導語：如何才能寫好一篇蛋白質(zhì)組學，這就需要搜集整理更多的資料和文獻，歡迎閱讀由公務員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

在疾病基因組的研究中,為了尋找差異表達的疾病相關(guān)基因或蛋白質(zhì),除了采用傳統(tǒng)的分子生物學方法,如差減雜交[1]、抑制性差減雜交[2]、差異顯示PCR法[3]及基因表達串聯(lián)分析技術(shù)(serialanalysisofgeneexpression,SAGE)[4]外,還可采用蛋白質(zhì)組學的方法,即從蛋白質(zhì)入手尋找新的或疾病相關(guān)基因或蛋白質(zhì)?；蚝偷鞍踪|(zhì)間并沒有一一對應的關(guān)系,有mRNA,不一定能表達為有功能的蛋白質(zhì)。但是,基因要表現(xiàn)其功能,一定要通過相應的蛋白質(zhì)。所以,研究基因,特別是疾病相關(guān)基因,可從研究其表達蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能入手。常見的幾種研究差異表達蛋白的蛋白質(zhì)組學方法包括蛋白芯片技術(shù)、雙向電泳技術(shù)、多維液相色譜技術(shù)以及它們和質(zhì)譜鑒定的有機結(jié)合。

1•1蛋白質(zhì)芯片技術(shù)

繼基因芯片以后,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)逐漸發(fā)展起來?；蛐酒纸蠨NA芯片,是以DN段為材料的,而蛋白質(zhì)芯片以蛋白質(zhì)或多肽為材料。利用蛋白芯片技術(shù)能同時從微量的樣品中檢測成千上萬個蛋白質(zhì)或多肽,用于分析差異表達的蛋白質(zhì)及藥物靶標的鑒定,所以,蛋白質(zhì)芯片在藥物基因組學的研究中發(fā)揮著極為重要的作用。眾所周知,蛋白質(zhì)不如核酸穩(wěn)定,在蛋白質(zhì)樣品的處理中將會遇到很多困難,對蛋白質(zhì)芯片的操作將比對基因芯片的操作要求更為嚴格。從基因組測序知道,僅有約30000~35000個基因維持人體正常的生理作用[5],由于RNA編輯及翻譯后修飾等因素,使得人體細胞的總蛋白質(zhì)數(shù)目(蛋白質(zhì)組)遠遠超過有活性的基因數(shù)目。因此,能同時檢測成千上萬蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)芯片技術(shù),是唯一可用來有效研究人體蛋白質(zhì)組的方法。目前,主要將蛋白芯片和表面增強的激光解吸離子化質(zhì)譜技術(shù)(SELDI-MS)相結(jié)合尋找差異表達的蛋白質(zhì)。其原理是將不同生理狀態(tài)的樣品(培養(yǎng)的細胞或組織樣品)和同一蛋白芯片結(jié)合,洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì),然后用SELDI-MS分析結(jié)合的蛋白質(zhì)。一般來說,每種芯片可特異地結(jié)合某一細胞特定的蛋白質(zhì)。具體的操作方法隨不同廠家生產(chǎn)的蛋白芯片不同而異。LiX及其同事[6]將小鼠MRL的耳朵穿刺,觀察耳朵上傷口愈合過程中蛋白質(zhì)表達的變化情況,用蛋白芯片分析的結(jié)果表明,分子量為23•56ku的蛋白在傷口愈合過程中表達量大幅度增加,加速了傷口的愈合。盡管蛋白質(zhì)芯片技術(shù)正逐漸得到廣泛應用,但在應用于尋找差異表達蛋白時也有局限性:1)待檢的低豐度蛋白往往被高豐度蛋白所掩蓋而不能檢測出來,2)蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)對檢測小分子量的蛋白有效,檢測范圍為10~30ku,但是10~30ku的蛋白只是占總蛋白的一小部分。

1•2多維分離技術(shù)

對于復雜的蛋白質(zhì)樣品,比如特定組織或細胞中的所有蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)組),僅靠某一分離原理將它們分開是不可能的,而要利用蛋白質(zhì)的不同性質(zhì)將它們分離開,由此而發(fā)展起來的分離技術(shù)叫多維分離技術(shù)(multidimensionalseparation)。目前主要采用的是二維分離技術(shù),因為對于大多數(shù)蛋白質(zhì)的分離,采用蛋白質(zhì)間某兩個性質(zhì)的不同,利用二維分離技術(shù)已足夠了。其中,雙向電泳技術(shù)和二維液相色譜以及它們和質(zhì)譜的聯(lián)用,已成為當今蛋白質(zhì)組學研究的有力工具。

1•2•1雙向電泳技術(shù):雙向電泳(two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE)技術(shù)是80年展起來的一種有效的二維分離技術(shù)。其原理是基于不同蛋白質(zhì)的等電點和分子量不同的特性,第一相是等電聚焦電泳,第二相是SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。很多實驗室利用不同的雙向電泳技術(shù)建立了特定組織或細胞的雙向電泳數(shù)據(jù)庫(2DPAGE),以供不同的實驗室檢索和比較雙向電泳圖譜。SWISS-2DPAGE是一個經(jīng)注釋過的雙向電泳公共檢索數(shù)據(jù)庫,其格式和SWISS-PROT蛋白序列數(shù)據(jù)庫類似。在SWISS-2DPAGE數(shù)據(jù)庫中包括蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜(其中標明了蛋白質(zhì)的具置)、建立圖譜的具體方法和程序、以及相關(guān)的病理和生理數(shù)據(jù)。關(guān)于蛋白質(zhì)的雙向電泳數(shù)據(jù)可通過如下服務器進行檢索:expasy•hcuge•ch/。在功能基因組時代,雙向電泳技術(shù)除了用于分離復雜的蛋白樣品,建立雙向電泳數(shù)據(jù)庫外,主要用于尋找不同組織或細胞中差異表達的蛋白質(zhì),以進行疾病相關(guān)蛋白或基因的研究。先用pH3-10的IPG膠條,對疾病組織和正常組織進行雙向電泳分離,然后利用計算機軟件對所產(chǎn)生的2-DE圖譜進行分析,找出差異表達的蛋白。

如果想得到更為詳細的2-DE圖譜,可用pH4-7或pH6-9的膠條,甚至只有一個pH單位的窄pH范圍的膠條,從而使分辨率大大提高。將找到的差異表達蛋白斑點從膠上切下來,經(jīng)酶消化(常用胰蛋白酶),通過質(zhì)譜(MS)或串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)測定和數(shù)據(jù)庫搜索,鑒定出所差異表達蛋白。然而,雙向電泳技術(shù)有許多局限性,由于樣品處理的差別、翻譯后修飾、人為修飾等導致同一基因表達的蛋白質(zhì)遷移到不同的位置;另外,不同的蛋白也會遷移到同一斑點,出現(xiàn)共遷移現(xiàn)象,從而使得用2-DE進行定性和定量分析變得相當復雜。而且,對于低豐度和低拷貝數(shù)蛋白的檢測也相當困難。雙向電泳要求操作者熟練掌握電泳、染色及軟件分析技術(shù),整個實驗過程中要穿實驗服,戴手套,盡量避免角蛋白等污染,才能得到較好的重復性。為了改進雙向電泳的重復性和靈敏度,最近發(fā)展了一種熒光染料標記的雙向電泳技術(shù)即凝膠內(nèi)差別電泳(differentialin-gelelec-trophoresis,DIGE)[7]。將樣品和對照品分別用1-(5-羧戊基)-1′-丙基靛碳氰鹵化物(Cy3)N-羥基琥珀酸酯[1-(5-carboxypentyl)-1′-propylindocarbocyaninehalinge(Cy3)N-hydroxy-succinimidylester]和1-(5-羧戊基)-1′-甲基靛碳氰鹵化物(Cy5)N-羥基琥珀酸酯[1-(5-carboxypentyl)-1′-methylindocarbocyaninehalinge(Cy5)N-hydroxy-succinimidylester]標記。在DIGE時,由于樣品和對照在同一膠內(nèi)分離,使用相同的內(nèi)標,避免了使用不同凝膠時在操作上的偶然性和不平行性,可以準確檢測出兩個不同樣品蛋白表達上的差別,消除膠與膠之間的差異,保證統(tǒng)計上的可靠性及操作上的重復性。熒光標記較其他染色方法靈敏度更高。與常規(guī)的雙向電泳技術(shù)比較,DIGE更加簡單,勞動強度大大降低,效率大大提高。

1•2•2多維液相色譜-質(zhì)譜技術(shù):液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀用于小分子和大分子的分離和鑒定是一項常規(guī)而重要的技術(shù),將液相色譜和質(zhì)譜用于蛋白質(zhì)組的研究,尤其是差異表達蛋白質(zhì)組的研究,是最近才發(fā)展起來的。目前,利用多維液相色譜-質(zhì)譜進行差異表達蛋白的研究,通常要借助于同位素標記技術(shù),也即是下面所述的ICAT技術(shù)。ICAT技術(shù)是指采用同位素標記多肽或蛋白質(zhì)的親和標簽技術(shù)(isotopecoded-affinitytags,ICAT),可以較準確的鑒定出不同狀態(tài)細胞或組織中差異表達的蛋白質(zhì)。目前的ICAT試劑,大多是用來標記磷酸化蛋白的[8]。對于酵母和細菌細胞,可在培養(yǎng)基中加入同位素進行標記。另外,在蛋白酶解的過程中,可采用18O對蛋白樣品的片段進行標記,而對照品不用同位素標記。當使用胰酶、Glu-C或Lys-C等蛋白酶時,可分別引入2個18O到正在被酶解的肽中?，F(xiàn)在流行的市售ICAT試劑由美國華盛頓大學GygiSP教授[9]等人首先報道。此ICAT試劑的結(jié)構(gòu)包括三個部分:生物素親和標簽,用于分離ICAT標記的多肽;中部的連接子,使引入的同位素更穩(wěn)定;反應活性基團,可和半胱氨酸的巰基發(fā)生特異性反應。此試劑以兩種形式存在,重試劑(含同位素氘)和輕試劑(不含同位素),前者的質(zhì)量數(shù)比后者多8。利用ICAT試劑標記蛋白,尋找差異表達蛋白質(zhì)的原理是:當樣品和對照分別用重試劑和輕試劑標記后,將兩樣品混合,酶解,過鏈親和素柱,使ICAT標記的肽片段吸附在鏈親和素柱上。將ICAT標記的肽洗脫下來,經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜分析。樣品和其對照表達量的差別可用質(zhì)譜峰的強度(面積)進行定量。將所得的差別峰經(jīng)進一步的串聯(lián)質(zhì)譜分析,數(shù)據(jù)庫搜索,從而鑒定出相應的差異表達蛋白質(zhì),并進行進一步的功能鑒定,如Westernblot等。用這種ICAT試劑尋找差異表達蛋白的缺點是只對含半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)有效,而不能測定其它的蛋白質(zhì)和多肽。

2疾病診斷與藥物開發(fā)

蛋白質(zhì)組學方法除了在基礎醫(yī)學研究中用于尋找差異表達蛋白質(zhì),進而找出疾病相關(guān)蛋白質(zhì)外,在疾病基因組學與藥物基因組學的研究中還具有以下幾個方面的作用。

2•1鑒定和疾病相關(guān)的生物標記分子

蛋白質(zhì)組學方法在基礎醫(yī)學研究中的優(yōu)點在于,可以高通量的方式篩選和鑒定和疾病相關(guān)的生物標記分子,用于臨床診斷。HeineG[10]等人利用腦脊液作材料,經(jīng)過雙向電泳分離后的蛋白斑點,用液相色譜-質(zhì)譜分離鑒定,得到了腦脊液的高分辨率肽譜。因腦脊液的肽中包括許多激素、細胞因子和生長因子,在生物體中起著關(guān)鍵作用,它們以多種方式反映機體體內(nèi)平衡中和疾病相關(guān)的變化,如果能從這些肽中鑒定出疾病相關(guān)的標記分子,將可從肽水平上調(diào)查中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病,因而是一種疾病診斷和治療的新方法。KuererHM[11]等人利用高通量的雙向電泳技術(shù),分析乳腺管流體(breastductalfluid)中生化和細胞成分,以監(jiān)測乳腺癌的發(fā)生和進展情況。BrunagelG[12]等人則根據(jù)核基質(zhì)蛋白和結(jié)腸癌的相關(guān)性,利用雙向電泳技術(shù)鑒定病人的肝樣品中是否有核基質(zhì)蛋白,從而判斷結(jié)腸癌病人是否發(fā)生肝轉(zhuǎn)移,以此作為結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的早期診斷。對于蛋白芯片技術(shù),在基礎研究中常用于檢測蛋白質(zhì)修飾、表征蛋白質(zhì)相互作用、信號傳導以及酶動力學研究等。在臨床上,廣泛用于尋找疾病相關(guān)的生物標記分子和疾病診斷。WuW[13]等用SELDI-蛋白芯片技術(shù)鑒定了來自同一病人的兩種頭頸部鱗狀細胞癌細胞株HBSCC10A和VMSCC10B中蛋白的差異表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn),α-烯醇酶、annexin-Ⅰ和annex-in-Ⅱ是頭頸部鱗狀細胞癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的重要分子,以這些分子作為生物標記分子,用于頭頸部鱗狀細胞癌的臨床診斷。對于多維液相或毛細管液相色譜-質(zhì)譜技術(shù),由于可進行連續(xù)和微量檢測,在尋找疾病相關(guān)的生物標記分子方面具有超強的靈敏度。可進行大體積、低豐度蛋白的分析,如對血清樣品[14]和尿液[15]進行蛋白質(zhì)組學的研究。

2•2藥物開發(fā)

因為蛋白質(zhì)直接決定生物體處于健康或疾病狀態(tài),所以,蛋白質(zhì)可作為藥物設計和開發(fā)的藥靶。利用蛋白質(zhì)組學方法研究健康或疾病生物體蛋白間的相互關(guān)系、疾病病理基礎、鑒定藥物成分、毒性和作用機理,從而改進藥效和藥物安全性。MujerCV[16]等利用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù),分析了布魯氏桿菌(Brucellamelitensis,BM)的蛋白質(zhì)組。BM是一種細胞內(nèi)兼性革蘭氏陰性桿菌,可引起人或動物的布魯氏熱(brucellosis)。此桿菌的一個屬中至少有6個種。利用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù),分析了BM致病株16M的蛋白表達模式,并鑒定了所有表達的蛋白質(zhì),對6種布魯氏桿菌減毒疫苗Rev1的蛋白圖譜進行了廣泛研究。從而為發(fā)展疫苗,鑒定致病島(patho-genicityisland),建立宿主專一性、進化相關(guān)性及疾病治療和藥物開發(fā)奠定了基礎。

2•3致病機理研究

用蛋白質(zhì)組學方法研究疾病發(fā)生發(fā)展過程中某些蛋白或多肽水平的變化,從而了解疾病發(fā)生的機理,如對慢性髓性白血病(chronicmyeloidleukemia,CML)分子機理的研究[17]。此病為造血干細胞疾病,標記分子為Bcr-Abl蛋白酪氨酸激酶。讓全能的骨髓干細胞株(FDCP-Mix)有條件的表達Bcr-Abl蛋白酪氨酸激酶,從而使FDCP-Mix細胞株長期暴露于Bcr-Abl中,模擬CML疾病進程。用長期暴露和短期暴露進行對照,用MALDI-Tof質(zhì)譜或LC-MS進行鑒定。分析結(jié)果表明,白三烯(Leukotriene)A4水解酶的表達上調(diào),AnnexinⅥ、液泡ATP合成酶催化亞單位A及mortain的表達下調(diào),表明這些分子在CML的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。將蛋白質(zhì)組學方法用于疾病機理研究的例子很多,這里不再贅述。

篇2

現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)作為蛋白質(zhì)組學支撐技術(shù)之一，在蛋白質(zhì)和肽段的鑒定、定量和結(jié)構(gòu)分析方面起著非常重要的作用。質(zhì)譜分析進行蛋白質(zhì)鑒定和序列測定的基本原理是使用電噴霧離子化和基質(zhì)輔助激光解吸離子化的軟電離方法，經(jīng)酶切后的蛋白質(zhì)肽段或完整蛋白質(zhì)帶上電荷，然后根據(jù)不同離子間的質(zhì)荷比的差異來分離并確定相對質(zhì)量。樣品分子進行上述方法電離時能保留整個分子，確保了完整性而不會形成碎片離子，稱為肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF）技術(shù)。PMF是一種現(xiàn)在運用最廣的用來鑒定2-DE分離出來的蛋白質(zhì)和肽的方法，伴隨著現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，其在蛋白質(zhì)組學中的應用將越來越廣泛。

