycopene on autophagy in cardiac hypertrophy induced by angiotensin Ⅱ

WANG Haining LI Jilin YAO Huaiqi YANG Baojun XU Tan

The First Affiliated Hospital of Shantou University， Guangdong Province， Shantou 515041， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of lycopene on autophagy in cardiac hypertrophy induced by angiotensin Ⅱ （AngⅡ）. Methods Cardiac hypertrophy was induced by AngⅡ incultured neonatal rat cardiomyocytes. Morphology and expression of hypertrophy marker atrial natriuretic peptide （ANP） were detected by optical microscope and Real time PCR. Protein level of Atg6 （Beclin1） and autophagic marker， LC3 were tested by western blotting. Results Lycopene down regulated cell surface area [（355.82±40.45） vs （517.19±52.31）， F = 56.518， P < 0.05] and RNA expression of ANP [（12.16±1.41） vs （17.83±2.07）， F = 157.048， P < 0.05] in cardiac hypertrophy induced by AngⅡ. Lycopene increased expression of autophagy related gene Beclin1 [（0.685±0.058）， F = 202.873， P < 0.05] and LC3 protein [（0.608±0.045）， F = 177.114， P < 0.05]. Blocking autophagy by 3-MA could significantly reduce the impact of lycopene on myocardial hypertrophy induced by AngⅡ（P < 0.01）. Conclusion Lycopene may inhibit myocardial hypertrophy by activating autophagy.

[Key words] Cardiomyocyte； Cardiac hypertrophy； Lycopene； Angiotensin Ⅱ； Autophagy related gene

番茄紅素（lycopene，Lyc）是一種廣泛存在于紅色水果和蔬菜中的天然生物色素，屬于類(lèi)胡蘿卜素一族，因最早發(fā)現(xiàn)于番茄中而得名[1]。目前國(guó)內(nèi)外大量的研究證明Lyc不僅有極強(qiáng)的抗氧化能力[2]，還具有抑制炎癥因子表達(dá)、抗癌、預(yù)防衰老等多種生物學(xué)效應(yīng)[3-4]。雖然，近年來(lái)有少量關(guān)于Lyc可以防治心血管疾病、抗缺血缺氧、抑制動(dòng)脈粥樣硬化等文獻(xiàn)報(bào)道[5-6]，但到目前為止，未見(jiàn)有關(guān)于其在心肌肥大方面的作用和機(jī)制的研究。因此，探索其內(nèi)在的作用機(jī)制對(duì)于尋找預(yù)防和控制高血壓等心臟肥大疾病的臨床有效治療具有重要的意義。

心肌肥大的本質(zhì)是細(xì)胞合成代謝與分解代謝的失衡，機(jī)體主宰分解代謝的途徑主要有自噬。自噬（autophagy，Atg）是廣泛存在于真核細(xì)胞中一個(gè)保守的生物學(xué)現(xiàn)象，它是通過(guò)包裹待降解物形成自噬體，然后與溶酶體結(jié)合進(jìn)行多種酶的消化及降解，參與機(jī)體受損細(xì)胞器和蛋白質(zhì)的清除，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要方式[7]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（tiny tubes related proteins 1 light chain 3，LC3）是自噬的特異性蛋白，分為胞質(zhì)型LC3-Ⅰ和膜型LC3-Ⅱ，后者是LC3的活性形式[8]。在既往的研究中[9]，筆者已經(jīng)證實(shí)在心肌肥大中自噬受到抑制，阻斷自噬會(huì)促進(jìn)心肌肥大的發(fā)展，而Lyc是否對(duì)心肌肥大產(chǎn)生作用，其作用是否與自噬相關(guān)尚未明確；本研究旨在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥大中明確Lyc的作用，探討Lyc和自噬的關(guān)系。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SD乳鼠，清潔級(jí)，1～2日齡，汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（SCXK粵2012-0017）。

1.2 主要試劑

DMEM-F12培養(yǎng)基（SH30023.01B）和胎牛血清（SV30087.01）（Hyclone）；胰蛋白酶（25200056）和Ⅰ型膠原酶（B1067）（Gibco）；5-溴脫氧尿嘧啶核苷BrdU（B5002），血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）（A9525）和3-甲基腺嘌呤3MA（M9281）（Sigma）；Lyclycopene（L9879-10MG）（Sigma-Aldrich）；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 LC3 Ⅰ/Ⅱ抗體（3868s），Bclin1抗體（3738s）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶GADPH（2118s）（Cell Signaling Technology）；羊抗兔IgG-HRP（SA00001-2）（PTG，proteintech group），免疫印跡發(fā)光液（WBKLS0100）（Millipore），四氫呋喃（THF）（tetrahydrofuran）和2，6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT）（butylated hydroxytoluene）（上海寶曼生物科技有限公司）；無(wú)核酶水（9012），逆轉(zhuǎn)錄酶（DR100A），RNA酶抑制劑+脫氧核糖核苷酸混合物（RR02MA）（Takara）。

2 方法

2.1 原代心肌細(xì)胞分離和培養(yǎng)

消毒乳鼠，開(kāi)胸取心臟，用D-Hank's溶液去血污，分離心室。置入離心管，剪碎1 mm3大小，加入0.125%的胰酶37℃消化10 min，棄上清，放入0.05%Ⅰ型膠原酶，37℃振蕩消化2 h。用上述胰酶重復(fù)消化1～2次，每次約6 min。將細(xì)胞懸液集中放入含10%胎牛血清培養(yǎng)基，均勻接種到培養(yǎng)皿，放置于5% CO2的培養(yǎng)箱60 min以分離成纖維細(xì)胞。以1×106/mL密度接種于6孔板，加入100 U/mL鏈霉素和青霉素防止污染，及0.1 mmol/L的Brdu抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，最后放入50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。接種24 h后80%的細(xì)胞生長(zhǎng)成片并有規(guī)律搏動(dòng)時(shí)，換無(wú)血清DMEM處理24 h后分組干預(yù)。在予以Lyc處理前，先將Lyc溶解于含有0.025%丁基羥基甲苯（BHT）的四氫呋喃。其在培養(yǎng)基中的濃度控制在0.05%（V/V），不會(huì)影響細(xì)胞活性。

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組

首先在AngⅡ（1 μmol/L）誘導(dǎo)的心肌肥大中，觀察Lyc（5 μmol/L）對(duì)細(xì)胞的作用，將心肌細(xì)胞分為四組進(jìn)行干預(yù)：對(duì)照組、AngⅡ組、AngⅡ+Lyc組（5 μmol/L）和Lyc組（5 μmol/L）；于48 h檢測(cè)心肌肥大的標(biāo)志物ANP的mRNA表達(dá)水平。為觀察心肌肥大時(shí)Lyc（5 μmol/L）對(duì)自噬相關(guān)基因Beclin1和LC3蛋白的影響，將心肌細(xì)胞分為四組進(jìn)行干預(yù)：對(duì)照組、AngⅡ組、AngⅡ+Lyc組（5 μmol/L）和AngⅡ+Lyc（5 μmol/L）組+3-MA（5 μmol/L）組；于48 h以Western blot法測(cè)定Beclin1和LC3蛋白的水平。

2.3 細(xì)胞鏡檢

用AngⅡ和（或）Lyc干預(yù)48 h的心肌細(xì)胞以4% PFA固定，顯微鏡400倍拍照，每組取50個(gè)同樣大小視野，利用圖像分析軟件Image pro plus 6.0計(jì)算細(xì)胞面積[9]。

2.4 Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)

冰上裂解細(xì)胞30 min，收取蛋白。取總蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白以80 V，100 min轉(zhuǎn)至PVDF膜上；用50 g/L的BSA封閉1 h，加LC3B抗體（1∶1000）、GADPH抗體（1∶10 000）4℃孵育過(guò)夜；次日用TBST洗膜，與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體（1∶10 000）室溫孵育1 h；用ECL顯影、曝光。采用圖像分析軟件檢測(cè)蛋白條帶的灰度值，LC3Ⅱ與LC3Ⅰ條帶的比值代表LC3蛋白的表達(dá)水平，其余以GAPDH作為參照[9]。

2.5 實(shí)時(shí)定量PCR

常規(guī)Trizol裂解法提取mRNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。參照文獻(xiàn)[9]做標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量PCR體系。在Roche PCR分析儀器里擴(kuò)增目的基因，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，然后94℃ 15 s，55℃ 45 s，72℃ 60 s，共30循環(huán)，72℃ 6 min。反應(yīng)結(jié)束后，使用PCR儀配套軟件進(jìn)行分析。重復(fù)3次，數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。引物序列：ANP：上游引物5'-TGAGCCGAGACAGCAAACATC-3'，下游引物5'-AGGCCAGGAAGAGGAAGAAG C-3'；GAPDH：上游引物5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3'，下游引物5'-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組之間的差異用One-way ANOVA比較均值的單因素分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 Lyc在AngⅡ誘導(dǎo)心肌肥大中的作用

本研究從心肌細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞面積及心肌肥大標(biāo)志物水平這三個(gè)方面，明確Lyc在AngⅡ誘導(dǎo)心肌肥大中的作用。將心肌細(xì)胞分為四組進(jìn)行干預(yù)：對(duì)照組、AngⅡ組、AngⅡ+Lyc（5 μmol/L）和Lyc（5 μmol/L）組；結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，AngⅡ刺激48 h后細(xì)胞面積增大（P < 0.01），心肌肥大標(biāo)志物ANP的mRNA水平上調(diào)（P < 0.01）；Lyc結(jié)合AngⅡ干預(yù)，細(xì)胞大小和面積明顯減?。≒ < 0.05），ANP的mRNA比值顯著下降（P < 0.05）；而用Lyc本身對(duì)心肌細(xì)胞大小和形態(tài)無(wú)明顯作用（P > 0.05），ANP的mRNA比值無(wú)顯著影響（P > 0.05）（圖1、表1）。提示Lyc可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。

與對(duì)照組比較，**P < 0.01；與AngⅡ組比較，*P < 0.05

圖1 Lyc在AngⅡ誘導(dǎo)心肌肥大中的作用

表1 四組大鼠心肌細(xì)胞面積和ANPmRNA測(cè)定結(jié)果比較

（x±s，n = 5）

注：與對(duì)照組比較，**P < 0.01；與AngⅡ組比較，#P < 0.05

3.2 在心肌肥大中Lyc對(duì)自噬的作用

為明確在心肌肥大中Lyc對(duì)自噬的作用，將細(xì)胞分為四組：對(duì)照組、AngⅡ組、AngⅡ+Lyc組（5 μmol/L）和AngⅡ+Lyc（5 μmol/L）組+3-MA（5 μmol/L）組；于48 h以Western blot法測(cè)定Beclin1和LC3蛋白的水平，LC3Ⅱ/Ⅰ反應(yīng)自噬活性。結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，AngⅡ干預(yù)48 h后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin1的蛋白水平下降（P < 0.05），加入Lyc干預(yù)后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin1的蛋白水平有所增加（P < 0.05），而使用3-MA后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin1的蛋白水平迅速下降（P < 0.01）；3-MA（5 μM）對(duì)細(xì)胞本身無(wú)影響（圖2、3，表2）。

