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長期以來,傳統(tǒng)的免疫組織化學、原位雜交、各種特殊染色等研究方法,建立在常規(guī)病理組織切片基礎上,一張玻片上只能載有限的組織作一種測試。若只用于日常臨床疾病的診斷尚可勝任,但要用其從事大規(guī)模、多樣本的科研則顯得太費時、費力。由此組織芯片技術應運而生,它的出現(xiàn)給病理學研究開辟了新天地。組織芯片具有體積小、信息含量高、并可根據(jù)不同的需要進行組合和設計的特點。從而大大減少了勞動力和勞動強度,縮短研究時間,提高檢測效率,更重要的是減少實驗誤差。從根本上解決了病理學家的難題,是病理學研究技術的一項重大革命。作者就組織芯片技術的原理、應用范圍和對醫(yī)學科學發(fā)展的影響及其自身的發(fā)展前景做一簡要綜述。

1組織芯片技術的基本原理

組織芯片又稱組織微陣列(tissuemicroarray),1998年由Kononen等在cDNA微陣列的基礎上發(fā)明的一種特殊的生物芯片,是繼基因芯片和蛋白芯片之后生物芯片家族的又一新成員。組織芯片的原理是根據(jù)不同需要,利用特殊的儀器,將多個(病例)小組織片高密度地整齊排列固定在某一固相載體上(載玻片、硅片、聚丙烯或尼龍膜等)而制成微縮的組織切片(圖1a,西安超英生物公司提供)。然后可以用各種酶、核素或熒光標記的不同基因、寡核苷酸、抗體在微縮組織切片上進行雜交和標記染色,最后在顯微鏡(包括激光共聚焦顯微鏡等)下獲取圖像信息(或通過計算機處理所獲的信息),以研究目的基因或基因產(chǎn)物在不同組織之間的表達差異。

該技術的最大潛在作用是將基因、蛋白水平的研究與組織形態(tài)學相結合,使應用同一實驗指標,同時快速研究大量不同組織樣本(高通量、多樣本)的設想成為現(xiàn)實,減少了實驗誤差,幾十倍、上百倍地提高組織病理學研究的效率,節(jié)約實驗材料和試劑,同時使實驗結果有更可靠的可比性,對于原始病理資料的保存和大量樣本的回顧性研究具有重要的意義。

組織芯片的制備目前主要依靠機械化芯片制備儀來完成。其主要的設備有操作平臺、特殊的打孔采樣裝置和一個定位系統(tǒng)。打孔采樣裝置對供者組織蠟塊進行采樣,同時也可對受者蠟塊進行打孔,其孔徑與采樣直徑相同,二者均可精確定位。制備儀的定位裝置可使穿刺針或受者蠟塊線性移動,從而制備出孔徑、孔距、孔深完全相同的組織微陣列蠟塊。通過切片輔助系統(tǒng)將其轉移并固定到硅化和膠化玻片上即成為組織芯片(圖1)。

組織芯片制作的專業(yè)技術要求很高,組織芯片中的各小組織直徑一般在0.6(0.2~2.0)mm左右,為保證其取材的準確性,在組織芯片制作前,要根據(jù)常規(guī)蘇木精-伊紅染色,對要取組織的類型、病變性質有一明確的病理診斷結果,以確定取樣組織的位置。然后用定位裝置的不銹鋼針穿刺,一般深度為2~3mm,將取下的組織縱向固定于適當?shù)哪＞呱?每個標本間距0.1cm。用特殊的切片機將其切成0.4μm的薄片,粘附于載玻片或硅片等固相載體上,這便是組織芯片。惡性實體腫瘤組織較均一,一般在2~3mm內組織結構上不會有太大的變化,準確性較高。而正常組織、良性腫瘤、交界性腫瘤則不然,所以每隔一段要重新對其做蘇木精-伊紅染色觀察,以確保穿刺取材部位病變的準確性,這一點十分重要。組織芯片制成后便可進行免疫組化標記;或與已用核素、生物素或熒光染料標記的探針進行雜交,將放射自顯影或激光共聚焦顯微鏡檢測到的結果輸入計算機,用相應的軟件,對實驗所得的數(shù)據(jù)、信息進行分析,最后得出結論。

2組織芯片的用途

組織芯片的應用范圍很廣,如研究目的基因在不同病變(腫瘤)間的表達差異、尋找疾病新基因〔疾病(腫瘤)中新基因、突變體與基因多態(tài)性的檢測〕、藥物的篩選、疾病的病理診斷及質量控制等。Kononen等將cDNA微陣列發(fā)展成組織芯片技術,并將645種腫瘤組織(包括乳腺癌)固定于載體上,同時進行DNA、RNA的原位雜交及蛋白檢測,其中包括P53、雌激素受體(ER)、c-myc、ERBB2、MYBL2、CCND1等6種基因產(chǎn)物,研究發(fā)現(xiàn)石蠟包埋的標本和新鮮組織標本的結果之間無顯著差異,即此項技術可以廣泛用于大樣本的回顧性研究。

Bubendorf等對264例前列腺病變(其中包括26例良性前列腺增生,208例原發(fā)性前列腺癌和30例激素難治性局限性復發(fā)性前列腺癌),運用組織芯片、免疫組化技術檢測病變組織中特異性基因產(chǎn)物的表達,結果顯示100%的激素難治性癌和36%的原發(fā)性癌IGFBP2蛋白有高表達,而良性前列腺增生者無一例IGFBP2蛋白高表達;31%的激素難治性癌和5%的原發(fā)性癌HSP27蛋白過度表達,同樣良性增生者無一例HSP27蛋白過度表達。癌基因擴增在不同種類的腫瘤中普遍存在,檢測其擴增情況可指導診斷、治療和判斷預后。

Schrama等為了同時、快速、大量地了解不同惡性腫瘤的基因改變,研制了17組不同組織來源腫瘤的FANA組織芯片,每個載體上397個不同的腫瘤組織,對其分別進行CCND1、c-myc和ERBB2探針的原位雜交,結果顯示CCND1的擴增廣泛存在于乳腺、肺、頭頸、膀胱癌和黑色素瘤中;同時在乳腺、結腸、腎、肺、卵巢、膀胱、頭頸及子宮內膜癌中還有c-myc的擴增。該研究提供了大量有重要價值的數(shù)據(jù)。Moch等把組織芯片與cDNA芯片聯(lián)合應用于腎細胞癌中CRL-1933基因的表達研究,在5184例腎腫瘤組織中有89例與正常腎組織的基因表達有顯著差異,其中以一個基因編碼CRL-1933差異最為顯著,隨后的以CRL-1933探針進行原位雜交,結果顯示CRL-1933常見于腎透明細胞癌和乳頭狀癌中,而在嫌色細胞癌和嗜酸細胞癌中則少見,且CRL-1933高表達提示預后不良。

Richter等為研究膀胱癌中cyclinE的表達,從1842例膀胱癌中采取2317個標本制成組織芯片,用免疫組化技術方法檢測cyclin蛋白的表達,用原位雜交技術檢測cyclin基因的擴增,結果顯示:前法1842例中陽性587例,后法1561例中陽性30例。提示cyclinE特異地表達于膀胱癌的亞型中,特別是早期浸潤癌,但其表達與預后無相關性。另外,該研究2周內完成了對1500例膀胱癌CCNE基因的擴增和蛋白表達的研究,充分顯示組織芯片在腫瘤研究中快速、高效的價值。