高效液相色譜及多維液相色譜高效液相色譜（HPLC）技術(shù)最初被用于分離蛋白質(zhì)或多肽?，F(xiàn)在，HPLC已成功應用于蛋白質(zhì)組學研究中，它是基于樣品分子在固定相（柱填料）和流動相（淋洗液）間的特殊相互作用而實現(xiàn)樣品分離的。無須變性處理樣品，可實現(xiàn)上樣收集及在線分析的自動化。利用液相色譜結(jié)合電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）而不依賴于2-DE，也可以分析磷肽或糖肽，先由特異性的胰蛋白酶消化，產(chǎn)生的多肽由強陽離子交換柱和反相HPLC分離后經(jīng)ESI-MS/MS分析。液相色譜與MS聯(lián)用，采用高速且高靈敏度的色譜分離法來代替耗時的2-DE蛋白質(zhì)分離法，故其與經(jīng)典的2-DE-MS法相比，具有快速、樣品需要量少和多肽分離的通用性強等優(yōu)點，將會在不同酪蛋白形式的分子特性描述中得到更進一步的應用。但由于層析填充物對許多蛋白質(zhì)組分有吸附作用，且難以實現(xiàn)多組分蛋白質(zhì)樣品的多維層析，因此僅適用于研究單一蛋白質(zhì)或簡單樣品蛋白質(zhì)組。多維液相色譜（MLC）則是利用與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用，可以檢測低豐度肽段，是目前蛋白質(zhì)組學研究最新的技術(shù)，可快速并高通量鑒定復雜蛋白質(zhì)混合物。

蛋白質(zhì)組學技術(shù)在畜禽動物營養(yǎng)學中的應用

傳統(tǒng)肉類生產(chǎn)中的飼養(yǎng)管理、飼料結(jié)構(gòu)、飼喂方式和飼養(yǎng)密度在基于動物營養(yǎng)和飼料工業(yè)的現(xiàn)代肉類生產(chǎn)的出現(xiàn)后，發(fā)生了本質(zhì)性的改變。同時，大規(guī)模的現(xiàn)代肉類生產(chǎn)影響到了飼養(yǎng)動物的生理學、行為學和生物化學過程，隨之導致了肉品品質(zhì)的下降。同時生產(chǎn)者為了增大產(chǎn)量和減少疾病風險，在養(yǎng)殖過程中濫用抗生素等化學藥物，加劇了肉類品質(zhì)的惡化。此外，為了追求提高肉類的某些性能，忽視了飼養(yǎng)動物的體質(zhì)健康、外部形狀與內(nèi)在機能的協(xié)調(diào)，生理學的平衡和整體適應性，從而導致現(xiàn)代肉用動物（豬和雞）對周圍環(huán)境條件的高度敏感性，最終導致了肉品的食用品質(zhì)，如：色澤、風味和嫩度等下降，PSE肉的比例升高，肉中的抗生素殘留現(xiàn)象極為突出。鑒于此，對肉品品質(zhì)進行評價并對其進行可能的等級標注及對其生產(chǎn)過程控制，對于現(xiàn)代肉品生產(chǎn)至關(guān)重要。蛋白質(zhì)是肌肉組織的重要組成成分，研究表明：肉類品質(zhì)研究與功能蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究間密不可分，蛋白組變化可能與肉的嫩度相關(guān)。肌纖維分紅肌纖維和白肌纖維2種類型，這2種類型在代謝水平上存在著結(jié)構(gòu)和功能的差異。纖維類型與肉質(zhì)性狀，如：性、風味和嫩度等的關(guān)系存在著很多爭議，尤其是纖維類型對肉嫩度的影響仍然不清。Lametsch等首次利用蛋白質(zhì)組學分析屠宰后豬肌肉的變化情況，采集了剛屠宰至屠宰后48h的肌肉蛋白質(zhì)組樣品，這些肌肉蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量介于5000~20萬不等，pH在4~9，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組模式發(fā)生了15種顯著的變化。此后的研究中Lametsch等最終確定了可作為肉品質(zhì)標記的20多種蛋白質(zhì)，包括結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)（肌動蛋白、肌球蛋白和肌鈣蛋白）和代謝酶（肌激酶、丙酮酸激酶和糖原磷酸化酶）。在這些標記蛋白中，人們發(fā)現(xiàn)肌動蛋白和肌球蛋白重鏈與肌肉的剪切力間存在極顯著的相關(guān)，這就清楚地表明屠宰后肌動蛋白和肌球蛋白重鏈的降解會影響肉的質(zhì)量。Remignon等直接對肌肉蛋白質(zhì)片段進行分析，認為蛋白質(zhì)的改變很可能是導致家禽PSE肉綜合征的直接原因。Molette等研究發(fā)現(xiàn)火雞屠宰后胸肌糖酵解的速度比較快（屠宰后每20minpH比正常的多下降0.5），從而使得肉品質(zhì)發(fā)生改變，如：系水力下降、加工產(chǎn)量降低和嫩度降低等。同樣報道了糖酵解快的動物肉的系水力低，并且提取到的肌漿蛋白含量低，這表明當pH下降的速率加快時蛋白質(zhì)功能發(fā)生了改變。

蛋白質(zhì)組學技術(shù)在水產(chǎn)動物營養(yǎng)學中的應用

蛋白質(zhì)組學方法在水產(chǎn)動物營養(yǎng)特別是魚的品質(zhì)鑒定中已有應用，目前也被廣泛應用到了對蝦和海蜇等的品質(zhì)控制中。隨著對魚類水產(chǎn)品的需求日益增長，保障和控制其安全生產(chǎn)具有重要的意義。在以數(shù)量增長為主的水產(chǎn)集約化養(yǎng)殖、運輸和銷售過程中，擁擠應激是常見的影響水產(chǎn)品食用品質(zhì)的因素，解凍程序同樣深刻地影響水產(chǎn)的品質(zhì)。近年來，蛋白質(zhì)組學已被廣泛地應用到了水產(chǎn)品品質(zhì)控制。Inger等利用2-DE技術(shù)研究新鮮的鱈魚與死后鱈魚肌肉，發(fā)現(xiàn)有11個蛋白質(zhì)點的豐度發(fā)生了變化，其中8個蛋白質(zhì)點的豐度顯著增加，后續(xù)分析表明：這些蛋白質(zhì)點是肌原蛋白、肌漿蛋白和肌肉纖維等肌肉組織的分解產(chǎn)物。由此可見，蛋白質(zhì)組學技術(shù)對評價魚肉鮮度等品質(zhì)具有重要的現(xiàn)實意義。Kjaersgard等通過對11種不同冷凍儲存條件下對鱈魚肌肉蛋白質(zhì)圖譜進行研究分析，發(fā)現(xiàn)不同冷凍儲存溫度對蛋白質(zhì)圖譜并無顯著影響，但經(jīng)過不同的冷凍儲存時間（3、6和12個月），肌漿球蛋白輕鏈、磷酸丙糖異構(gòu)酶、醛縮酶A和2-α肌動蛋白片段等蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度發(fā)生了顯著變化，從而導致魚肉的質(zhì)地和味道發(fā)生了變化。Martinez等通過研究人工養(yǎng)殖的鱈魚與野生的鱈魚，比較發(fā)現(xiàn)人工養(yǎng)殖的鱈魚2-DE圖上蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量在3.5萬~4.5萬間存在顯著差異。然而目前蛋白質(zhì)組學技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖和貯藏加工過程中的研究還處于起步階段，隨著相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，將在水產(chǎn)動物營養(yǎng)中起到更加重要的作用。

篇3

【摘要】 作為后基因時代的一門新學科，蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)為線粒體蛋白質(zhì)組的研究提供了有力的支持，使得從整體上研究線粒體蛋白質(zhì)組在生理、病理過程中的變化成為可能. 本文回顧了近年來國外學者應用蛋白質(zhì)組學研究方法揭示相關(guān)疾病線粒體蛋白質(zhì)存在相應的變化，以及通過對線粒體蛋白質(zhì)組的研究去發(fā)現(xiàn)線粒體蛋白質(zhì)在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，從而為尋找與疾病密切相關(guān)的疾病特異性蛋白提供線索.

【關(guān)鍵詞】 線粒體；疾??；蛋白質(zhì)組學

0引言

二十一世紀初，人類基因組計劃基本完成. 生命科學研究步入了后基因時代，其核心便是蛋白質(zhì)組研究. 蛋白質(zhì)組被定義為：一種細胞、組織或完整的生物體所擁有的全套的蛋白質(zhì). 這是一個整體的、動態(tài)的概念.而蛋白質(zhì)組學是研究這些成分在指定時間或特定環(huán)境條件下的表達. 因為蛋白質(zhì)是我們理解細胞功能和疾病過程的核心，如果在蛋白質(zhì)組學方面沒有共同的努力，基因組學的成果將不會成為現(xiàn)實. 蛋白質(zhì)組學現(xiàn)在被認為是一個在診斷和發(fā)現(xiàn)伴隨細胞器變化的復雜疾病的強有力的工具. 迅速發(fā)展的蛋白質(zhì)組學也推動了線粒體蛋白質(zhì)組的研究發(fā)展.

近年來國外學者應用蛋白質(zhì)組學研究方法揭示相關(guān)疾病線粒體蛋白質(zhì)存在相應的變化，并通過對線粒體蛋白質(zhì)組的研究去發(fā)現(xiàn)線粒體蛋白質(zhì)在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，從而為尋找與疾病密切相關(guān)的疾病特異性蛋白提供線索. 現(xiàn)就近年來，相關(guān)疾病線粒體蛋白質(zhì)組的研究進展作一綜述.

1線粒體相關(guān)疾病蛋白質(zhì)組學研究

線粒體是真核細胞中最復雜和最重要的細胞器之一，哺乳動物除成熟紅細胞外，線粒體普遍存在于有氧呼吸的真核細胞的細胞質(zhì)中. 它是細胞內(nèi)的能量供應中心，與氧自由基生成有關(guān). 線粒體在脂肪酸代謝、嘧啶生物合成、體內(nèi)鈣平衡，以及細胞信號傳導中起著主要作用. 同時，線粒體也是人類“另一”個來源于母系基因組的所在地. 許多細胞進程，如凋亡、老化以及多種疾病病理學機制(包括癌、肌病、糖尿病、肥胖、老化、特別是神經(jīng)退行性疾病等)都與線粒體功能障礙或突變有關(guān)［1-2］. 在人類線粒體中約有1500個蛋白質(zhì)［3］，其中已經(jīng)有600多種蛋白質(zhì)被鑒定出來. 如果能鑒定出大部分，甚至全部蛋白質(zhì)那將是非常寶貴的資源. 蛋白質(zhì)組學技術(shù)為研究線粒體疾病和線粒體功能失調(diào)，為尋找疾病診斷的標志物，探索藥物作用靶點提供了必不可少的手段. 成為臨床、基礎研究的熱點.

1.1神經(jīng)系統(tǒng)疾病

1.1.1神經(jīng)退行性疾病帕金森?。菏且环N中老年人常見的運動障礙疾病，以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性缺失和路易小體形成為病理特征［4］. 目前，導致黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性缺失的確切發(fā)病機制尚不完全清楚，但是已經(jīng)知道線粒體功能障礙在其中起了重要作用. 采用定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)和同位素編碼標記物方法，Jin等［5］對使用1甲基4苯基1，2，3，6四氫吡啶（MPTP）輔以二丙苯磺胺（probenecid）處理5 wk的慢性帕金森病小鼠和對照小鼠，進行了二組間黑質(zhì)線粒體蛋白表達譜的差異表達比較. 辨別出超過300個蛋白點. 比較處理組和對照組中這些蛋白點，發(fā)現(xiàn)超過100個蛋白點在處理組中有量上的顯著變化，經(jīng)鑒定其中有一個蛋白質(zhì)為：DJ1，它的突變與家族性帕金森病有關(guān). 采用蛋白印記分析和免疫組化方法得出，其在黑質(zhì)的分布與鼠細胞內(nèi)包涵體形成有關(guān). 包涵體如同帕金森患者中的路易小體. 這一結(jié)果說明DJ1不僅與α突觸核蛋白同時聚集在多巴胺能神經(jīng)元中，還存在于經(jīng)MPTP/prob處理的小鼠細胞包涵體內(nèi). 這一結(jié)果表明：在線粒體功能缺陷和帕金森病患者路易小體的形成中，DJ1可能起了重要作用.

阿爾茨海默病：是老年人中常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病. 日益增多的證據(jù)表明新陳代謝異常和氧化應激所致線粒體功能缺陷與阿爾茨海默病相關(guān). David等［6］采用蛋白質(zhì)組學技術(shù)對阿爾茨海默病的P301L Tau轉(zhuǎn)基因小鼠的蛋白質(zhì)表達譜進行分析發(fā)現(xiàn)，主要是與新陳代謝相關(guān)的蛋白：包括線粒體呼吸鏈復合物組成部分、抗氧化劑酶、突觸蛋白等都有改變. 隨后的功能分析提示，Tau蛋白和β淀粉樣蛋白對線粒體損傷有協(xié)同作用.

1.1.2家族性肌萎縮側(cè)索硬化癥肌萎縮側(cè)索硬化癥是運動神經(jīng)元疾病最常見的類型，肌萎縮側(cè)索硬化癥是一種致命的神經(jīng)變性疾病，特征是運動神經(jīng)元的不斷死亡. 大約10%的肌萎縮側(cè)索硬化癥患者是家族遺傳病例. 肌萎縮側(cè)索硬癥已被公認與銅/鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn super oxide dismutase gene，SOD1）基因突變有關(guān)，其在家族性遺傳性病例中占20%. 至今已有超過90種基因突變類型被發(fā)現(xiàn). 不斷積累的研究證據(jù)表明，在家族性肌萎縮側(cè)索硬化癥的病因?qū)W中線粒體功能障礙和細胞凋亡的激活起了重要作用. 但是很少知道哪個SOD1基因突變導致了線粒體功能障礙和細胞凋亡. 應用蛋白質(zhì)組學方法，F(xiàn)ukada等［7］對NSC34細胞的G93ASOD1型所致的家族性肌萎縮側(cè)索硬化癥的線粒體蛋白質(zhì)改變進行了研究. 采用兩種獨立的蛋白質(zhì)組學方法，在線粒體斷片中辨別出470個蛋白點，其中有75個是新發(fā)現(xiàn)的，這些蛋白以前只在cDNA水平報道過. 隨后，他們采用2DPAGE方法分析了NSC34細胞野生型和NSC34細胞的G93ASOD1型的線粒體蛋白質(zhì)組表達譜的區(qū)別. 在G93ASOD1型表達譜中，有9個點顯示高表達，36個點低表達. 運用MS鑒定這45個點，這些蛋白點包含了有關(guān)線粒體膜轉(zhuǎn)運、凋亡、呼吸鏈和分子伴侶蛋白等. 特別是發(fā)現(xiàn)，翻譯后修飾的電壓依賴性陰離子通道2蛋白的改變，該蛋白與線粒體膜滲透性的調(diào)節(jié)和細胞凋亡激活之間的關(guān)聯(lián)正在激烈地討論之中. 該研究所發(fā)現(xiàn)的這些線粒體蛋白，很可能是揭開SOD1突變導致線粒體功能障礙和細胞凋亡的鑰匙.

1.1.3癲癇癲癇是一組由不同病因引起，腦部神經(jīng)元高度同步化、且常具有自限性的異常放電所致疾病. 臨床表現(xiàn)具有發(fā)作性、短暫性、重復性以及刻板性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的綜合征. Kammer等［8］對點燃小鼠的腦組織采用2DE和質(zhì)譜分析技術(shù)鑒定出了一種變異的Rieske鐵硫蛋白（Rieske ironsulfur protein）. Rieske鐵硫蛋白是線粒體復合物Ⅲ的一部分. 研究顯示，在癲癇發(fā)作中Rieske蛋白可能對神經(jīng)元的反應起一定作用，從而在癲癇的分子發(fā)病機制上提出了一種新見解.

