導(dǎo)語：如何才能寫好一篇基因治療的基本策略，這就需要搜集整理更多的資料和文獻(xiàn)，歡迎閱讀由公務(wù)員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

關(guān)鍵詞：基本醫(yī)療 醫(yī)保費(fèi)用 增長 控制

目前我國基本醫(yī)療保險(xiǎn)已經(jīng)覆蓋12.95億人，覆蓋95%以上人口。隨著我國醫(yī)療衛(wèi)生體制的改革，覆蓋面已經(jīng)基本涵蓋了城鎮(zhèn)居民、農(nóng)民及外出打工人群。人們?cè)谙硎茚t(yī)療保險(xiǎn)帶給我們醫(yī)療保障的同時(shí)，醫(yī)療費(fèi)用的快速上漲，也給醫(yī)?；饚砹顺林氐呢?fù)擔(dān)。因此，若何有效控制醫(yī)療保險(xiǎn)費(fèi)用的過快增長，是醫(yī)療保險(xiǎn)制度健康、有序、穩(wěn)步發(fā)展的前提，是保障人民群眾健康的物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)，也是醫(yī)療保險(xiǎn)事業(yè)平穩(wěn)運(yùn)行的基石。本文結(jié)合醫(yī)療保險(xiǎn)管理的實(shí)際，對(duì)我國醫(yī)療保險(xiǎn)運(yùn)行機(jī)構(gòu)如何控制醫(yī)療保險(xiǎn)費(fèi)用的過快增長進(jìn)行分析和探討。

一、醫(yī)療費(fèi)用過快增長的原因分析

引起次均醫(yī)療費(fèi)用和就醫(yī)頻率增加的因素很多，從對(duì)部分省份醫(yī)療基金運(yùn)行的實(shí)際情況分析，主要影響因素包括以下方面：

（一）正常醫(yī)療需求的增加。

一方面，基本醫(yī)療保險(xiǎn)制度從無到有，居民生活水平不斷提高，使人們的醫(yī)療需求得以正常釋放，直接影響到了就醫(yī)頻率的增加。同時(shí)，2009年開始，各統(tǒng)籌地區(qū)為了合理控制醫(yī)療保險(xiǎn)統(tǒng)籌基金的結(jié)余規(guī)模，分階段、不同程度地對(duì)本統(tǒng)籌地區(qū)醫(yī)療保險(xiǎn)待遇政策進(jìn)行了調(diào)整。例如：提高醫(yī)療保險(xiǎn)統(tǒng)籌基金年度最高支付限額和共付段醫(yī)保基金支付比例、增設(shè)門診大病病種等。在降低參保人員個(gè)人負(fù)擔(dān)的同時(shí)，提升了參保人員的就醫(yī)意愿，從而影響到了就醫(yī)頻率的增加。

另一方面，我國城鎮(zhèn)職工參保人群年齡結(jié)構(gòu)處于一個(gè)逐漸老化的趨勢(shì)中，各種慢性疾病、危重病發(fā)生概率增加，直接導(dǎo)致就醫(yī)頻率和次均費(fèi)用的增加。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，退休人員的次均門診費(fèi)用與在職人員差別不大，次均住院費(fèi)用、門診就診率和住院率卻差別明顯。

（二）以量補(bǔ)價(jià)的過度醫(yī)療現(xiàn)象普遍存在，推動(dòng)醫(yī)療費(fèi)用大幅增加。

受國家價(jià)格政策因素的影響，醫(yī)療機(jī)構(gòu)通過提高醫(yī)療收費(fèi)項(xiàng)目價(jià)格的創(chuàng)收途徑受到制約，同時(shí)又由于我國絕大部分統(tǒng)籌地區(qū)均采用項(xiàng)目付費(fèi)的結(jié)算方式，刺激了各醫(yī)療機(jī)構(gòu)通過增加醫(yī)療服務(wù)提供量和種類來創(chuàng)收。以量補(bǔ)價(jià)的過度醫(yī)療情況已成為我國醫(yī)療費(fèi)用不合理支出快速增加的重要原因。

