導(dǎo)語(yǔ)：如何才能寫好一篇免疫組化，這就需要搜集整理更多的資料和文獻(xiàn)，歡迎閱讀由公務(wù)員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

關(guān)鍵詞：免疫組化；水產(chǎn)品；分析

中圖分類號(hào)：F40 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

隨著免疫組化技術(shù)在臨床病理診斷中的不斷深入和廣泛應(yīng)用，我們也在試圖將它運(yùn)用到更多領(lǐng)域的研究中，本文作者主要從事的就是水產(chǎn)動(dòng)物內(nèi)源性蛋白酶的免疫組化研究。由于免疫組化技術(shù)是一個(gè)復(fù)雜的生物技術(shù)，實(shí)驗(yàn)操作步驟也較繁瑣，諸多的因素都可以影響到最終的染色結(jié)果，其中只要一步有問(wèn)題就會(huì)影響最終結(jié)果的判定。筆者結(jié)合從事免疫組化研究以來(lái)的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)談一下關(guān)于水產(chǎn)動(dòng)物免疫組化的經(jīng)驗(yàn)和體會(huì)，希望能對(duì)從事相同研究的同行有所幫助。

1 做免疫組化載玻片的準(zhǔn)備

選用高質(zhì)量的玻璃片作為免疫組化的載玻片，載玻片在使用前一定要用強(qiáng)酸洗液進(jìn)行浸泡，之后用大量的蒸餾水沖洗干凈，再用無(wú)水乙醇清洗一遍，之后用雙蒸水沖洗干凈，烘干后要經(jīng)APES處理后使用，這樣可以防止后續(xù)的處理過(guò)程中組織切片的脫落。載玻片的處理也是免疫組化中較為基礎(chǔ)的一步，如果處理不好，最后的組織切片上會(huì)有黑點(diǎn)或其他不干凈的東西，從而影響最終免疫組化染色切片的質(zhì)量。

2 組織的取材和固定

組織的取材要根據(jù)自己的實(shí)際需要自行決定，不宜過(guò)大或者過(guò)小，因?yàn)槊庖呓M化后續(xù)的處理過(guò)程中有高溫加熱抗原修復(fù)的步驟，所以組織取材不宜過(guò)大，約為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm較為適宜，否則后續(xù)處理中組織塊很容易脫落，造成后續(xù)的染色步驟無(wú)法正常進(jìn)行；但是取材也不宜過(guò)小，否則顯微鏡下視野太小，不利于結(jié)果的判定。取材后的組織要及時(shí)的進(jìn)行固定，同時(shí)還要選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ?，固定液的濃度和pH值也要把握好，我們一般選用的是10%的中性甲醛作為固定液，不恰當(dāng)?shù)墓潭ㄒ簼舛葧?huì)使組織的抗原性降低甚至消失，從而影響抗原的表達(dá)，導(dǎo)致檢測(cè)不到陽(yáng)性結(jié)果。同時(shí)，固定時(shí)間也要掌握好，時(shí)間的長(zhǎng)短也會(huì)影響組織的抗原性。此外，固定不當(dāng)還會(huì)影響到組織細(xì)胞的通透性，不利于后續(xù)染色中抗體的進(jìn)入，適宜的固定時(shí)間一般是12-24小時(shí)。固定過(guò)程中還要確保組織塊都浸沒(méi)在固定液中。

3 石蠟切片的脫蠟處理

要想得到一張高質(zhì)量的免疫組化染色切片，脫蠟處理也是其中較為關(guān)鍵和基礎(chǔ)的一步。首先要在60℃下進(jìn)行烤片30min，使石蠟融化，然后迅速放入60℃預(yù)熱的二甲苯中，但是實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)表明，有時(shí)在規(guī)定的溫度和時(shí)間條件下，石蠟并不能很好的融化，此時(shí)要延長(zhǎng)脫蠟時(shí)間或適當(dāng)提高烤片溫度，使石蠟?zāi)芎芎玫娜诨?，而且脫蠟的效果和室溫也有很大的關(guān)系，冬天脫蠟時(shí)間相對(duì)就要長(zhǎng)些，而夏天就可以適當(dāng)短些。脫蠟后的組織切片如果發(fā)白，則說(shuō)明脫蠟不徹底，這樣會(huì)造成最終的免疫組化染色結(jié)果的背景過(guò)深，非特異性染色嚴(yán)重，影響結(jié)果的判定。

4 抗原修復(fù)

在免疫組化操作的整個(gè)過(guò)程中，抗原修復(fù)是其中一個(gè)極其關(guān)鍵的步驟，它的好與壞直接影響到最終結(jié)果的可靠性和真實(shí)性。由于組織經(jīng)過(guò)中性甲醛或其他固定液固定和石蠟包埋后，組織內(nèi)部的氨基酸殘基容易形成分子內(nèi)或分子間的醛鍵，使得抗原決定簇被封閉，抗原與抗體的結(jié)合位點(diǎn)減少，從而使抗原的陽(yáng)性檢測(cè)率及著色強(qiáng)度相對(duì)減弱。

抗原修復(fù)就是采用加熱修復(fù)或高溫高壓的方式打破抗原決定簇之間的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，使抗原決定簇重新暴露出來(lái)，以便更好的和抗體進(jìn)行結(jié)合，從而提高免疫組化染色結(jié)果的陽(yáng)性率。一般采用的是加0.01M，pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液，微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，但是微波火力要控制好，否則容易造成組織切片的破碎和脫落。個(gè)人經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為，對(duì)于含肌原纖維較多的水產(chǎn)動(dòng)物組織來(lái)說(shuō)，微波火力可以適當(dāng)高些，用中高火20～30 min即可，組織切片還可以保存的較完整；但是對(duì)于含膠原纖維較多的水產(chǎn)動(dòng)物組織來(lái)說(shuō)，由于組織比較脆弱，所以微波火力要適當(dāng)降低，即先用中高火加熱至微沸，之后要改用中火或中低火，時(shí)間也要減短，大概10-15 min即可。需要注意的是，加熱過(guò)程中溶液不可沸騰，發(fā)現(xiàn)液體里有大量氣泡產(chǎn)生應(yīng)立即停止加熱，稍冷片刻再繼續(xù)加熱。

5 抗體的稀釋和保存

對(duì)于每一批新進(jìn)的抗體，都應(yīng)該按照廠家提供的建議稀釋度，進(jìn)行成倍稀釋的預(yù)實(shí)驗(yàn)，如果廠家建議稀釋度為1：50～1：100，那實(shí)驗(yàn)就要進(jìn)行1：20，1：50，1：100，1：200的梯度實(shí)驗(yàn)，最終確定實(shí)驗(yàn)應(yīng)選用的最適濃度?？贵w的稀釋要選用組織切片各步的清洗中的所用緩沖液進(jìn)行稀釋，而且要保持pH值的穩(wěn)定，這樣可以使抗體處于一種緩沖的狀態(tài)中，更有利于抗原抗體的結(jié)合?？贵w最好是現(xiàn)用現(xiàn)配，稀釋后的抗體最好一次用完，而且不能反復(fù)凍融，因?yàn)檫@樣會(huì)使抗體的效價(jià)降低，影響最終的免疫組化染色結(jié)果。

6 DAB顯色

DAB顯色劑的濃度和顯色時(shí)間也是影響免疫組化染色結(jié)果的一個(gè)很重要的因素，濃度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都會(huì)使組織切片的背景加深，甚至造成假陽(yáng)性結(jié)果。顯色不宜過(guò)快或過(guò)慢，一般以5-10min為宜。顯色時(shí)間太短（如幾秒或幾十秒），很可能說(shuō)明抗體濃度過(guò)高或者抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，需要下調(diào)抗體濃度或縮短孵育時(shí)間，也可能是前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長(zhǎng)封閉時(shí)間；顯色時(shí)間太長(zhǎng)（如超過(guò)十幾分鐘）才出現(xiàn)陽(yáng)性染色，說(shuō)明抗體濃度太低或孵育時(shí)間太短，也可能是封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

DAB顯色劑最好也是現(xiàn)用現(xiàn)配，稀釋用的緩沖液要在4℃進(jìn)行存放，而溶液A和溶液C要在-20℃避光保存，現(xiàn)配的DAB顯色劑應(yīng)該為無(wú)色或淺棕色，如果顏色過(guò)深，就不可以再使用了，應(yīng)重新配制或檢查藥品是否存放不當(dāng)或者是否過(guò)期等。

結(jié)語(yǔ)

綜上所述，免疫組化操作雖然步驟繁多，其中的影響因素也較多，但是只要把握好以上幾點(diǎn)，出現(xiàn)問(wèn)題能夠及時(shí)有效的解決，就可以做出一張背景清晰，結(jié)構(gòu)完整的免疫組化切片。

參考文獻(xiàn)

[1]倪燦榮，馬大烈，戴益民.免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及應(yīng)用[M].上海：化學(xué)工業(yè)出版社，2006.

篇2

【關(guān)鍵詞】 兒童；幽門螺桿菌；免疫組化；檢測(cè)；分析

DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2015.34.014

Hp為消化性胃潰瘍、胃炎及胃癌的主要致病原因之一。目前， 相關(guān)臨床資料已經(jīng)證實(shí)， 缺鐵性貧血以及兒童生長(zhǎng)發(fā)育較緩等均與兒童Hp之間存在相對(duì)緊密的聯(lián)系， 因此， 采用何種方式提高Hp診斷準(zhǔn)確率具有重要意義[1]。由此， 本研究針對(duì)兒童Hp免疫組化染色檢測(cè)的價(jià)值進(jìn)行分析， 現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 回顧性分析本院2013年12月～2014年12月收治的Hp感染患兒103例， 其中男女比例40：63， 年齡2～12歲， 平均年齡（7.48±1.56）歲；所有患兒在近1個(gè)月內(nèi)均未接受抗生素或者抑酸制劑治療。

1. 2 方法 所有患兒均予以免疫組化染色檢測(cè)、CIM血清學(xué)檢測(cè)、RUT試驗(yàn)以及13C-UBT試驗(yàn)。①RUT試驗(yàn)：所有患兒均予以電子胃鏡（日本OLMPUS 260）檢查， 于距離幽門5 cm處選取黏膜組織， 將此黏膜組織分成3塊， 選取1塊予以RUT實(shí)驗(yàn)， 嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作， 深紫色代表陽(yáng)性， 未變色則為陰性[2]。②13C-UBT試驗(yàn)：口服13C尿素散劑（河北省協(xié)和藥業(yè)有限公司生產(chǎn)）， 于服藥前后30 min對(duì)呼出氣體進(jìn)行采集， 應(yīng)用13C 紅外光譜儀（北京華亙安邦科技有限公司）檢測(cè)患兒呼出氣體。③免疫組化染色檢測(cè)：檢測(cè)試劑均由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)， 檢測(cè)Hp中的抗原成分， 陽(yáng)性為棕褐色。④CIM血清學(xué)檢測(cè)：選用Hp快速檢測(cè)試劑（上海安倍醫(yī)療器械貿(mào)易有限公司）， 利用免疫層析術(shù)對(duì)血清中Hp特異抗體進(jìn)行檢測(cè)。患兒需要保持空腹， 采取末梢血， 紅色條帶為陽(yáng)性。

1. 3 觀察指標(biāo) 將13C-UBT試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果作為黃金判定標(biāo)準(zhǔn)， 對(duì)本次檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判定：RUT試驗(yàn)、細(xì)菌培養(yǎng)、13C-UBT試驗(yàn)、單克隆的抗體糞便Hp抗原檢測(cè)中一項(xiàng)陽(yáng)性；Hp形態(tài)學(xué)、基因檢測(cè)、免疫學(xué)兩項(xiàng)陽(yáng)性[3]。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)。 P

2 結(jié)果

2. 1 13C-UBT試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)統(tǒng)計(jì)， 13C-UBT試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性62（60.19%）例， 陰性41（39.81%）例。