1.2心臟病擴張型心肌病是一種嚴重的可導致心衰的心臟病. Knecht等［9］采用雙向電泳（2DE，2D electrophoresis）取得了3300個心肌蛋白條帶. 通過氨基酸序列分析、Edman降解法及基質(zhì)輔助的激光解吸離子化質(zhì)譜（matrixassisted laser desorption MALD mass spectrometry MS）等方法分析了其中150條帶. 經(jīng)活檢及術(shù)后病理證實，其中有12條為擴張性心肌病特有的蛋白質(zhì). Arnott等對新福林誘導的肥大心肌細胞進行線粒體蛋白質(zhì)組分析，與對照樣品相比較發(fā)現(xiàn)有8種蛋白質(zhì)的表達水平發(fā)生了不同程度的變化. 對存在缺血再灌注區(qū)、被預先處理的局部缺血兔心和正常兔心線粒體斷片，Kim等［10］應用蛋白組學技術(shù)檢測其蛋白表達水平的差異. 采用2DE，辨別出25個線粒體蛋白，在缺血再灌注心肌中出現(xiàn)了不同程度的表達. 鑒定出的大部分蛋白與線粒體呼吸鏈和能量代謝有關(guān). 同時表明，要鑒定因缺血所致心肌損害的生物標志物，蛋白質(zhì)組學技術(shù)為其提供了一個適當?shù)氖侄?

1.3其他疾病

1.3.1乙醇依賴性肝損傷對暴露于慢性乙醇的動物模型，Venkatraman等［11］運用蛋白質(zhì)組學方法進行了肝線粒體蛋白水平變化的分析，結(jié)果顯示43個點出現(xiàn)不同水平的改變. 其中13個點上調(diào)而另30個點下降. 在這些蛋白中，以前并不知道的25個蛋白發(fā)生了改變. 研究結(jié)果表明，長期飲酒導致的線粒體蛋白質(zhì)組的改變遠遠超過了人們的預先估計. 在長期乙醇喂養(yǎng)的小鼠線粒體中所有核和線粒體編碼基因產(chǎn)物中的氧化磷酸化復合物均有下降，說明在整個代謝通路中存在合成障礙.

1.3.2腫瘤隨著線粒體功能蛋白質(zhì)組學研究的發(fā)展，已經(jīng)有可能鑒定出癌細胞中線粒體蛋白表達的異常，并有可能鑒定出新產(chǎn)生的生物標記物，并以此來作為早期檢測和進行風險評估的指標［12］. Herrmann等［13］采用蛋白組學技術(shù)定量分析了，線粒體編碼細胞色素C氧化酶亞單位和核編碼細胞色素C氧化酶亞單位的比率，發(fā)現(xiàn)該比率與前列腺組織惡性進程相關(guān). 在從正常上皮組織通過癌前病變發(fā)展到浸潤性癌的過程中，核編碼細胞色素C氧化酶亞單位IV， Vb， Vic與線粒體編碼細胞色素C氧化酶亞單位I 和 II 之間相對濃度的比率有很顯著的變化. 顯然這一改變發(fā)生在惡化的早期階段，充分顯示了核DNA編碼的線粒體蛋白在致癌上起了作用，為尋找潛在的生物標志物提供了依據(jù).

1.3.3內(nèi)毒素血癥內(nèi)毒素休克導致的器官功能衰竭現(xiàn)在已經(jīng)被認為與線粒體功能受損相關(guān)聯(lián). Miller等［14］運用2DE及MS技術(shù)，通過對存在脂多糖免疫反應的大鼠肝線粒體蛋白質(zhì)和對照組進行比較，發(fā)現(xiàn)ATP合酶α鏈、超氧化物歧化酶有顯著的增量調(diào)節(jié). 這些結(jié)果提示，內(nèi)毒素休克介導的線粒體蛋白組改變促進了代償反應（適應內(nèi)毒素休克），而不是細胞損傷所致. Crouser等［15］也對內(nèi)毒素血癥中線粒體蛋白質(zhì)組變化作了研究. 采用經(jīng)靜脈注入內(nèi)毒素（3.0 mg/kg），以成年雄性貓和未處理的貓作對照，經(jīng)2DE發(fā)現(xiàn)兩組動物的肝線粒體蛋白表達譜有14個點不同. 質(zhì)譜分析表明鳥氨酸循環(huán)酶、熱休克蛋白60、二氧化錳超氧化劑岐化酶高表達，而熱休克蛋白70、F(1)ATP酶和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶表達降低. 他們認為在內(nèi)毒素血癥中線粒體功能有明顯改變.

1.4老化關(guān)于老化過程的信息可以通過認識蛋白表達的改變來獲得. Kim等［16］用2DE方法，對13 mo（年幼）和31 mo（年老）大小的雄性Fischer344大鼠腎的線粒體斷片進行了差別分析. 電泳圖譜中檢測出380個點，其中167個點二者比較有顯著性差異，再通過應用基質(zhì)輔助的激光解吸及電離時間飛行質(zhì)譜鑒定了其中103個蛋白. 在年老的線粒體斷片中顯示出，抗氧化和蛋白水解的蛋白增多，細胞骨架蛋白減少. 他們認為：通過對蛋白表達的蛋白質(zhì)組學分析，可有效的評估年齡狀態(tài). Kiri等［17］也做了類似實驗，他們對3~8 mo（年幼）牛心和18~24 mo（成年）牛心線粒體運用蛋白質(zhì)組學技術(shù)進行蛋白分離和鑒定. 在PH 5~8范圍中選取鑒定40個蛋白點，40個點中有5個蛋白只存在于成年，而另有5個蛋白只存在于年幼的牛心，有8個蛋白的量在兩組中比較至少相差2倍以上. 這些蛋白中有與能量生成、新陳代謝密切相關(guān)的酶，線粒體蛋白合成延伸酶等. 這些氧化修飾蛋白很可能與促成心臟蛋白年齡相關(guān)性退化和功能減退有關(guān).

1.5毒理學研究為研究錳對線粒體的毒性，Zhang等［18］對經(jīng)二氯化錳（30 mg/kg）處理的雄性斯普拉道來大鼠的腦的線粒體，應用考馬斯藍染色，2DPAGE分離出超過300個點在. 與對照組相比，有3個點被抑制，3個點被誘導. 通過MALDITOF鑒定了有ATP依賴鈣離子泵、60 000熱休克蛋白、線粒體跨膜鳥苷三磷酸酶FZO1B、長鏈脂肪酸CoA連接酶、ATP合酶β鏈、琥珀酸脫氫酶、黃素蛋白等. 這些結(jié)果表明線粒體呼吸鏈復合物的改變與二氯化錳誘導的線粒體機能障礙相關(guān).

2展望

線粒體蛋白質(zhì)組研究也必須克服一些困難：由于分離技術(shù)和鑒定技術(shù)的局限，低豐度、低分子量蛋白質(zhì)及疏水性蛋白質(zhì)難以鑒定. 數(shù)據(jù)庫的貧乏，線粒體蛋白質(zhì)組學還有待于更進一步的發(fā)展. 雖然線粒體蛋白組學在疾病中的應用還不是十分廣泛，但是從發(fā)展趨勢可以看出它的研究是值得期待的. 今后需進一步完善：① 線粒體蛋白組數(shù)據(jù)庫，特別是人類線粒體蛋白組數(shù)據(jù)庫的完善，以便將來與病變組織線粒體蛋白質(zhì)表達譜進行比對. 建立一個詳細全面的人類線粒體圖譜數(shù)據(jù)庫，有意義的線粒體蛋白功能得到確定，將會成為開發(fā)藥物和探索疾病診斷的強大工具. ② 研究細胞內(nèi)線粒體蛋白的相互作用和轉(zhuǎn)運. 隨著蛋白質(zhì)組學技術(shù)的不斷發(fā)展進步，線粒體蛋白質(zhì)組也將得到長足發(fā)展，因此揭開線粒體作用機制不再是夢想，預防和治療線粒體相關(guān)疾病必將成為現(xiàn)實.

參考文獻

［1］ McDonald TG， Van Eyk JE. Undercover in the lipid bilayer ［J］. Basic Res Cardiol， 2003，98(4):219-227.

［2］ Lopez MF， Melov S. Mitochondrial proteins and effect on functions ［J］. Circ Res， 2002， 90(4):380-389.

［3］ Taylor SW， Fahy E， Zhang B， et al. Characterization of the human heart mitochondrial proteome ［J］. Nat Biotechnol， 2003，21(3):281-286.

［4］ Braak H， Del Tredici K， Rub U， et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinsons disease ［J］. Neurobiol Aging， 2003，24(2):197-211.

［5］ Jin JH， Meredith， Gloria E， et al. Quantitative proteomic analysis of mitochondrial proteins: relevance to Lewy body formation and Parkinsons disease ［J］. Brain Res Mol Brain Res， 2005，134(1): 119-138.

［6］ David DC， Hauptmann S， Scherping I， et al. Proteomic and functional analyses reveal a mitochondrial dysfunction in P301L tau transgenic mice ［J］. J Biol Chem， 2005，280(25): 23802-23814.

［7］ Fukada K， Zhang FJ， Alexis Vien， et al. Mitochondrial proteomic analysis of a cell line model of familial amyotrophic lateral sclerosis ［J］. Mol Cell Proteomics， 2004，3(12):1211-1223.

［8］ Junker H， Spate K， Suofu Y， et al. Proteomic identification of the involvement of the mitochondrial rieske protein in epilepsy ［J］. Epilepsia， 2005，46(3):339-343.

［9］ Knecht H， Odermatt BF. Rearranged epsteinbarr virus genome in Hodgkins disease and angioimmunoblastic lymphadenopathy: Swiss results ［J］. Am J Pathol， 2003， 163(1):369-370.

［10］ Kim N， Lee Y， Kim H， et al. Potential biomarkers for ischemic heart damage identified in

mitochondrial proteins by comparative proteomics ［J］. Proteomics， 2006，6 (4):1237-1249.

［11］ Venkatraman A， Landar A， Ashley J， et al. Modification of the mitochondrial proteome in response to the stress of ethanoldependent hepatotoxicity ［J］. J Biol Chem， 2004，279(21):22092-22101.

［12］ Verma M， Kagan J， Sidransky D， et al. Proteomic analysis of cancercell mitochondria ［J］. Nat Rev Cancer， 2003， 3(10): 789-795.

［13］ Herrmann PC， Gillespie JW， Charboneau L， et al. Mitochondrial proteome: Altered cytochrome c oxidase subunit levels in prostate cancer ［J］ . Proteomics， 2003， 3(9):1801-1810.

［14］ Miller I， Gemeiner M， Gesslbauer B， et al. Proteome analysis of rat liver mitochondria reveals a possible compensatory response to endotoxic shock ［J］. FEBS Lett， 2006，580(5):1257-1262.

［15］ Crouser ED， Julian MW， Huff JE， et al. A proteomic analysis of liver mitochondria during acute endotoxemia ［J］. Intensive Care Med， 2006， 32(8):1252-1262.

［16］ Kim CH， Park DU， Chung AS， et al. Proteomic analysis of postmitochondrial fractions of young and old rat kidney ［J］. Exp Gerontol， 2004，39(8): 1155-1168.

［17］ Ajay NK， HungCuong T， Kate L， et al. Proteomic changes in bovine heart mitochondria with age: Using a novel technique for organelle

篇4

關(guān)鍵詞： 大腸癌 蛋白質(zhì)組學 差異表達

大腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈上升趨勢，尤其是結(jié)腸癌發(fā)病率的增長速度迅猛。全球大腸癌的發(fā)病率在腫瘤中男性居第4位、女性居第3位，患病率居第2位[1]。早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療是決定大腸癌患者預后及生活質(zhì)量的關(guān)鍵。為了深入研究大腸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，強化大腸癌的防治效果，筆者采用蛋白質(zhì)組學雙向凝膠電泳（2-DE）等研究方法，對比分析正常直腸黏膜、大腸癌原發(fā)灶組織中蛋白質(zhì)的表達差異，分離、鑒定大腸癌發(fā)生的相關(guān)蛋白，研究其對大腸癌細胞生物學行為的影響，以期為篩選臨床腫瘤標志物和治療靶標提供依據(jù)。

1.材料與方法

1.1材料

1.1.1標本采集。實驗所用標本均取自湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，國家重點肛腸科經(jīng)病理確診的本病首診患者共10例，以及經(jīng)病理確診的正常成人直腸黏膜12例。

1.1.2試劑。IPG緩沖液pH3～10、24cm固相化pH梯度干膠條、2D Quant蛋白質(zhì)定量試劑盒、考馬斯亮藍G-250，購自Amershan Pharmacia公司。

1.1.3儀器。IPGphor等電聚焦儀、Ettan DALT Ⅱ垂直電泳槽、Imagescanner掃描儀均為Amersham Biosciences公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1組織蛋白樣品的制備。組織活檢樣本用生理鹽水反復沖洗，以去除血液及其他污染，稱取適量組織樣品與8倍體積的組織裂解液混合后，用研缽使組織充分研磨裂解，研磨過程中不斷加入液氮以避免蛋白降解，置于室溫下1小時，間斷渦旋混勻，然后于12000g、4℃離心1小時，吸取上清液即為組織的總蛋白質(zhì)。2D Quant Kit定量試劑盒測定蛋白濃度。

1.2.2二維凝膠電泳。操作步驟主要按照IPGphor等電聚焦系統(tǒng)使用指南進行。實驗重復3次。

1.2.3凝膠圖像分析。應用Imagescanner掃描儀及LabScan掃描軟件掃描考馬斯亮藍染膠獲取圖像，PDQuest 2-DE軟件比較分析健康人和大腸癌患者組織蛋白二維電泳圖譜的差異，選取表達水平相差 2倍以上的點作為后續(xù)質(zhì)譜分析的候選蛋白質(zhì)點。

1.2.4質(zhì)譜分析。從膠中切取差異蛋白質(zhì)點于1.5 ml Eppendorf管中，50%乙腈和100 mmol/L碳酸氫銨脫色30 min，乙腈脫水冷凍抽干。加入10 μl TPCK處理的胰蛋白酶（0.1 mg/L）冰上吸脹60 min，37℃酶解12 h，30 μl萃取液（100%乙腈∶5%甲酸1∶1）萃取60 min，重復萃取1次。將萃取液收集于0.5 ml Eppendorf管，冷凍濃縮至總體積2-5μl。制備好的樣品在MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀中進行分析儀上進行分析。結(jié)果利用Mascot軟件檢索NCBI數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質(zhì)。

2.結(jié)果

2.1兩組組織二維電泳圖譜的建立和圖像分析

應用2-DE技術(shù)分別分離12例健康人直腸黏膜和10例大腸癌患者癌組織的混合蛋白?？捡R斯亮藍G-250染色后，得到了健康人和大腸癌患者組織的2-DE圖譜。為了保證結(jié)果的可靠性，在相同的條件下重復2-DE兩次，獲得兩組的2-DE圖譜各3張，采用PDquest圖像分析軟件對2-DE圖像進行分析。結(jié)果顯示：健康人組織平均蛋白質(zhì)點數(shù)為1000±10，大腸癌組織平均蛋白質(zhì)點數(shù)為1010±5，匹配率為（93.5±5.0）%。兩種組織樣本共有26個差異點，其中在大腸癌組織中表達上調(diào)點11個，下調(diào)的點15個。圖1為有代表性的大腸癌組織蛋白質(zhì)的2-DE圖譜。

2.2差異蛋白質(zhì)點的鑒定

從膠中切取較明顯的10個差異蛋白質(zhì)點，進行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析。利用Mascot查詢NCBI數(shù)據(jù)庫，如果Mascot分數(shù)>56分（P

3.討論

不同生物學特性的腫瘤細胞具有不同的發(fā)生、發(fā)展和特殊性狀，其中蛋白表達的差異起到了重要作用。腫瘤與正常組織或細胞的蛋白質(zhì)表達譜差異分析是腫瘤蛋白質(zhì)組學研究中應用最廣泛和最有效的手段[2，3]。本課題利用蛋白組學技術(shù)比較了大腸癌組織與正常直腸黏膜，發(fā)現(xiàn)了5種蛋白質(zhì)的表達水平均發(fā)生了明顯變化，這些差異表達的蛋白有可能成為早期診斷大腸癌的候選標記物。本研究鑒定出的HSP27、Sl00A9和GST-π均可能與大腸癌的發(fā)生有關(guān)，可能作為大腸癌早期診斷的候選新型生物標志物及大腸癌治療的靶標，但這需要在以后的實驗中進一步證實。生物信息學分析表明，本研究篩選出的5種蛋白與細胞增殖、信號轉(zhuǎn)導通路、細胞周期調(diào)控等密切相關(guān)，可能在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，而對這些蛋白的特進一步分析研究可為探討大腸癌的分子機制、尋找大腸癌早期診斷的分子標記物提供實驗和理論依據(jù)。

參考文獻：

[1]Park in DM，Bray F，F(xiàn)erlay J，et al.G lobal cancer statistics[J].CA CancerJ Clin，2005，55（2）：74-108.