與對(duì)照組比較，*P < 0.05；與AngⅡ組比較，#P < 0.05；與AngⅡ+Lyc組比較，**P < 0.01

圖2 在心肌肥大中Lyc對(duì)LC3蛋白的影響

與對(duì)照組比較，*P < 0.05；與AngⅡ組比較，#P < 0.05；與AngⅡ+Lyc組比較，**P < 0.01

圖3 在心肌肥大中Lyc對(duì)Beclin1蛋白的影響

4 討論

從20世紀(jì)末人們發(fā)現(xiàn)服用Lyc能明顯降低前列腺癌的發(fā)病率至今，已有大量的流行病學(xué)調(diào)查、臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明Lyc具有極強(qiáng)的抗氧化能力，可以預(yù)防各種慢性疾病[8-10]。特別是在心血管疾病中，Lyc不僅可以降低血脂，降低收縮壓，減少心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，還能緩解缺血/再灌注損傷[11-12]。但對(duì)于其是否有抑制心肌肥大的作用及相關(guān)機(jī)制，目前國(guó)內(nèi)尚未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首次在心肌肥大的模型上探討Lyc的作用和與自噬之間的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)觀察到，AngⅡ干預(yù)心肌細(xì)胞后細(xì)胞面積明顯增大、心肌肥大標(biāo)志物心房利鈉多肽（ANP）明顯上升，說(shuō)明AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞肥大模型成功；然后加入Lyc干預(yù)發(fā)現(xiàn)，Lyc減少了AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞面積的增大，降低了ANP的升高，在一點(diǎn)程度上對(duì)心肌肥大起到了抑制作用。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞肥大中伴有自噬相關(guān)基因Beclin1和LC3蛋白表達(dá)的下降，而Lyc的干預(yù)卻促進(jìn)了自噬相關(guān)基因Beclin1和LC3蛋白的表達(dá)。利用自噬阻斷劑3MA降低了Lyc對(duì)心肌細(xì)胞肥大的抑制作用，提示Lyc可能通過(guò)激活自噬來(lái)抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥大。

自噬在心臟中的作用存在著爭(zhēng)議。早在20世紀(jì)80年代，人們就發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成增加和細(xì)胞肥大的同時(shí)，伴隨著自噬水平的降低[13]。21世紀(jì)初Nakai等[14]在橫主動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)的早期心肌肥大模型中發(fā)現(xiàn)，自噬水平明顯低于假手術(shù)組，提示心肌肥大代償期，自噬活性顯著下降；此外亦有文獻(xiàn)報(bào)道自噬的激活劑雷帕霉素可以阻斷由主動(dòng)脈縮窄[15]、甲狀腺激素[16]引起的心肌肥大，并且逆轉(zhuǎn)已經(jīng)存在的心肌肥大[17]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO3可通過(guò)上調(diào)自噬水平，使心肌肥大的心臟體積縮小[18]。目前關(guān)于Lyc對(duì)自噬的作用在心臟病中的研究是空白。筆者前期實(shí)驗(yàn)表明自噬對(duì)于AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥大發(fā)展可能起抑制作用[9]。本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平上明確了Lyc具有抗心肌肥大和提高自噬水平的作用，而阻斷自噬會(huì)明顯降低Lyc對(duì)細(xì)胞肥大的影響，提示自噬可能是Lyc抑制心肌肥大的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，而Lyc是如何調(diào)控自噬，其具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究和探索。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Conn PF，Schalch W，Truscott TG. The singlet oxygen and carotenoid interaction [J]. J Photochem Photobiol B，1991，11（1）：41-47.

[2] Miller NJ，Sampson J，Candeias LP，et al. Antioxidant activities of carotenes and xanthophylls [J]. FEBS Lett，1996，384（3）：240-242.

[3] Simone RE，Russo M，Catalano A，et al. Lycopene inhibits NF-kB-mediated IL-8 expression and changes redox and PPAR gamma signalling in cigarette smoke-stimulated macrophages [J]. PLoS ONE，2011，6（5）：e19652.

[4] Kang M，Park KS，Seo JY，et al. Lycopene inhibits IL-6 expression in cerulein-stimulated pancreatic acinar cells [J]. Genes Nutr，2011，6（2）：117-123.

[5] Shukla SK，Gupta S，Ojha SK，et al. Cardiovascular friendly natural products：a promising approach in the management of CVD [J]. Nat Prod Res，2010，24（9）：873-898.

[6] Lo HM，Hung CF，Tseng YL，et al. Lycopene binds PDGF-BB and inhibits PDGF-BB-induced intracellular signaling transduction pathway in rat smooth muscle cells [J]. Biochem Pharmacol，2007，74（1）：54-63.

[7] Shintani T，Klionky DJ. Autophagy in health and disease：a double-edged sword [J]. Science，2004，306（5698）：990-995.

[8] Huang WP，Klionsky DJ. Autophagy in yeast：a review of the molecular machinery [J]. Cell Struct Funct，2002，27（6）：409-420.

[9] 汪海寧，劉晨，李燕輝，等.自噬在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大中的作用[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)科學(xué)版，2012，33（4）：440-443.

[10] Giovannucci E，Ascherio A，Rimm EB，et al. Intake of carotenoids and retinol in relation to risk of prostate cancer [J]. J Natl Cancer Inst，1995，87（23）：1767-1776.

[11] Hu MY，Li YL，Jiang CH，et al. Comparison of lycopene and fluvastatin effects on atherosclerosis induced by a high-fat diet in rabbits [J]. Nutrition，2008，24（10）：1030-1038.

[12] Hekimoglu A，Kurcer Z，Aral F，et al. Lycopene，an antioxidant carotenoid，attenuates testicular injury caused by ischemia/reperfusion in rats [J]. Tohoku J Exp Med，2009，218（2）：141-147.

[13] Pfeifer U，F(xiàn)ohr J，Wilhelm W，et al. Short-term inhibition of cardiac cellular autophagy by isoproterenol [J]. J Mol Cell Cardiol，1987，19（12）：1179-1184.

[14] Nakai A，Yamaguchi O，Takeda T，et al. The role of autophagy in cardiomyocytes in the basal state and in response to hemo-dynamic stress [J]. Nat Med，2007，13（5）：619-624.

[15] Ha T，Li Y，Gao X，et al. Attenuation of cardiac hypertrophy by inhibiting both mTOR and NF kappaB activation in vivo [J]. Free Radic Biol Med，2005，39（12）：1570-1580.

[16] Kuzman JA，O'Connell TD，Gerdes AM. Rapamycin prevents thyroid hormone-induced cardiac hypertrophy [J]. Endocrinology，2007，148（7）：3477-3484.

[17] McMullen JR，Sherwood MC，Tarnavski O，et al. Inhibition of mTOR signaling with rapamycin regresses established cardiac hypertrophy induced by pressure overload [J]. Circulation，2004，109（24）：3050-3055.

篇4

關(guān)鍵詞：自噬；凋亡；3-甲基腺嘌呤（3-MA）；順鉑（DDP）；骨肉瘤細(xì)胞

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1細(xì)胞來(lái)源 骨肉瘤MG63細(xì)胞購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2主要試劑 3-甲基腺嘌呤（3-MA）、二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）、單丹黃酰尸胺（MDC）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。Annexin-FITC/PI凋亡試劑盒購(gòu)于上海碧云天公司。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）、酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）、倒置熒光顯微鏡（德國(guó)LEICA公司）、低溫高速旋轉(zhuǎn)離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）、細(xì)胞培養(yǎng)孔板（美國(guó)NEST公司）。

1.4試劑配制

1.4.1 MDC溶液 將1 mg MDC粉末溶于1 mL無(wú)菌水中，可獲得3 mmol/L的MDC溶液，取上述溶液100 μL加到6 mL無(wú)菌水中，獲得實(shí)驗(yàn)用50 μmol/L的最終溶液，置于4℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 DDP溶液 取1 mL濃度為5 mg/mL的DDP，用無(wú)菌水稀釋到250 mL，即獲得20 μg/mL的DDP用于實(shí)驗(yàn)，4℃冰箱保存。

2實(shí)驗(yàn)分組

該實(shí)驗(yàn)分為4組：空白對(duì)照組（加入等量的培養(yǎng)液做對(duì)照）、3-MA組（僅添加濃度為12.5 μg/mL的3-MA）、DDP組（僅添加濃度為20 μg/mL的DDP）、3-MA+DDP組（12.5 μg/mL的3-MA和20 μg/mL DDP同時(shí)添加）。

3實(shí)驗(yàn)方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng) 骨肉瘤MG63細(xì)胞培養(yǎng)于提前配置好的含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，其中含有100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素。在濕度飽和的情況下，培養(yǎng)于5%CO2、37°的培養(yǎng)箱中，隔天換一次培養(yǎng)液，3 d傳代1次，取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)研究。

3.2 MTT比色法 外源性MTT在活細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶作用下能夠還原成藍(lán)紫色結(jié)晶甲，且該結(jié)晶物質(zhì)不溶于水，DMSO可使不溶于水的甲溶解，在490 nm波長(zhǎng)處可以用酶標(biāo)儀檢測(cè)光吸收值，在死亡細(xì)胞中不存在上述反應(yīng)過(guò)程，檢測(cè)不到吸光度值，從而可以用來(lái)比較不同組之間細(xì)胞增殖率。取細(xì)胞數(shù)為1×108個(gè)/L，種植于96孔板中，分別在每孔添加等量的細(xì)胞懸液，細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)10 h后根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組在3個(gè)組中加入相應(yīng)的藥物，在恒溫（37℃）5%CO2的環(huán)境下培養(yǎng)24 h后，將每孔加入等量的MTT溶液作用4 h，然后PBS溶液洗1遍，再加入等量的DMSO溶液，搖擺15 min，然后在酶標(biāo)儀上檢測(cè)不同組的吸光度值（A）。結(jié)合以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖率：細(xì)胞增殖率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A/對(duì)照組A）×100%。

3.3 MDC染色法 單丹黃酰尸胺（MDC）被細(xì)胞吸收后蓄積于嗜酸性的細(xì)胞囊泡中，在熒光顯微鏡下可以看到藍(lán)綠色或黃綠色點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)在細(xì)胞核周?chē)?，?jīng)常被用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞自噬囊泡的存在。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨肉瘤MG63細(xì)胞（細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)/mL）加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)12 h待細(xì)胞貼壁后根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)濃度的藥物繼續(xù)培養(yǎng)24 h，24 h后加入MDC溶液（濃度為50 μmol/L）避光環(huán)境中培養(yǎng)1 h，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定，用PBS洗滌，然后用倒置熒光顯微鏡觀察自噬空泡差異；同樣方法，經(jīng)相應(yīng)藥物處理24 h后，MDC染色、4%多聚甲醛固定，PBS洗滌，然后分別收集各組細(xì)胞（不能收集倒置熒光顯微鏡觀察過(guò)的細(xì)胞，以免影響細(xì)胞熒光強(qiáng)度），用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同組細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 磷脂酰絲氨酸位于正常細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但是在細(xì)胞凋亡的初期，磷脂酰絲氨酸從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，出現(xiàn)在細(xì)胞外環(huán)境中，也就是所謂的磷脂酰絲氨酸外翻。Annexin-V是一種分子量為35~36 KD的Ca2+依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白，能與磷脂酰絲氨酸高親和力特異性結(jié)合。 Annexin-FITC/PI凋亡試劑盒是用帶綠色熒光燈熒光探針FITC標(biāo)記的Annexin，直接用流式細(xì)胞儀檢測(cè)磷脂酰絲氨酸外翻這一細(xì)胞凋亡的重要特征，可以使壞死細(xì)胞呈綠色熒光。而碘化丙啶（PI）可以將壞死細(xì)胞和凋亡晚期失去細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞染成紅色。因正常細(xì)胞不被FITC和PI染色，所以二者結(jié)合可以較準(zhǔn)確檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。將細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)/mL的骨肉瘤MG63細(xì)胞種植于6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，結(jié)合試驗(yàn)分組加入相應(yīng)藥物干預(yù)24 h，然后分組收集、離心細(xì)胞，PBS洗滌，按照Annexin-FITC/PI凋亡試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，比較各組間差異。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件幫助下進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間差異用單因素方差分析進(jìn)行比較，取P

4結(jié)果

4.1 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖抑制率 MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，單獨(dú)添加3-MA對(duì)細(xì)胞增殖沒(méi)有明顯影響；單獨(dú)添加DDP細(xì)胞增殖率為（47.6±3.1）%；與單獨(dú)添加DDP相比，同時(shí)添加3-MA和DDP組細(xì)胞增殖率為（27.1±2.8）%，增殖率下降，P