2. 2 三種檢測(cè)結(jié)果對(duì)比 以13C-UBT試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果作為黃金標(biāo)準(zhǔn)， 免疫組化染色檢測(cè)共檢出56（54.37%）例陽(yáng)性， 敏感性、特異性、準(zhǔn)確性分別為79.03%、82.93%、80.58%；RUT試驗(yàn)檢出58（56.31%）例陽(yáng)性， 敏感性、特異性、準(zhǔn)確性分別為77.42%、75.61%、76.70%；CIM血清學(xué)檢測(cè)共檢出59（57.28%）例， 敏感性、特異性、準(zhǔn)確性分別為88.71%、90.24%、89.32%。三組敏感性、特異性以及準(zhǔn)確性比較， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

3 討論

將胃黏膜標(biāo)本通過(guò)石蠟包埋、乙醇固定以及切片染色進(jìn)行處理的操作為組織切片染色， 將組織切片置于顯微鏡下進(jìn)行觀察， 其以Hp形態(tài)特點(diǎn)、分布特征作為診斷是否存在Hp感染的重要依據(jù)。臨床研究證實(shí)， 采用組織學(xué)Hp進(jìn)行診斷的同時(shí)可以進(jìn)行病理學(xué)診斷， 其中W-S銀染色法的效果尤為明顯， 能夠清晰地顯示細(xì)菌， 但不足之處在于需要耗費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間和一定的技術(shù)[4]。本研究方案將13C-UBT試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果作為黃金判定標(biāo)準(zhǔn)， 發(fā)現(xiàn)其他三組檢測(cè)結(jié)果的敏感性、特異性以及準(zhǔn)確性之間無(wú)顯著差異， 上述研究結(jié)果證實(shí)兒童Hp采用免疫組化法染色檢測(cè)具有可行性。推測(cè)上述結(jié)果的產(chǎn)生可能與組織學(xué)免疫組化法染色檢測(cè)不僅能夠清晰觀察黏膜表面、小凹腺腔中的Hp， 而且還能夠?qū)?xì)胞內(nèi)以及變形的Hp非菌體成分進(jìn)行觀察， 因而該方案檢測(cè)在敏感性、特異性兩方面均較強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示， 免疫組化法染色檢查的檢出率為54.37%， 陽(yáng)性檢出率接近于13C-UBT試驗(yàn)檢測(cè)法， 可見(jiàn)該方案的Hp陽(yáng)性檢出率較高， 故可以作為一種可靠且穩(wěn)定的檢測(cè)方法。相關(guān)研究指出， 在檢測(cè)胃癌或者低胃酸患者組織時(shí)， 受到其他相似細(xì)菌的影響， 可能導(dǎo)致誤診現(xiàn)象的存在， 因此更需要免疫組化染色進(jìn)行辨認(rèn)和診斷[5]。本研究中進(jìn)行免疫組化染色采用的試劑均由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供， 該試劑利于保存且能夠多次使用。本研究結(jié)果中免疫組化法染色檢測(cè)的敏感性相對(duì)較低， 考慮上述結(jié)果的產(chǎn)生可能與取材的部位以及取材的數(shù)量有關(guān)。

綜上所述， 組織學(xué)免疫組化染色檢測(cè)的準(zhǔn)確性較高， 技術(shù)安全可靠， 且易于長(zhǎng)期保存， 因此在兒童Hp的臨床診斷中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

[1] 徐翠， 王濤， 周平.兒童幽門螺桿菌免疫組化染色檢測(cè)分析.山東大學(xué)學(xué)報(bào)， 2014， 52（9）：82-84.

[2] 鄒明艷， 張勇， 李錦霞， 等.兒童上消化道疾病的臨床特征及與幽門螺桿菌感染的關(guān)系.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志， 2013， 29（7）：1138-1139.

[3] 張運(yùn)玲， 朱朝敏.兒童幽門螺桿菌感染的診斷與治療.實(shí)用兒科臨床雜志， 2012， 27（19）：1541-1544.

[4] 孫紅霞， 張?jiān)谕ぃ?宋建林， 等.現(xiàn)癥感染條帶檢測(cè)對(duì)兒童幽門螺桿菌感染的診斷價(jià)值.山東醫(yī)藥， 2014， 54（37）：50-51.

篇3

免疫組織化學(xué)技術(shù)是常規(guī)病理診斷中不可缺少的重要手段，盡管試劑盒及自動(dòng)免疫組化儀的使用使免疫組化結(jié)果陽(yáng)性率大幅提高但由于免疫組化染色步驟繁多，不同的實(shí)驗(yàn)室操作程序不同，結(jié)果都有所差異。影響免疫組化切片質(zhì)量控制的幾個(gè)主要因素有：組織的固定、切片的制作、適宜的溫度，抗原的修復(fù)。

組織固定

組織的正確固定可以防止細(xì)胞在自身溶酶體的作用下溶解破壞。用于免疫組化染色固定的重要意義是保存組織細(xì)胞的抗原性，使抗原不發(fā)生彌散和抗原性喪失。若固定不良在以后的過(guò)程中將無(wú)法糾正。通常使用4%的中性緩沖福爾馬林作為固定劑，固定液量要充足，一般為組織塊總體積的4～5倍。盡快固定，時(shí)間8～48小時(shí)，穿刺活檢標(biāo)本應(yīng)盡量固定6小時(shí)以上，條件不允許的情況也不能少于1小時(shí)。

切片的制作

免疫組化切片必須用防脫片，切片厚度以3～4um為宜，薄而平整。切片攤片時(shí)組織裱在載玻片的位置非常重要，如果試劑覆蓋不到組織就會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性和陰陽(yáng)“臉”的現(xiàn)象。組織盡量裱在載玻片中位。采用60℃恒溫烤片機(jī)烤片1小時(shí)以上。時(shí)間過(guò)短會(huì)造成脫片。用于脫蠟的二甲苯要經(jīng)常更換，保證脫蠟徹底。滴抗體前用免疫組化筆在組織上方下方化橫線，劃線時(shí)不要緊靠組織，以免染色時(shí)產(chǎn)生邊緣效應(yīng)?？贵w滴量設(shè)置一般80μl，組織過(guò)大或附陽(yáng)性對(duì)照是抗體滴量設(shè)置比平時(shí)量多20μl即可。

保持適宜的溫度和實(shí)驗(yàn)室溫

蠟塊制備時(shí)石蠟應(yīng)不超過(guò)62℃，最好用熔點(diǎn)低的石蠟。實(shí)驗(yàn)室溫度以25℃為基準(zhǔn)，空氣溫度在40%以上。室溫過(guò)低會(huì)影響抗原、抗體的結(jié)合，導(dǎo)致假陰性；溫度太高，室內(nèi)空氣干燥會(huì)導(dǎo)致抗體孵育過(guò)程中干片，實(shí)驗(yàn)失敗。如果實(shí)驗(yàn)室溫度過(guò)低，可以適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間，溫度過(guò)高，可適當(dāng)縮短時(shí)間，同時(shí)增加空氣溫度。為防止以上現(xiàn)象的發(fā)生，將整個(gè)過(guò)程把切片放在濕盒中再置于37℃恒溫水浴箱中進(jìn)行可以防止切片干燥而導(dǎo)致失敗，又能解決對(duì)實(shí)驗(yàn)室溫度難以達(dá)到要求的問(wèn)題。

抗原的修復(fù)

組織經(jīng)福爾馬林固定經(jīng)常會(huì)引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變而導(dǎo)致抗原決定簇被封閉，阻礙了抗原、抗體的結(jié)合。采用適合的抗原修復(fù)技術(shù)使抗原決定簇充分暴露，可以提高抗原的敏感性，染色結(jié)果要強(qiáng)于不修復(fù)。常用的抗原修復(fù)技術(shù)方法有微波加熱修復(fù)法、高溫高壓修復(fù)法、酶消化法。推薦方法：微波抗原修復(fù)法，抗原修復(fù)液以檸檬酸緩沖液(PH6.0)為佳。即微波高溫加熱3分鐘后(加熱至沸騰，92℃～95℃)，勿拿出切片待20分鐘后溫度降至室溫，用PBS液沖洗3次后進(jìn)行下一步驟。

制片質(zhì)量的好壞直接影響著診斷的準(zhǔn)確性，正確的操作是病理技術(shù)質(zhì)量控制的基礎(chǔ)。因此每位病理技術(shù)工作者都應(yīng)認(rèn)真對(duì)待制片的每個(gè)環(huán)節(jié)。

參考文獻(xiàn)

1 楊瑩,魏兵,等.組織固定和處理對(duì)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的影響及其標(biāo)準(zhǔn)化探討.中華病理學(xué)雜志,2009,38(12):852-855.

篇4

關(guān)鍵詞 尖銳濕疣 HPV 原位雜交 免疫組化

doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2010.17.177

AbstractObjective:To investigate the sensitivity and specificity of in situ hybridization(ISH)and immunohistiochemistry(IHC)associated with the diagnosis of Condyloma Acuminatum(CA)and compare it with histopathological feature.To understand the HPV genotype that the CA patients infect and the distribution pattern of HPV genotypes in infected CA patients in XiangTan area.Methods:CA samples were obtained from 124 patients with pathological diagnosis or clinical diagnosis and were examined with ISH and IHC,respectively.Results:84 cases were positive for HPV-P and 82 positive for HPV-16 by IHC.Overall positive rate is 69.35%.Expression of HPV-P and HPV-16 was evident in the upper spinous and granular layer.108(87.09%)cases were positive for HPV6/11 and 14(1129%)cases were positive for HPV16/18,6 of which were positive for HPV6/11 by ISH.The overall positive rate of HPV expression by ISH is 93.5% and the positive rate of double infections(HPV6/11+HPV16/18)analyzed by ISH was 42.85%.In addition to the upper spinous and granular layer,the strongest reaction was observed in lower or middle stratum spinosum and stratum basale.Conclusion:IHC and ISH were the necessary assisted examinations for the diagnosis of CA.ISH can detect HPV sensitvity and specially,and locate positice of the Virus in histopathology of CA.And this technique can be used to detect the type of HPV.Results:Revealed that the predominant types from patients in XiangTan were HPV11 and HPV6 with mixed infection.

Key WorodsCondyloma Acuminatum(CA);Human Papilloma Virus(HPV);In Situ Hybridization(ISH);Immunohistiochemistry(IHC)

HPV(Human Papilloma Virus)的中文名稱為人狀瘤病毒,屬于Papovaviridae家族,是一種環(huán)狀雙鏈DNA病毒,長(zhǎng)約8kb[1]。目前發(fā)現(xiàn)的HPV亞型有200多種[2]。其主要通過(guò)直接或間接的接觸或性傳播感染人類,引起人類皮膚和黏膜的多種良性狀瘤或疣,某些亞型的感染具有很強(qiáng)的致癌性。近年隨著分子檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展,可從分子水平更早期、更準(zhǔn)確的檢測(cè)出低拷貝數(shù)下的病毒感染情況[3]。而尖銳濕疣(CA)是由HPV感染所引起的性傳播疾病,其中最常見(jiàn)的是HPV6、11、16、18感染。現(xiàn)在大多數(shù)CA的病理診斷主要依靠組織形態(tài)學(xué)改變結(jié)合免疫組化來(lái)確診,但有時(shí)并沒(méi)有典型的形態(tài)學(xué)改變?nèi)缭\斷性挖空細(xì)胞等,或有典型的形態(tài)學(xué)改變而免疫組化表達(dá)卻是陰性結(jié)果,這就給尖銳濕疣的病理診斷帶來(lái)了一些困難。為了更準(zhǔn)確地診斷CA,我科對(duì)2008年1月～2009年10月的病例用原位雜交(ISH)和免疫組化(IHC)方法做了如下對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