篇5

【關(guān)鍵詞】蛋白質(zhì)組學；農(nóng)業(yè)生物科學；研究應用

一、引言

蛋白質(zhì)組學是一種用于解決蛋白質(zhì)在現(xiàn)有水平之上，運用大規(guī)模轉(zhuǎn)基因的方式發(fā)揮蛋白質(zhì)應有的功能。蛋白質(zhì)組學是基于蛋白質(zhì)功能體系所形成的前所未有的一種中大突破，其通過利用生化研究的途徑，順利的攻克了這一難關(guān)。隨著我國社會主義現(xiàn)代化的飛速發(fā)展，我國城鄉(xiāng)之間人口流動的比率不斷提高，從而促使了我國從事農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的居民越來越少，進而增加了我國對轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物、林業(yè)喬木等農(nóng)業(yè)生物開發(fā)的依賴。但是，由于人們對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的認識性不足，帶來了這些產(chǎn)物在我國社會中的普及性程度不夠，并且也帶來了這一領域發(fā)展的困難。蛋白質(zhì)組學相關(guān)研究能夠順利的讓我國人們和科研領域從對基因?qū)哟?、核酸層次的認識順利的過度到了直接從蛋白質(zhì)層次對諸多基因產(chǎn)物的認識。并且隨著我國乃至世界對蛋白質(zhì)組學的深入研究，這一領域在不久的將來將會成為生命科學研究領域的核心，其能夠解決當前在農(nóng)業(yè)生物科學研究領域遇到的諸多難題。因此，作者在本文中主要結(jié)合自身多年從事生命科學研究領域的經(jīng)驗，對這一追隨時代潮流的理論進行研究，并就其適用的主要領域（農(nóng)業(yè)生物科學領域）展開應用研究。

二、蛋白質(zhì)組學在農(nóng)學基礎研究領域中的應用研究

蛋白質(zhì)組學在農(nóng)學基礎的研究領域中主要應用于以下幾兩個方面：（1）農(nóng)作物與微生物之間相互的作用機理。有關(guān)文獻表面，農(nóng)作物在生長過程當中會與微生物的生存之間存在對資源的競爭，其最終的生長發(fā)育會隨著微生物存在的現(xiàn)狀進行改變。那么，對于這一事實也可以用蛋白質(zhì)組學理論進行解釋。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的主要原因是由于當農(nóng)作物作物遭遇到微生物的共生和寄生，以及遭遇到病菌的侵害的時候，其就會改變被侵害部位的蛋白質(zhì)的含量，從而向外界或者是其他未受侵害的組織或者部分傳遞這一信號，從而引起整個農(nóng)作物個體的反應機制；（2）農(nóng)作物的品質(zhì)改良、提升產(chǎn)量問題。通過利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)，科學家發(fā)現(xiàn)可以提高農(nóng)作物的產(chǎn)量，還可以改善農(nóng)作物的品質(zhì)。例如，著名生物學家Natarajan，其對野生型的黃豆和農(nóng)戶種植型的黃豆，利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)進行研究、比較其兩種不同生長環(huán)境下的黃豆，其內(nèi)部硫氨基酸的含量存在較大區(qū)別，從而證明了提升黃豆蛋白中的硫氨基酸的濃度，能夠極大的改善現(xiàn)有大豆農(nóng)作物產(chǎn)品的品質(zhì)。

三、蛋白質(zhì)組學在林學研究研究領域中的應用研究

時至今日，世界范圍已經(jīng)開始應用蛋白質(zhì)組學這門技術(shù)，來對林木的生長、發(fā)育、繁殖，以及當林木受到了生物以及非生物的脅迫后產(chǎn)生的反應展開研究。這些研究為人們增加了眼界，使得當前人們對有關(guān)林木生物學產(chǎn)生了更為深刻的了解。在今天，蛋白質(zhì)組學已經(jīng)滲透到了農(nóng)學基礎領域的多個方面，例如：在林木的遺傳育種領域、林木病蟲害的防止領域等等。通過對蛋白質(zhì)組學的應用，解決了以往讓諸多從事這一研究領域科學家頭疼的問題。以下作者將結(jié)合上述幾種應用領域進行分別應用研究：（1）林木的遺傳育種領域。著名生物學家Huang在其文中建立了具有高分辨率的和高穩(wěn)定性的一種雙向的電泳式的圖譜，并以經(jīng)過矮化處理過后的杉木葉片中蛋白質(zhì)為例，運用蛋白質(zhì)組學技術(shù)對其展開了有關(guān)研究。其發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過矮化處理的杉木其葉片蛋白質(zhì)的數(shù)量較野生杉木葉片蛋白質(zhì)的數(shù)量更低。（2）關(guān)于林木的逆境應答研究。著名生物科學家Renaut等人，采用情景模擬的方式，為林木設置逆境的環(huán)境，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，在擁有六百個蛋白質(zhì)的植物經(jīng)過環(huán)境變化，其內(nèi)部蛋白質(zhì)的數(shù)量減少了百分之十，并且這些消失的蛋白質(zhì)主要是與林木的新陳代謝有關(guān)。（3）關(guān)于林木病蟲害領域研究。著名科學家Fan等人，以毛泡桐、白花泡桐為例，通過設置同齡和同方位的產(chǎn)生病蟲害的部位切片，對這一切片中的蛋白質(zhì)進行了單項和雙向兩種方式的電泳分析。其研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這兩種類型的泡桐的病蟲害切片當中均找尋不到蛋白多肽這種物質(zhì)，從而他們得出了這一的研究結(jié)論，即：林木的病蟲害與林木中所含的蛋白多肽存在負相關(guān)的關(guān)系。

四、蛋白質(zhì)組學在其他農(nóng)業(yè)生物科學領域中的應用研究

蛋白質(zhì)組學還可以應用于研究水產(chǎn)業(yè)和畜牧業(yè)的研究，例如：可以利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)，研究水產(chǎn)業(yè)和畜牧業(yè)的肉類不同品質(zhì)、不同性狀時其內(nèi)部所含有的蛋白質(zhì)的數(shù)量，從而判斷哪種元素能夠促進蛋白質(zhì)總量的增加，從而改變?nèi)赓|(zhì)和性狀。另外，也可以利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)去研究這些產(chǎn)業(yè)中神經(jīng)組織中蛋白組的問題、逆境脅迫的應答反應，或者是用于其他領域，例如：研究分離和鑒定農(nóng)藥蛋白質(zhì)中所包含的靶分子的結(jié)構(gòu)等等。

篇6

關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)組學；非生物脅迫；生物脅迫；雙向電泳；質(zhì)譜

中圖分類號：q946.1；q945.78 文獻標識碼：a 文章編號：0439-8114（2013）22-5403-06

隨著生命科學的日益發(fā)展，對基因功能的研究已不僅僅局限在核酸水平。蛋白質(zhì)是基因功能的執(zhí)行者，是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者。要深入了解生命的復雜活動，就需要從蛋白質(zhì)的整體水平上進行研究。蛋白質(zhì)組學是指研究蛋白質(zhì)組的科學，本質(zhì)上是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達水平、翻譯后的修飾、蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于組織變化、細胞代謝等過程的整體而全面的認識[1]。近些年來，蛋白質(zhì)組學發(fā)展迅速，并得到了廣泛的應用，成為生命科學研究的核心內(nèi)容之一。

植物在生長發(fā)育過程中會遭遇高（低）溫、干旱、水澇和高鹽等非生物脅迫以及病原菌侵染和蟲害等生物脅迫。植物感受逆境信號后，可以通過信號轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)細胞內(nèi)抗逆相關(guān)蛋白的表達，從而調(diào)整自身的生理狀態(tài)或形態(tài)來提高對逆境的耐受能力。在蛋白水平，對發(fā)生變化的蛋白質(zhì)進行定性和定量測定，探討植物在逆境脅迫條件下的調(diào)控機制，是研究植物抗逆性的重要手段之一，并已在多種植物的研究中取得了一定的成果。

1 蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)

過去，許多科學家都致力于蛋白質(zhì)組的大規(guī)模定性分析，而現(xiàn)在，如何系統(tǒng)地識別和定量一個蛋白質(zhì)組則是蛋白質(zhì)組學研究的主要目的之一[2]。由于蛋白質(zhì)的濃度在很大程度上影響了其功能的實現(xiàn)，因此，對蛋白質(zhì)的相對和絕對濃度進行測量也就變得至關(guān)重要。目前，比較成熟的蛋白質(zhì)定量方法主要分為兩類，一類基于傳統(tǒng)雙向凝膠電泳及染色，另一類基于質(zhì)譜檢測技術(shù)。

1.1 基于凝膠的定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)

雙向電泳（two dimensional electrophoresis，2de）技術(shù)是由o’farrell于20世紀70年代建立的[3]，具有高分辨率的特點，通常能分辨出1 000～3 000個蛋白點[4]。該技術(shù)自誕生以來，一直在不斷改進和優(yōu)化。目前，應用比較廣泛的雙向電泳技術(shù)主要是雙向熒光差異凝膠電泳（two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2d-dige）。但雙向電泳本身也存在著一些弊端：試驗重復性差；對蛋白質(zhì)的分離受到蛋白豐度、等電點、相對分子質(zhì)量和疏水性等的限制；自動化程度低；操作起來費時費力等，這些都在一定程度上限制了該技術(shù)的應用。

1.2 基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)

基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學定量技術(shù)可以分為兩大類：標記定量技術(shù)（labeling quantitation）和非標記定量技術(shù)（label-free quantitation）[2]。此外，標記或非標記的鳥槍蛋白質(zhì)組學策略也是基于質(zhì)譜技術(shù)的常用方法。

1.2.1 標記定量技術(shù)

1.2.1.1 同位素代謝標記法

同位素代謝標記以同位素元素或同位素標記氨基酸形式摻入到細胞培養(yǎng)基中，在細胞生長代謝過程中完成蛋白質(zhì)同位素標記。此方法的顯著優(yōu)點是蛋白質(zhì)在樣品制備的初期被標記，由此減少了試驗操作造成的誤差，從而提高了準確度。目前比較常用的方法包括15n體內(nèi)代謝標記和細胞培養(yǎng)中穩(wěn)定同位素標記氨基酸（stable isotope labeling by amino acids in cell culture，silac）方法。

1）15n體內(nèi)代謝標記法。采用含有15n（或14n）作為惟一氮源的培養(yǎng)基來培養(yǎng)植物組織（植株），依靠摻入合成蛋白質(zhì)的15n實現(xiàn)定量[5]。這項技術(shù)適用于多種蛋白提取物的蛋白質(zhì)定量，包括那些需要進行大量純化步驟、蛋白產(chǎn)量易發(fā)生改變的[6]。其優(yōu)勢還在于可應用于水培植物，使得植物對養(yǎng)分的吸收得到更好的控制。

2）silac方法。依靠在培養(yǎng)介質(zhì)中加入穩(wěn)定同位素標記的必需氨基酸（如賴氨酸或精氨酸等）實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的定量，已經(jīng)廣泛用于高等動物細胞蛋白質(zhì)的鑒定及定量[5]。silac法標記效率高、損失小；標記誤差低，可靠性高。然而，由于植物細胞本身可以合成這些

必需氨基酸，導致只有部分蛋白質(zhì)被標記。并且，此方法成本較高，導致其在植物蛋白質(zhì)組學研究中的應用受到了一定的限制。

1.2.1.2 同位素化學標記法

1）同位素親和標記法。比較典型且已商業(yè)化的一項技術(shù)是同位素親和標記技術(shù)（isotope coded affinity tages，icat）。icat 無需繁冗的雙向凝膠電泳技術(shù)，標記策略靈活多變，可對低豐度、難溶性蛋白進行分析。近些年來，該技術(shù)與不同的質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)合應用得到了廣泛的研究。但icat適用于含半胱氨酸或半胱氨酸存在修飾的蛋白質(zhì)。

2）酶催化18o-同位素標記法。酶催化18o-同位素標記法是通過加入h218o，在蛋白酶催化作用下將羧基上的2個16o替換成18o，從而對肽段進行標記。該技術(shù)有以下優(yōu)點：操作簡單；標記效率高，準確率高；應用范圍廣，可用于多種不同類型的蛋白質(zhì)；可標記所有酶解的肽段，使相對定量所有的蛋白質(zhì)成為可能；反應條件溫和、副產(chǎn)物少；便于與磷酸化肽段富集方法聯(lián)用，適于低豐度磷酸化肽段的定量標記肽段；在蛋白質(zhì)水解分裂的同時被標記上，避免了人為因素的干擾。但由于標記后的蛋白質(zhì)樣品過于復雜，該技術(shù)還有待進一步的完善。 　3）相對和絕對定量同位素標記法。相對和絕對定量同位素標記（isobaric tags for relative and absolute quantitation，itraq）技術(shù)是美國應用生物系統(tǒng)公司在 2004 年推出的一項新的體外同位素標記技術(shù)[7]。該技術(shù)使用8種（或4種）不同的同位素試劑來同時標記和比較8種（或4種）不同的蛋白質(zhì)樣品。如今該技術(shù)的應用越來越廣泛，其優(yōu)越性也逐步在許多生物體和組織研究中得到了證明，已成為目前蛋白質(zhì)組學定量方法中一個十分重要的技術(shù)。

itraq技術(shù)有如下特點：①樣本量大?？蓪Χ噙_4個樣本同時相對量化，大大降低了試驗過程中所引入的技術(shù)誤差；②定性分析結(jié)果可靠?？梢酝瑫r給出每一個組分的相對分子質(zhì)量和豐富的結(jié)構(gòu)信息；③靈敏度、準確度高。將離子抑制效應、背景噪音和儀器條件等系統(tǒng)誤差的影響降到最小，獲得的變異系數(shù)在9%的范圍；④分離能力強，分析范圍廣。作為標記的反應不在活細胞，適合任何類型的蛋白質(zhì)樣品，包括高相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)、酸性蛋白質(zhì)、堿性蛋白質(zhì)、不溶性蛋白質(zhì)（eg.膜蛋白）等；⑤分析時間快，自動化程度高。

當然，itraq標記技術(shù)也有自己的局限性。對全組蛋白質(zhì)而言，它只能對相對豐度進行比較，因此只能提供相對的定量；數(shù)據(jù)的復雜度更高，因此需要開發(fā)更多的信息學工具；高豐度蛋白質(zhì)干涉了低豐度蛋白質(zhì)的檢測和鑒定；每次試驗，研究人員都必須鑒別全部的蛋白質(zhì)組[8]。

1.2.2 非標記定量技術(shù) 非標記定量法（label-free）是一種新興的蛋白質(zhì)定量方法，包括基于色譜峰面積定量法及利用二級離子信號的強度進行mrm（多反應監(jiān)測）檢測等。與標記定量法相比，非標記定量法不需要花費大量時間準備同位素化合物，也不需要使用非常昂貴的試劑，但該技術(shù)比較依賴于儀器的狀態(tài)、樣品的復雜性以及一些未知因素，其靈敏度和精確度都不及標記定量法。要得到廣泛的應用，非標記定量技術(shù)還需要進一步的優(yōu)化和改進。

1.2.3 鳥槍蛋白質(zhì)組學策略 鳥槍法首先采用標記或非標記的方法將蛋白質(zhì)混合物降解成肽段的混合物，利用質(zhì)譜進行分析測序，然后利用計算機技術(shù)描繪出肽段在蛋白質(zhì)上的位置圖譜，從而確定該混合物中的蛋白質(zhì)成分。其代表方法是mudpit。

2 蛋白質(zhì)組學在植物逆境生物學研究中的應用

自然界中有多種非生物和生物因子都會對植物的生長發(fā)育造成不利影響，嚴重時甚至會導致植物的死亡。植物對這些逆境脅迫都有很強的響應機制，可通過一系列從細胞到生理水平的應答反應來適應這些不利的環(huán)境條件。應用蛋白質(zhì)組學技術(shù)研究在逆境脅迫下植物蛋白質(zhì)種類及表達量的變化，將有助于人們從整體和動態(tài)的蛋白質(zhì)水平了解脅迫因子的傷害機制以及植物的適應機制。