4.2 MDC染色檢測(cè)細(xì)胞自噬 MDC染色后在細(xì)胞核周?chē)霈F(xiàn)黃綠色的自噬空泡，與單獨(dú)添加DDP組相比，3-MA和DDP同時(shí)添加組細(xì)胞自噬空泡較少。經(jīng)倒置熒光顯微鏡拍片后顯示，見(jiàn)圖1。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組熒光強(qiáng)度差異，結(jié)果提示：對(duì)照組為（83.1±8.2）%，單獨(dú)添加3-MA組為（89.8±9.5）%，單獨(dú)添加DDP組為（183.1±14.8）%，3-MA和DDP同時(shí)添加組為（121.5±10.4）%。3-MA和DDP同時(shí)添加組與單獨(dú)添加DDP組相比，P

圖1 不同組MDC染色后自噬空泡的變化

4.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)我們發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)添加3-MA組細(xì)胞凋亡率為（2.5±0.4）%；單獨(dú)添加DDP組為（12.5±1.1）%，與對(duì)照組相比，P

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率

5討論

骨肉瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性是決定治療效果的關(guān)鍵因素，據(jù)統(tǒng)計(jì)仍有10%~25%患者對(duì)化療反應(yīng)較差，根本原因在于對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性[1-2]。另外，臨床上不合理、不規(guī)范的使用化療藥物也可引起腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性，將嚴(yán)重影響治療效果。近些年多數(shù)研究[3-4]認(rèn)為骨肉瘤的耐藥性與多種腫瘤基因位點(diǎn)或傳導(dǎo)通路有關(guān)，如骨肉瘤的生長(zhǎng)、發(fā)展或耐藥性與信號(hào)傳導(dǎo)子STAT3通路的激活存在一定的相關(guān)性；腫瘤細(xì)胞對(duì)甲氨蝶呤耐藥與異位轉(zhuǎn)染miR-140存在聯(lián)系等。由于新的化療方案的實(shí)施，外加新的化療輔助藥物的應(yīng)用，能很大程度上控制骨肉瘤的發(fā)展，產(chǎn)生良好治療效果[5-6]。為了尋找更有效、更廣泛的腫瘤化療輔助藥物，自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤對(duì)腫瘤耐藥性的影響日益引起大家的關(guān)注[7-8]。

順鉑屬于細(xì)胞周期非特異性藥物，結(jié)構(gòu)類(lèi)似于雙功能烷化劑，在DNA復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮抑制作用。在骨肉瘤、肺癌、食管癌、卵巢癌等實(shí)體惡性腫瘤中應(yīng)用較廣泛。自噬是細(xì)胞通過(guò)自身來(lái)消除細(xì)胞內(nèi)部衰老或死亡細(xì)胞來(lái)維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的過(guò)程。3-甲基腺嘌呤可以通過(guò)抑制磷脂酰肌醇-3激酶（ClassⅢPI3K），阻止自噬體與溶酶體形成自噬溶酶體，進(jìn)而發(fā)揮抑制作用，是一種常見(jiàn)的自噬抑制劑，廣泛應(yīng)用于自噬相關(guān)基礎(chǔ)研究[9]。MDC是特異性自噬體標(biāo)記物，被MDC染色的細(xì)胞核周?chē)梢?jiàn)藍(lán)綠色或黃綠色點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，常用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞自噬囊泡[10]。

本研究結(jié)合臨床中順鉑在骨肉瘤化療中的應(yīng)用，借助自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤來(lái)說(shuō)明自噬在骨肉瘤化療過(guò)程中的作用。經(jīng)MTT比色法檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)3-MA+DDP組細(xì)胞增殖率明顯低于單獨(dú)添加DDP組，P

隨著人們對(duì)自噬與腫瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)制研究的深入，我們不難發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)控自噬可以克服腫瘤耐藥性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，為臨床獲得良好的治療效果提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，該研究也證實(shí)調(diào)控自噬在改進(jìn)腫瘤治療方案中有更寬闊的研究前景。但是如今，自噬抑制劑不能在臨床上應(yīng)用的主要原因主要有：①自噬在臨床上還沒(méi)有特異性的抑制劑，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的藥物還不能直接應(yīng)用于臨床。②在臨床上對(duì)自噬水平的檢測(cè)到目前為止還沒(méi)有一個(gè)客觀定量的方法，比如根據(jù)一個(gè)血液標(biāo)本或者腫瘤組織就可以檢測(cè)到自噬水平。這兩點(diǎn)也正是我們下一步繼續(xù)努力研究的方向。

參考文獻(xiàn)：

[1]Longhi A,Errani C,Depaolis M,et al.Primary bone osteosarcoma in the pediatric age:state of the art[J].Cancer Treat Rev,2006,32:423-436.

[2]Mehta RG,Murillo G,Naithani R,et al.Cancer chemoprevention by natural products:how far have we come[J].Pharm Res,2010,27:950-961.

[3]Lee JW,Kim KS,An HK,et al.Dendropanoxide induces autophagy through ERK1/2 activation in MG-63 human osteosarcoma cells and autophagy inhibition enhance dendropanoxide-induced apoptosis[J].PLoS One,2013,8:e83611.

[4]Funderburk SF,Wang QJ,Yue Z.The Beclin 1-VPS34 complex-at the crossroads of autophagy and beyond[J].Trends Cell Biol,2010,20:355-362.

[5]Bacci G,Longhi A,Fagioli F,et al.Adjuvant and neoadjuvant chemotherapy for osteosarcoma of the extremities:27 year experience at Rizzoli Institute,Italy[J].Eur J Cancer,2005,41:2836-2845.

[6］Tanida I,Ueno T,Kominami E.Human light chain 3-MAPI-LC3-B is cleaved at its carboxyl-teminal met121 to exposegiy 120 for lipidation and targeting to autophagosomal membranes[J].Biol Chem,2007,279:47004-47710.

[9]Kim HJ,Lee SG,Kim YJ,et al.Cytoprotective role of autophagy during paclitaxel-induced apoptosis in Saos-2 osteosarcoma cells[J].Int J Oncol,2013,42:1985-1992.

[7]Chiu HW,Lin W,Ho SY,et al.Synergistic effects of arsenic trioxide and radiation in osteosarcoma cells through the induction of both autophagy and apoptosis[J].Radiat Res,2011,175:547-560.

[8]Zhang Z,Shao Z,Xiong L,et al.Expression of Beclin1 in osteosarcoma and the effects of down-regulation of autophagy on the chemotherapeutic sensitivity[J].J Huazhang Univ Sci Technology Med Sci,2009,29:737-740.

篇5

基金項(xiàng)目：蘇州市2013年“科教興衛(wèi)”青年科技項(xiàng)目（KJXW2013026）

作者單位：215007 江蘇省蘇州， 蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院急診與重癥醫(yī)學(xué)科[陸件（在讀碩士研究生）、錢(qián)會(huì)銀（在讀碩士研究生）、劉勵(lì)軍、周保純、肖鹽]，心內(nèi)科[毛錦寧、安國(guó)印（在讀碩士研究生）]，血液科[芮明忠（在讀碩士研究生）]，檢驗(yàn)科[王濤（在讀碩士研究生）]；南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院電鏡教研室（朱昌來(lái)）

通信作者：劉勵(lì)軍，Email：

【摘要】目的 觀察亞低溫（MH）對(duì)心肺復(fù)蘇（CPR）后海馬神經(jīng)細(xì)胞活性氧（ROS）產(chǎn)生量和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）mRNA和自噬相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）表達(dá)的影響。方法 65只健康成年雄性SD大鼠隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分為2組：空白對(duì)照組（BC，n=5）；CPR組（n=60）。CPR組制作窒息法心肺復(fù)蘇模型，在自主循環(huán)恢復(fù)（ROSC）后再隨機(jī)分為2組：常溫CPR組（NT）和低溫CPR組（HT）。NT組在ROSC后保持37 ℃恒溫，HT組在ROSC后立即行低溫32 ℃干預(yù)4 h。根據(jù)觀察時(shí)點(diǎn)的不同，再將兩組CPR組隨機(jī)分2個(gè)亞組：即 ROSC后12 h和24 h組（NT-12，NT24，HT-12，HT-24）。到達(dá)觀察時(shí)點(diǎn)先對(duì)存活大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分（NDS），然后立即取雙側(cè)海馬組織，應(yīng)用流式法檢測(cè)大鼠海馬單細(xì)胞懸液ROS水平。利用透射電鏡觀察海馬神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞核和線粒體的超微結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)變化。利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)測(cè)定海馬神經(jīng)細(xì)胞caspase-3mRNA的表達(dá)水平；蛋白免疫印跡法（WB）測(cè)定海馬神經(jīng)細(xì)胞LC3蛋白水平。應(yīng)用SPSS 19.0軟件包，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間均數(shù)比較用成組t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。結(jié)果 60只大鼠中有44只（73%）成功ROSC，存活到觀察時(shí)點(diǎn)的有33只大鼠（55%）。NT和HT組各時(shí)點(diǎn)的NDS明顯低于BC組（F=8.107，P

【關(guān)鍵詞】亞低溫；心肺復(fù)蘇；活性氧；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；輕鏈3；自噬

The impact of mild hypothermia on the ROS and expression of caspase-3mRNA and LC3 of hippocampus nerve cells in rats after cardiopulmonary resuscitation Lu Jian， Qian Huiyin， Liu Lijun， Zhou Baochun， Xiao Yan， Mao Jinning， An Guoyin， Rui Mingzhong， Wang Tao， Zhu Changlai. Department of Emergency and Critical Care Medicine， The Second Affiliated Hospital of Soochow University， Suzhou， 215007， China

Corresponding author： Liu Lijun， Email：

【Abstract】Objective To observe the impact of mild hypothermia （MH） on the reactive oxygen species （ROS） and expression of cacpase-3mRNA and light chain 3 （LC3， a subunit of immunoglobulin） in hippocampus nerve cells of rats after cardiopulmonary resuscitation （CPR）. Methods A total of 65 healthy male Sprague Dawley （SD）rats were randomly（random number） divided into 2 groups： blank control group （n=5） and CPR group （n=60）. Cardiac arrest （CA） was induced in rats of CPR group by asphyxia. The survival rats after CPR were randomly（random number） divided into 2 groups： normothermia CPR group （NT） and hypothermia CPR group （HT）. Homeothermia of 37 ℃ was maintained in NT group after restoration of spontaneous circulation （ROSC）， and hypothermal intervention to 32 ℃ was carried out in HT group for 4 hours immediately after ROSC. Both NT group and HT group were then randomly divided to 2 subgroups 12 hours and 24 hours after ROSC （NT-12， NT-24， HT-12， HT-24 subgroups）. During observation， the neurological deficit （NDS） of rats was scored， then the bilateral hippocampi were obtained from rats' head， and monoplast suspension of fresh hippocampus tissue was made immediately to determine the level of intracellular ROS by flow cytometry. Transmission electron microscope was used to observe the ultrastructure changes of cellular nucleus and mitochondria. Reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） was used to determine the expression of caspase-3mRNA and Western-blotting （WB） was used to determine the level of LC3 in frozen hippocampus tissue. Measured data were analyzed with paired sample T test and One-Way ANOVA. Results Of 60 rats with CA， 44 were successfully resuscitated （73%） and 33 survived until the end of the experiment （55%）. The NDSs of rats in NT and HT groups were significantly reduced in comparison with BC group （F=8.107， P

【Key words】Mild hypothermia； Cardiopulmonary resuscitation； Reactive oxygen species； Caspase-3； LC3； Autophagy