材料與方法

材料:2008年1月～2009年10月收治在湘潭市各醫(yī)院皮膚性病科、婦科和泌尿科就診,經(jīng)臨床和/或組織學(xué)診斷尖銳濕疣的病例124例。其中男52例,女68例;年齡17～67歲,平均32.1±9.2歲。皮損表現(xiàn)為生殖器、會(huì)陰或部位出現(xiàn)單個(gè)或多個(gè)丘疹狀、狀、菜花狀或雞冠狀贅生物;部分女性為陰道和/或?qū)m頸贅生物,所有組織塊均經(jīng)10%的中爾馬林固定,石蠟包埋,在做HE切片的同時(shí),每個(gè)蠟塊切6張4白片黏附在APES處理的載玻片上,以備原位雜交和免疫組化之用。原位雜交HPV6/11和HPV16/18試劑盒;免疫組化HPV-P多克隆抗體、HPV-16單克隆抗體及二抗即用型快速免疫組化Maxvision試劑盒。

方法:①IHC:步驟為切片脫蠟、水化。加3%雙氧水室溫10分,蒸餾水沖洗。高壓鍋檸檬酸修復(fù),自然冷卻。滴加一抗室溫下孵育60分,PBS洗3×5分。加二抗室溫下孵育15分,PBS洗3×5分。DAB顯微鏡下觀察顯色,復(fù)染,封片。②ISH:按照HPV6/11和HPV16/18試劑盒說(shuō)明書操作,脫蠟和脫水,切片于二甲苯3×10分,100%酒精2×3分,干燥。增強(qiáng)液處理,微波加熱30分。梯度酒精脫水,干燥。雜交,分別滴加25 HPV6/11和HPV16/18試劑盒探針加蓋,95℃變性8分,30%濕盒增效液的濕盒中37℃孵育過(guò)夜。45℃ PBS脫蓋、浸泡25分,加一抗37℃孵育30分,PBS浸泡3×5分,加二抗增強(qiáng)劑室溫20分,PBS浸泡3×5分,加二抗室溫30分,PBS浸泡3×5分,DAB顯微鏡下觀察顯色,復(fù)染,封片。兩組均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照為已知陽(yáng)性的尖銳濕疣陽(yáng)性片;空白對(duì)照為ISH用PBS代替探針,IHC用PBS代替一抗染色。

陽(yáng)性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):細(xì)胞核棕褐色著色,如病毒拷貝數(shù)較低,為細(xì)胞核內(nèi)散在棕褐色點(diǎn)狀顆粒[4]。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:敏感性用陽(yáng)性標(biāo)本中原位雜交檢測(cè)陽(yáng)性的百分?jǐn)?shù)計(jì)算,特異性用陰性標(biāo)本中原位雜交檢測(cè)陰性的百分?jǐn)?shù)計(jì)算。分析用卡方檢驗(yàn)檢查樣本差異的顯著性。

結(jié) 果

所有結(jié)果均由兩位高年資病理醫(yī)師閱片后得出。IHC陽(yáng)性以細(xì)胞核/核周棕褐色著色為準(zhǔn)。其中HPV-P陽(yáng)性84例,HPV16陽(yáng)性82例,總陽(yáng)性率為6935%(86/124),陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在棘細(xì)胞上層及顆粒細(xì)胞層。ISH陽(yáng)性以細(xì)胞核棕褐色著色,如病毒拷貝數(shù)較低,為細(xì)胞核內(nèi)散在棕褐色點(diǎn)狀顆粒為標(biāo)準(zhǔn)[4]。其中HPV6/11陽(yáng)性108例,HPV16/18陽(yáng)性14例。HPV16/18陽(yáng)性的14例中有6例合并有HPV6/11陽(yáng)性。ISH總陽(yáng)性率為93.5%(116/124),陽(yáng)性細(xì)胞主要出現(xiàn)在棘層中上層、顆粒層及角化不全細(xì)胞核內(nèi),在角化不全層被擠壓的細(xì)胞核內(nèi)也可見(jiàn)到陽(yáng)性表達(dá)可見(jiàn)。

討 論

原位雜交將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交,稱為原位雜交。使用DNA或者RNA探針來(lái)檢測(cè)與其互補(bǔ)的另一條鏈在細(xì)菌或其他真核細(xì)胞中的位置。近年來(lái),隨著免疫組織化學(xué)技術(shù)的發(fā)展和各種特異性抗體的出現(xiàn),使許多疑難腫瘤得到了明確診斷。在常規(guī)腫瘤病理診斷中,5%～10%的病例單靠H.E.染色難以作出明確的形態(tài)學(xué)診斷。尤其是免疫組化在腫瘤診斷和鑒別診斷中的實(shí)用價(jià)值受到了普遍的認(rèn)可,其在低分化或未分化腫瘤的鑒別診斷時(shí),準(zhǔn)確率可達(dá)50%～75%。免疫組織化學(xué)的臨床應(yīng)用主要包括以下幾方面:惡性腫瘤的診斷與鑒別診斷;確定轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的原發(fā)部位;對(duì)某類腫瘤進(jìn)行進(jìn)一步的病理分型;軟組織腫瘤的治療一般需根據(jù)正確的組織學(xué)分類,因其種類多、組織形態(tài)相像,有時(shí)難以區(qū)分其組織來(lái)源,應(yīng)用多種標(biāo)志進(jìn)行免疫組化研究對(duì)軟組織腫瘤的診斷是不可缺少的;發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶,有助于臨床治療方案的確定,包括手術(shù)范圍的確定。為臨床提供治療方案的選擇。

尖銳濕疣(CA)是HPV感染的全球范圍內(nèi)廣泛流行的性傳播疾病之一,為全球各種性傳播性疾病的第一或第二位[5],主要是HPV6、11、16、18、30～32、40、42～44、51～55等型引起。其中HPV6、11型約占90%[6],在世界各國(guó)都占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)尖銳濕疣發(fā)病率逐年增加。有研究顯示,近10年尖銳濕疣的發(fā)病率已增長(zhǎng)10倍。所以CA的診斷也越來(lái)越受到病理科的重視,而一般情況下尖銳濕疣的診斷主要依賴其典型的組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)如表皮角化過(guò)度伴角化不全,棘層明顯肥厚,挖空細(xì)胞伴實(shí)性或疣狀、狀的外生性生長(zhǎng)。淺表有空泡的角質(zhì)形成細(xì)胞(空泡化細(xì)胞)為尖銳濕疣的較為特征性的組織學(xué)表現(xiàn),也成為診斷尖銳濕疣的重要形態(tài)學(xué)依據(jù),但非典型尖銳濕疣空泡化細(xì)胞較少或無(wú)。所以單憑空泡化細(xì)胞等形態(tài)學(xué)改變來(lái)診斷尖銳濕疣是不可靠的,尤其是尖銳濕疣亞臨床損害和早期損害可以不出現(xiàn)這一特征。因此對(duì)HPV病毒的檢測(cè)就顯得更為重要。HPV是雙鏈閉環(huán)的小DNA病毒,包含約8000個(gè)堿基對(duì),其中包括8個(gè)早期開放讀碼框架(E1-E8)、2個(gè)晚期讀碼框架和一個(gè)非編碼長(zhǎng)控區(qū)。在早期開放讀碼框架中,E6和E7基因?qū)?xì)胞生長(zhǎng)刺激最為重要,E6、E7編碼的E6、E7蛋白可引起子宮頸上皮細(xì)胞永生化。而晚期讀碼框L1和L2基因分別編碼HPV的主要和次要衣殼蛋白,組裝成HPV的衣殼[7]。我科用免疫組化方法對(duì)124例CA標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),其陽(yáng)性率為694%(86/124),而原位雜交總陽(yáng)性率為935%(116/124),其中HPV6/11型占大多數(shù),與國(guó)內(nèi)外的報(bào)道大致相似。從以上結(jié)果可以看出免疫組化檢測(cè)陽(yáng)性率明顯低于原位雜交檢測(cè)HPV的陽(yáng)性率,其原因主要是由于免疫組化方法是屬于HPV衣殼抗原檢測(cè),此蛋白僅在后期病毒顆粒中產(chǎn)生,且衣殼蛋白的合成及病毒顆粒的裝配只發(fā)生在最終分化的顆粒層及棘細(xì)胞上層[8];其次免疫組化方法需要足夠量的病毒顆粒才有陽(yáng)性反應(yīng);另外衣殼蛋白在病理制片過(guò)程中也會(huì)受到固定、修復(fù)等因素的影響使一些抗原喪失。而原位雜交法則是利用堿基互補(bǔ)的原理,一種探針只能與其對(duì)應(yīng)的核酸序列雜交,只要每個(gè)細(xì)胞中有50～100個(gè)病毒DNA拷貝即可獲得陽(yáng)性結(jié)果[9],并且不受各種影響抗原表達(dá)的因素的影響,故陽(yáng)性率及陽(yáng)性強(qiáng)度高,且背景清晰。我們?cè)浑s交實(shí)驗(yàn)中的8例陰性病例我們分析有可能是細(xì)胞中病毒拷貝太少或者是除HPV6/11/16/18型外的其他型別感染所致。

綜上所述,可以看出原位雜交法檢測(cè)HPV6/11、HPV16/18比免疫組化法敏感性和特異性都要高,且定位準(zhǔn)確,背景清晰,操作快速簡(jiǎn)便,更有助于HPV分型研究,給臨床治療、監(jiān)測(cè)及判斷預(yù)后提供重要依據(jù)。因此HPV原位雜交是診斷尖銳濕疣的一種重要輔助手段,如廣泛應(yīng)用,可以使尖銳濕疣的病理診斷更加準(zhǔn)確,可靠。我們的研究發(fā)現(xiàn),湘潭地區(qū)的HPV感染以HPV6/11型為主,有較高的混合感染率。

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篇5

[關(guān)鍵詞] 乳腺癌；免疫組化指標(biāo)；表達(dá)；相關(guān)性

[中圖分類號(hào)] R737.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2015）05（c）-0008-03

[Abstract] Objective To explore the expressions and significance of immunohistochemical indexes including Ki67，VEGF，p53 and C-erbB-2 in breast cancer tissue. Methods 70 patients with breast cancer admitted into our hospital from April 2012 to April 2014 were selected as research objects. Pathological tissue was taken after surgery and expression levels of Ki67，VEGF，p53 and C-erbB-2 in breast cancer tissue were detected by immunohistochemical method and correlations of pathological factors in breast cancer were analyzed. Results The highest positive expression rate in breast cancer tissue was Ki67 accounting for 75.71%，and then C-erbB-2 for 67.14%.Expression level of Ki67 had an obvious correlation with neoplasm staging in breast cancer patients. The higher cancer staging was，the higher positive rate of Ki67 became in mammary tissue，expression of C-erbB-2 positive rate of breast cancer patients related to age，the younger，breast C-erbB-2 positive rate was higher，p53 and positive rate of VEFG had no embodied obvious correlation with patient age，tumor size，tumor staging. Conclusion Positive rate of Ki67 expression in mammary tissue in breast cancer patients has a positive correlation with cancer staging. C-erbB-2 expression level has a close relation with the age of patient. The positive expression of Ki67 is positively correlated with the expression of C-erbB-2 and p53，and the Ki67 can be used as an important marker for evaluating the progression of breast cancer.