2.1 非生物脅迫的植物蛋白質(zhì)組學研究

2.1.1 溫度脅迫 溫度是影響植物生長發(fā)育和農(nóng)作物產(chǎn)量的重要環(huán)境因子。目前的研究較多集中于溫度脅迫下差異表達蛋白質(zhì)的鑒定和植物響應高溫、低溫分子機制的解析。

ganmulla等[9]將24日齡水稻秧苗的葉片分別在5 ℃（12 d）、12 ℃（20 d）的低溫和28 ℃（36 d）、36 ℃（44 d）的高溫環(huán)境下處理3 d，并檢測其蛋白質(zhì)組變化。采用無標記的鳥槍法，對每個處理組的3個生物

學重復進行了蛋白質(zhì)定量分析。結(jié)果表明，在一個或多個處理組中被鑒定出來的蛋白，有超過400個都對溫度脅迫進行了響應。其中，分別有43、126和47個蛋白專一地出現(xiàn)在了5 ℃（12 d）、12 ℃（20 d）和36 ℃（44 d）處理組中。并且，與其他溫度處理相比， 12 ℃（20 d）處理后的水稻葉片蛋白質(zhì)組發(fā)生的變化更顯著。另外，該試驗還鑒定出了20個新的脅迫響應蛋白。

為了檢測在成熟的硬質(zhì)小麥子粒中熱脅迫對非醇溶谷蛋白積累所產(chǎn)生的影響，laino等[10]將意大利栽培種svevo進行了2個不同的溫度處理（熱脅迫和對照）。通過檢測非醇溶谷蛋白的2-d模型，鑒定出了在灌漿期受熱脅迫影響的多肽。這項研究共發(fā)現(xiàn)了132個表達發(fā)生變化的多肽，其中有47個（包括hsps和脅迫相關(guān)蛋白）是通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（maldi-tof）和基質(zhì)輔助激光解析電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（maldi-tof-tof-ms）鑒定出來的。很多熱誘導的多肽被認為會引起敏感植株的反應。

2.1.2 水分脅迫 近年來，研究人員利用蛋白質(zhì)組學，已鑒定出一些水分脅迫響應關(guān)鍵因子，并揭示出植物應答水分脅迫所涉及到的多個代謝通路。

ford等[11]在2011年首次采用鳥槍蛋白質(zhì)組策略研究了小麥（triticum aestivum l.）栽培種在干旱脅迫下的蛋白豐度變化。對不耐旱種kukri、耐旱種excalibur和耐旱種rac875在溫室中進行周期性干旱處理，處理結(jié)束后從葉片中提取蛋白，共鑒定出5 125個肽段，并分析出1 299個蛋白。從中選擇了159個在所有時間點都有表達的蛋白用itraq技術(shù)進行相對定量。在不同時間點，3個栽培種的蛋白組變化反映了它們對干旱脅迫的不同生理響應。結(jié)果顯示，在脅迫處理前期，excalibur沒有明顯的蛋白組變化，而rac875的蛋白組發(fā)生了顯著變化。這3個栽培種的蛋白組變化都與它們的氧化脅迫代謝和活性氧清除能力相一致，表現(xiàn)為超氧化物歧化酶、過氧化氫酶的增多以及參與光合作用和卡爾文循環(huán)的蛋白的減少。

祁建民等[12]以鑒定出的耐旱性紅麻品種ga42為材料，在5葉期設置正常供水與控水比較試驗，運用雙向電泳分析紅麻在干旱脅迫和正常供水條件下葉片蛋白質(zhì)組的動態(tài)變化。在干旱脅迫下出現(xiàn)65個差異表達蛋白質(zhì)點，選擇表達量明顯上調(diào)的9 個蛋白質(zhì)點，通過maldi-tof-tof ms分析和數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定出6個差異表達蛋白，分別是2個核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶或其大亞基、1個rubisco活化酶、1個二甲基萘醌甲基轉(zhuǎn)移酶、1個推測的胞質(zhì)型谷氨酰胺合成酶以及1個atp合酶β亞基。試驗證明，紅麻ga42表現(xiàn)出較強的耐旱性與上述6個差異表達蛋白質(zhì)點明顯上調(diào)有關(guān)。 　komatsu等[13]將發(fā)芽2 d的大豆在水澇脅迫下處理2 d，從大豆的根系和下胚軸中提取蛋白質(zhì)。經(jīng)sd-page和cbb染色后，在每張凝膠上得到具有可重復性的蛋白點約803個。水澇脅迫引起了21個蛋白點的表達量升高，其中有定位/貯存相關(guān)蛋白（11個）、能量相關(guān)蛋白（3個）、信號轉(zhuǎn)導相關(guān)蛋白（2個）、初生代謝相關(guān)蛋白（2個）、細胞結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白（1個）、病害/防御相關(guān)蛋白（1個）以及轉(zhuǎn)運蛋白（1個）。同時，7個蛋白點的表達量在水澇脅迫處理后降低，包括4個定位/貯存相關(guān)蛋白和3個病害/防御相關(guān)蛋白。

2.1.3 鹽脅迫及滲透脅迫 土壤鹽分過多是影響植物生長發(fā)育、導致農(nóng)業(yè)減產(chǎn)的主要因素之一。鹽脅迫對植物的危害主要體現(xiàn)在滲透脅迫和離子脅迫等方面。

barkla等[14]對植物質(zhì)膜在鹽脅迫下的作用進行了研究，鑒定出了參與調(diào)控液泡中na+隔離的蛋白質(zhì)。對鹽脅迫處理的冰葉日中花和對照進行的雙向差異凝膠電泳分析表明，質(zhì)膜包括質(zhì)膜h+-atpase 和v-atpase的亞基，都與醛縮酶和烯醇酶這兩個糖降解酶相關(guān)。利用免疫共沉淀證實糖降解酶與v-atpase的b亞基vha-b存在相互作用。體外試驗證明，醛縮酶可以通過吸引atp來激活v-atpase的活性。采用擬南芥烯醇酶突變體進行生物學功能驗證，發(fā)現(xiàn)這些突變體對鹽脅迫敏感，并且在其質(zhì)膜中，醛縮酶激活v-atpase水解活性的能力減弱。糖降解蛋白與質(zhì)膜的這些聯(lián)系直接上調(diào)了質(zhì)子泵的活性。

bandehagh等[15]對油菜鹽脅迫響應機制進行了研究，分析了耐鹽的油菜栽培種hyola 308和不耐鹽的栽培種sarigol的第二片新葉和第三片新葉中蛋白的表達。對處于營養(yǎng)生長期的植株分別進行0、175和350 mmol/l的nacl處理。與第二片新葉相比，第三片新葉中的na含量較高且生長勢較弱。不耐鹽植株中na的積累比耐鹽

植株中更加顯著。2-de凝膠檢測出了900多個蛋白點，其中有44個和31個蛋白的表達量分別在耐鹽和不耐鹽的基因型中發(fā)生了變化。聚類分析發(fā)現(xiàn)，根據(jù)第二片新葉的鹽含量可明顯區(qū)分出這兩種不同的基因型。ms分析鑒定出了46個蛋白，包括參與氧脅迫響應、能量供應、電子轉(zhuǎn)運、翻譯和光合作用的蛋白。

skirycz等[16]研究了擬南芥葉片在緩和而持久的滲透脅迫下的適應能力。通過15n代謝標記法分析了蛋白變化。結(jié)果表明，質(zhì)體的atpase、卡爾文循環(huán)和光呼吸都被下調(diào)了，但線粒體的atp系統(tǒng)被上調(diào)了。這說明線粒體在植物遭受水分脅迫時對保護質(zhì)體起到很重要的作用。此外，脅迫下的轉(zhuǎn)錄組和蛋白組數(shù)據(jù)非常一致，但很多蛋白與蛋白合成和降解相關(guān)，推測其受到了轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。

張恒[17]用不同濃度的na2co3對星星草（puccinellia tenuiflora）進行處理，研究了其在鹽脅迫下的應答機制。應用itraq標記法對蛋白質(zhì)組進行定量分析，發(fā)現(xiàn)葉綠體中68種na2co3應答蛋白質(zhì)，它們主要參與捕光復合體、光系統(tǒng)ⅱ、光合電子傳遞鏈和光系統(tǒng)ⅰ的形成、能量代謝、卡爾文循環(huán)、光合色素代謝、基礎代謝、脅迫防御、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成與命運，以及信號轉(zhuǎn)導等過程。

2.1.4 營養(yǎng)脅迫 為了解水稻對磷缺乏的適應性，torabi等[18]分析了親本株系nipponbare與其近等基因系nil6-4（在第12條染色體上攜帶一個主要磷吸收的qtl）的根系在1和100 mmol/l磷濃度下生長的蛋白質(zhì)組。2-de檢測到669個蛋白點，兩種基因型中有32個蛋白有明顯差異。其中，兩種基因型在脅迫條件下有17個蛋白表現(xiàn)不同。質(zhì)譜鑒定出參與適應磷缺乏途徑的26個蛋白，包括活性氧清除劑、檸檬酸循環(huán)、信號轉(zhuǎn)導和植物防御反應蛋白，還有一些未知功能蛋白。這說明不僅有一條控制適應磷缺乏能力的信號途徑，可能還存在著不同途徑間的相互作用。

visioli等[19]對黑楊的一個高度抗鈣脅迫的未定種進行了蛋白組變化分析。運用2-d液相色譜技術(shù)分離出126個蛋白。其中，有20個蛋白被鑒定為受到了鈣脅迫的影響，并通過maldi-tof進行了指紋圖譜分析。在脅迫處理的樣品中，豐度較高的蛋白集中在葉綠體和線粒體中，說明這兩個細胞器在植物對鈣脅迫的響應中扮演了重要角色。

李坤朋[20]對兩種不同基因型的玉米在富磷或缺磷條件下的蛋白質(zhì)組變化進行了雙向凝膠電泳分析，分別鑒定出79個和108個差異表達蛋白，功能解析表明，這些蛋白可能在調(diào)控玉米根系形態(tài)發(fā)育、細胞周期以及感知環(huán)境磷濃度變化等方面發(fā)揮了重要作用。

2.1.5 其他非生物脅迫 其他非生物脅迫如臭氧、重金屬、機械損傷等對植物的影響，也在蛋白質(zhì)組水平上取得了一定的進展。

肖清鐵等[21]以抗鎘水稻品種pi312777和鎘敏感水稻品種ir24為材料，在不同鎘離子濃度的條件下水培處理7 d。與對照相比，不同濃度鎘脅迫下，pi312777中熱激蛋白、谷胱甘肽還原酶、蛋白酶體α亞基6型、果糖-1，6-二磷酸醛縮酶、硫氧還蛋白和dna重組修復蛋白均上調(diào)表達；而ir24中熱激蛋白、谷胱甘肽還原酶、蛋白酶體α亞基6型的表達無顯著差異，但果糖-1，6-二磷酸醛縮酶和硫氧還蛋白表達下調(diào)。此外，dna重組修復蛋白僅在鎘脅迫的pi312777葉片中表達。這些差異表達的蛋白質(zhì)很可能是水稻pi312777比ir24具有更強鎘抗性的生物學基礎。

fuhrs等[22]研究了豇豆蛋白質(zhì)組對錳脅迫的響應，發(fā)現(xiàn)錳脅迫后豇豆葉綠體中與co2固定和光合作用相關(guān)的蛋白豐度下降，說明錳脅迫對豇豆的能量代謝產(chǎn)生抑制作用。

樂寅婷等[23]對比了油菜（brassica napus cv. westar）在機械損傷前后可溶性總蛋白的含量變化，發(fā)現(xiàn)損傷后蛋白表達量增高。雙向凝膠電泳分析表明有8個蛋白質(zhì)點發(fā)生了明顯的上調(diào)或下調(diào)，質(zhì)譜鑒定出rubisco小亞基前體、果糖-1，6-二磷酸醛縮酶和糞卟啉-3-氧化酶，這些蛋白質(zhì)可能在油菜葉片應答機械損傷過程中起關(guān)鍵作用。 　ahsan等[24]用雙向凝膠電泳法檢測了在o3脅迫下大豆中蛋白質(zhì)的變化，分別在葉片和葉綠體中鑒定出20個和32個差異表達蛋白。其中，參與光合作用（包括光系統(tǒng)ⅰ/ⅱ和碳素同化）的蛋白都在脅迫后表達量降低，而與抗氧化劑系統(tǒng)和碳代謝相關(guān)的蛋白表達量增高。參與糖代謝的酶活性在脅迫后增強，淀粉減少而蔗糖增加。試驗表明在光合系統(tǒng)經(jīng)受o3脅迫時，可能通過淀粉降解為三羧酸的循環(huán)功能，使碳分配受到了影響。

2.2 生物脅迫的植物蛋白質(zhì)組

學研究

2.2.1 病原菌侵染 病原菌侵染時植物局部會發(fā)生壞死并誘導產(chǎn)生一些抗病蛋白質(zhì)。

maserti等[25]以柑橘屬（citrus l.）的果樹為材料，對二斑葉螨（tetranychus urticae）侵染后和茉莉酸甲酯處理后的葉片進行了蛋白表達差異分析，分別檢測出了110個和67個蛋白質(zhì)點。應用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)鑒定出50個蛋白，大部分都屬于光合和代謝相關(guān)蛋白。其中有5個與氧脅迫相關(guān)的酶，包括磷脂谷胱甘肽過氧化物酶、1個鹽脅迫相關(guān)蛋白、抗壞血酸過氧化物酶和錳超氧化物歧化酶。有7個防御相關(guān)蛋白，包括與發(fā)病相關(guān)的酸性幾丁質(zhì)酶、蛋白酶抑制劑類奇蛋白和低密度脂蛋白等。

采用雙向電泳聯(lián)用 moldi-tof-tof 質(zhì)譜技術(shù)，張曉婷等[26]對水稻感病品種武育粳3號和抗病品種kt95-418感染水稻條紋病毒（rice stripe virus，rsv）前后的葉片進行蛋白質(zhì)組學分析。結(jié)果顯示，rsv基因組編碼的病害特異蛋白（disease specific protein， dsp）在武育粳3號中的積累量明顯高于kt95-418中。另外還鑒定出其他25個蛋白，包括rsv ns2蛋白，寄主中與光合作用、細胞氧化還原狀態(tài)和離子平衡狀態(tài)及蛋白的合成、轉(zhuǎn)運與翻譯后修飾等相關(guān)的蛋白。

鐘云[27]選用廣東主栽砧木資源——江西紅橘的根系為材料，運用itraq技術(shù)，分析了其接種黃龍病病原后第50天的根系蛋白。鑒定得到差異顯著蛋白78個。差異蛋白主要參與生物代謝、防御反應、抗氧化、轉(zhuǎn)運和幾丁質(zhì)代謝等。與轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)性強的差異蛋白有36個，其中半數(shù)與抗?。妫┫嚓P(guān)。植株感病后韌皮部篩管閉塞有關(guān)的篩管阻塞蛋白上調(diào)了1.67倍，這與防御黃龍病病原有關(guān)。另外，枯草桿菌樣蛋白酶表達是對照的282.09倍，說明該酶參與了黃龍病病原菌的抵御及根尖分生區(qū)的保護。

2.2.2 蟲害 魏哲[28]利用itraq技術(shù)篩選了水稻抗褐飛虱相關(guān)蛋白質(zhì)。在褐飛虱取食96 h后的水稻葉鞘中，發(fā)現(xiàn)多種蛋白質(zhì)表達量發(fā)生了顯著變化。這些蛋白包括3個ja合成蛋白質(zhì)（alpah-dox、aos和aoc），7個氧脅迫應答蛋白（cata、apx2和5個poxs），3個β-葡聚糖酶（gnsl、gns4和gns5），3個蛋白激酶（crks、crk6和atypicalrlk），1個蛋白網(wǎng)格蛋白，1個甘氨酸分解系統(tǒng)h蛋白，5個光合作用相關(guān)蛋白和4個水通道蛋白。其中aoc、cata、3個poxs、gnsl、gns5、3個蛋白激酶和網(wǎng)格蛋白更多地在易感性水稻株系中被誘導。

由于自然環(huán)境下植物時常遭遇多重逆境，因此，目前有不少針對植物逆境蛋白質(zhì)組學的工作已不僅僅局限于單一脅迫，而是將相關(guān)性較高的幾種脅迫進行整合研究。zhang等[29]對云南假虎刺（carissa spinarum）同時進行了42 ℃高溫和干旱處理。在處理期和恢復期設置4個不同的時間點取葉片進行蛋白質(zhì)組學分析，發(fā)現(xiàn)49個蛋白質(zhì)點的表達量發(fā)生了變化。用ms和2-d凝膠法鑒定出30個蛋白，這些蛋白包括hsp、光合成相關(guān)蛋白、rna加工蛋白以及參與代謝機制和能量生產(chǎn)的蛋白。evers等[30]對馬鈴薯分別進行了冷脅迫和鹽脅迫處理，并在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)組水平都進行了分析和研究。發(fā)現(xiàn)響應鹽脅迫和冷脅迫的基因和蛋白有一致也有不同。在蛋白質(zhì)組水平，大部分鑒定出的蛋白都在脅迫下表達增強了。大多數(shù)光合成相關(guān)蛋白的豐度在兩種脅迫下都降低了。

3 展望

綜上所述，作為后基因時代的一個重要研究手段，蛋白質(zhì)組學已經(jīng)在植物抗逆研究中廣泛開展，獲得了豐碩的成果，對傳統(tǒng)的植物生理學及功能基因組學研究進行了補充。然而，植物對環(huán)境脅迫的響應是一個非常復雜的過程，人們對植物在逆境下產(chǎn)生的復雜的生物學反應都還知之甚少，在這方面的研究還處于初步階段。隨著越來越多植物全基因組測序的完成、est數(shù)據(jù)庫的日益豐富，以及研究手段的不斷改進，相信將會有更多的與抗性相關(guān)的基因和蛋白被挖掘，更全面地揭示植物抗逆性的本質(zhì)，為植物抗脅迫品種的選擇和培育奠定基礎。

參考文獻：

[1] 趙 欣，蒲小平.蛋白質(zhì)組學在藥物研究中的應用[j].中國藥理學通報，2009，25（8）：988-991.