隨著心肺復(fù)蘇（CPR）技術(shù)和急診醫(yī)學(xué)的發(fā)展，大多數(shù)心臟驟停（CA）患者能恢復(fù)自主循環(huán)，但均遺留有不同程度的神經(jīng)功能障礙，造成家庭和社會(huì)的巨大負(fù)擔(dān)[1]。神經(jīng)細(xì)胞凋亡是CA后存活患者神經(jīng)功能障礙的主要病理生理過(guò)程，如何預(yù)防和控制CA后腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展是減少繼發(fā)性神經(jīng)功能障礙的重要治療措施之一[2]。腦神經(jīng)細(xì)胞在缺血缺氧后凋亡的發(fā)生與細(xì)胞自噬程度密切相關(guān)[3]，這種自噬與凋亡的關(guān)系以及其調(diào)節(jié)機(jī)制尚需進(jìn)一步的明確。本研究采用窒息法大鼠心肺復(fù)蘇模型，來(lái)觀察亞低溫（mild hypothermia， MH）對(duì)CPR后大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞活性氧（reactive oxygen species， ROS）產(chǎn)生量和神經(jīng)功能的影響，并探討其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

采用雄性健康成年SD大鼠[由中科院上海動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究所提供，合格證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005，周齡16～18 周，體質(zhì)量（450±45）g，共65只；隨機(jī)（隨機(jī)數(shù)字法）分為兩組：空白對(duì)照組（BC，n=5）、CPR組（n=60）。BC組用3.6%水合氯醛（批號(hào)：120203，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）按10 mL/kg進(jìn)行腹腔內(nèi)注射麻醉后，氣管插管和股動(dòng)、靜脈置管，不建立窒息CPR模型，待穩(wěn)定后開(kāi)始計(jì)時(shí)，到達(dá)觀察時(shí)間點(diǎn)后進(jìn)行NDS，然后在麻醉狀態(tài)下處死大鼠取腦。CPR組在麻醉后，氣管插管和股動(dòng)、靜脈置管，并復(fù)制窒息大鼠CPR模型（詳見(jiàn)模型制備），待成功自主循環(huán)恢復(fù)（ROSC）后，再將大鼠分為常溫CPR組（NT）、低溫CPR組（HT）。NT組在ROSC后保持其體溫在

37.0 ℃，HT組在ROSC后立即予32 ℃低溫干預(yù)，持續(xù)4 h后開(kāi)始緩慢復(fù)溫至正常體溫。根據(jù)觀察時(shí)點(diǎn)的不同，再將上述CPR組大鼠隨機(jī)分為2個(gè)亞組，即ROSC后12和24 h組（NT-12，NT24，HT-12，HT-24）。

1.2 模型制備和神經(jīng)功能缺損評(píng)分

模型參照Idris等[4]所建立的方法進(jìn)行。用3.6%水合氯醛（10 mL/kg）腹腔注射麻醉，然后將大鼠固定于鋪有控溫毯（型號(hào)：MODLE6900，深圳瑞沃德公司）的操作臺(tái)上。大鼠氣管插管后用24 G套管針行股動(dòng)、靜脈置管，股動(dòng)脈置管成功后接壓力換能器。所有大鼠均行心電、肛溫及有創(chuàng)動(dòng)脈壓監(jiān)測(cè)（8導(dǎo)生物信號(hào)采集系統(tǒng)MD3000，安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）。操作完成后再穩(wěn)定5 min，期間予心肺復(fù)蘇裝置（型號(hào)：A-CPR-IIC，中山大學(xué)心肺腦復(fù)蘇研究所）機(jī)械通氣，心肺復(fù)蘇裝置參數(shù)如下：呼吸頻率100次/min、潮氣量6 mL/kg、吸氧體積分?jǐn)?shù)100%通氣1 min，然后將吸氧體積分?jǐn)?shù)改為21%繼續(xù)通氣4 min。采用呼氣末夾閉氣管導(dǎo)管模擬窒息，CA判定標(biāo)準(zhǔn)如下：收縮壓（SBP）≤25 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），并持續(xù)至心電圖呈直線。此后，開(kāi)始復(fù)蘇，予機(jī)械通氣 （呼吸頻率50次/min，潮氣量6 mL/kg，氧濃度100%）；同時(shí)，使用心肺復(fù)蘇裝置進(jìn)行胸外心臟按壓，頻率250次/min，按壓深度為大鼠胸廓前后徑的1/3。復(fù)蘇開(kāi)始10 s后，經(jīng)股靜脈注射腎上腺素（批號(hào)：120505，上海禾豐制藥有限公司）（0.01 mg/kg）。CPR后ROSC的標(biāo)志：出現(xiàn)自主心律和SBP≥60 mmHg，

并持續(xù)10 min以上[4]。復(fù)蘇前和復(fù)蘇時(shí)動(dòng)物肛溫均控制在（37.0±0.5）℃。HT組在復(fù)蘇后立即予控溫毯、冰袋和風(fēng)扇等降溫措施將肛溫降至32 ℃，持續(xù)4 h后再以0.5 ℃/h的速度緩慢復(fù)溫至37.0 ℃。到達(dá)觀察時(shí)點(diǎn)先按Geocadin等[5]的方法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分（neurological deficit scores， NDS），然后在麻醉下處死大鼠獲取海馬組織標(biāo)本。

1.3 檢驗(yàn)取材方法

CPR組大鼠在窒息前、ROSC后0.5 h和4 h均從股動(dòng)脈抽取0.5 mL動(dòng)脈血（取血后補(bǔ)充等量生理鹽水）行血?dú)夥治?。各組大鼠在到達(dá)觀察時(shí)間點(diǎn)之前均予5%GNS灌胃（10 mL/kg，1次/6 h），到達(dá)相應(yīng)的觀察時(shí)間點(diǎn)后，先對(duì)大鼠進(jìn)行NDS，然后在麻醉狀態(tài)下心內(nèi)注射10%氯化鉀2 mL處死大鼠，切開(kāi)胸骨，分離心包，暴露心臟，將穿刺針經(jīng)左心室送入升主動(dòng)脈，剪開(kāi)右心耳，經(jīng)心臟快速灌注4 ℃生理鹽水250 mL至右房流出液清，迅速斷頭取腦，分離雙側(cè)海馬。左側(cè)海馬切取2/3立即在冰上研磨制作單細(xì)胞懸液，剩余1/3行電鏡觀察；右側(cè)海馬-80 ℃凍存，用于caspase-3mRNA和LC3B表達(dá)的測(cè)定。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平

左側(cè)海馬取出后切取2/3在冰上用裝有冷PBS的玻璃勻漿器內(nèi)勻漿10次，經(jīng)300目尼龍過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液600×g 4 ℃離心5 min，棄上清，冷PBS重懸沉淀，反復(fù)吹打后再離心，重復(fù)上述操作3次，最后用冷PBS重懸沉淀，用活性氧檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：S0033，碧云天生物技術(shù)研究所）中的DCFH-DA按1∶1000的濃度裝載探針，37 ℃孵育20 min后用PBS洗滌3次，最后重懸后用流式細(xì)胞儀（型號(hào)：FACSCalibur，美國(guó)BD公司）檢測(cè)，分析100000個(gè)單細(xì)胞內(nèi)的DCF熒光強(qiáng)度，取其平均值。

1.5 caspase-3mRNA表達(dá)測(cè)定

采用RT-PCR法測(cè)定：用Trizol（批號(hào)：120805，美國(guó)GIBCO公司）抽提RNA；逆轉(zhuǎn)錄mRNA至cDNA；再用PCR擴(kuò)增儀（型號(hào)：9700，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)中國(guó)公司）擴(kuò)增cDNA。由invitrogen上海提供合成引物，caspase-3引物：上游5’-GCA CTG GAA TGT CAG CTC GCA-3’，下游5’-GCC ACC TTC CGG TTA ACA CGA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小559 bp；β-actin引物：上游5’-CAT CTC TTG CTC GAA GTC CA-3’，下游5’-ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC A-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小300 bp。反應(yīng)條件：94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃終末延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用電泳儀（型號(hào)：三恒ECP3000，北京市六一儀器廠）電泳，電泳后攝片，并應(yīng)用Vilber凝膠成像分析系統(tǒng)（型號(hào)：Type T2A，法國(guó)Lourmat公司）進(jìn)行吸光度掃描，以目的條帶與β-actin的積分比值表示caspase-3mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 LC3B表達(dá)測(cè)定

采用Western blot法測(cè)定：用蛋白裂解液RIPA（中）（貨號(hào)：P0013C，碧云天生物技術(shù)研究所）在玻璃勻漿器中裂解凍存組織，高速離心后得上清蛋白溶液。采用BCA蛋白含量測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：P0010S，碧云天生物技術(shù)研究所）測(cè)定蛋白濃度；然后，用SDS-PAGE（貨號(hào)：P0012A，碧云天生物技術(shù)研究所）制備12%的分離膠和6%濃縮膠。加樣后恒壓100V電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)PVDF膜，轉(zhuǎn)膜后加一抗（anti-LC3B 1∶1000；anti-GAPDH 1∶800）；過(guò)夜后加二抗（second anti-LC3B 1∶3000；second anti-GAPDH 1∶4000）。孵育后將膜包好進(jìn)入暗室壓片并洗片，使用凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)膠片進(jìn)行掃描分析，以特定的目標(biāo)蛋白條帶OD值（volume）與內(nèi)參蛋白GAPDH（volume）比值表示LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)水平。

1.7 透射電鏡標(biāo)本制作

將左側(cè)海馬剩余1/3新鮮組織塊用手術(shù)刀片切成1 mm3大小，并用4%戊二醛固定，然后用0.1 mol/L磷酸緩沖液洗2次，每次15 min。1%鋨酸固定1 h，再用0.1 mol/L磷酸緩沖液洗2次，每次15 min。30%丙酮脫水15 min，50%丙酮脫水15 min，70%丙酮飽和醋酸鈾過(guò)夜。過(guò)夜后再用80%丙酮脫水15 min，90%丙酮脫水15 min，100%丙酮脫水3次，每次10 min。將包埋劑與100%丙酮按1∶1比例放置1 h，然后將組織塊放入膠囊包埋，放入烘箱，制超薄切片并枸櫞酸鉛染色待檢。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 19.0和office excel 2007統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間均數(shù)比較用成組t檢驗(yàn)，多組間比較用LSD-t檢驗(yàn)，以P

2 結(jié)果

2.1 CPR組大鼠窒息和復(fù)蘇時(shí)間以及存活情況

60只大鼠制模成功44只（73%），存活到觀察時(shí)點(diǎn)者33只（55%）。心臟驟停后大鼠主要復(fù)蘇措施以機(jī)械通氣和胸外心臟按壓為主。在復(fù)蘇過(guò)程中大鼠的心律未見(jiàn)長(zhǎng)時(shí)間的心室顫動(dòng)，故在復(fù)蘇過(guò)程中未使用心臟電除顫。各組大鼠窒息和復(fù)蘇時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 CPR組大鼠基本生命體征及血?dú)夥治鲎兓?/p>

CPR組大鼠在窒息前、ROSC后0.5和4 h各項(xiàng)生命體征（除Tc外）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。動(dòng)脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果比較，HT組ROSC后4 h乳酸水平明顯低于NT組（t=2.146，P=0.036），余各相同時(shí)點(diǎn)血?dú)夥治鲋笜?biāo)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2、3。

2.3 ROSC后各組NDS情況

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CPR組各組大鼠的NDS顯著低于BC組（F=8.107，P

NDS滿(mǎn)分為80分，0分為腦死亡；BC：空白對(duì)照組；NT：常溫CPR組；HT：亞低溫CPR組；ROSC：自主循環(huán)恢復(fù)；NDS：神經(jīng)功能缺損評(píng)分。NT和HT組與BC組比較，aP

圖1 各組NDS比較

Fig 1 NDS in each group

2.4 各組大鼠海馬單細(xì)胞懸液ROS的變化

與BC組比較，CPR組各組大鼠海馬組織單細(xì)胞懸液反應(yīng)ROS水平的指標(biāo)――DCF值均明顯上升（F=16.824，P

A：空白對(duì)照組；B：常溫CPR組ROSC后12 h；C：低溫CPR組ROSC后12 h；D：常溫CPR組ROSC后24 h；E：低溫CPR組ROSC后24 h。每組的左圖是通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分辨出的在單細(xì)胞懸液中不同的有形物質(zhì)，白色箭頭標(biāo)注的是所計(jì)數(shù)的單細(xì)胞群，右圖是該細(xì)胞群的平均熒光度