[Key words] Breast cancer；Immunohistochemical index；Expression；Correlation

乳腺癌是臨床常見(jiàn)女性惡性腫瘤之一，有較高的發(fā)病率[1]，且統(tǒng)計(jì)資料顯示，全球范圍內(nèi)每年新增乳腺癌病例超過(guò)100萬(wàn)，超過(guò)15%的惡性腫瘤患者死于乳腺癌。當(dāng)前乳腺癌已成為威脅女性身體健康的關(guān)鍵疾病。有報(bào)道顯示，腫瘤的產(chǎn)生、進(jìn)展均與細(xì)胞的增殖存在一定的相關(guān)性[2]。Ki67是增殖細(xì)胞相關(guān)核抗原中的一種，近年來(lái)，有大量研究證實(shí)可將Ki67作為評(píng)估乳腺癌腫瘤增殖活性的相關(guān)標(biāo)志物，其有較好的靈敏度與特異度[3-4]?；诖耍窘M采用免疫組化法對(duì)乳腺癌組織中Ki67、VEGF、p53、C-erbB-3表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)分析，旨在證實(shí)其在乳腺癌組織中的表達(dá)及應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將本院自2012年4月～2014年4月收治的70例乳腺癌患者作為研究對(duì)象。取患者乳腺癌術(shù)后病理組織標(biāo)本作為研究標(biāo)本。所有納入研究患者均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為乳腺癌，均為女性，術(shù)前均未接受化療、放射治療等抗癌治療手段，納入前均接受血常規(guī)、肝腎功能常規(guī)、胸片、腹部超聲及盆腔超聲檢查，排除癌癥遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移患者。年齡29～83歲，平均（48.2±1.6）歲；乳腺癌分期：Ⅰ期20例，Ⅱ期39例，Ⅲ期11例；腫瘤分類：導(dǎo)管內(nèi)癌1例，浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌64例，黏液腺癌4例，浸潤(rùn)小葉癌1例。

1.2 試劑與方法

免疫組化染色一抗Ki67、VEGF、P53與C-erbB-2工作液。將所有納入研究組織標(biāo)本均給予甲醛液固定1 d，作石蠟包埋，連續(xù)切片，貼于含APES的載玻片上，在60℃條件下烘烤2 h。隨后作免疫組化染色。常規(guī)石蠟切片后脫蠟，在濃度為3%的雙氧水室溫下孵育10 min左右，清除過(guò)氧化物酶活性，行蒸餾水沖洗，PBS洗滌，浸泡，時(shí)間為5 min。后作抗原修復(fù)，血清封閉，在室溫條件下孵育10 min，棄血清，加入四種一抗工作液，在37℃溫度環(huán)境下孵育2 h，作PBS洗滌，重復(fù)3次，5 min/次，滴入二抗，加入辣根酶標(biāo)記物，孵育0.5 h后，作PBS洗滌，重復(fù)3次。作DAB顯色處理，隨后采用清水沖洗，復(fù)染，最后作封面處理。并將陽(yáng)性標(biāo)本作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，以PBS作為陰性對(duì)照。每張切片均至少取3個(gè)高倍視野，觀察細(xì)胞顏色及比例。

1.3 陽(yáng)性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

①Ki67細(xì)胞陽(yáng)性：細(xì)胞多數(shù)呈棕黃色，核著色表現(xiàn)，少數(shù)呈弱細(xì)胞質(zhì)染色；p53細(xì)胞陽(yáng)性：呈棕黃色、核著色表現(xiàn)，少部分呈現(xiàn)較弱細(xì)胞質(zhì)染色表現(xiàn)；VEGF陽(yáng)性：胞漿著色；陰性：不著色。陰性（-）：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)低于10%。②Ki67、p53及VEGF陽(yáng)性程度標(biāo)準(zhǔn)：弱陽(yáng)性（+）：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)10%～25%；陽(yáng)性（++）：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>25%～50%；強(qiáng)陽(yáng)性（+++）：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)超過(guò)50%。③C-erbB-2陽(yáng)性：膜著色，著色細(xì)胞數(shù)超過(guò)10%。陰性：不著色；弱陽(yáng)性：著色弱，不連續(xù)；陽(yáng)性：著色中等，部分不連續(xù)；強(qiáng)陽(yáng)性：著色強(qiáng)，且呈連續(xù)性表現(xiàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。等級(jí)資料用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ki67、VEGF、p53與C-erbB-2在乳腺癌組織中的表達(dá)情況

Ki67在乳腺癌組織中表達(dá)陽(yáng)性率最高，為75.71%，其次為C-erbB-2，為67.14%（表1）。

2.2 Ki67、VEGF、p53與C-erbB-2的表達(dá)與病理因素的關(guān)系

乳腺癌組織Ki67表達(dá)水平與乳腺癌患者年齡、腫瘤直徑無(wú)明顯聯(lián)系，但與乳腺癌患者腫瘤分期有顯著相關(guān)性，癌癥分期越高，乳腺組織Ki67陽(yáng)性率越高，C-erbB-2表達(dá)陽(yáng)性率與乳腺癌患者年齡有相關(guān)性，年齡越輕，乳腺C-erbB-2陽(yáng)性率越高，p53與VEGF陽(yáng)性率與患者年齡、腫瘤直徑、腫瘤分期均未體現(xiàn)明顯相關(guān)性（表2）。

3 討論

Ki67核抗原在細(xì)胞增殖中的表達(dá)作用最早由國(guó)外學(xué)者提出，當(dāng)前已被臨床上認(rèn)定為核增殖的特異性標(biāo)志物，主要存在于人體細(xì)胞周期中除G0期外的不同階段，最初表達(dá)于G1期，在G2期與S期增殖明顯，到M期則達(dá)到峰值[5-6]。且于細(xì)胞分裂晚期消失，其半衰期相對(duì)較短，在脫離細(xì)胞周期后可快速降解，因此可將其作為測(cè)定腫瘤細(xì)胞增殖活性的重要標(biāo)志[7]。當(dāng)前臨床上已有大量研究報(bào)道均證實(shí)，Ki67可反饋乳腺癌患者腫瘤增殖率，可將其作為評(píng)估腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后水平的重要標(biāo)志[8-9]。

本組研究結(jié)果證實(shí)，所有乳腺癌患者乳腺組織中Ki67表達(dá)陽(yáng)性率達(dá)到75.71%，與早期研究學(xué)者報(bào)道的77.9%較為相近[10]。同時(shí)本組研究證實(shí)，患者乳腺組織Ki67表達(dá)水平同樣與乳腺癌臨床分期存在一定的相關(guān)性，晚期腫瘤患者陽(yáng)性率明顯高于早中期患者，提示乳腺組織Ki67水平與癌癥組織的生長(zhǎng)與浸潤(rùn)存在關(guān)聯(lián)[11]。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)較多報(bào)道對(duì)Ki67表達(dá)與乳腺癌分期進(jìn)行研究，僅有部分文獻(xiàn)提示可將Ki67指標(biāo)作為評(píng)估乳腺癌患者化療敏感性的重要標(biāo)志[12]。同時(shí)本組研究證實(shí)，患者乳腺組織Ki67表達(dá)水平與其是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)明顯相關(guān)性，與早期研究報(bào)道意見(jiàn)尚未統(tǒng)一，有待下一步探究。

當(dāng)前也有部分研究報(bào)道提示，腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移同樣與新生血管的形成存在一定的相關(guān)性[13]。而VEGF屬于調(diào)控血管生成的關(guān)鍵因子，可作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，在細(xì)胞有絲分裂中起到重要的作用，可增加毛細(xì)血管通透性，進(jìn)而達(dá)到促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的目的[14]。且有報(bào)道證實(shí)，VEGF與Ki67在乳腺腫瘤的進(jìn)展過(guò)程中有顯著的協(xié)同作用，癌癥細(xì)胞增殖活性提升，同樣可促進(jìn)新生血管的形成[15]。而本組研究結(jié)果證實(shí)，乳腺組織中VEGF與Ki67的共同表達(dá)與患者腫瘤直徑、癌癥分期有明顯的相關(guān)性，因此認(rèn)為惡性腫瘤的進(jìn)展與腫瘤細(xì)胞的增殖活性及新生血管等不同的生物學(xué)因素相關(guān)。而p53位于17號(hào)染色體短臂上，其中野生型p53基因可限制細(xì)胞轉(zhuǎn)化，抑制癌細(xì)胞活動(dòng)，突變型p53基因則可引起細(xì)胞的癌變及轉(zhuǎn)化，促進(jìn)癌細(xì)胞無(wú)限增生，是引起乳腺癌患者病情進(jìn)展及惡化的相關(guān)因子。有研究者表示，超過(guò)50%的腫瘤均存在p53基因突變表現(xiàn)，而統(tǒng)計(jì)顯示乳腺癌患者p53蛋白陽(yáng)性率在20%～60%，本組p53陽(yáng)性率為62.86%，稍高于早期報(bào)道，且其與Ki67的表達(dá)呈正相關(guān)，提示兩者均在乳腺癌腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)與協(xié)同作用。此外，p53基因突變?cè)谝欢ǔ潭壬峡烧{(diào)節(jié)促進(jìn)血管增生的內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，調(diào)控腫瘤血管生長(zhǎng)。且p53表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤其侵襲性高，需引起重視。C-erbB-2則為來(lái)源于細(xì)胞的癌基因，一般情況下處于未激活狀態(tài)，參與細(xì)胞的分化與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)構(gòu)成，具備腫瘤轉(zhuǎn)化活性。當(dāng)前已公認(rèn)其為與乳腺癌發(fā)生與進(jìn)展相關(guān)密切的腫瘤基因。其過(guò)度表達(dá)通常提示乳腺癌腫瘤程度高，患者預(yù)后水平差。本組結(jié)果證實(shí)，乳腺癌患者C-erbB-2表達(dá)水平與患者年齡呈明顯相關(guān)性，年齡越輕，其乳腺癌陽(yáng)性表達(dá)率越高。進(jìn)一步證實(shí)，腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展與多種基因變異及協(xié)同作用相關(guān)。

綜上，乳腺癌患者乳腺組織中Ki67表達(dá)的陽(yáng)性率與癌癥分期呈正相關(guān)，C-erbB-2的表達(dá)水平與患者年齡有密切聯(lián)系，且Ki67陽(yáng)性表達(dá)與C-erbB-2及p53表達(dá)呈正相關(guān)，可將Ki67指標(biāo)作為評(píng)估乳腺癌患者病情進(jìn)展的重要標(biāo)志。

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篇6

[關(guān)鍵詞] 細(xì)胞涂片；細(xì)胞塊切片；胸腔積液；免疫組化染色；診斷

[中圖分類號(hào)] R730.48 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2014）01（a）-0179-02

胸腔積液的來(lái)源主要于非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌和惡性彩胸膜間皮瘤等，長(zhǎng)期以來(lái)，胸腔腔積液的診斷主要采用細(xì)胞涂片檢查，其診斷的敏感度可達(dá)78%[1]。但單純應(yīng)用細(xì)胞涂片進(jìn)行檢查，無(wú)法對(duì)轉(zhuǎn)移性癌和漿膜腔原發(fā)性間皮性腫瘤進(jìn)行區(qū)別，這給臨床治療帶來(lái)了較大的困難，目前臨床研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)細(xì)胞塊切片結(jié)合免疫組化染色的檢測(cè)方法效果較好[2]。為探討細(xì)胞塊切片免疫組化染色在胸腔積液病理診斷中的應(yīng)用價(jià)值，該研究采用常規(guī)細(xì)胞塊切片結(jié)合免疫組化染色的檢測(cè)方法對(duì)2010年6月―2012年7月收集82例胸腔積液患者進(jìn)行診斷，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取該院呼吸內(nèi)科收治的82例胸腔積液患者為研究對(duì)象，其中男52例，女30例，年齡16～77歲，平均年齡為（46.83±3.09）歲；納入標(biāo)準(zhǔn)：送檢標(biāo)本均為胸腔積液；每1例患者均給予常規(guī)細(xì)胞涂片和細(xì)胞塊切片及免疫組化染色檢測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 患者入院第2天清晨由護(hù)理人員收集患者新鮮的胸腔積液100 mL，分為4個(gè)試管進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速：2 500 r/min，離心時(shí)間：10～15 min；離心后采用移液槍吸出上清液；取部分沉渣進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞涂片學(xué)檢查，合并余下的沉渣，加入戊二醛 2.5 mL 進(jìn)行固定，離心，轉(zhuǎn)速：2 500 r/min，離心時(shí)間：5 min；離心后采用移液槍吸出上清液，取出沉渣，濾紙包好后，常規(guī)脫水，用石蠟包埋切片，應(yīng)用HE染色。

1.2.2 免疫組化 采用 Maxvision 快捷免疫組織化學(xué) S-P法染色，Maxvision 試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺（ DAB） 顯色試劑均購(gòu)于福建邁新有限公司。CEA、CK7、WT-1、CR抗體均購(gòu)于自基因公司，染色過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