[2] 謝秀枝，王 欣，劉麗華，等. itraq技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組學中的應用[j]. 中國生物化學與分子生物學報，2011，27（7）：616-621.

[3] wolters d a， washburn m p， yates j r. an automated multidimensional protein identification technology for shotgun proteomics[j]. analytical chemistry，2001，73（23）：5683-569

0.

[4] gorg a， weiss w， dunn m j. current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics[j]. proteomics，2004，4（12）：3665-3685.

[5] 喻娟娟，戴紹軍.植物蛋白質(zhì)組學研究若干重要進展[j]. 植物學報，2009，44（4）：410-425. 　[6] blindschedler l v， cramer r. quantitative plant proteomics[j].proteomics， 2011， 11（4）：756-775.

[7] ross p l， huang y n， marchese j n， et al. multiplexed protein quantitation in saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents[j]. mol cell proteomics，2004，3（12）：1154-1169.

[8] 王林纖，戴 勇，涂植光. itraq標記技術(shù)與差異蛋白質(zhì)組學的生物標志物研究[j].生命的化學，2010，30（1）：135-140.

[9] gammulla c g， pascovici d， atwell b j， et al. differential proteomic response of rice （oryza sativa） leaves exposed to high-and low-temperature stress[j]. proteomics，2011，11（14）：2839-2850.

[10] laino p， shelton d， finnie c， et al. comparative proteome analysis of metabolic proteins from seeds of durum wheat （cv. svevo） subjected to heat stress[j]. proteomics，2010，10（12）：2359-2368.

[11] ford k l， cassin a， bacic a. quantitative proteomic analysis of wheat cultivars with differing drought stress tolerance[j]. frontiers in plant science，2011，2：44.

[12] 祁建民，姜海青，陳美霞，等.干旱脅迫下紅麻葉片的差異蛋白表達分析[j].中國農(nóng)業(yè)科學，2012，45（17）：3632-3638.

[13] komatsu s， sugimoto t， hoshino t， et al. identification of flooding stress responsible cascades in root and hypocotyl of soybean using proteome analysis[j]. amino acids， 2010，38（3）：729-738.

[14] barkla b j， vera-estrella r， hern？魣ndez-coronado m， et al. quantitative proteomics of the tonoplast reveals a role for glycolytic enzymes in salt tolerance[j]. the plant cell，2009，21（12）：4044-4058.

[15] bandehagh a， salekdeh g h， toorchi m， et al. comparative proteomic analysis of canola leaves under salinity stress[j]. proteomics，2011，11（10）：1965-1975.

[16] skirycz a，memmi s，de bodt s，et al. a reciprocal 15n-labeling proteomic analysis of expanding arabidopsis leaves subjected to osmotic stress indicates importance of mitochondria in preserving plastid functions[j]. journal of proteome，2011，10（3）：1018-1029.

[17] 張 恒. 星星草（puccinellia tenuiflora）葉綠體na2co3脅迫應答的生理學與定量蛋白質(zhì)組學研究[d]. 哈爾濱：東北林業(yè)大學，2012.

[18] torabi s， wissuwa m， heidari m， et al. a comparative proteome approach to decipher the mechanism of rice adaptation to phosphorous deficiency[j]. proteomics，2009，9（1）：159-170.

[19] visioli g， marmiroli m， marmiroli n. two-dimensional liquid chromatography technique coupled with mass spectrometry analysis to compare the proteomic response to cadmium stress in plants[j]. journal of biomedicine and biotechnology，2010：id567510.

[20] 李坤朋.不同基因型玉米對磷脅迫的反應及根系蛋白質(zhì)組學研究[d]. 濟南：山東大學，2007. 　[21] 肖清鐵，戎 紅，周麗英，等.水稻葉片對鎘脅迫響應的蛋白質(zhì)差異表達[j].應用生態(tài)學報，2011，22（4）：1013-1019.

[22] fuhrs h， hartwig m， molina l e b， et al. early manganese-toxicity response in vigna unguiculata l. ——a proteomic and transcriptomic study[j]. proteomics，2008，8（1）：149-159.

[23] 樂寅婷，李 梅，陳 倩，等.油菜葉片蛋白質(zhì)組對機械損傷應答的初步分析[j].植物生態(tài)學報，2008，32（1）：220-225.

[24] ahsan n， nanjo y， sawada h， et al. ozone stress-induced proteomic cha

nges in leaf total soluble and chloroplast proteins of soybean reveal that carbon allocation is involved in adaptation in the early developmental stage[j]. proteomics，2010，10（14）：2605-2619.

[25] maserti b e， del carratore r， croce c m， et al. comparative analysis of proteome changes induced by the two spotted spider mite tetranychus urticae and methyl jasmonate in citrus leaves[j]. journal of plant physiology，2011，168（4）：392-402.

[26] 張曉婷，謝荔巖，林奇英，等.水稻條紋病毒脅迫下的水稻蛋白質(zhì)組學[j].植物病理學報， 2011，41（3）：253-261.

[27] 鐘 云. candidatus liberibacter asiaticus誘導的柑橘轉(zhuǎn)錄組學及蛋白組學研究[d]. 長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學，2012.

[28] 魏 哲.水稻對褐飛虱取食應答的蛋白質(zhì)組學研究[d].武漢：武漢大學，2010.

[29] zhang m， li g， huang w， et al. proteomic study of carissa spinarum in response to combined heat and drought stress[j]. proteomics，2010，10（17）：3117-3129.

篇7

中藥歸經(jīng)是用來表示藥物作用定位的藥性理論。歸經(jīng)理論源于《內(nèi)經(jīng)》，成于金元時代，再經(jīng)后人的不斷補充和發(fā)展，至明清時代已發(fā)展成系統(tǒng)理論，成為中藥理論的重要組成部分之一，并用來指導臨床用藥。

目前對中藥歸經(jīng)理論的現(xiàn)代研究處于停滯狀態(tài)。由于至今對歸經(jīng)理論的認識不盡一致，無統(tǒng)一規(guī)范的客觀判斷標準，加之受到實驗技術(shù)的限制，所以為從現(xiàn)代實驗方法來探求歸經(jīng)的本質(zhì)帶來了很大的困難。筆者在回顧和總結(jié)分析了中藥歸經(jīng)理論研究方法的現(xiàn)狀后，提出了新的研究思路。

1 中藥歸經(jīng)理論研究方法的現(xiàn)狀

1.1 以藥理作用來認識藥物的歸經(jīng)

有人用數(shù)理統(tǒng)計分析法分析其藥物作用與歸經(jīng)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)中藥的歸經(jīng)與它的藥理作用存在一定的相互關(guān)系[1-2]。

1.2 以有效成分來探索藥物的歸經(jīng)

利用有效成分探索中藥歸經(jīng)，應用較多的是借助同位素示蹤和放射性自顯影來觀察中藥中的某種活性成分在體內(nèi)臟器的分布特點，以此說明中藥活性成分的體內(nèi)分布與中藥歸經(jīng)的關(guān)系[3-4]。根據(jù)這種研究的結(jié)果來推論，中藥歸經(jīng)的實質(zhì)是指藥物活性成分在體內(nèi)某些臟器的高濃度分布。但以成分的臟器分布說明歸經(jīng)的實質(zhì)則混淆了中醫(yī)臟腑與解剖臟器在概念與內(nèi)容上的差別，同時活性成分分布較多的器官，不一定就是該藥作用最明顯的靶器官。但作為一種新的研究方法，值得進一步探索。

1.3 用中藥微量元素研究藥物的歸經(jīng)

微量元素分析法是通過剖析中藥中某些特異性元素的濃度，并結(jié)合這些微量元素在人體臟腑組織中的分布特點，來實現(xiàn)“歸經(jīng)”，從而發(fā)揮療效，以推測微量元素是中藥歸經(jīng)的物質(zhì)基礎[5-7]。

1.4 從受體學說判斷藥物的歸經(jīng)受體為首先與藥物結(jié)合并能傳遞信息、引起效應的細胞成分，是存在于細胞膜上或胞漿內(nèi)的大分子蛋白質(zhì)。最初由Langleg[8]用來描述細胞上可與藥物和其它化學信使物質(zhì)結(jié)合并介導效應的化學成分。有人從分子藥理的角度理解，認為歸經(jīng)理論可以從現(xiàn)代的受體學說來認識[9]。葉氏[10]也認為，歸經(jīng)與受體學說在強調(diào)藥物對人體的特殊選擇方面是一致的。只是歸經(jīng)主要從藥物特性的角度出發(fā)，說明它對臟腑經(jīng)絡具有選擇性的性能；而受體學說則是從人體組織器官的角度出發(fā)，說明它對藥物具有特殊的敏感作用。這兩種認識方法可謂“異曲同工”。

1.5 用環(huán)核苷酸檢測法認識藥物的歸經(jīng)

鄭氏[11]報道，環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)是細胞內(nèi)調(diào)節(jié)代謝的重要物質(zhì)，兩者具有相互拮抗、相互制約的生物學效應。正常情況下，二者必需維持一定的比例，若比例發(fā)生改變(偏高或降低)就會引起機體功能失調(diào)而導致疾病，這與中醫(yī)的陰陽學說非常相似。有人用五味子、魚腥草、漢防己3味藥的水煎劑分別給大白鼠灌胃后，用放射免疫測定技術(shù)測定動物腦、肺、心、肝、脾、胃、腎、膀胱8個臟器組織中cAMP、cGMP的水平。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，每一種藥物對不同臟器組織中cAMP、cGMP水平的影響是不一樣的。這表明cAMP、cGMP的濃度變化能在一定程度反映藥物對某臟器組織的選擇性作用。經(jīng)統(tǒng)計分析還發(fā)現(xiàn)，cAMP、cGMP濃度以及cAMP/cGMP值有顯著變化者之相關(guān)臟器，與各藥歸經(jīng)的關(guān)系非常密切[12]。

最近，王氏[13]將麻黃、丹參、葛根、大黃給動物分別灌胃，通過測定動物心臟、肝臟等10種組織臟器中環(huán)核苷酸水平的變化，觀察比較中藥對組織選擇性的影響。結(jié)果顯示，給動物連續(xù)灌服麻黃等中藥后，動物各組織臟器環(huán)核苷酸含量明顯不同；在所測定的10種組織中，有9種組織受到麻黃的明顯影響而出現(xiàn)cAMP/cGMP比值顯著升高或者降低；而受丹參影響的組織僅有3種；葛根和大黃對組織環(huán)核苷酸的影響介于兩者之間。

2 目前研究方法的可取之處與不足之處

綜觀以上各種研究和實驗方法，其思路可概括為兩大類：一是根據(jù)中藥有效成分在體內(nèi)的分布及其作用部位研究中藥的歸經(jīng)，主要從歸經(jīng)與作用部位、歸經(jīng)與有效成分、歸經(jīng)與微量元素、歸經(jīng)與體內(nèi)代謝等方面著手，運用同位素示蹤、放射自顯影、微量元素分析等方法進行研究；二是根據(jù)藥理效應，選定某些特異性的藥理觀察指標研究中藥的歸經(jīng)，主要從歸經(jīng)與藥理藥效、歸經(jīng)與受體、歸經(jīng)與環(huán)核苷酸等方面著手進行。這些研究方法和思路各有所長，有可取之處，但也有不足之處。

2.1 可取之處

在這些方法中，取各組織臟器作為觀察材料是可取的，因為歸經(jīng)的“經(jīng)”并非單純的經(jīng)絡或經(jīng)脈之意，而是帶有藥性理論特色的方向、部位的概念，是部位和功能的綜合。正是由于大家知道中醫(yī)的臟腑不同于解剖學上的臟器，所以才選擇各組織臟器作為觀察對象，去尋找藥物發(fā)揮主要作用的部位，因為藥物被機體吸收后，總要落實到相關(guān)的組織臟器才能發(fā)揮其藥理作用。

2.2 不足之處

已知藥物有效成分分布得較多的臟器，不一定就是作用最明顯的靶器官，故僅從分布難以闡明藥物發(fā)揮療效的部位。

所檢測的藥物是主要活性成分，但不是唯一的活性成分，其分布不能代表所有活性成分的分布。

中藥歸經(jīng)是從疾病對藥的治療反應中總結(jié)出來的，而大多實驗所用都是生理狀態(tài)下的動物，這就不能準確地反映藥物在病理狀態(tài)動物體內(nèi)的作用過程。

最重要的問題是有些實驗方法有悖于中醫(yī)的歸經(jīng)理論。中醫(yī)傳統(tǒng)理論認為：一種藥物主要對某一經(jīng)或某幾經(jīng)發(fā)生明顯作用，而對其它經(jīng)作用較小，甚至沒有作用，是為歸經(jīng)；根據(jù)藥物在機體產(chǎn)生效應的部位各有偏重，將其歸納總結(jié)，使之系統(tǒng)化，便形成歸經(jīng)理論。

很明顯，這里講的應是藥物對機體產(chǎn)生的效應而不是藥物的分布。目前的研究方法大都是從觀察藥物有效成分的分布著手。從歸經(jīng)理論的定義來看，應從藥效學觀點出發(fā)觀察藥物的歸經(jīng)問題才符合中醫(yī)歸經(jīng)理論。在這一點上，其實人們早已認識到了，只是由于研究技術(shù)的限制，即使目前有人從藥效反應來研究藥物歸經(jīng)問題，也只能是觀察幾個功能指標，而不可能觀察藥物對機體產(chǎn)生的全部效應。

3 新的研究思路與方法

如何做到全面地觀察中藥對機體各部位產(chǎn)生的效應，并從中發(fā)現(xiàn)潛在的規(guī)律，從而闡明歸經(jīng)理論的科學內(nèi)涵是中藥歸經(jīng)理論研究必須要解決的問題。在回顧和總結(jié)分析他人所做的有關(guān)研究工作之后，根據(jù)中藥作用機制的特點和歸經(jīng)的定義，筆者提出一個假說，并根據(jù)這一假說，結(jié)合蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)，設計了新的研究方案，使較全面地觀察藥物對機體產(chǎn)生的效應成為可能。

3.1 中藥的作用特點決定其效應可能發(fā)生在機體任何組織臟器中

由于中藥成分復雜，單味藥材就是一個化學分子庫，雖然不是所有化學成分都是有效成分，但在發(fā)揮作用過程中是一個涉及多成分、多靶點、多途徑的作用過程，因而其效應可能發(fā)生在機體任何組織臟器中，所不同的是在有的組織臟器中其效應較強，有的較弱。