圖2 各組大鼠海馬單細(xì)胞懸液ROS檢測(cè)流式細(xì)胞圖

Fig 2 ROS flow cytometry in hippocampus monoplast suspension of each group

2.5 海馬神經(jīng)細(xì)胞caspase-3mRNA表達(dá)水平

與BC組相比，CPR組各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞caspase-3mRNA表達(dá)均明顯升高（F=24.527，P

BC：空白對(duì)照組；NT12：常溫CPR組ROSC后12 h；HT12：低溫CPR組ROSC后12 h；NT24：常溫CPR組ROSC后24 h；HT24：低溫CPR組ROSC后24 h；ROSC：自主循環(huán)恢復(fù)。ROSC后NT和HT組的平均熒光強(qiáng)度與BC組比較，aP

圖3 各組大鼠海馬單細(xì)胞懸液ROS檢測(cè)結(jié)果比較

Fig 3 ROS compare in monoplast suspension of each group rats

A：目的基因caspase-3mRNA（559 bp）的表達(dá)。從左向右依次為BC組、NT組ROSC后12 h、HT組ROSC后12 h、NT組ROSC后24 h和HT組ROSC后24 h；B：為內(nèi)參照β-actin （300bp）的表達(dá)，從左向右依次為BC組、NT組ROSC后12 h、HT組ROSC后12 h、NT組ROSC后24 h和HT組ROSC后24 h。BC，空白對(duì)照組；NT，常溫CPR組；HT，低溫CPR組

圖4 各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞caspase-3mRNA表達(dá)

Fig 4 Caspase-3mRNA expression in hippocampus nerve cells of each group

2.6 大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞LC3B表達(dá)水平

與BC組相比，CPR組各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞LC3B表達(dá)均明顯升高（F=6.584，P

2.7 透射電鏡觀察結(jié)果

ROSC后24 h取各組大鼠海馬組織作電鏡觀察。空白對(duì)照組大鼠的海馬神經(jīng)細(xì)胞核，核膜完整、光滑，核染色質(zhì)分布均勻；線粒體，外膜完整，嵴光滑清晰可見(jiàn)，基質(zhì)均勻。常溫復(fù)蘇組大鼠的海馬神經(jīng)細(xì)胞核體積縮小，核膜有皺褶，核染色質(zhì)邊集、密度不均勻；線粒體體積明顯減小，嵴紊亂、粗糙，基質(zhì)濃縮。低溫復(fù)蘇組大鼠的海馬神經(jīng)細(xì)胞核體積略有縮小，核膜尚光滑，核染色質(zhì)略有邊集，分布尚均勻；線粒體體積略有減小，嵴可分辨，基質(zhì)濃度略不均勻。見(jiàn)圖8。

BC：空白對(duì)照組；NT-12：常溫CPR組ROSC后12 h；HT-12：低溫CPR組ROSC后12 h；NT-24：常溫CPR組ROSC后24 h；HT-24：低溫CPR組ROSC后24 h。NT和HT組的caspase-3mRNA表達(dá)量與BC組比較，aP

圖5 各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞caspase-3mRNA表達(dá)水平比較

Fig 5 Caspase-3mRNA in hippocampus nerve cells in groups

（A）目的蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ（16/18 kd）的表達(dá)，從左向右依次為BC組、NT組ROSC后12 h、HT組ROSC后12 h、NT組ROSC后24 h和HT組ROSC后24 h；（B）內(nèi)參照GAPDH（36 000）的表達(dá)，從左向右依次為BC組、NT組ROSC后12 h、HT組ROSC后12 h、NT組ROSC后24 h和HT組ROSC后24 h。BC，空白對(duì)照組；NT組，常溫CPR組；HT組，低溫CPR組

圖6 各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)

Fig 6 LC3B-Ⅱ/Ⅰ expression in hippocampus nerve cells of each group

3 討論

治療性低溫已成為心臟驟停患者腦復(fù)蘇治療的有效措施之一；然而，它也主要對(duì)院外心室顫動(dòng)心臟驟?；颊哂幸?，提示低溫可能僅對(duì)輕、中度腦損傷患者有益；但是其有效的主要機(jī)制仍有待研究。

BC：空白對(duì)照組；NT-12：常溫CPR組ROSC后12 h；HT-12：低溫CPR組ROSC后12 h；NT-24：常溫CPR組ROSC后24 h；HT-24：低溫CPR組ROSC后24 h。NT和HT組的LC3B- Ⅱ/Ⅰ表達(dá)量與BC組比較，aP

圖7 各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)水平比較

Fig 7 LC3B-Ⅱ/Ⅰ expression in hippocampus nerve cells of each group

A：空白對(duì)照組大鼠的海馬神經(jīng)細(xì)胞核（×8000）；B：常溫復(fù)蘇組大鼠的海馬神經(jīng)細(xì)胞核（×8000）；C：低溫復(fù)蘇組大鼠的海馬神經(jīng)細(xì)胞核（×8000）；D：空白對(duì)照組大鼠的海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體（×40 000）；E：常溫復(fù)蘇組大鼠的海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體（×40 000）；F：低溫復(fù)蘇組大鼠的海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體（×40 000）；G：常溫復(fù)蘇組大鼠的海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體（×40 000）被雙膜結(jié)構(gòu)（黑箭頭所示）包圍形成自噬體

圖8 各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞核和線粒體的超微結(jié)構(gòu)變化

Fig 8 Electron micrographs of nucleus and mitochondria in each group

心臟驟停后全身各器官、組織和細(xì)胞缺血缺氧，使呼吸鏈傳遞電子的效能下降，并使電子受體減少，造成缺血區(qū)ROS的產(chǎn)生并未增加[6]。經(jīng)CPR治療恢復(fù)自主循環(huán)（ROSC）后，再灌注血液中含有大量的氧，而此時(shí)線粒體呼吸鏈的酶活性卻未能迅速恢復(fù)，致使氧經(jīng)單電子還原成氧自由基增多[7]。此外，Ca2+超載也使線粒體功能受損，細(xì)胞色素氧化酶系統(tǒng)抑制，最終使ROS的產(chǎn)生超過(guò)組織的清除能力[6]，進(jìn)而造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器不同程度受損，甚至引起細(xì)胞壞死和凋亡[8]。本研究結(jié)果表明，大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞在缺血-再灌注（I/R）后胞內(nèi)ROS明顯增高，這與細(xì)胞在缺血缺氧后發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果是一致的。低溫治療使ROS的產(chǎn)生量較相同時(shí)點(diǎn)的NT組明顯減少（圖2、3），其原因可能與MH能降低ROS的產(chǎn)生，同時(shí)具有保護(hù)清除ROS的酶系統(tǒng)有關(guān)。

Caspase-3是凋亡通路的最后執(zhí)行者，能從一定程度上反應(yīng)細(xì)胞凋亡的程度[9]，已有研究結(jié)果表明，MH能通過(guò)減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡而使神經(jīng)功能得到保護(hù)[10]。本研究中發(fā)現(xiàn)，MH能顯著減少腦細(xì)胞I/R后ROS的產(chǎn)生量，并且與caspase-3mRNA的表達(dá)有一定的相關(guān)性。其原因可能是ROS的減少，通過(guò)抑制鈣介導(dǎo)的興奮性氨基酸與氧自由基之間的惡性循環(huán)，使caspase-3mRNA表達(dá)減少（圖4、5），在一定程度上降低了細(xì)胞凋亡的程度。

另外，自噬通常被認(rèn)為是細(xì)胞的一種保護(hù)性作用，它在維持缺血缺氧等應(yīng)激狀態(tài)下使細(xì)胞存活[11]，并清除細(xì)胞內(nèi)衰老細(xì)胞器和錯(cuò)誤折疊蛋白中起重要作用[12]。但是，近年來(lái)也發(fā)現(xiàn)，在某些條件下細(xì)胞自噬也能導(dǎo)致細(xì)胞死亡，即所謂過(guò)度自噬[13]。除利用電鏡可觀察自噬體形成外，還可以利用WB的方法檢測(cè)LC3的形成，從而判斷自噬發(fā)生的程度[14]。由于LC3B在腦中表達(dá)較多，可以用作腦細(xì)胞自噬的分子標(biāo)志[15]。在自噬過(guò)程中，LC3-I被泛素樣體系修飾和加工，產(chǎn)生相對(duì)分子質(zhì)量為16 000的LC3-Ⅱ，并被定位到自噬小體中。故此，自噬小體中存在的LC3I和LC3-Ⅱ均可成為細(xì)胞發(fā)生自噬的分子標(biāo)志，并且LC3Ⅱ的含量和發(fā)生自噬的程度成正比[16]。本研究也發(fā)現(xiàn)，HT組LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)較相同時(shí)相點(diǎn)的NT組有所下降（圖6、7），表明MH減小了細(xì)胞的自噬程度，并可能是大鼠神經(jīng)功能改善的原因之一（圖1）。提示大鼠復(fù)蘇后腦神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生的自噬是過(guò)度的、有害的。

參考文獻(xiàn)

[1]Wang XP， Lin QM， Zhao S，et al. Therapeutic benefits of mild hypothermia in patients successfully resuscitated from cardiac arrest： A meta-analysis [J]. World J Emerg Med， 2013， 4（4）： 260-265.

[2]Xiong W， Hoesch RE， Geocadin RG. Post-cardiac arrest encephalopathy [J]. Semin Neurol， 2011， 31（2）： 216-225.

[3] 劉堅(jiān)， 黃亮. AMPK和mTOR信號(hào)傳導(dǎo)的相互拮抗在缺血性腦損傷中的作用 [J]. 中華急診醫(yī)學(xué)雜志， 2012， 21（12）： 1398-1400.

[4] Idris， Pecker LB， Ornato JP， et al. Utstein-style guidelines for uniformreporting of laboratory CPR research [J]. Circulation， 1996， 94： 2324-2336.

[5]Geocadin RG， Ghodadra R， Kimura T， et al. A novel quantitative EEG injury measure of global cerebral ischemia [J]. Clin Neurophysiol， 2000， 111（10）： 1779-1787.

[6] Murphy MP. How mitochondria produce reactive oxygen species ？[J]. Biochem， 2009， 417： 1-13.

[7] Marchi S， Giorgi C， Suski JM，et al. Mitochondria-Ros Crosstalk in the Control of Cell Death and Aging [J]. J Sign Tran， 2012， 2012： 329635.

[8] Liu X， Wang M， Chen H， et al. Hypothermia protects the brain from transient gobal ischemia/reperfusion by attenuating endoplasmic reticulum response-induced apoptosis through CHOP [J]. PLoS One， 2013， 8（1）： e53431.

[9] 吳思榮， 惠國(guó)楨， 李向東.大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)變化及其與caspase-3基因表達(dá)的關(guān)系 [J]. 中華急診醫(yī)學(xué)雜志， 2009， 18（4）： 361-366.

[10]Zgavc T， Ceulemans AG， Hachimi-Idrissi S， et al. The neuroprotective effect of post ischemic brief mild hypothermic treatment correlates with apoptosis， but not with gliosis in endothelin-1 treated rats [J]. BMC Neurosci， 2012， 13： 105.

[11] Faisal Adhami， Guanghong Liao， Yury M， et a1. Cerebral ischemia-hypoxia Induces Intravascular coagulation and Autophagy [J]. Am J Path， 2006， 169（ 2）： 566-583.

[12] Philipp A Jaeger， Tony Wyss-Coray. All-you-can-eat： autophagy in neurodegeneration and neuroprotection [J]. Molecular Neurodegeneration， 2009， 4：16.

[13] Adhami F， Liao GH， Morozov YM， et al. Cerebral Ischemia-Hypoxia Induces Intravascular Coagulation and Autophagy [J]. Am J Path， 2006， 169（2）： 566-583.

[14] Weidberg H， Shvets E， Shpilka T， et al. LC3 and GATE-16/GABARAP subfamilies are both essential yet act differently in autophagosome biogenesis [J]. EMBOJ， 2010， 29（11）： 1792-1802.