結(jié)果判斷[3]：CEA 及 CK7 在胞漿或胞漿胞膜同時(shí)出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性，Calretinin在細(xì)胞漿、細(xì)胞核和細(xì)胞膜或細(xì)胞漿膜出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性，WT-1 的細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。間皮細(xì)胞或腺癌細(xì)胞達(dá) 10% 以上細(xì)胞陽(yáng)性診斷為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組陽(yáng)性率比較分析

細(xì)胞塊切片結(jié)合免疫組化陽(yáng)性82例，陽(yáng)性率為100%，常規(guī)細(xì)胞學(xué)涂片的陽(yáng)性46例，陽(yáng)性率56.10%，細(xì)胞塊切片結(jié)合免疫組化陽(yáng)性率明顯高于常規(guī)細(xì)胞學(xué)涂片，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

2.2 腺癌與間皮性腫瘤細(xì)胞不同抗體表達(dá)分析

結(jié)果顯示，CEA、CK7 是腺癌較為特異性的抗體，而CR 是間皮性腫瘤細(xì)胞較為特異性的抗體，各抗體在腺癌細(xì)胞和間皮性腫瘤細(xì)胞均有交叉表達(dá)，見(jiàn)表 2。

3 討論

胸腔積液是胸部腫瘤的常見(jiàn)并發(fā)癥[4]，腫瘤患者并發(fā)胸腔積液后，使間皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞均浸泡于胸腔積液中，長(zhǎng)期受胸腔積液的刺激，致使間皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞均發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，而使兩種細(xì)胞應(yīng)用常規(guī)方法很難鑒別是出來(lái)[5]。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是細(xì)胞學(xué)涂片，常規(guī)細(xì)胞學(xué)涂片操作易于掌握，且可有效保持細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)，但其準(zhǔn)確性及敏感性不高，尤其是對(duì)惡性胸腔積液患者的診斷準(zhǔn)確性較低，約為60%[6]。

免疫組化染色法是利用已標(biāo)記的特異性抗體來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)未知抗原，并通過(guò)酶所產(chǎn)生的著色反應(yīng)來(lái)顯示細(xì)胞的活性、定位及其分布。此方法操作易于掌握，陽(yáng)性物質(zhì)定位準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)。同時(shí)，細(xì)胞塊的應(yīng)用彌補(bǔ)了傳統(tǒng)細(xì)胞涂片方法單一的缺點(diǎn)，使細(xì)胞標(biāo)本得以保存，具有了連續(xù)切片的性質(zhì)，更利于進(jìn)行多項(xiàng)檢查。

該組研究結(jié)果顯示，常規(guī)細(xì)胞學(xué)涂片的診斷陽(yáng)性率為56.10%，這與以往報(bào)道相似。采用CEA、CK7、WT-1、CR抗體進(jìn)行免疫組化檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，82例患者均得到了明顯的診斷，其診斷陽(yáng)性率為100.00%；說(shuō)明細(xì)胞塊切片聯(lián)合免疫組化染色可顯著提高胸腔積液診斷的陽(yáng)性率，為臨床的治療提供了理論參考，值得臨床廣泛推廣和應(yīng)用。

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篇7

關(guān)鍵詞：細(xì)針穿刺；卵巢癌；上皮型間皮瘤；免疫組織化學(xué)；聯(lián)合抗體

腹膜惡性間皮瘤（PMM）與低級(jí)別卵巢漿液性癌（OSA）細(xì)胞學(xué)形態(tài)極其相似，單純依靠組織學(xué)鑒別二者非常困難，尤其是經(jīng)后穹隆盆腔腫瘤穿刺標(biāo)本，由于取材困難，穿刺過(guò)程中組織損傷，診斷更加困難，只能依靠免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行鑒別診斷。目前標(biāo)記間皮瘤的抗體較多，但敏感性和特異性差異很大，找到一組簡(jiǎn)單可靠的抗體組合正成為目前研究的熱點(diǎn)。本研究選取我院2013年1月～2014年12月卵巢低級(jí)別漿液性癌40例，腹膜上皮型惡性間皮瘤26例，應(yīng)用CK5/6、CK8/18、CEA、Vim、Cal、D2-40、ER、PR、CA125九種抗體對(duì)盆腔上皮型惡性間皮瘤和卵巢漿液性癌進(jìn)行檢測(cè)，希望找到鑒別二者較好的抗體組合。

1資料與方法

1.1一般資料 選用我院2013年1月～2014年12月盆腔腫瘤手術(shù)標(biāo)本66例，其中上皮型惡性間皮瘤26例，男性17例，女性9例，16例有石棉接觸史，年齡35～72歲，平均（52.8±5.6）歲。卵巢低級(jí)別漿液性癌40例，年齡40～75歲，平均（50.5±12.4）歲。

1.2 SP法免疫組化試劑盒來(lái)源（表1）

1.3方法 所有標(biāo)本均經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)4μm厚度連續(xù)切片，HE染色。免疫組化采用SP法，嚴(yán)格按照使用說(shuō)明書操作，DAB顯色，蘇木精復(fù)染、脫水、透明和封固。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4結(jié)果判定 免疫組化染色陽(yáng)性信號(hào)呈棕褐色或棕黃色，ER、PR定位在細(xì)胞核；CK5/6、CK8/18、Cal、Vim定位在細(xì)胞漿；D2-40、CEA、CA125定位在細(xì)胞漿/膜，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

2結(jié)果

2.1病理組織學(xué)形態(tài) 40例卵巢癌病例均為低級(jí)別漿液性癌，呈腺管狀、狀排列，瘤細(xì)胞單層或復(fù)層，呈矮柱狀或立方型，相似于間皮細(xì)胞，結(jié)構(gòu)較寬，可見(jiàn)多級(jí)分枝，有的間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)砂粒體（圖1，圖2）。26例上皮型惡性間皮瘤光鏡下組織結(jié)構(gòu)多樣，表現(xiàn)為管狀、狀、實(shí)性巢狀等（圖3）。細(xì)胞圓形或卵圓形，核通常為單個(gè)，居中或稍偏位，核仁1～2個(gè)，核分裂像少見(jiàn)，少數(shù)病例可伴有砂粒體形成。上皮型惡性間皮瘤在CK5/6、Cal、D2-40中高表達(dá)（圖4～圖6），而卵巢癌在ER、PR、CA125中高表達(dá)（圖7～圖9）。

2.2免疫組化表達(dá)情況（表2）

3討論

盆腔腫瘤中，腹膜惡性間皮瘤和卵巢癌為最常見(jiàn)的2種腫瘤，由于組織來(lái)源不同，治療方法也不相同，因此組織學(xué)的分型對(duì)指導(dǎo)臨床的治療、腫瘤的分期及預(yù)后的判斷有著重要的意義。有文獻(xiàn)報(bào)道惡性間皮瘤90%發(fā)生于胸膜[1]，3%～12%發(fā)生于腹膜[2]。

腹膜間皮瘤是腹腔內(nèi)惡性度極高的腫瘤，目前尚無(wú)有效的治療方法，大多數(shù)死于診斷后的1～2年內(nèi)，男性發(fā)病多于女性，發(fā)生于兒童的病例罕見(jiàn)報(bào)道[3]。根據(jù)國(guó)內(nèi)資料統(tǒng)計(jì)，間皮瘤的發(fā)病率為0.04%，且多與石棉接觸有關(guān)[4]，其他原因包括職業(yè)和周圍環(huán)境的接觸[5]。近年其發(fā)病率有逐年增多的趨勢(shì)。有研究表明，惡性間皮瘤的潛伏期為35～40年[6]，目前發(fā)病率增高的原因，可能與20世紀(jì)70年代我國(guó)大面積手紡石棉加工有關(guān)。

由于間皮細(xì)胞的組織學(xué)形態(tài)多樣，在光鏡下與卵巢分化好的腺癌很難鑒別，尤其是卵巢低級(jí)別漿液性癌，光鏡下幾乎無(wú)法鑒別。所以尋找一組有效的抗體能夠鑒別惡性間皮瘤與卵巢癌的組織學(xué)類型，對(duì)病人的準(zhǔn)確診斷和正確治療尤為必要。由于單一抗體的敏感性、特異性不同，往往達(dá)不到鑒別診斷的作用，因此，國(guó)際間皮瘤小組建議至少同時(shí)使用2種間皮標(biāo)記和2種其他癌的標(biāo)記[7]。

3.1 CK5/6 通常標(biāo)記鱗狀上皮和導(dǎo)管上皮的基底細(xì)胞、部分前列腺基底細(xì)胞以及部分鱗狀上皮生發(fā)層細(xì)胞，腺上皮細(xì)胞不表達(dá)。在肉瘤樣惡性間皮瘤中陽(yáng)性率較低，而在上皮型間皮瘤中高表達(dá)，本結(jié)果中，CK5/6在PMM中的陽(yáng)性率極高（100%），而卵巢癌全部陰性?？梢宰鳛镻MM的可靠標(biāo)記物用于PMM和OSA的鑒別診斷中。

3.2 CK8/18 是單層腺上皮來(lái)源腫瘤的首選標(biāo)記物，鱗狀上皮不表達(dá)，由于間皮細(xì)胞多潛能分化的特性，CK8/18在間皮腫瘤也高表達(dá)，通常和CK5/6聯(lián)合使用標(biāo)記間皮細(xì)胞。

3.3 CEA 是腺癌常用的標(biāo)記物，在少部分間皮瘤中有局灶弱的陽(yáng)性表達(dá)，腺癌細(xì)胞分化越低則CEA含量越高。本結(jié)果CEA在OSA中表達(dá)（87.5%）明顯高于PMM中的表達(dá)（3.8%），因此CEA是鑒別腺癌和間皮瘤的重要標(biāo)記物，可作為二者鑒別的一線抗體使用。

3.4 Vim 在梭形細(xì)胞為主型惡性間皮瘤呈陽(yáng)性表達(dá)，國(guó)外的研究也表明，Vim在間皮瘤的陽(yáng)性率較高，而在腺癌為陰性，雖然Vim在本結(jié)果中的表達(dá)率僅為76.9%。而在卵巢腺癌中全部為陰性表達(dá)，二者之間陽(yáng)性率差異仍十分顯著。

3.5 Calretinin是一種鈣結(jié)合蛋白，表達(dá)于神經(jīng)組織、脂肪組織、間皮細(xì)胞，腺癌極少表達(dá)，因此，Calretinin是上皮樣間皮瘤最敏感和特異的抗體，在鑒別腺癌和間皮瘤中有較強(qiáng)的特異性。

3.6 D2-40 是一種分子量為40kDa的糖蛋白，主要存在于胚胎和生殖細(xì)胞腫瘤中，近幾年的研究表明，D2-40在上皮型間皮瘤中亦高表達(dá)，本研究D2-40在間皮瘤中表達(dá)率為95.2%，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。因此可作為間皮瘤鑒別診斷有用的標(biāo)記物。

3.7 ER 雌激素受體存在于正常子宮內(nèi)膜、平滑肌細(xì)胞以及正常乳腺的上皮細(xì)胞中 ，在間皮瘤中陰性表達(dá)，在卵巢漿液性腫瘤中陽(yáng)性表達(dá)，此抗體識(shí)別雌激素受體的N端功能區(qū)（A/B區(qū)），研究表明ER表達(dá)陽(yáng)性的病人對(duì)其進(jìn)行激素治療往往有效，預(yù)后較好。

3.8 PR 孕激素受體表達(dá)有兩個(gè)異構(gòu)體PRA（94KDa）和PRB（114 Kda），其功能是作為配體活化后轉(zhuǎn)錄因子存在于子宮內(nèi)膜、卵巢及乳腺上皮細(xì)胞中，間皮瘤陰性表達(dá)。PR也可作為鑒別間皮瘤的有用標(biāo)記物之一。