3.2 其藥效最終作用結(jié)果是影響機體蛋白質(zhì)表達，且效應越強，蛋白質(zhì)表達變化越大

從中藥治療疾病的機理來看，中藥治療疾病不是單純強調(diào)以藥物去直接對抗致病因子，重點在于調(diào)整機體功能狀態(tài)，發(fā)揮機體抗病能力。中藥有效部位或有效成分進入人體發(fā)揮作用，必然會引起從遺傳信息到整體功能實現(xiàn)中的分子、細胞、器官、整體多個層面的結(jié)構(gòu)與功能狀態(tài)的改變，調(diào)節(jié)這些層面的結(jié)構(gòu)與功能的本質(zhì)是基因，其藥效最終作用結(jié)果是影響機體蛋白質(zhì)表達，因此藥物對機體產(chǎn)生的效應能從蛋白質(zhì)表達的變化反映出來，藥物對機體某組織臟器產(chǎn)生的效應越強，其蛋白質(zhì)表達應變化越大。

3.3 根據(jù)中藥作用機制的特點和歸經(jīng)的定義，提出假說

由此，根據(jù)歸經(jīng)的定義和中藥作用機制的特點，我們提出假說：歸某經(jīng)的藥物對機體產(chǎn)生明顯效應的組織臟器應當具有一定的共性，其效應的強度與該組織臟器蛋白質(zhì)表達差異的數(shù)量有關(guān)，即效應越強，蛋白質(zhì)表達差異的數(shù)量越多，反之亦然。

3.4 蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)的出現(xiàn)，使驗證這一假說成為可能

蛋白質(zhì)組學是一門對某一生物或細胞在各種不同環(huán)境條件下表達的所有蛋白質(zhì)進行定性和定量分析的科學。蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)以其特有的思想方法和技術(shù)手段在解決生物學重大問題上已顯示出其強大的威力。全世界的科學家正應用蛋白質(zhì)組學技術(shù)來解決用傳統(tǒng)方法所不能解決的問題[14]。同樣，將蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)運用到藥物歸經(jīng)理論研究中，可能會發(fā)現(xiàn)歸經(jīng)的潛在規(guī)律和本質(zhì)，從而對中藥歸經(jīng)理論的研究帶來重大的突破。蛋白質(zhì)組學集生物技術(shù)、分析技術(shù)、信息技術(shù)和材料技術(shù)等的精華，采用大規(guī)模、高通量、高速度的技術(shù)手段，通過研究基因所表達的所有蛋白質(zhì)表達譜，可以較全面地觀察到機體對藥物作用產(chǎn)生的蛋白質(zhì)表達差異，從而為從藥效學觀點出發(fā)研究藥物歸經(jīng)的實質(zhì)與內(nèi)涵找到了一個極好的實驗平臺。

4 根據(jù)假說，制定研究方法

根據(jù)假說，利用蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)，我們只要觀察藥物對機體作用后各組織臟器蛋白質(zhì)表達差異變化的程度，即可推斷出該藥物對機體組織臟器產(chǎn)生效應強度的大小。具有相同歸經(jīng)的藥物對機體產(chǎn)生較強效應的那些組織臟器就必然有一定的共性，而產(chǎn)生效應強度較大的那些組織臟器就應與該藥物所歸經(jīng)絡有關(guān)。

根據(jù)各味中藥的歸經(jīng)情況，我們可以有兩種研究方法，這兩種方法各有優(yōu)點與缺陷。

4.1 用正常動物為實驗觀察對象

用正常動物為實驗觀察對象，所觀察的中藥可不考慮它的作用與藥性，首先選取那些歸單一經(jīng)絡的藥物，如青葙子、密蒙花、赤芍、月季花、茜草等單歸肝經(jīng)的藥物，浮萍、魚腥草、掛金燈、馬勃、蒼耳子等單歸肺經(jīng)的藥物，仙茅、巴戟天、海狗腎、陽起石、葫蘆巴、蛇床子等單歸腎經(jīng)的藥物作為觀察對象。這種方法的優(yōu)點是所觀察的藥物歸經(jīng)單一，便于找出其內(nèi)在的規(guī)律。此方法的缺陷是用正常動物為實驗觀察對象，與用病理狀態(tài)下的動物相比可能有所差距。

4.2 以中醫(yī)證的動物模型為實驗觀察對象，觀察中藥在病理狀態(tài)動物體內(nèi)的作用過程

這種方法雖然能準確地反映藥物在病理狀態(tài)動物體內(nèi)的作用過程，但由于作用相同的藥物所歸經(jīng)絡過于分散，只有為數(shù)不多的幾類藥物中存在5味以上歸相同經(jīng)絡的藥物，例如，平肝熄風類藥中羚羊角、石決明、天麻、白蒺藜、貝齒、全蝎和蜈蚣等7味歸肝經(jīng)，祛風濕類藥中豨薟草、海桐皮、石楠葉、松節(jié)、五加皮和千年健等6味歸肝、腎兩經(jīng)，澤蘭、荊三棱、蓬莪術(shù)、馬鞭草、延胡索、姜黃等6味歸脾、肝兩經(jīng)，且這幾類藥物所治療的相應證候動物模型也不易制造，因此，這種方法也有一定的局限性。

以上方法無論選用哪一種，所觀察的具有相同歸經(jīng)的藥物至少選取5味。每味藥給予一組動物，然后取每只動物的肺臟、腎臟、肝臟、脾臟、胃、心臟、、大腸、小腸以及腦等組織臟器，提取蛋白質(zhì)做雙向凝膠電泳。其蛋白質(zhì)表達圖譜與給水對照組的各個相應組織臟器蛋白質(zhì)表達圖譜相比較，找出表達差異的蛋白質(zhì)。然后，以表達差異蛋白質(zhì)數(shù)量的多少排列各組織臟器，最后看給予歸相同經(jīng)絡幾味藥的動物各組織臟器的排列順序是否一致，而給予不同歸經(jīng)藥物的動物各組織臟器的排列順序是否不一致。如果能得到上述結(jié)果的話，那么我們就可能找到了歸經(jīng)理論的內(nèi)在規(guī)律和其科學內(nèi)涵。同時，我們也可得出排列在前面的幾種組織臟器與所歸的經(jīng)絡有密切關(guān)系的結(jié)論，這也可為中醫(yī)有關(guān)經(jīng)絡的實質(zhì)研究提供客觀依據(jù)。

當然，我們也可能得不到這樣的結(jié)果，這無非有兩種可能：一種是假說本身不符合歸經(jīng)理論的真實客觀情況，因此得不到預期的結(jié)果；二是假說正確，只是由于根據(jù)臨床經(jīng)驗得來的各味藥物的歸經(jīng)所屬還不夠精確客觀，因而得不到預期的結(jié)果。

在目前中藥歸經(jīng)理論研究停滯不前的狀況下，迫切需要有新的研究思路與方法出現(xiàn)。此方法的思路與設計更加符合歸經(jīng)理論的定義，其蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)的應用是目前從藥效學角度來研究中藥歸經(jīng)問題的最佳途徑和方法。在有條件的情況下，我們應嘗試采用這一方法對歸經(jīng)理論進行實驗研究。雖然我們不能肯定這種方法就能完全揭示歸經(jīng)理論的實質(zhì)，但無論其結(jié)果如何都會對歸經(jīng)理論的研究有所幫助和推進，因為科學上的任何成就都是在不斷總結(jié)前人成功和失敗的經(jīng)驗基礎上取得的。

參考文獻

[1] 李儀奎，徐蓮英，馬建平.中藥藥理和歸經(jīng)關(guān)系的統(tǒng)計分析[J].中藥通報，1988，13(7)：48－50.

[2] 高其銘.當歸的藥理研究與其歸經(jīng)功效關(guān)系的探討[J].中成藥研究，1985，(5)：13－15.

[3] 陸光偉.中藥歸經(jīng)及其成分在體內(nèi)的分布[J].中成藥研究，1984，(5)：38－39.

[4] 郭順根，牛建昭，賁長恩.3H-川芎嗪在動物體內(nèi)分布的放射自顯影研究[J].中國醫(yī)藥學報，1989，4(3)：17－21.

[5] 柴 立.從微量元素及其配位化合物對組織器官的富集、親合探討“歸經(jīng)”實質(zhì)[J].微量元素，1984，(試刊號)：24.

[6] 朱梅年，柴 立.試論中醫(yī)“腎”的物質(zhì)基礎中有關(guān)微量元素鋅、錳的探討[J].中醫(yī)雜志，1983，24(5)：66－67.

[7] 徐徑采.明目中藥的歸經(jīng)與微量元素的關(guān)系[J].微量元素，1987，(2)：23－24.

[8] 王 莉(譯).受體與遞質(zhì)：現(xiàn)代概念[J].中國藥理學通報，1987，3(6)：379－382.

[9] 王海東.中藥歸經(jīng)理論研究現(xiàn)狀及受體學說關(guān)系的論證[J].浙江中醫(yī)雜志，2001，36(8)：323－326.

[10] 葉顯純.論“歸經(jīng)”[J].山東中醫(yī)學院學報，1980，(4)：11－12.

[11] 鄭廣華.陰陽學說與環(huán)核苷酸[J].自然雜志，1979，2(4)：208－209.

[12] 王樹榮，孫 冰，丁國明.中藥歸經(jīng)的實驗研究[J].中國中藥雜志， 1994，19(8)：500－502.

[13] 王樹榮，翟繼偉，蓋英臣，等.麻黃等四味中藥歸經(jīng)的實驗研究[J].中華現(xiàn)代中西醫(yī)雜志，2003，1(5)：388.

篇8

蛋白質(zhì)組學簡介

蛋白質(zhì)組（Proteome）一詞，源于蛋白質(zhì)（protein）與 基因組（genome）兩個詞的組合，意指“一種基因組所表達的全套蛋白質(zhì)”，即包括一種細胞乃至一種生物所表達的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學本質(zhì)上指的是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生，細胞代謝等過程的整體而全面的認識，這個概念最早是由Marc Wilkins 在1994年提出的。

蛋白質(zhì)組（Proteome）的概念最先由Marc Wilkins提出，指由一個基因組（genome），或一個細胞、組織表達的所有蛋白質(zhì)（Protein）。蛋白質(zhì)組的概念與基因組的概念有許多差別，它隨著組織、甚至環(huán)境狀態(tài)的不同而改變. 在轉(zhuǎn)錄時，一個基因可以多種mRNA形式剪接，并且，同一蛋白可能以許多形式進行翻譯后的修飾。故一個蛋白質(zhì)組不是一個基因組的直接產(chǎn)物，蛋白質(zhì)組中蛋白質(zhì)的數(shù)目有時可以超過基因組的數(shù)目。蛋白質(zhì)組學（Proteomics）處于早期“發(fā)育”狀態(tài)，這個領域的專家否認它是單純的方法學，就像基因組學一樣，不是一個封閉的、概念化的穩(wěn)定的知識體系，而是一個領域。蛋白質(zhì)組學集中于動態(tài)描述基因調(diào)節(jié)，對基因表達的蛋白質(zhì)水平進行定量的測定，鑒定疾病、藥物對生命過程的影響，以及解釋基因表達調(diào)控的機制。作為一門科學，蛋白質(zhì)組研究并非從零開始，它是已有20多年歷史的蛋白質(zhì)（多肽）譜和基因產(chǎn)物圖譜技術(shù)的一種延伸。多肽圖譜依靠雙向電泳（Two-dimensional gel electrophoresis， 2-DE）和進一步的圖象分析；而基因產(chǎn)物圖譜依靠多種分離后的分析，如質(zhì)譜技術(shù)、氨基酸組分分析等。

蛋白質(zhì)組學在大豆與根瘤菌相互作用中的研究進展

篇9

【摘要】 目的：研究梗阻性黃疸家兔血漿中蛋白質(zhì)電泳變化。方法：復制家兔梗阻性黃疸模型，用淀粉-瓊脂糖混合凝膠薄層電泳檢測血漿中蛋白質(zhì)電泳的變化。結(jié)果：血漿蛋白中α1球蛋白組分增多、纖維蛋白原增多;在血紅蛋白類物質(zhì)的三個區(qū)帶中，有一個區(qū)帶增多。結(jié)論：梗阻性黃疸家兔血漿中蛋白質(zhì)成分發(fā)生明顯變化，此變化是否與手術(shù)因素、黃疸因素或是機體對手術(shù)刺激的應激反應等有關(guān)，有待于深入研究。

【關(guān)鍵詞】 梗阻性黃疸;家兔;血漿蛋白;血紅蛋白

Abstract　Objective： To study the changes in plasma protein electrophoresis of rabbits with obstructive jaundice. Methods：Electrophoresis of agarose-starch mixed gel was used in these experiments. Results： There was an increases in α1 globulin and fibrinogen. Among the three electrophoresis zones of hemoglobin， there was an increase in one of them. Conclusions： There are some obvious changes in plasma protein elements of the rabbits with obstructive jaundice. It needs a further study to reveal if this is related to such factors as jaundice， operation or stress.

Key words　Obstructive jaundice; Rabbit ; Plasma protein; Hemoglobin

我們在關(guān)于血漿中蛋白質(zhì)電泳變化與人類常見疾病關(guān)系的系列研究中發(fā)現(xiàn)，個別膽石癥等梗阻性黃疸患者血漿中蛋白質(zhì)電泳行為有變化，第一次電泳后原點殘留血紅蛋白量增多[1]，而目前國內(nèi)外有關(guān)梗阻性黃疸研究中，很少涉及血漿中蛋白質(zhì)的變化[2-5]。為了進一步深入研究，本實驗通過復制家兔梗阻性黃疸動物模型及蛋白質(zhì)電泳方法，探討梗阻性黃疸后血漿中蛋白質(zhì)的變化及其意義。

1　材料與方法

1.1　取材　采用膽總管結(jié)扎法復制家兔梗阻性黃疸模型，耳緣靜脈采血。

1.2　電泳及染色　采用淀粉-瓊脂糖混合凝膠薄層電泳。電泳完畢后將玻璃板置于麗春紅溶液染色過夜，次日取出晾干，再用聯(lián)苯胺溶液染色10 min，用漂洗液10 min，室溫晾干。

2　結(jié)果

2.1　家兔一般情況　家兔膽總管結(jié)扎術(shù)后12 h出現(xiàn)尿色加深，術(shù)后2 d出現(xiàn)皮膚及鞏膜黃染，糞便顏色變淺。隨梗阻時間延長，家兔食欲減退，精神不振，反應漸遲鈍，皮膚及鞏膜黃染加重。術(shù)后5 d時取血，血清總膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量均明顯升高。

2.2　家兔梗阻性黃疸后血漿中蛋白質(zhì)的單向電泳　從圖1中泳道2可見，家兔梗阻性黃疸后α1球蛋白組分總體減少、其中慢泳成分增多，α2球蛋白組分增多，β球蛋白組分也增多;血紅蛋白類物質(zhì)區(qū)帶由三個變成兩個，其中快泳成分明顯多于慢泳者。從泳道4可見，家兔梗阻性黃疸后α1球蛋白組分減少不明顯、但其中慢泳成分明顯或增多，α2球蛋白組分減少，β球蛋白組分未增多，白蛋白減少;血紅蛋白類物質(zhì)三個區(qū)帶的中央成分明顯增多。

2.3　家兔梗阻性黃疸后血漿中蛋白質(zhì)的雙向電泳　家兔梗阻性黃疸后血漿中血漿蛋白的變化及血紅蛋白類物質(zhì)的變化，與單向電泳結(jié)果基本相同，見圖2。圖1　家兔梗阻性黃疸前、后血漿中蛋白質(zhì)的單向電泳

3　討論

梗阻性黃疸是由肝內(nèi)小膽管、肝總管或膽總管的機械性梗阻所致膽紅素沉著導致的皮膚與黏膜黃染，是臨床多發(fā)病之一，患者常出現(xiàn)肝、腎功能損害及消化道出血等一系列并發(fā)癥，嚴重危害機體健康甚至生命。目前，人們對梗阻性黃疸的研究多集中在分子生物學、血液流變學、影像學等幾方面，其中很少涉及有關(guān)血漿中蛋白質(zhì)的變化。本實驗發(fā)現(xiàn)，家兔梗阻性黃疸后血漿中蛋白質(zhì)的電泳發(fā)生如下改變：(1)血漿蛋白中α1球蛋白組分增多，纖維蛋白原增多，白蛋白減少。(2)血紅蛋白類物質(zhì)含量增多。

人類α1球蛋白組分有α1抗胰蛋白酶、α1酸性糖蛋白等，在營養(yǎng)不良、嚴重肝臟疾病、應激等情況下均可增多。在肝臟疾病及應激狀態(tài)下，白蛋白合成可減少。人類血漿中與血紅蛋白有關(guān)的成分有結(jié)合珠蛋白(haptoglobin，Hp)、血紅素結(jié)合蛋白(hemopexin，Hpx)。Hp位于α球蛋白區(qū)，Hpx位于β球蛋白區(qū)。Hp是一種α2糖蛋白，主要由肝臟合成，其功能是和血液中游離的血紅蛋白結(jié)合，防止體內(nèi)鐵的丟失，屬于一種急性反應蛋白。一些人類Hp的研究表明，許多疾病可以引起體內(nèi)Hp含量的變化，而且某些疾病Hp含量的變化與疾病的嚴重程度相一致[7]。Hp廣泛存在與哺乳動物體內(nèi)，但每種動物Hp類型差異很大，且存在遺傳多態(tài)性[8]。Hpx和游離血紅素有特異結(jié)合能力，可配合結(jié)合珠蛋白對血紅蛋白進行處理。Hpx可與血紅素可逆地結(jié)合，避免血紅蛋白和血紅素從腎排出體外，是機體有效地保存鐵的一種方式。已報道人類多種溶血性疾病、急慢性肝炎、肝癌、腎病綜合征病人Hpx含量降低，某些腫瘤、慢性神經(jīng)-肌肉病變病人Hpx含量升高[9]。有關(guān)家兔Hp或Hpx的含量及在梗阻性黃疸中發(fā)生變化的意義，尚未見文獻報道。本研究推測，梗阻性黃疸家兔血紅蛋白類物質(zhì)成分增多，可能與上述兩種蛋白有關(guān)。

家兔梗阻性黃疸前后血漿蛋白、血紅蛋白成分發(fā)生明顯變化。這些變化可能由黃疸因素、手術(shù)因素或是機體對手術(shù)刺激的應激反應等引起，有待進一步研究確定。

參考文獻

[1]　秦文斌，高麗君，蘇燕，等.血紅蛋白釋放試驗與輕型β地中海貧血[J].包頭醫(yī)學院學報，2007，23(6):561-563.