[15] Bendix I， Schulze C， Haefen Cv， et al. Erythropoietin modulates autophagy signaling in the developing rat brain in an in vivo model of oxygen-toxicity [J]. Int J Mol Sci， 2012， 13（10）： 12939-12951.

[16] Klionsky DJ， Abdalla FC， Abeliovich H， et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes [J]. Autophagy， 2008， 4（2）： 151-175.

篇6

1.1、延安紅棗的現(xiàn)狀及問(wèn)題

延安大紅棗是馳名中外的陜西傳統(tǒng)名優(yōu)特產(chǎn)之一。其特點(diǎn)是果大核小，皮薄肉厚，質(zhì)脆絲長(zhǎng)，汁多味甜，甘美醇香，含糖量高，色澤鮮紅，水分較少，貯藏期長(zhǎng)，品質(zhì)優(yōu)良。真乃“味奪石蜜甜偏永，紅邁朱櫻色莫論”，是色、香、味、形俱全的紅棗。

但現(xiàn)狀就如下面：

棗子青了、紅了，爛了、收了;棗農(nóng)喜悅了、揪心了、希望又落空了……年復(fù)一年。每年9月底10月初,老天爺?shù)?quot;臉色"總是那樣地讓延安棗農(nóng)揪心。延安大紅棗，牽扯到沿黃七縣近百萬(wàn)群眾的一項(xiàng)大產(chǎn)業(yè)，今年遭災(zāi)了嗎?收成如何?紅棗產(chǎn)業(yè)還面臨什么亟待解決的問(wèn)題?

⑴信息不能很通暢的進(jìn)行交流

農(nóng)民們不知外面市場(chǎng)的需求量有多大，是否還可以擴(kuò)大種植面積，獲得更多的利潤(rùn)

⑵交通不夠發(fā)達(dá)

不能將如此好的產(chǎn)品銷(xiāo)售出去。(路難：肩扛背馱的棗農(nóng)無(wú)奈)

⑶當(dāng)年的棗不能很好的賣(mài)出

雖然外面對(duì)棗的需求很大，延安人手中有棗，但是不能很好的銷(xiāo)售出去。好多的棗由于在當(dāng)年沒(méi)有賣(mài)出去到了以后就會(huì)出現(xiàn)好多的問(wèn)題(發(fā)霉，生蟲(chóng)等)

⑷目前紅棗的營(yíng)銷(xiāo)模式局限于傳統(tǒng)的營(yíng)銷(xiāo)模式，市場(chǎng)前景狹窄

銷(xiāo)售渠道不廣泛，導(dǎo)致了紅棗的銷(xiāo)售一直不是很理想，所以延安紅棗應(yīng)該發(fā)展新的營(yíng)銷(xiāo)模式 ⑴利用淘寶網(wǎng)店銷(xiāo)售會(huì)使得延安紅棗有個(gè)更好的前景

再好的東西得不到好的銷(xiāo)售，就會(huì)積壓在農(nóng)民手中，就會(huì)失去它應(yīng)有的價(jià)值。延安地區(qū)如果將迎來(lái)陰雨天氣，省氣象臺(tái)應(yīng)及時(shí)提醒，紅棗成熟會(huì)受到影響。此外，還須加強(qiáng)地質(zhì)災(zāi)害的監(jiān)測(cè)和預(yù)防。

目前紅棗的營(yíng)銷(xiāo)模式局限于傳統(tǒng)的營(yíng)銷(xiāo)模式，市場(chǎng)前景狹窄，銷(xiāo)售渠道不廣泛，導(dǎo)致了紅棗的銷(xiāo)售一直不是很理想，所以延安紅棗應(yīng)該發(fā)展新的營(yíng)銷(xiāo)模式。

我方在淘寶網(wǎng)上注冊(cè)了網(wǎng)店，就是為了讓更多的消費(fèi)者可以買(mǎi)到他們想要的延安大紅棗。讓延安紅棗闖出陜西，走出中國(guó)，走向世界!

2、選擇延安大紅棗的理由

紅棗，盛名己久，。尤其延安延川縣的紅棗，更負(fù)盛名。延安延川縣東傍黃河，屬溫帶半干旱區(qū)，氣候干燥少雨，晝夜溫差大，日照時(shí)間長(zhǎng)，延安大紅棗主要產(chǎn)于黃河沿岸，它以個(gè)大、核小、皮薄、肉厚、味醇、富含維生素c、d、p(蘆丁)、糖份、果膠物質(zhì)、鐵鈣、磷，鉀等成分是名副其實(shí)的"果中皇后"。受黃河特殊的地理因素影響，是大棗的理想適生區(qū)。

紅棗的功效

1.減少老人斑

紅棗中所含的維生素c是一種活性很強(qiáng)的還原性抗氧化物質(zhì)，參與體內(nèi)的生理氧氣還原過(guò)程，防止黑色素在體內(nèi)慢性沉淀，可有效地減少色素老年斑的產(chǎn)生。

2.保肝護(hù)肝

紅棗中所含的糖類(lèi)、脂肪、蛋白質(zhì)是保護(hù)肝臟的營(yíng)養(yǎng)劑。它能促進(jìn)肝臟合成蛋白，增加血清紅蛋白與白蛋白含量，調(diào)整白蛋促進(jìn)肝臟合成蛋白，增加血清紅蛋白與白蛋白含量，調(diào)整白蛋白與球蛋白比例，有預(yù)防輸血反應(yīng)、降低血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平等作用。

3.防止落發(fā)

紅棗有健脾養(yǎng)胃之功能。"脾好則皮堅(jiān)"，皮膚容光煥發(fā)，毛發(fā)則有了安身之處，所以常食營(yíng)養(yǎng)豐富的紅棗可以防止發(fā)脫落，而且可長(zhǎng)出烏黑發(fā)亮的頭發(fā)。

4.健胃補(bǔ)腦

中醫(yī)常用紅棗養(yǎng)胃健脾。如在處方中遇有藥力較猛或有刺激性藥物時(shí)，常配用紅棗，以保護(hù)脾胃，紅棗中含有糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、脂肪、有機(jī)酸，對(duì)大腦有補(bǔ)益作用。用紅棗與面粉制成棗糕，能養(yǎng)胃補(bǔ)腦。

5.可補(bǔ)氣養(yǎng)血

“紅棗有補(bǔ)中益氣，養(yǎng)血安神”之功效。紅棗中的高維生素含量，對(duì)人體毛細(xì)血管有健全的作用。

延安紅棗好處如此之多，我們就借助網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)，讓延安紅棗的銷(xiāo)售更上一個(gè)臺(tái)階，讓更多的人受益!

3、項(xiàng)目的可行性

3.1、目前農(nóng)村電子商務(wù)的發(fā)展

目前，從對(duì)中國(guó)互聯(lián)網(wǎng)認(rèn)識(shí)和使用的群體來(lái)看，絕大部分都集中于受過(guò)高等教育的人口。在電子商務(wù)迅速發(fā)展的情況下，農(nóng)村電子商務(wù)出現(xiàn)了一些屬于自己買(mǎi)賣(mài)的平臺(tái)，秉承綠色、助農(nóng)、至誠(chéng)、共贏的價(jià)值觀，樹(shù)立開(kāi)放式接入、專(zhuān)業(yè)化運(yùn)營(yíng)、市場(chǎng)化經(jīng)營(yíng)的經(jīng)營(yíng)理念，依托全省供銷(xiāo)社行業(yè)資源，建立專(zhuān)業(yè)的、開(kāi)放的、涉及農(nóng)產(chǎn)品的電子商務(wù)平臺(tái)"網(wǎng)上供銷(xiāo)社"，聯(lián)接城鄉(xiāng)、服務(wù)三農(nóng)，努力打造一條從線下到線上的綠色農(nóng)產(chǎn)品通道。網(wǎng)上供銷(xiāo)社全面整合供銷(xiāo)社行業(yè)資源，以最優(yōu)質(zhì)、最全面的服務(wù)，為農(nóng)民兄弟解決“買(mǎi)難”、“賣(mài)難”問(wèn)題

3.2、農(nóng)村網(wǎng)絡(luò)使用的增長(zhǎng)

近年來(lái)，農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，農(nóng)民的生活也火起來(lái)了，互聯(lián)網(wǎng)也相繼進(jìn)入了各家各戶(hù)。

4、方案策劃

4.1、網(wǎng)絡(luò)廣告推廣營(yíng)銷(xiāo)戰(zhàn)略

4.1.1、網(wǎng)絡(luò)廣告

①?gòu)V告目標(biāo)

擴(kuò)大陜北延安農(nóng)村地區(qū)紅棗的知名度，使其更好地走向市場(chǎng)。

②廣告定位

篇7

姓名

性別

男

學(xué)號(hào)

分院

現(xiàn)代服務(wù)系

專(zhuān)業(yè)

實(shí)踐

單位

山東百利通亞陶科技有限公司

實(shí)踐

崗位

助理技術(shù)員

實(shí)習(xí)

時(shí)間

2021-09-10至2022-12-10

（一）實(shí)踐主要內(nèi)容及進(jìn)程

1. 對(duì)生產(chǎn)原料以及產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)檢，將不符合生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)的原料、產(chǎn)品淘汰，提高成品率

2. 及時(shí)處理或上報(bào)各工序出現(xiàn)的的異常情況，恢復(fù)正常生產(chǎn)

3. 協(xié)助技術(shù)員做好組織生產(chǎn)工作，保證車(chē)間員工嚴(yán)格按照工藝標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行生產(chǎn)

4. 負(fù)責(zé)設(shè)備工序的組裝與打包，對(duì)生產(chǎn)車(chē)間和設(shè)備進(jìn)行日常維護(hù)

（二）主要收獲與體會(huì)

通過(guò)此次實(shí)習(xí)，我學(xué)到了如何運(yùn)用所學(xué)知識(shí)解決處理簡(jiǎn)單問(wèn)題的方法與技巧，積累了一線的生產(chǎn)知識(shí)，增強(qiáng)了實(shí)踐操作技能，為專(zhuān)業(yè)課學(xué)習(xí)打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。同時(shí)使我體驗(yàn)到了社會(huì)工作的艱辛，磨練了自己的意志。更重要的是，我懂得了與員工同事相處溝通的有效方法途徑，積累了社會(huì)工作的簡(jiǎn)單經(jīng)驗(yàn)，為畢業(yè)后走向工作崗位打下了一定基礎(chǔ)。

（二）對(duì)實(shí)踐單位的建議

1. 檢修器件后剩余材料、備件應(yīng)注意重新入庫(kù)，避免造成浪費(fèi)。

2. 生產(chǎn)車(chē)間需保持通風(fēng)狀態(tài)良好，整潔。

3.