3.9 CA125 幾乎在所有的卵巢漿液性癌中陽(yáng)性表達(dá)，宮頸、子宮內(nèi)膜、乳腺、胃腸道及甲狀腺腺瘤均有少數(shù)表達(dá)。而卵巢粘液性腫瘤和間皮瘤陽(yáng)性率很低，對(duì)鑒別診斷有重要的參考價(jià)值。單純的形態(tài)學(xué)診斷間皮瘤非常困難，目前對(duì)于間皮瘤的診斷基本依賴于免疫組化的輔助診斷，迄今為止尚無(wú)一種抗體對(duì)間皮瘤完全特異，都是依靠一組抗體的聯(lián)合應(yīng)用。以往用于間皮瘤的抗體組還有HBME、WT1、P-CK等，但由于抗體昂貴或敏感性、特異性、穩(wěn)定性差等原因沒(méi)有廣泛的推廣使用。本研究抗體組試劑便宜、操作簡(jiǎn)單，特異性、敏感性較高，使間皮瘤的診斷與鑒別診斷水平有了很大提高。

綜上所述，由于惡性間皮瘤的病理形態(tài)多樣，對(duì)于臨床影像學(xué)和組織學(xué)鑒別困難的病例，需要依賴于免疫組織化學(xué)抗體的聯(lián)合檢測(cè)?？贵w組CK5/6、Vim、D2-40和 Cal對(duì)間皮瘤具有較強(qiáng)的敏感性和特異性，而CK8/18、CEA、ER、PR、CA125對(duì)腺癌敏感，兩組抗體的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)PMM和OSA的鑒別診斷有重要意義。

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篇8

概述：當(dāng)前，經(jīng)過(guò)權(quán)威資料認(rèn)證的免疫組化實(shí)驗(yàn)方法，已經(jīng)對(duì)免疫組化的最基本問(wèn)題做出了解答，并可以作為免疫組化技術(shù)中一種相對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)。本文對(duì)免疫組化的操作步驟作出了一些具體的描述，提出了一些注意事項(xiàng)，并且對(duì)當(dāng)前、今后的免疫組化自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化作出了評(píng)價(jià)和展望。

免疫組織化學(xué)在病理診斷中的作用已得到廣泛的認(rèn)同，具有特異性高、敏感性高、程序相對(duì)一致等特點(diǎn)，并已成為病理診斷中不可或缺的重要輔助技術(shù)。盡管免疫組化的理論比較簡(jiǎn)單，但方法與步驟卻比較繁瑣，在實(shí)際應(yīng)用中還存在不少問(wèn)題，直接或間接地影響了最終的病理診斷。要想達(dá)到可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最重要的是將免疫組化技術(shù)的全部程序形成一種概念上的標(biāo)準(zhǔn)化。本文就免疫組化技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)行一些淺顯地探討。

1 標(biāo)本的固定

為了使細(xì)胞和組織保持原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)，防止組織自溶和抗原性丟失，固定是關(guān)鍵。標(biāo)本離體后要求在15分鐘內(nèi)用10%中性緩沖甲醛固定，在常溫下時(shí)間為8-24小時(shí)，避免過(guò)度固定，固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，切片中容易產(chǎn)生甲醛色素顆粒，會(huì)影響結(jié)果觀察以及抗原的破壞。固定組織的固定液為標(biāo)本體積的5-10倍，脫鈣液對(duì)抗原也有較強(qiáng)的破壞，所以濃度和脫鈣時(shí)間不易太長(zhǎng)。

2 防脫片的制備

目前通用的是Sigma多聚左旋賴氨酸（Poly-L-ly-sine）或硅化片，具有很理想的防脫片效果。

3 包埋與切片

用過(guò)高溫度的石蠟包埋組織會(huì)破壞抗原，對(duì)于固定不太好的組織影響更大，包埋用的石蠟應(yīng)選用低熔點(diǎn)的石蠟，切片的厚度在3-4微米，以利于觀察，太厚的切片會(huì)影響染色結(jié)果和診斷。

4 烤片

切片在50-60℃的恒溫箱里烤片2小時(shí)，至少1小時(shí)才不至于脫片，烤片時(shí)間過(guò)短易脫片，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或溫度過(guò)高會(huì)破壞抗原。

5 脫蠟

免疫組化的脫蠟應(yīng)與常規(guī)HE脫蠟分離，以保證脫蠟徹底，脫蠟不徹底會(huì)影響組化染色結(jié)果，切片脫蠟后進(jìn)入梯度乙醇脫水至水化。

6 抗原修復(fù)

6.1 抗原修復(fù)是組化的關(guān)鍵技術(shù)

免疫組化染色中最關(guān)鍵的步驟可以說(shuō)是抗原修復(fù)了，組化染色結(jié)果的表達(dá)與抗原修復(fù)直接相關(guān)。因組織被甲醛固定后蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，抗原決定簇封閉，只有恢復(fù)抗原的免疫原性才能完成免疫化學(xué)反應(yīng)?？乖迯?fù)方法有多種，主要是酶消化法與加熱修復(fù)兩種方法，現(xiàn)在由于加熱抗原修復(fù)方法的廣泛應(yīng)用，酶消化法在免疫組化中的應(yīng)用已很少。免疫組化的加熱抗原修復(fù)方法包含微波法、水煮法、高壓法，現(xiàn)在比較公認(rèn)的修復(fù)效果是高壓法大于水煮法，水煮法大于微波法。

6.2 抗原修復(fù)液的選擇

抗原修復(fù)液有多種，有檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0）、EDTA（PH8.0）、Tris（PH7-8）等，目前檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0）可作為首選的常規(guī)使用的抗原修復(fù)液，它適合于大多數(shù)種類抗體，染色背景清晰。一般抗原難以表達(dá)的可以選擇EDTA和Tris緩沖液，這兩種修復(fù)液對(duì)一部分抗原修復(fù)效果較強(qiáng)，但染色背景較深。

6.3 抗原修復(fù)實(shí)例

在全國(guó)，有多家實(shí)驗(yàn)室對(duì)ER、PR進(jìn)行了反復(fù)實(shí)驗(yàn)，得出的結(jié)論是強(qiáng)力推薦使用高壓抗原修復(fù)方法。

我們單位在最近的免疫組化測(cè)評(píng)賽中，對(duì)參賽的5個(gè)待測(cè)抗原進(jìn)行抗原修復(fù)，取得了比較滿意的結(jié)果。根據(jù)我們得出的經(jīng)驗(yàn)，檢測(cè)CD10、CD30這兩項(xiàng)抗原，我們推薦使用高溫水煮修復(fù)，修復(fù)液為tris-EDTA(PH9.0)，檢測(cè)ER、PR、CK這三項(xiàng)抗原，推薦使用壓力鍋，修復(fù)液為檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0），各單位可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的具體條件和經(jīng)驗(yàn)選用微波、水煮、高壓修復(fù)以及抗原修復(fù)液。

6.4 高壓抗原修復(fù)方法

組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟至水，浸泡于蒸餾水中待用，取一定量抗原修復(fù)液于壓力鍋中，修復(fù)液必須浸沒(méi)整張切片，加熱沸騰，將脫蠟水化后的切片置于耐高溫染色架上，放入已沸騰的修復(fù)液中，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續(xù)加熱至噴氣（整個(gè)時(shí)間約需4-5分鐘），開始計(jì)時(shí)1-2分鐘后，壓力鍋離開熱源，室溫冷卻15分鐘，取下氣閥，打開鍋蓋，切片冷卻至室溫后，蒸餾水洗，PBS洗2min×3次。

7 生物素封閉

一般進(jìn)行抗原修復(fù)處理的切片都需要進(jìn)行內(nèi)源性生物素封閉處理；

7.1 3%H2O2浸泡切片10min

在免疫組化染色中如果采用過(guò)氧化物酶檢測(cè)系統(tǒng)，必須進(jìn)行封閉處理，這樣可以消除組織中的紅細(xì)胞、粒細(xì)胞對(duì)染色結(jié)果的干擾。雖然3%的H2O2對(duì)抗原有輕微的損害，但封閉效果非常顯著。

7.2 血清封閉

一般在加載一抗之前使用封閉血清（室溫15-20分鐘），可以減少非特異性顯色。血清的種屬一般與二抗的種屬相同，一抗中若含正常血清則可以免去此步驟。

實(shí)驗(yàn)中通常用的沖洗緩沖液為PBS和TBS，加入Tween20可以加強(qiáng)沖洗效果，在組化染色中嚴(yán)格的沖洗可防止背景著色。

8 一抗孵育

加載一抗50-100ul，室溫靜置1小時(shí)或者4℃過(guò)夜或者37℃1小時(shí)，如4℃過(guò)夜后需在37℃復(fù)溫45分鐘，PBS洗3次各2分鐘。

9． 加一滴（50ul-100ul）檢測(cè)試劑（二抗），室溫或37℃放置30分鐘， PBS洗三次，每次2分鐘。

10. DAB顯色5-10分鐘

11. 蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。

襯染的步驟十分簡(jiǎn)單，但襯染的好壞對(duì)染色質(zhì)量的影響很大，不易太深或太淺。首選的是Harris蘇木素襯染，它在水中洗滌后可以呈鮮亮的蘭色，與DAB染色對(duì)照效果很好，使用簡(jiǎn)單方便。

對(duì)于即用型抗體，廠商已進(jìn)行多種實(shí)驗(yàn)條件的檢測(cè)，可以直接使用，而濃縮性抗體，可按照供應(yīng)廠商提供的稀釋度進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，一般在廠家提供的滴度前后各加一個(gè)滴度做預(yù)實(shí)驗(yàn)，抗體的最佳稀釋度為在無(wú)背景染色的情況下獲得最強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)。

通用的檢測(cè)系統(tǒng)是生物素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法，有SP、LSAB、ABC等方法，都是目前實(shí)驗(yàn)室廣泛采用的檢測(cè)方法，其方法簡(jiǎn)便易行且試劑穩(wěn)定。SP三步法和Envision二步法高效經(jīng)濟(jì)，為國(guó)內(nèi)免疫組化首選的檢測(cè)系統(tǒng)。

顯色系統(tǒng)通常采用的是辣根過(guò)氧化物酶系統(tǒng)，因此選擇DAB（棕色）和AEC（紅色）酶底物，常規(guī)組化顯色首選的是DAB，它定位清晰，易于保存。

在免疫組化的質(zhì)量控制中，最重要的是設(shè)立陽(yáng)性和陰性對(duì)照，每批實(shí)驗(yàn)中最好有一張陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，這樣才能確保實(shí)驗(yàn)的可靠性，雖然很多醫(yī)院病理科的工作量很大，但是不要怕麻煩，可以每月進(jìn)行一次室間質(zhì)控，以保證免疫組化染色結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。

自動(dòng)染色儀，它是一種各種試劑高度通用的儀器，可使用大多數(shù)免疫組化染色的抗體、檢測(cè)系統(tǒng)和其他試劑，是當(dāng)今最流行的開放式的自動(dòng)染色儀。它利用電腦控制代替技術(shù)人員手工操作，大大地減少了手工操作出現(xiàn)的誤差。自動(dòng)染色儀能精確泵出每次滴加試劑的量，以及將每一步的染色時(shí)間精確到秒，空氣壓縮泵能均勻地吹掉切片上多余的液體，這一切徹底避免了免疫組化染色過(guò)程中人工操作的誤差，染色儀將所有的染色步驟存儲(chǔ)在電腦里，這些優(yōu)點(diǎn)保證了染色結(jié)果的一致性，不同單位的實(shí)驗(yàn)室選擇相同的試劑及染色過(guò)程就可以達(dá)到相同的染色結(jié)果。

近年來(lái)，隨著免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化的逐步實(shí)行，免疫組化自動(dòng)染色儀將逐步進(jìn)入病理科，技術(shù)人員將從煩瑣的人工操作中解脫出來(lái)，會(huì)極大提高免疫組化的工作效率，同時(shí)也將免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化推上了一個(gè)新的臺(tái)階。