（三）先進(jìn)醫(yī)療技術(shù)在臨床推廣，對(duì)高級(jí)別醫(yī)院的次均費(fèi)用影響較大。

隨著科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，新的醫(yī)療儀器設(shè)備、藥品和診療技術(shù)層出不窮，極大地提高了診療水平，在解決疑難雜癥方面起到了重要作用。與此同時(shí)，醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，其本身的高科技價(jià)值也帶來了醫(yī)療費(fèi)用的攀升。

二、控制醫(yī)療費(fèi)用上漲的應(yīng)對(duì)措施

醫(yī)療衛(wèi)生資源的有限性與醫(yī)療服務(wù)需求的不斷膨脹之間的矛盾，醫(yī)療保險(xiǎn)籌資與支出之間的矛盾，醫(yī)療保險(xiǎn)支出與積累之間的矛盾，是關(guān)系到社會(huì)保險(xiǎn)事業(yè)持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。根據(jù)醫(yī)療費(fèi)用上漲的特點(diǎn)，在保障醫(yī)療需求合理增加的前提下，結(jié)合電力行業(yè)實(shí)際，應(yīng)從以下幾方面采取措施，控制醫(yī)療費(fèi)用的快速上漲。

（一）加大醫(yī)保政策宣傳力度。

我國現(xiàn)行的是“低水平、廣覆蓋、?；尽钡尼t(yī)療保障制度和“以收定支、收支平衡、略有結(jié)余”的基金管理原則。醫(yī)保部門應(yīng)加強(qiáng)醫(yī)保政策的宣傳，使參保人員明白基本醫(yī)療保險(xiǎn)保的是基本醫(yī)療，而不是特需醫(yī)療?；踞t(yī)療就是因病施治，進(jìn)行合理的檢查、用藥及治療。不根據(jù)病情需要，盲目要求醫(yī)生多開藥、開貴藥，不僅不能對(duì)癥治療，還會(huì)給自己和醫(yī)保基金造成浪費(fèi)。

（二）加強(qiáng)政策引導(dǎo)，合理分流病人。

建立雙向轉(zhuǎn)診制度，合理分流參保人員到適合自身疾病治療的相應(yīng)級(jí)別醫(yī)院就醫(yī)。為促使雙向就診制度的有效實(shí)施，醫(yī)療保險(xiǎn)經(jīng)辦機(jī)構(gòu)應(yīng)積極主動(dòng)延伸服務(wù)，一方面將各定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)收治的各類常見病的治愈率、次均醫(yī)療費(fèi)用、平均住院天數(shù)、個(gè)人負(fù)擔(dān)、病人滿意度等多種信息定期對(duì)外公布；另一方面，對(duì)我國醫(yī)技高超、醫(yī)德高尚的醫(yī)務(wù)工作者，醫(yī)療保險(xiǎn)經(jīng)辦機(jī)構(gòu)可以主動(dòng)進(jìn)行宣傳，盡量減少病人和醫(yī)院之間的信息不對(duì)稱程度。

（三）實(shí)施醫(yī)療保險(xiǎn)定點(diǎn)醫(yī)生管理制度，強(qiáng)化醫(yī)務(wù)人員的自律性。

隨著我國五險(xiǎn)合一的金保工程二期信息系統(tǒng)在部分地區(qū)范圍內(nèi)逐步推廣使用，對(duì)醫(yī)療保險(xiǎn)定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)精確化管理程度提高，管理落實(shí)到醫(yī)生的條件已基本成熟。可以建立部分地區(qū)醫(yī)療保險(xiǎn)定點(diǎn)醫(yī)生庫，制定定點(diǎn)醫(yī)生誠信評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)和激勵(lì)機(jī)制，建議全國各省份人力資源和社會(huì)保障管理部門將醫(yī)保定點(diǎn)醫(yī)生的誠信狀況作為醫(yī)生職稱評(píng)定的標(biāo)準(zhǔn)之一，提升醫(yī)生提供醫(yī)療服務(wù)的自律性。