（四）實(shí)踐成果

1. 對(duì)車(chē)間生產(chǎn)流程、工藝標(biāo)準(zhǔn)以及有關(guān)注意事項(xiàng)建立了清晰的認(rèn)識(shí)

篇8

自動(dòng)化認(rèn)識(shí)實(shí)習(xí)報(bào)告一

一、實(shí)習(xí)目的和任務(wù)

認(rèn)識(shí)實(shí)習(xí)是實(shí)踐性教學(xué)環(huán)節(jié)中的重要組成部分，是實(shí)現(xiàn)本專(zhuān)業(yè)應(yīng)用型人才培養(yǎng)的主要手段之一。通過(guò)實(shí)習(xí)使學(xué)生對(duì)工業(yè)企業(yè)生產(chǎn)過(guò)程和主要設(shè)備，以及自動(dòng)控制在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用有一個(gè)全面、感性的認(rèn)識(shí)，提高學(xué)習(xí)專(zhuān)業(yè)知識(shí)的積極性和主動(dòng)性。

其任務(wù)是：通過(guò)參觀了解工廠的生產(chǎn)概況及生產(chǎn)組織和管理的一般情況，了解自動(dòng)控制在工業(yè)生產(chǎn)中的作用，了解工廠電氣控制設(shè)備生產(chǎn)狀況，了解電氣控制技術(shù)的新工藝，新設(shè)備及電氣控制的新方向，了解工程技術(shù)人員、生產(chǎn)管理人員在生產(chǎn)和試驗(yàn)過(guò)程中的作用和職責(zé)。

二、實(shí)習(xí)時(shí)間

20xx年6月21日-20xx年6月25日

三、實(shí)習(xí)地點(diǎn)

湘潭市各有關(guān)工廠企業(yè)【湖南京電開(kāi)關(guān)廠、世通電氣、雙馬電氣、超宇科技和凌天科技】

四、實(shí)習(xí)內(nèi)容

20xx.6.22 星期二 多云

今天我們參觀湖南京電開(kāi)關(guān)廠，該廠位于湘潭市雙擁路27號(hào)火炬創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)園，早上8：10后，我們坐車(chē)奔赴了目的地。

湖南京電開(kāi)關(guān)廠是隸屬于國(guó)家電網(wǎng)公司中興電力實(shí)業(yè)發(fā)展總公司的全資企業(yè)，于1995年成立，廠房面積約7200平方米。注冊(cè)資本人民幣壹仟貳佰萬(wàn)元整，是電力、冶金、礦山、煤炭、化工等行業(yè)高低壓電器和高壓低壓電氣成套設(shè)備的專(zhuān)業(yè)生產(chǎn)廠家,是湖南省電器行業(yè)的重點(diǎn)骨干企業(yè)。

該廠子分為兩層，我們首先參觀了第二層，我們?nèi)サ臅r(shí)候，有些工人正在工作，那里的一個(gè)師傅給我們介紹了一些產(chǎn)品的性能、結(jié)構(gòu)、原理等方面的知識(shí)，限于專(zhuān)業(yè)知識(shí)還沒(méi)有學(xué)到，部分東西還不能理解。但對(duì)這些產(chǎn)品有了感性的認(rèn)識(shí)，同學(xué)們參觀時(shí)興趣盎然，都對(duì)這些以前沒(méi)有見(jiàn)到過(guò)的東西有著濃厚的興趣，我們幾個(gè)同學(xué)走到一個(gè)接線工人的工作臺(tái)觀察她接線，只見(jiàn)他技術(shù)嫻熟，接線速度很快，而且美觀。我們很多人在旁邊看了好久，都對(duì)她的接線技術(shù)贊不絕口，自嘆不如，我們覺(jué)得自己在以前的電工實(shí)習(xí)上接的線都比這個(gè)差了很多，同學(xué)們表示自己一定要多動(dòng)手，把自己要做的事情做的美觀，就像接線工人接的線一樣結(jié)實(shí)、漂亮!

參觀完了第二層，我們來(lái)到了第一層，這里沒(méi)有工人在生產(chǎn)，有很多的開(kāi)關(guān)都擺在這里，我以前總覺(jué)得開(kāi)關(guān)是個(gè)非常簡(jiǎn)單的東西，不就一開(kāi)一關(guān)嗎?能有什么高級(jí)的開(kāi)關(guān)么?事實(shí)證明我錯(cuò)了，開(kāi)關(guān)很多，我之所以這么想，就是以前接觸過(guò)的都是生活中見(jiàn)到的簡(jiǎn)單的開(kāi)關(guān)。在這里，我們看到了VSI型戶(hù)內(nèi)高壓真空斷路器、KYN28A(GZSI)-12戶(hù)內(nèi)交流金屬鎧裝抽出式開(kāi)關(guān)設(shè)備、VJD中壓固封式真空斷路器、GCS型低壓抽出式開(kāi)關(guān)柜和MNS型低壓成套開(kāi)關(guān)裝置等設(shè)備。

在這里，我具體GCS型低壓抽出式開(kāi)關(guān)柜的一些情況，我從掛在那個(gè)柜子上的說(shuō)明書(shū)上了解到：這種低壓抽出式開(kāi)關(guān)柜的主構(gòu)架為兩種,全組合式結(jié)構(gòu)和部分焊接式結(jié)構(gòu);裝置各功能室嚴(yán)格分開(kāi), 各功能室主要分為單元式、母線式、電纜式,各單元的作用相對(duì)獨(dú)立;水平母線采用框后平置式排列布置,以增加母線抗短路電流電動(dòng)力的能力;電纜間采用上下進(jìn)出線方式;按三相五線制或三相四線制;一個(gè)抽屜為一個(gè)單元, 抽屜尺寸分為一單元、二單元、三單元、二分之一單元、四分之一單元, 五個(gè)尺寸系列, 各單元回路額定電流在630A及以下。抽屜尺寸的變化僅僅為高度的變化, 其寬度、 深度不能變化,相同功能的單元可以互換。

MNS型低壓成套開(kāi)關(guān)裝置我也了解了一下，它適用于發(fā)電廠、變電站、石油化工、冶金軋鋼、輕工紡織等廠礦企業(yè)和住宅小區(qū)、高層建筑等場(chǎng)所，作為交流50～60Hz，額定工作電壓交流660V及以下的電力系統(tǒng)的配電設(shè)備的電能轉(zhuǎn)換、分配及控制之用。

VSI型戶(hù)內(nèi)高壓真空斷路器我也仔細(xì)地看了一下產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，它有很多優(yōu)點(diǎn)，其優(yōu)點(diǎn)之一是：它的觸頭常采取對(duì)接式觸頭。因?yàn)橐话愕恼婵諗嗦菲髟诜珠l狀態(tài)下動(dòng)靜觸頭的距離只有16mm這么小的距離很難制作出其他形狀的接觸面，而且平直的接觸面瞬間動(dòng)作電弧的損傷也較小。真空斷路器的優(yōu)點(diǎn)之一是體積小，動(dòng)靜觸頭要在一個(gè)絕對(duì)真空的空間內(nèi)動(dòng)作，如果制作成其他的對(duì)接方式也會(huì)增加斷路器自身的體積!

說(shuō)實(shí)話，我還不太懂得這些高級(jí)開(kāi)關(guān)設(shè)備的原理，這次在京電開(kāi)關(guān)廠的參觀使我對(duì)電器原理產(chǎn)生了更大的好奇，我一定在大三的時(shí)候努力學(xué)好專(zhuān)業(yè)知識(shí)，立志以后從事電氣行業(yè)，為電氣事業(yè)奉獻(xiàn)自己的綿薄之力。

自動(dòng)化認(rèn)識(shí)實(shí)習(xí)報(bào)告二

一、實(shí)習(xí)目的

1. 通過(guò)親身接觸自動(dòng)化設(shè)備和實(shí)驗(yàn)器材，并且通過(guò)老師及工廠人員的講解，對(duì)自動(dòng)化專(zhuān)業(yè)進(jìn)行初步的認(rèn)識(shí)，在實(shí)踐中驗(yàn)證、鞏固和深化已學(xué)的專(zhuān)業(yè)理論基礎(chǔ)知識(shí)。

2.加強(qiáng)對(duì)企業(yè)技術(shù)操作的理解，將學(xué)到的知識(shí)與實(shí)際相結(jié)合，運(yùn)用已學(xué)的專(zhuān)業(yè)基礎(chǔ)課程理論知識(shí)，對(duì)實(shí)習(xí)單位的各項(xiàng)技術(shù)操作進(jìn)行初步分析觀察和分析對(duì)比，找到其合理和不足之處，靈活運(yùn)用所學(xué)的專(zhuān)業(yè)知識(shí)，在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)并提出問(wèn)題，找到解決問(wèn)題的思路和方法，提高分析問(wèn)題和解決問(wèn)題的能力。

3.見(jiàn)識(shí)電子控制類(lèi)產(chǎn)品的設(shè)計(jì)、開(kāi)發(fā)及維護(hù)等過(guò)程，理解自動(dòng)化專(zhuān)業(yè)的發(fā)展動(dòng)態(tài)與專(zhuān)業(yè)前景。

4.通過(guò)一定的實(shí)踐認(rèn)知實(shí)習(xí)，為以后的畢業(yè)設(shè)計(jì)及論文撰寫(xiě)做好鋪墊。

5. 讓我們了解到知識(shí)與現(xiàn)實(shí)之間的差距，提升自己實(shí)際的工作能力，領(lǐng)悟到現(xiàn)實(shí)工作中我們需要什么，我們應(yīng)該朝哪一方面發(fā)展，對(duì)我們以后的發(fā)展指明了道路，為今后真正走上工作崗位打下良好基礎(chǔ)。

二、實(shí)習(xí)地點(diǎn)及時(shí)間安排

1.實(shí)習(xí)地點(diǎn)：

中冶連鑄技術(shù)工程股份有限公司

2.時(shí)間安排：

8：30 由武漢科技大學(xué)黃家湖校區(qū)出發(fā)

9：20 到達(dá)中冶連鑄技術(shù)工程股份有限公司，開(kāi)始參觀

11:00 返回學(xué)校

三、實(shí)習(xí)單位介紹

中冶連鑄技術(shù)工程股份有限公司(簡(jiǎn)稱(chēng)中冶連鑄，CCTEC)，是由中國(guó)冶金科工集團(tuán)(MCC)發(fā)起設(shè)立的科技型股份制企業(yè)。xxxx年，中冶集團(tuán)在美國(guó)《財(cái)富》雜志評(píng)選的世界企業(yè)500強(qiáng)中，排名第280位。中冶連鑄總部設(shè)在武漢，是國(guó)內(nèi)最大的以連鑄、板帶冷軋與表面處理為特色的冶金專(zhuān)業(yè)化技術(shù)工程公司;xxxx年7月，中冶集團(tuán)宣布，中冶南方合并中冶連鑄，自此，中冶連鑄成為中冶南方的全資子公司。

公司主營(yíng)業(yè)務(wù)為：方坯、板坯和薄板坯連鑄連軋工程，板帶冷軋與處理工程和工業(yè)電氣自動(dòng)化控制系統(tǒng)。自動(dòng)化專(zhuān)業(yè)認(rèn)識(shí)實(shí)習(xí)心得。中冶連鑄現(xiàn)依托集團(tuán)各項(xiàng)優(yōu)勢(shì)在北京設(shè)立了分支機(jī)構(gòu)，從事國(guó)內(nèi)外海水淡化項(xiàng)目的投資、建設(shè)和運(yùn)營(yíng)。連鑄核心業(yè)務(wù)有：EPC工程總承包，事業(yè)部具有專(zhuān)業(yè)化連鑄技術(shù)研發(fā)、工程設(shè)計(jì)、設(shè)備制造能力的優(yōu)勢(shì)，可以為客戶(hù)提供各類(lèi)連鑄機(jī)(大小方坯、圓坯、矩形坯、異型坯、扁坯、板坯、薄板坯等)的設(shè)計(jì)、制造、安裝、調(diào)試一條龍工程總承包及單項(xiàng)服務(wù);技術(shù)服務(wù)，事業(yè)部依靠專(zhuān)業(yè)化連鑄技術(shù)研發(fā)實(shí)力，為客戶(hù)提供連鑄生產(chǎn)工藝、品種開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)工藝訣竅、鑄坯質(zhì)量問(wèn)題診斷等相關(guān)技術(shù)服務(wù);設(shè)備維護(hù)服務(wù)外包，事業(yè)部具有專(zhuān)業(yè)化連鑄設(shè)備制造、供應(yīng)鏈管理能力，能夠提供連鑄設(shè)備維護(hù)服務(wù)外包，為客戶(hù)帶來(lái)良好的經(jīng)濟(jì)效益。

公司人力資源實(shí)力：xxxx年初，公司已有職工854人，其中技術(shù)管理人員496人，擁有博士學(xué)位11人、碩士學(xué)位101人、高級(jí)工程師以上職稱(chēng)83人。公司在北京設(shè)有自己獨(dú)立的研究院，擁有多項(xiàng)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的核心技術(shù)，每年研發(fā)費(fèi)用占營(yíng)業(yè)額的5%#from 本文來(lái)自高考資源網(wǎng)gkstk.com end#，研發(fā)實(shí)力強(qiáng)大。中冶連鑄擁有專(zhuān)業(yè)的設(shè)備制造基地中冶易新科技，設(shè)備制造能力強(qiáng)大。主要機(jī)械、電氣設(shè)備在公司內(nèi)部制造完成，產(chǎn)品質(zhì)量和交貨期有保證。