篇9

【關(guān)鍵詞】

胃腸間質(zhì)瘤;病理學(xué);免疫組化;CD117;CD34;S-100

胃腸道間質(zhì)瘤(gastrointestinal stromal tumors,GISTs)分化尚未明確,以往根據(jù)發(fā)生的部位和形態(tài)學(xué)的多樣性表現(xiàn)被診斷為平滑肌瘤、神經(jīng)纖維瘤、神經(jīng)鞘瘤等。近年應(yīng)用免疫組化法對(duì)其特定抗原和基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記,研究結(jié)果對(duì)胃腸間質(zhì)瘤的組織起源、病理診斷標(biāo)準(zhǔn)和生物學(xué)行為仍然存在分歧。1983年Mazur和Clark首先命名胃腸間質(zhì)瘤(GIST)并描述了這是一組位于胃腸道和腸系膜上具有明確病理和免疫組化特征的胃腸道肉瘤[1]。本文通過(guò)對(duì)一組胃腸間質(zhì)瘤的回顧研究,以提高對(duì)間質(zhì)瘤的認(rèn)識(shí)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集本院2005年2月至2009年11月經(jīng)手術(shù)后病理診斷證實(shí)的24例胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)的臨床和病理資料進(jìn)行分析?；颊邽槟?6例,女8例,中位年齡 51(29~72歲)。胃 13例,小腸及結(jié)腸 8例,腸系膜3例,臨床表現(xiàn)為腹痛、腹脹及發(fā)現(xiàn)腹部包塊等。

1.2 病理學(xué)標(biāo)準(zhǔn) GIST良、惡性判別采用 Lewin[2]的標(biāo)準(zhǔn):即將 GIST的惡性指標(biāo)分為肯定惡性指標(biāo)和潛在惡性指標(biāo),從而將 GIST分為良性間質(zhì)瘤(無(wú)惡性指標(biāo))、潛在惡性間質(zhì)瘤(僅具備 1項(xiàng)潛在惡性指標(biāo))、惡性間質(zhì)瘤(具備 1項(xiàng)肯定惡性指標(biāo)或 2項(xiàng)以上潛在惡性指標(biāo))?？隙◥盒灾笜?biāo)為:①遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(經(jīng)病理證實(shí));②浸潤(rùn)?quán)徑K器。潛在惡性指標(biāo)包括:①胃間質(zhì)瘤>5.5 cm,腸間質(zhì)瘤>4 cm;②胃間質(zhì)瘤核分

裂數(shù)>5/50 HPF,腸間質(zhì)瘤只要出現(xiàn)核分裂,就具有潛在惡性;③腫瘤壞死明顯;④核異性大;⑤細(xì)胞密度大;⑥鏡下可見(jiàn)黏膜固有層或血管浸潤(rùn);⑦上皮樣間質(zhì)瘤中出現(xiàn)腺泡狀結(jié)構(gòu)或細(xì)胞球結(jié)構(gòu)。24例中良性 3例,潛在惡性 7例,惡性 14例。

1.3 方法HE染色 甲醛固定,常規(guī)切片,HE染色,鏡下觀察。免疫組化染色:采用北京中衫公司即用型第二代免疫組化EliVision plus廣譜試劑盒。免疫組化二代二步染色法標(biāo)記CD117、CD34、SMA、S-100 蛋白。

2 結(jié)果

2.1 病理組織學(xué)觀察 ①大體形態(tài):GISTs 腫塊可單發(fā)或多發(fā),體積大小不等,小者為黏膜下或肌壁間結(jié)節(jié),大者為肌壁內(nèi)腫塊或向腔內(nèi)生長(zhǎng),可繼發(fā)黏膜潰瘍,也可向漿膜側(cè)生長(zhǎng)形成漿膜下腫塊。腫塊邊界較清,但無(wú)真包膜,多呈膨脹性生長(zhǎng)。良性間質(zhì)瘤3例,瘤體一般較小,直徑 2~4.6 cm,平均直徑約3.5 cm 切面實(shí)性灰白,質(zhì)地韌。潛在惡性間質(zhì)瘤7例,體積較大,直徑3.5~10 cm,平均直徑約6.5 cm,切面實(shí)性灰白或灰紅色,或伴出血囊性變,質(zhì)地較韌;多數(shù)瘤組織邊界較清楚,有 2例與 周圍組織有粘連。14例惡性間質(zhì)瘤瘤體大,最大直徑20.5 cm,最小瘤體直徑4.5 cm,平均直徑約11.5 cm,5例累計(jì)漿膜外、腸系膜或大網(wǎng)膜多發(fā)瘤結(jié)節(jié),切面灰白灰紅色,質(zhì)地細(xì)膩呈魚肉狀或腦回狀,可見(jiàn)出血、壞死及囊性變;②組織學(xué)形態(tài):GISTs瘤細(xì)胞形態(tài)主要為梭形和上皮樣形。大部分梭形瘤細(xì)胞排列呈束狀或交織狀,灶性可呈車輻狀、柵欄狀及圍繞血管呈器官樣排列。上皮樣形瘤細(xì)胞主要成彌漫片狀、巢狀和腺泡狀排列,多數(shù)瘤細(xì)胞胞 界較清楚,細(xì)胞呈圓形、卵圓形、不規(guī)則形或呈鐮刀形,可出現(xiàn)胞質(zhì)空泡化,似印戒樣細(xì)胞。本研究 24例腫瘤中梭形細(xì)胞型 13例(54.2%),上皮樣細(xì)胞型5例(20.8%),混合型 6例(25%)。

2.2 免疫組化染色表型 免疫組織化學(xué)抗體 CD117陽(yáng)性定位于腫瘤細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜呈棕黃色或棕褐色,CD34定位于細(xì)胞膜、SMA定位于細(xì)胞質(zhì)、S-100 蛋白定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。CD117 與 CD34 陽(yáng)性瘤細(xì)胞一般呈彌漫或片狀分布,而SMA與 S-100 陽(yáng)性瘤細(xì)胞大部分為散在或小灶狀分布。24例GISTs 的 CD117 陽(yáng)性21例(87.5%),CD34 陽(yáng)性19例(79.2%),SMA陽(yáng)性10例(41.7%),提示平滑肌分化。S-100蛋白陽(yáng)性2例(8.3%),提示神經(jīng)分化。CD117 和 CD34 共同表達(dá) 16例(66.7%),CD117 單項(xiàng)表達(dá)4例,CD34 單項(xiàng)表達(dá)3例。

3 討論

1998年,GIST的分子研究有了重大突破。Hirota[3]等發(fā)現(xiàn)大部分 GIST表達(dá) C-kit基因蛋白KIT(CD117),C-kit基因有功能獲得性突變,而真正的平滑肌腫瘤和雪旺氏細(xì)胞腫瘤無(wú) C-kit基因突變和 CD117蛋白表達(dá)。故 GIST的概念迅速發(fā)生重大改變,現(xiàn)在 GIST特指胃腸道間葉腫瘤(GIMT)中C-kit基因蛋白(CD117)表達(dá)陽(yáng)性,組織學(xué)呈梭形和上皮樣細(xì)胞的腫瘤。目前對(duì) GIST的認(rèn)識(shí)是:GIST只是 GIMT的其中一種類型,是最常見(jiàn)的一種類型,與平滑肌腫瘤、神經(jīng)鞘瘤、脂肪瘤、脈管腫瘤等 GIMT并列。

由于 Cajal細(xì)胞與 GIST體同樣表達(dá) CD117和/(或)CD34,兩者在超微結(jié)構(gòu)上具有相似性,有學(xué)者認(rèn)為 GIST起源于[4]Cajal細(xì)胞。但有學(xué)者認(rèn)為[5]GIST來(lái)源于更原始的,具有多潛能分化的中胚葉的間質(zhì)干細(xì)胞,其理由主要是間葉干細(xì)胞廣泛存在于消化系統(tǒng)的各部位,具有多向分化潛能,這樣可以較好地解釋 GIST不僅可以發(fā)生在胃腸道,也可以發(fā)生在腸系膜、網(wǎng)膜和腹膜后等消化道外,而且有如此高的發(fā)病率,免疫表型的表達(dá)多樣化。

C-kit基因是 H24貓科肉瘤病毒 kit癌基因的同源物,位于人染色體 4q12-13。C-kit基因的產(chǎn)物是 Ⅲ型酪氨酸激酶,編碼 47kD的跨膜糖蛋白-酪氨酸激酶受體,即 C-kit受體(CD117)。研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有的 Cajal細(xì)胞都表達(dá) C-kit,黑色素細(xì)胞、生殖細(xì)胞及造血細(xì)胞也有表達(dá)[6]。CD34 是一種骨髓造血前體細(xì)胞標(biāo)記物,內(nèi)皮細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞可陽(yáng)性表達(dá)。

近年來(lái),大量的免疫組化研究發(fā)現(xiàn)CD34和CD117在GIST中均有高表達(dá),本組病例CD117陽(yáng)性表達(dá)率為87.5%,且其陽(yáng)性表達(dá)不受組織學(xué)類型,良惡性及部位不同的影響。CD34陽(yáng)性表達(dá)率79.2%。本組所研究的大部分病例(87.5%)表達(dá)CD117,且CD34陰性的GIST病例CD117幾乎全部陽(yáng)性表達(dá),提示CD117是比CD34更敏感的指標(biāo),CD34及CD117的陽(yáng)性率并不能對(duì)判斷間質(zhì)瘤的良、惡性起決定作用。但也有報(bào)導(dǎo)CD34在鑒別中間性及惡性GIST方面較CD117更為敏感[7]。本組病例SMA, S-100只在惡性,潛在惡性病例中散在表達(dá)而良性無(wú)一例表達(dá)(見(jiàn)表1),提示SMA,S-100免疫表型可作為鑒別GIST良、惡性參考指標(biāo),即間質(zhì)瘤向平滑肌或神經(jīng)分化多惡性度高。

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篇10

[關(guān)鍵詞] 免疫組織化學(xué)；腫瘤；腫瘤分子；靶向治療

[中圖分類號(hào)] R730.4 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2014）09（b）-0188-03

Immunohistochemical clinical pathological application and tumor molecular significance

GUAN Lei

Department of Pathology，Jiangdu People′s Hospital of Yangzhou City in Jiangsu Province，Yangzhou 225200，China

[Abstract] Medical technology is changing rapidly，in the 1970s with the development of monoclonal antibody technology，immunohistochemistry （IHC） is developed in pathology，IHC brings people from the traditional pathological histology （morphology） into protein levels （qualitative and positioning of antigen and antibody） and it is widely applied increasingly in modern pathological diagnosis，and plays a very important role in tumor diagnosis and differential and has a great influence on diagnosis of tumor，tumor classification，prognosis estimation，and expandes people′s understanding of the various diseases and tumor formation，improve the level of the pathological diagnosis and research.Recent molecular pathological diagnosis of tumor and the significance of targeted therapy becoms a hot research topic.