[2]　關(guān)曉東，張百萌，熊國珍，等.熱應激預處理對梗阻性黃疸大鼠腎功能的影響[J].中國誤診學雜志，2008，8(13):3032-3034.

[3]　王天然，曾祥元，胡曉莉，等.可逆型梗阻性黃疸兔血液流變性研究[J].四川醫(yī)學，2006，27，(9):886-888.

[4]　林琳，鞏鵬，馬曉蘭，等.梗阻性黃疸大鼠腎細胞凋亡及bcl-2表達的作用[J].中國普外基礎與臨床雜志，2007，14(3):296-299.

[5]　王天然，周緯，黃海，等.可逆型梗阻性黃疸動物模型探討[J].世界華人消化雜志，2005，13(12):1454-1456.

[6]　周斌，姚南，李玉民，等.內(nèi)皮素在梗阻性黃疸肝、腎、心組織損傷中的作用及血塞通干預[J].中國普外基礎與臨床雜志，2006，13(1):77-81.

[7]　Huntoon KM，Wang Y，Eppolito CA，et al.The acute phase protein haptoglobin regulates host immunity[J].J Leukoc Biol，2008，7(84):1-12.

篇10

Expression of HSP in the mouse brain after shortterm learning and memory

【Abstract】 AIM: To investigate the association of heat shock proteins (HSP70 and HSP27) with shortterm learning and memory. METHODS: Thirty mice were randomly pided into 3 groups: Trained group（TG）， swimming control group （SC） and blank control group（BC）. After shortterm training， the mice were killed and the brains were prepared for tissue section. An immunohistochemical method was used in detecting HSP70 and HSP27 expression. RESULTS: A significant increase in HSP70 levels was observed in hippocampus， cerebral cortex and nucleus amygdala in shortterm trained group， a little expression in SC group and hardly no expression in BC group. But no HSP27 expression was found in all the 3 groups. CONCLUSION: HSP70 may be a critical molecule involved in shortterm learning and memory.

【Keywords】 learning; memory; Morris water maze; heatshock proteins 70; heatshock proteins 27; immunohistochemistry

【摘要】 目的： 建立小鼠短期學習記憶模型，研究熱休克蛋白70(HSP 70)、熱休克蛋白27(HSP 27)是否參與學習記憶過程. 方法： 采用Morris水迷宮建立學習記憶模型，同時設立游水對照組及空白對照組. 訓練結(jié)束后處死小鼠，取腦，灌注固定腦組織，冰凍切片，免疫組化染色檢測腦組織中HSP70，HSP27的表達情況. 結(jié)果： 學習記憶模型組小鼠的海馬、杏仁核簇及大腦額葉皮質(zhì)高表達HSP70，游水對照組HSP70免疫陽性細胞數(shù)較少，空白對照組HSP70幾乎無表達；HSP27在各組均無表達. 結(jié)論： HSP70可能是參與學習記憶的重要分子之一.

【關(guān)鍵詞】 學習；記憶；Morris水迷宮；熱休克蛋白質(zhì)70；熱休克蛋白質(zhì)27；免疫組織化學

0引言

學習和記憶的機制至今不明. 熱休克蛋白（heat shock protein， HSP）是一種在應激狀態(tài)下產(chǎn)生的保護性蛋白質(zhì)，具有復雜的生物學功能. HSP與學習記憶的關(guān)系如何，目前此方面的報道并不多見. 本文采用Morris水迷宮建立小鼠學習記憶模型，同時設立游水對照組和空白對照組，排除應激因素所引起的HSP表達，觀察各組HSP表達的差異. 實驗結(jié)果可望為研究學習記憶的分子機制提供新的思路.

1材料和方法

1.1材料

雄性昆明種小鼠30只，6周齡，第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供. 利用隨機數(shù)字表將其均分為3組，即正?？瞻讓φ战M（BC）、游水對照組(SC)和學習記憶模型組(TG). 飼養(yǎng)條件為（22±1）℃，相對濕度40%~50%，自然晝夜非直接光照，自由飲食. 實驗前動物適應環(huán)境15 d，以避免環(huán)境應激造成的HSP表達的變化.

1.2方法

1.2.1Morris水迷宮實驗程序及組織準備Morris水迷宮（北京新天地科技公司）直徑為90 cm，高度50 cm. 水深27 cm，平臺置于水面下0.5～1 cm. 水溫（21±1）℃. 采用視頻圖象處理系統(tǒng)記錄小鼠尋找平臺的時間及軌跡圖. 參照Schimanski［1］的Morris水迷宮小鼠學習記憶模型建立方法，分為三個階段訓練小鼠. 訓練前期：將小鼠放置于平臺上，使其脫離平臺后，在水中自由游泳30 s，然后引導其到平臺上. 期間變換平臺位置，共進行3次實驗；訓練期：將平臺固定在一個象限的中點，每只動物從其它三個象限的任意位置頭面向池壁釋放入水. 記錄動物游上平臺的時間及軌跡圖. 若60 s內(nèi)小鼠未找到平臺，人工將其引導至平臺，并使其停留30 s，將游泳時間記錄為60 s. 共進行4 d實驗，8次/d，前4次實驗為一組，后4次實驗為一組. 組與組之間間隔時間約1 h，組內(nèi)給予小鼠數(shù)分鐘休息時間；空間探索期： 在訓練期最后一次實驗結(jié)束之后，撤除平臺，讓小鼠在池中游泳60 s，用于測試小鼠學會尋找平臺后對站臺的記憶能力. 學習記憶組完全按照上述方法行水迷宮實驗，游水對照組與學習記憶組配對，水中不放置平臺，使其游泳時間一致，也分4 d在同一時間進行. 空白對照組在實驗期間一直置于正常飼養(yǎng)環(huán)境中. 實驗在10：00～16：00進行，結(jié)束后將動物送回飼養(yǎng)室. 空間探索實驗結(jié)束后24 h用10 g/L戊巴比妥鈉麻醉小鼠，開胸，暴露心臟，先用生理鹽水10 mL沖洗血液，然后用預冷的40 g/L的多聚甲醛(pH=7.4)固定液40 mL灌注固定完畢后取出全腦，后固定12 h，再將腦放入200 g/L的蔗糖溶液中，4℃過夜，組織塊完全沉底后，用冰凍切片機連續(xù)冠狀切片（冰凍切片機，Leica），厚度14 μm.

1.2.2免疫組織化學檢測采用生物素酶標鏈霉親和素原理(即SP法)進行免疫組織化學檢測（SP9003試劑盒，寶信公司）. 具體步驟如下，組織切片室溫滴加30 mL/L的H2O2，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，加入試劑A(封閉用正常兔血清工作液)，孵育13 min，分別加山羊HSP70， HSP27多克隆抗體（1∶100， Santa Cruze 公司 ，李新民教授惠贈）， 4℃過夜. 然后依次加入試劑B（生物素標記兔抗山羊IgG二抗工作液）、試劑C（辣根酶標記鏈酶素卵白素工作液），各置于室溫中15 min，以上各步驟間PBS充分沖洗. DAB棕色法顯色，脫水、透明、封片. 用無關(guān)抗體和PBS作替代或空白對照. 細胞質(zhì)棕黃色為陽性信號. 每組隨機取6張切片，每張切片取3個高倍視野（×40），進行陽性細胞計數(shù).

統(tǒng)計學處理： 學習記憶組 Morris水迷宮實驗結(jié)果采用逐步回歸分析法，免疫陽性細胞計數(shù)結(jié)果用x±s表示，用t檢驗進行組間比較，SPSS11.0軟件進行處理.

2結(jié)果

2.1學習記憶模型的建立采用逐步回歸分析法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個自變量(次數(shù)，天數(shù))進入回歸方程，回歸方程為： Y=28.581-1.816X1-8.407X2，Y為時間（單位s），X1為次數(shù)，X2為天數(shù). 即說明小鼠尋找平臺潛伏期與訓練天數(shù)、次數(shù)有線性回歸關(guān)系. 隨著訓練天數(shù)次數(shù)的增加，小鼠尋找水下隱藏平臺的能力得以提高. 空間探索實驗階段根據(jù)小鼠在各個象限的時間分布，發(fā)現(xiàn)小鼠在平臺所處的象限游泳時間最長，而且實驗中可看到小鼠放入池中最先在目標象限游泳. 對采集到的軌跡圖進行分析，訓練初期小鼠為邊緣式搜索，但在學習記憶模型建成后，大多都為直線趨向式(Fig 1).

2.2腦組織中HSP70，HSP27的表達學習記憶模型組腦組織細胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色沉淀物，在杏仁核簇、海馬和大腦額葉皮質(zhì)，陽性反應神經(jīng)元密集分布（Fig 2）. 而游水對照組陽性細胞零星散布，空白對照組幾乎沒有陽性細胞表達（Fig 3）. 學習記憶組HSP70陽性細胞數(shù)(115.1±12.0)，明顯高于游水對照組(22.7±8.1， P＜0.05）. HSP27在各組間未有差異，均未達到免疫組化檢測水平.

3討論

Morris水迷宮是研究嚙齒類動物學習記憶的一種實驗工具，簡便易行. 強迫動物游泳及迷宮環(huán)境對于動物屬于一種應激行為. 通過調(diào)節(jié)水溫可把這種應激降低，但是實驗動物的神經(jīng)系統(tǒng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)仍會發(fā)生一些改變，可能影響空間學習記憶形成過程中細胞分子的表達. 神經(jīng)遞質(zhì)受體和生長因子是參與學習記憶的主要細胞分子. 其中包括三種受體：親離子受體、促代謝受體和跨膜受體. 而生長因子研究比較多的是腦源性生長因子，Yamada等［2］發(fā)現(xiàn)其對學習記憶有重要作用. 突觸可塑性及神經(jīng)元所形成的神經(jīng)網(wǎng)絡是學習記憶的神經(jīng)生理基礎. 對于長期學習記憶，突觸結(jié)構(gòu)需要轉(zhuǎn)錄翻譯合成新的蛋白質(zhì). 而短期學習記憶，可以不需合成新的蛋白質(zhì)，它的形成與突觸局部變化有關(guān)，如酶的活化、蛋白質(zhì)的磷酸化及相應的電生理的變化［3］. Lisman等［4］認為鈣/鈣調(diào)節(jié)蛋白引起激酶Ⅱ（ CaMKⅡ）活性的改變是短期學習記憶的典型代表，通過此途徑使AMPM谷氨酸受體的活性增加，來調(diào)節(jié)突觸功能. 突觸蛋白Ⅰ，突觸結(jié)合蛋白Ⅰ，突觸融合蛋白等都是短期突觸可塑性的調(diào)節(jié)信號. 本實驗對小鼠短期學習記憶的分子機制進行了研究，發(fā)現(xiàn)HSP70高表達. 即Morris水迷宮短期學習記憶過程中有新的蛋白質(zhì)合成.

目前，各個領域都對HSP進行了深入研究，分子伴侶是其最重要的生物學功能，此外還能裝配、折疊新合成的蛋白多肽，降解變性、錯誤折疊的蛋白質(zhì)，調(diào)控調(diào)節(jié)蛋白的活性，參與細胞器、分泌蛋白膜轉(zhuǎn)位［5，6］. 研究［7］發(fā)現(xiàn)，預先給予熱休克處理，可對東莨菪堿誘發(fā)的記憶缺損起一種保護作用，即熱休克反應產(chǎn)物HSP70可保護膽堿能受體不與東莨菪堿結(jié)合，從而維持學習記憶相關(guān)細胞分子的正常功能. 本實驗發(fā)現(xiàn)HSP70可孤立于應激因素，在短期學習記憶中表達. Morris水迷宮環(huán)境（即游水對照組）可引起HSP70的表達，但是這種與迷宮相關(guān)的應激并沒有引起HSP70表達的顯著變化，切片染色只有零星的免疫陽性HSP70細胞. 而學習記憶組可看到密集的HSP70免疫陽性細胞，這現(xiàn)象證明HSP70可能直接參與空間學習記憶的形成過程. 而HSP27在三個組均未有表達，說明HSP27與學習記憶無關(guān). 新近研究［8］認為，HSP27主要為一種抑制子，對于防止細胞凋亡起重要作用.

最新觀點［9］認為特殊的學習記憶行為由特殊的腦區(qū)來完成，如暗示性學習記憶相關(guān)腦區(qū)為新皮質(zhì)、新紋狀體、小腦或杏仁體，外在性學習記憶主要依賴于海馬，工作性學習記憶建立在額前皮質(zhì)與其他腦區(qū)相互作用相互聯(lián)系的基礎之上. HSP在學習記憶信號通路中的詳細作用機制還有待進一步研究. 我們可以從本實驗中得到啟發(fā)，對于臨床上常見的輕度認知功能障礙、癡呆性疾病，盡早對其進行一些主動功能訓練，可能可以通過增加HSP的表達來提高其學習記憶能力.

【參考文獻】

［1］ Schimanski LA， Nguyen PV. Multidisciplinary approaches for investigating the mechanisms of hippocampusdependent memory: A focus on inbred mouse strains ［J］. Neurosci Biobehav Rev， 2004; 28(5):463-483.

［2］ Yamada K， Mizuno M， Nabeshima T. Role for brainderived neurophic factor in learning and memory ［J］. Life

Sci， 2002; 70(7):735-744.

［3］ Zipursky A. Learning， memory and transcription factors ［J］. Pediatric Res， 2003;53:396-374.

［4］ Lisman J， Schulman H， Cline H. The molecular basis of CaMKⅡ function in synaptic and behavioural memory ［J］. Nat Rev Neurosci， 2002;3(3):175-190.

［5］ Bratincsak A， Palkovits M. Activation of brain areas in rat following warm and cold ambient exposure ［J］. Neuroscience， 2004;127(2):385-397.

［6］ Young JC， Barral JM， Ulrich HF. More than folding:Localized function of cytosolic chaperones ［J］. Trends Biochem Sci， 2003;28:541-547.

［7］ Hung CH， Lin MT， Liao JF， et al. Scopolamineinduced amnesia can be prevented by heat shock pretreatment in rats ［J］. Neurosci Lett， 2004;364(2):63-66.

［8］ Concannon CG， Gorman AM， Samali A. On the role of HSP27 in regulating apoptosis ［J］. Apoptosis， 2003;8:61-70.