事業(yè)部/子公司：連鑄事業(yè)部、海外事業(yè)部、北京科貿(mào)、斯瑞普科技、中冶易新科技、中冶重工。

四、實(shí)習(xí)內(nèi)容

1月5日我們到了中冶易新科技股份有限公司，在實(shí)習(xí)開(kāi)始，由公司員工李華剛師傅帶領(lǐng)全班同學(xué)對(duì)公司各個(gè)車(chē)間進(jìn)行專(zhuān)業(yè)性的參觀，在車(chē)間里李師傅對(duì)同學(xué)們參觀中的疑問(wèn)進(jìn)行了專(zhuān)業(yè)、技術(shù)性的講解。在參觀過(guò)程中，李師傅針對(duì)我們專(zhuān)業(yè)對(duì)他們車(chē)間采用及開(kāi)發(fā)的新技術(shù)、新設(shè)備進(jìn)行了詳細(xì)的介紹，這對(duì)我專(zhuān)業(yè)知識(shí)的認(rèn)識(shí)更深了一層。各個(gè)車(chē)間各司其職，但又緊密聯(lián)系，比如做一臺(tái)軋鋼機(jī)，它需要各個(gè)車(chē)間的配合，從最初的圖紙?jiān)O(shè)計(jì)到最后的零件組裝要求毫無(wú)差錯(cuò)，精密準(zhǔn)確。

對(duì)于李師傅介紹的一些簡(jiǎn)短又新鮮的名詞如銅排總、分控制機(jī)PID等，同學(xué)們疑惑百出，紛紛提出自己的疑問(wèn)。而李師傅耐心的為我們?cè)趯?zhuān)業(yè)技術(shù)與知識(shí)方面進(jìn)行了解惑，電子產(chǎn)品本來(lái)就更新速度快，在技術(shù)研發(fā)方面需要什么，大學(xué)生需要具備什么，專(zhuān)業(yè)的發(fā)展前景怎樣等問(wèn)題他都做了非常詳細(xì)的介紹。因?yàn)樗鲈摴竟ぷ髁送﹂L(zhǎng)一段時(shí)間，所以對(duì)大學(xué)生他很了解，對(duì)我們?cè)诖髮W(xué)中應(yīng)掌握的技能都做了一些要求，對(duì)專(zhuān)業(yè)知識(shí)的掌握以及在他們產(chǎn)品中占據(jù)的地位進(jìn)行了解惑，讓我受益匪淺。

五、實(shí)習(xí)心得與體會(huì)

通過(guò)此次實(shí)習(xí)，讓我學(xué)到了很多課堂上更本學(xué)不到的東西，仿佛自己一下子成熟了，懂得了做人做事的道理，也懂得了學(xué)習(xí)的意義。我看清了自己的人生方向，也讓我認(rèn)識(shí)到了從事電子工作應(yīng)支持仔細(xì)認(rèn)真的工作態(tài)度，要有一種平和的心態(tài)，創(chuàng)新的精神，應(yīng)該擁有一顆隨時(shí)接受考驗(yàn)的心，迎接未知的世界。

實(shí)習(xí)期間，我謙虛謹(jǐn)慎，認(rèn)真聽(tīng)取相關(guān)技術(shù)人員的指導(dǎo)講解，并能夠仔細(xì)觀察、切身體驗(yàn)、獨(dú)立思考、綜合分析，也培養(yǎng)了我的耐心和素質(zhì)，能夠做到服從指揮。感受到了提出疑惑和疑惑解決后的。對(duì)自己的專(zhuān)業(yè)也更喜愛(ài)，不再迷茫。

篇9

1、將瓜子裝到塑料袋，扎緊袋子，然后放入罐子密封，放點(diǎn)干燥劑，拿到避光陰涼干燥處存放或者放入冰箱冷藏，這樣能夠達(dá)到延長(zhǎng)濕瓜子的保質(zhì)期。

2、瓜的種子，特指炒熟了的做食品的倭瓜子、西瓜子等。又叫瓜子兒，俗名叫邊果。它的種類(lèi)較多，有葵花子、海瓜子、吊瓜子、西瓜子、南瓜子、黃瓜子、絲瓜子等?？ㄗ邮窍蛉湛墓麑?shí)，不但可以作為零食，而且還可以作為制作糕點(diǎn)的原料，同時(shí)也是重要的榨油原料，是高檔健康的油脂來(lái)源。

（來(lái)源：文章屋網(wǎng) ）

篇10

一周的電工實(shí)訓(xùn)進(jìn)行的緊張有序，使我們有在車(chē)間實(shí)習(xí)體驗(yàn)。這次實(shí)訓(xùn)是對(duì)實(shí)際條件下的依次模擬考核，使用的電壓在220伏到380伏，所以對(duì)我們的要求很高，弄不好會(huì)有觸電的危險(xiǎn)，還有燒毀儀器，在實(shí)訓(xùn)開(kāi)始前老師告訴我們，安全放在第一，不能馬虎，開(kāi)電的時(shí)候要檢查一遍，還要通知其他人，以免觸電，老師又講了試驗(yàn)時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題，然后我們按分好的組開(kāi)始做試驗(yàn)。

剛開(kāi)始作一周實(shí)訓(xùn)，以為要做很多試驗(yàn)，發(fā)下材料一看才四個(gè)，這次電工實(shí)訓(xùn)一共有四次試驗(yàn)，第一個(gè)試驗(yàn)是家用供電線路實(shí)訓(xùn)，主要目的是要學(xué)會(huì)日光燈電路，一燈兩地控制，燈光可調(diào)電路，聲光延時(shí)電路，鍘刀控制電路的正確接法。以前我對(duì)家用供電線路的了解，只存在火線，零線。一些開(kāi)關(guān)的連接，再實(shí)際生活中電是危險(xiǎn)物，在家根本不叫碰，所以知道的不多。通過(guò)老師的講解使我們有了一定的了解，我們接的很順利，聲光延時(shí)開(kāi)關(guān)必須用東西包住才能使燈泡亮。通過(guò)這次實(shí)訓(xùn)讓我對(duì)家用點(diǎn)有了一定的了解。

第二個(gè)試驗(yàn)是電動(dòng)機(jī)反-正轉(zhuǎn)實(shí)訓(xùn)，我們上學(xué)期有一定的理論知識(shí)，我想應(yīng)該沒(méi)問(wèn)題，可以做起來(lái)，可一做不是那一回事，接完后電機(jī)不轉(zhuǎn)，發(fā)現(xiàn)是接觸點(diǎn)不能吻和。我們將電壓改變后，電路恢復(fù)正常工作，電機(jī)開(kāi)始反-正轉(zhuǎn)。這讓我懂的接線必須認(rèn)真，不能馬虎。在做任何事都必須認(rèn)真做。是我感受頗多。

第三個(gè)試驗(yàn)電動(dòng)機(jī)既可點(diǎn)動(dòng)又可自鎖控制線路實(shí)訓(xùn)，這個(gè)試驗(yàn)線路和上一個(gè)沒(méi)有查別，在加上已經(jīng)做過(guò)二個(gè)試驗(yàn)，我們對(duì)電器的應(yīng)用有一定的熟悉。操作起來(lái)就比較順利，我從中學(xué)到了很多，讓我對(duì)電機(jī)有了新得認(rèn)識(shí)，可以順利的進(jìn)行調(diào)控。

最后一個(gè)試驗(yàn)是工作臺(tái)自動(dòng)往返循環(huán)線路實(shí)訓(xùn)，要求我們通過(guò)實(shí)際安裝接線掌握有電氣原理圖變換成安裝接線圖的方法，并掌握行程開(kāi)關(guān)的作用，以及機(jī)床電路的應(yīng)用。這個(gè)試驗(yàn)很復(fù)雜，我們接完線，打開(kāi)開(kāi)關(guān)，可機(jī)床不動(dòng)，我們檢查線路，發(fā)現(xiàn)一個(gè)地方?jīng)]有連線，我們把線接上，機(jī)床動(dòng)了。雖然和試驗(yàn)要求不一樣，但我們很高興，因?yàn)樗鼊?dòng)了，我們有把線檢查了好幾遍，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，我們很著急，把高頻調(diào)到低頻，還是不行，最后我們把1、2、3、4它們換個(gè)來(lái)，機(jī)床動(dòng)了，我們成功了。

一周的實(shí)習(xí)期瞬間結(jié)束了，但一顆熾熱的心依然還在那實(shí)習(xí)的場(chǎng)地依依不舍，特別是對(duì)咱們的指導(dǎo)老師很是敬佩。

通過(guò)幾天的實(shí)習(xí)，使我懂了許多許多的道理，真可謂是“受益非淺”啦，這次我們的實(shí)習(xí)任務(wù)，雖然算不上很重，其任務(wù)就是按圖安裝一些簡(jiǎn)單的照明電路。原理談不上很復(fù)雜，但是真正要安裝起來(lái)那得費(fèi)一把勁，由于是四位同學(xué)共用一個(gè)工位，最重要的是雙方協(xié)作精神，這一點(diǎn)我體會(huì)最深。

做工有條不紊的進(jìn)行著，這項(xiàng)工作需要特別的細(xì)心，弄不好的話很容易讓自己做的一切從頭再來(lái)。首先，必須把安裝的器材清好檢查是否完好，再次就是要運(yùn)用巧勁把每副夾子上好，牢固，一下午下來(lái)人累得是筋疲力盡，但看到自己安裝的效果，還是感到很欣慰的，再過(guò)一年半我們就要步入社會(huì)，踏上自己的工作崗位，但我感覺(jué)到一周的學(xué)習(xí)期就是以后生活的寫(xiě)照，我會(huì)運(yùn)用自己的書(shū)本知識(shí)和實(shí)踐能力去撐穩(wěn)，那在江中的風(fēng)帆……

第一次看著電動(dòng)機(jī)通過(guò)自己動(dòng)手接線轉(zhuǎn)起來(lái)，那種感覺(jué)是自豪的。自己在心里會(huì)說(shuō)：“呃，我也能讓電動(dòng)機(jī)轉(zhuǎn)起來(lái)，哈，開(kāi)心。加油，其實(shí)這蠻好玩的嘛”。

也培養(yǎng)了規(guī)范化的工作作風(fēng)，通過(guò)這一次的電工的實(shí)訓(xùn)。以及我團(tuán)結(jié)協(xié)作的團(tuán)隊(duì)精神。

再準(zhǔn)備讓我接線。剛開(kāi)始接線時(shí)我就按著圖接下來(lái)，老師總是先給我講一些理論的內(nèi)容。一點(diǎn)秩序也沒(méi)有，所以接好了線看過(guò)去亂亂的像蜘蛛網(wǎng)一樣?，F(xiàn)在想到都覺(jué)得好笑。

比如安全用電常識(shí)、電工基本操作（怎么連接導(dǎo)線）電氣照明（主要是日光燈）還有一些常用的低壓電器（意所布的線布的先后順序，也因?yàn)殡姽ふn我解到很多我平時(shí)都不會(huì)認(rèn)真去注意的常識(shí)。比如說(shuō)布線時(shí)應(yīng)把其他線都布好了之后再布開(kāi)關(guān)的線，交流接觸器，繼電器等）行程開(kāi)關(guān)的用法；電動(dòng)機(jī)的結(jié)構(gòu)和銘牌意義；控制電路故障分析與排除等。恩，總之，感覺(jué)學(xué)到東西還是蠻多的四次的電工對(duì)手親身體會(huì)到整體思考的重要性，布一塊好板就必須要有整的邏輯思維，布板要注意各元器件的空間排布還要注意到布線時(shí)線與線不能相交且要注