[Key words] Immunohistochemistry；Tumor；Tumor molecular；Targeted therapy

免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry， IHC）是利用免疫學(xué)基本原理，即抗原抗體的特異性結(jié)合，標(biāo)記顯色劑的抗體和組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)）發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，是免疫學(xué)和組織化學(xué)相結(jié)合而形成的[1]。它具有較高的靈敏度、特異度，操作比較簡(jiǎn)便，能將形態(tài)和功能代謝相結(jié)合，定性、定位和定量相結(jié)合，細(xì)胞水平和超微結(jié)構(gòu)水平相結(jié)合，基因水平和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)相結(jié)合，其特點(diǎn)是形態(tài)學(xué)改變與功能、代謝變化結(jié)合起來(lái)。分子病理的發(fā)展只能是完善補(bǔ)充之，而不能取而代之。對(duì)疑難病例的診斷和分型、指導(dǎo)臨床治療、了解腫瘤預(yù)后發(fā)揮重要作用，已成為病理科不可缺少的技術(shù)支持。

1 IHC的一般臨床病理應(yīng)用

1.1 判斷腫瘤的組織起源及確定轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的原發(fā)部位

如上皮性標(biāo)記常用HCK （34βE12）、LCK、CK-pan、CK7、CK19、CK20、EMA、CEA、TG、TTF-1等；軟組織標(biāo)記常用Vimentin、Desmin、SMA、MyoD1、CD31、CD34、CR等；神經(jīng)組織標(biāo)記常用GFAP、NF、S-100、CgA、SY、NSE、MBP等；對(duì)于某些轉(zhuǎn)移性腺癌可以通過(guò)CK7、CK20、TTF-1、CA125、CA15-3、E-Cadherin等來(lái)確定癌的來(lái)源。

1.2 確定腫瘤及分期

腫瘤相關(guān)抗原有利于臨床病理診斷和鑒別診斷，常用的有AFP、CEA、CA15-3、CA19-9、CA125、Melan-A、HMB45等。判斷腫瘤是原位或浸潤(rùn)，有無(wú)血管、淋巴管或神經(jīng)侵犯與腫瘤分期密切相關(guān)。如用層粘連蛋白（laminin）和Ⅳ型膠原抗體（collagen Ⅳ）可以顯示基底膜受損破壞情況，用于區(qū)分原位癌和浸潤(rùn)癌。有研究發(fā)現(xiàn)，IHC檢測(cè)胃癌標(biāo)本的CD34、D2-40有助于判別血管浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[2]。

1.3 判斷腫瘤良惡性以及淋巴瘤的分型

如用免疫球蛋白（Ig）的輕鏈抗體檢測(cè)B淋巴細(xì)胞增生的單克隆或多克隆性來(lái)區(qū)別是腫瘤性增生還是反應(yīng)性增生。淋巴系統(tǒng)、髓系統(tǒng)的細(xì)胞在分化成熟的不同階段和外周淋巴細(xì)胞活化的過(guò)程中細(xì)胞表達(dá)的抗原是不盡相同的，因此各種惡性淋巴瘤和白血病也可通過(guò)IHC檢測(cè)腫瘤細(xì)胞所表達(dá)的抗原來(lái)診斷與鑒別診斷[3]。通常采用CD3、CD45RO、CD43、CD20、CD79a、CD10、Bcl-2等，一組抗體有時(shí)作幾個(gè)T系及幾個(gè)B系，IHC幾乎已成為常規(guī)開展的工作項(xiàng)目。

1.4 發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶

常規(guī)病理組織學(xué)方法要在一個(gè)組織中認(rèn)出單個(gè)轉(zhuǎn)移性腫瘤或幾個(gè)瘤細(xì)胞是困難的，采用IHC則有助于發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶，如胃黏膜活檢中的印戒細(xì)胞癌，淋巴結(jié)內(nèi)極少轉(zhuǎn)移性瘤細(xì)胞的尋找，骨髓內(nèi)個(gè)別轉(zhuǎn)移性瘤細(xì)胞的認(rèn)定等，使微小癌、微小轉(zhuǎn)移灶（淋巴結(jié)及骨髓）、甚至不易察覺(jué)的病變得以確診，有助于臨床治療方案的確定，包括手術(shù)范圍的確定等。

1.5 檢測(cè)腫瘤增殖活性

腫瘤增殖活性的高低直接影響臨床治療與預(yù)后，用IHC檢測(cè)增殖細(xì)胞抗原（PCNA）、Ki-67最為簡(jiǎn)便、可靠。標(biāo)記指數(shù)高者常淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，無(wú)瘤緩解期和存活時(shí)間短，預(yù)后不良。Ki-67高表達(dá)與乳腺癌的ER陰性、人類表皮生長(zhǎng)因子受體-2（HER-2）陽(yáng)性、高級(jí)別及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，是其重要的預(yù)后與預(yù)測(cè)標(biāo)記[4-5]。其他預(yù)后指標(biāo)如p53、Bcl-2等也常應(yīng)用于臨床。

1.6 診斷感染性疾病

可以識(shí)別組織切片中的病原體而用于感染性疾病的診斷[6]。IHC應(yīng)用特異性抗體檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌、幽門螺桿菌、梅毒螺旋體、乙型肝炎病毒（HBV）、巨細(xì)胞病毒（CMV）、人狀瘤病毒（HPV）、皰疹病毒（HSV）等，這樣病理醫(yī)生就可以在病毒感染導(dǎo)致的可識(shí)別的細(xì)胞形態(tài)病理改變之前或病毒培養(yǎng)結(jié)果之前明確發(fā)現(xiàn)病原體抗原的部位及定量。

2 幾種常見(jiàn)癌基因檢測(cè)及腫瘤分子靶向治療

2.1 HER-2

HER-2基因位于17號(hào)染色體q12～q21，是具有受體酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，屬于表皮生長(zhǎng)因子受體家族，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、增強(qiáng)侵襲力及抑制細(xì)胞凋亡的作用，HER-2受體蛋白介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有RAS/RAF/MEK/ERK途徑和PI3K/PIP2/PIP3/PDK1/AKT途徑[7]。20%～30%的乳腺癌患者有HER-2的擴(kuò)增和蛋白過(guò)表達(dá)，其陽(yáng)性與乳腺癌分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)，提示預(yù)后差。HER-2基因高擴(kuò)增與ER、PR陰性表達(dá)相關(guān)，對(duì)內(nèi)分泌治療的反應(yīng)差及生存率低[8]。近年來(lái)一種新型分子靶向治療藥物――曲妥珠單抗，已被成功應(yīng)用于治療HER-2基因擴(kuò)增或過(guò)表達(dá)伴或不伴腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者。臨床最常用的HER-2基因檢測(cè)方法是IHC和熒光原位雜交（FISH），IHC操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉，與FISH符合率高，HER-2蛋白高強(qiáng)度表達(dá)（3+）與基因擴(kuò)增有極好的一致性，而中等強(qiáng)度表達(dá)（2+）必須進(jìn)一步行FISH法基因檢測(cè)，IHC可用作臨床治療是否應(yīng)用曲妥珠單抗的初篩[9]。

2.2 拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（TOP2）A

與HER-2基因相鄰，參與DNA的重組、修復(fù)、轉(zhuǎn)錄與復(fù)制過(guò)程，可促進(jìn)癌發(fā)生。TOP2A的異常分為擴(kuò)增與缺失。三陰性乳腺癌（TNBC）預(yù)后差、缺少特異治療，TOP2A蛋白過(guò)表達(dá)可見(jiàn)于TNBC，它是細(xì)胞內(nèi)蒽環(huán)類藥物治療的靶點(diǎn)，蒽環(huán)類藥物給TNBC患者帶來(lái)福音[10-11]。胃癌的發(fā)病率和死亡率很高，但尚未建立可靠的診斷和預(yù)后的標(biāo)志物，用IHC法檢測(cè)胃癌組織樣本中HER-2和TOP2A的表達(dá)均高于癌旁正常胃組織，與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腫瘤分期相關(guān)，但兩者表達(dá)無(wú)相關(guān)性，HER-2與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，TOP2A與胃癌的浸潤(rùn)深度相關(guān)，它們可作為評(píng)價(jià)胃癌患者預(yù)后的有用標(biāo)記[12]。

2.3 表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）

EGFR是HER家族成員之一，其高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成以及轉(zhuǎn)移相關(guān)。在全球范圍內(nèi)，肺癌是發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占80%，存在EGFR的異常高表達(dá)，用EGFR酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）（gefitinib 或erlotinib）單藥治療NSCLC，可增加患者總生存期（OS）和無(wú)進(jìn)展生存期（PFS），特別是不吸煙、腺癌和EGFR基因突變患者[13]。用IHC方法分析肺癌組織中EGFR突變蛋白，觀察染色腫瘤細(xì)胞的比例和染色的深度，以此標(biāo)準(zhǔn)量化NSCLC 患者EGFR突變陽(yáng)性，并可用以預(yù)測(cè)EGFR- TKIs的治療效應(yīng)[14]。

2.4 p53

p53位于人類第17號(hào)染色體短臂上（17p13.1），是一種抑癌基因，在腫瘤代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用。野生型p53為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，當(dāng)DNA或染色體損傷嚴(yán)重時(shí)，觸發(fā)凋亡機(jī)制，抑制細(xì)胞增殖，而突變型p53則具有致癌活性，與許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[15]，具有泛瘤性。p53突變率高的乳腺癌細(xì)胞增殖活力強(qiáng)、分化差、惡性度高和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，用IHC檢測(cè)p53蛋白表達(dá)，可作為評(píng)判乳腺癌生物學(xué)行為的一個(gè)獨(dú)立因素。近來(lái)報(bào)道[16]利用二氧化硅納米顆粒的p53基因治療，對(duì)人乳腺癌細(xì)胞有明顯的抑制效應(yīng)。不斷增加對(duì)p53調(diào)節(jié)機(jī)制的理解，在此基礎(chǔ)上加強(qiáng)對(duì)新藥的研究，以期在癌癥發(fā)展時(shí)通過(guò)重新激活p53的療法讓患者獲益[17]。研究發(fā)現(xiàn)在24例NSCLC患者體內(nèi)注射rAd-p53并聯(lián)合順鉑治療，17例患者達(dá)到病情穩(wěn)定，提高了生活質(zhì)量并延緩了病情發(fā)展[18]。

2.5 間變性淋巴瘤激酶（ALK）

棘皮動(dòng)物微管相關(guān)類蛋白4（EML4）與ALK融合基因存在于3%～5%的NSCLC，EML4-ALK融合基因激活了ALK酪氨酸激酶，引發(fā)凋亡抑制和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，ALK融合基因作為NSCLC一個(gè)特殊的分子類型，該患者具有獨(dú)特的臨床特點(diǎn)，諸如肺腺癌、從不吸煙或少吸煙、通常與EGFR突變不同時(shí)存在。IHC法檢測(cè)ALK基因重排靈敏度、特異度及可重復(fù)性均佳，個(gè)別檢測(cè)結(jié)果不確定可結(jié)合FISH和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法[19-20]。Crizotimib是一種新型靶向抗癌藥，被美國(guó)食品和藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)用于ALK陽(yáng)性的晚期NSCLC效果明顯，能改善腫瘤患者癥狀、延長(zhǎng)患者的PFS，且毒性低，患者耐受性較好，受到臨床關(guān)注[21-22]。

3 結(jié)語(yǔ)

石蠟切片是制作標(biāo)本最常用、最基本的方法，IHC首選之，對(duì)組織形態(tài)保存好，能連續(xù)切片，便于各種染色觀察，還能長(zhǎng)期存檔，供回顧性研究，但甲醛固定法封閉了細(xì)胞內(nèi)部分抗原決定簇以及蛋白發(fā)生交聯(lián)使抗原決定簇隱蔽，因此IHC首先要行抗原修復(fù)或暴露，還強(qiáng)調(diào)做好組織前期的處理以及陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，避免假陽(yáng)性和假陰性，嚴(yán)格做好IHC質(zhì)量控制，才能得到可靠的IHC染色[23]。IHC便于在大部分基層醫(yī)院開展，滿足基層患者疾病診治的需求，提高了病理診斷的水平。

在常規(guī)腫瘤病理診斷中，大約10%的腫瘤診斷是疑難的，隨著IHC技術(shù)的發(fā)展和各種特異性抗體的涌現(xiàn)，使越來(lái)越多的疑難腫瘤得以明確診斷。在低分化或未分化腫瘤的鑒別診斷時(shí)，準(zhǔn)確率可達(dá)50%～75%。

正如所有的事物都有兩面性，IHC亦如此。迄今為止特異性單抗比較少，目前沒(méi)有一種抗體只對(duì)其相應(yīng)的組織或細(xì)胞是絕對(duì)特異的，病理醫(yī)生選擇抗體及判斷結(jié)果都要客觀謹(jǐn)慎地以HE形態(tài)為依據(jù)，這是一個(gè)重要原則，IHC結(jié)果判斷的正確性和可靠性體現(xiàn)病理醫(yī)技人員的綜合水平。

隨著分子病理學(xué)的發(fā)展，靶向治療在腫瘤治療中有了很大進(jìn)展[24-25]，為一些細(xì)胞毒類藥物療效不佳的惡性腫瘤患者帶來(lái)了希望，選擇合適個(gè)體化治療的藥物正成為一種發(fā)展方向和趨勢(shì)，IHC則發(fā)揮著不可小覷的作用。

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