（四）加強(qiáng)醫(yī)保稽核管理，確保基金安全。

加強(qiáng)醫(yī)?；斯芾?，加大對(duì)違規(guī)行為的查處力度，對(duì)參保人員將醫(yī)療卡、證轉(zhuǎn)借他人使用，惡意騙取醫(yī)?；鸬雀鞣N違規(guī)行為，要加大查處打擊力度，以此強(qiáng)化就醫(yī)管理，促使參保人員規(guī)范就醫(yī)行為。如：把醫(yī)?；俗鳛獒t(yī)保工作重心之一，通過加強(qiáng)對(duì)監(jiān)管，有效遏制分解住院、降低入院標(biāo)準(zhǔn)、掛床、冒名住院、虛擬住院、過度治療等不規(guī)范醫(yī)療服務(wù)行為，促進(jìn)醫(yī)療服務(wù)質(zhì)量的提高，維護(hù)參保人的權(quán)益。

（五）完善醫(yī)療保險(xiǎn)定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)管理質(zhì)量評(píng)價(jià)機(jī)制，實(shí)施定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)分級(jí)管理。

通過實(shí)施定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)分級(jí)管理，進(jìn)一步改進(jìn)定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)年度考核指標(biāo)，并建立定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)管理激勵(lì)和約束機(jī)制，變被動(dòng)管理為主動(dòng)管理。

篇2

[中圖分類號(hào)] R735.7[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1005-0515（2011）-11-115-01

肝臟血供豐富，是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的最常見的靶器官之一，在惡性腫瘤的發(fā)展過程中約25%-50%的原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移至肝[1]。如何提高轉(zhuǎn)移性肝癌的治療有效率一直是腫瘤臨床工作的重點(diǎn)之一，正確認(rèn)識(shí)肝轉(zhuǎn)移癌的一般規(guī)律和特點(diǎn)，對(duì)進(jìn)一步提高該病的診治水平具有十分重要的意義。

1 肝轉(zhuǎn)移癌主要來源分析 常見肝轉(zhuǎn)移癌以消化道惡性腫瘤來源為主，所有的消化系統(tǒng)惡性腫瘤均可經(jīng)肝動(dòng)脈、門靜脈及淋巴途徑轉(zhuǎn)移到肝臟，其中以消化道腺癌經(jīng)血行肝轉(zhuǎn)移最多見。

由于消化道原發(fā)灶全部由門靜脈回流至肝臟，且手術(shù)操作過程中牽拉、擠捏等常使脫落進(jìn)入血管的腫瘤細(xì)胞首先進(jìn)入肝臟，因而消化道癌易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。從分子生物學(xué)的角度考慮，消化道癌細(xì)胞表面的糖蛋白CEA具有類似免疫球蛋白類細(xì)胞粘附分子功能，它由肝臟清除，在肝內(nèi)與肝細(xì)胞結(jié)合后，可作為粘附循環(huán)中腫瘤細(xì)胞的受體，而致腫瘤易在肝臟中滯留，進(jìn)一步激活新生血管而形成轉(zhuǎn)移灶[2]。從環(huán)境土壤學(xué)說來看，肝臟血供豐富，能夠?yàn)槟[瘤的高代謝特點(diǎn)提供營養(yǎng)保障。

2 肝臟病理損傷與肝轉(zhuǎn)移癌關(guān)系

2.1 肝纖維化/肝硬化與肝轉(zhuǎn)移癌關(guān)系 眾多的實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明肝纖維化/肝硬化患者很少發(fā)生肝轉(zhuǎn)移癌。大多學(xué)者認(rèn)為肝硬化時(shí)形成諸多假小葉，由于再生的肝細(xì)胞結(jié)節(jié)的壓迫和結(jié)締組織的收縮，使肝內(nèi)血管、膽管均發(fā)生扭曲和閉塞，酶學(xué)系也發(fā)生相應(yīng)的變化，以及肝硬化時(shí)門靜脈壓力升高，肝臟收納胃腸系統(tǒng)的血流量減少。這些變化使已到達(dá)肝內(nèi)的癌細(xì)胞不適宜“著床”及生長。

2.2 肝炎病毒感染與肝轉(zhuǎn)移癌關(guān)系 UtsunormiyaT[3]報(bào)告感染乙肝或丙肝病毒的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移率(3/37,8.1%)較非感染者的肝轉(zhuǎn)移率(85/401,21.1%)明顯降低。HBsAg感染后出現(xiàn)肝功能損害、肝硬化可能是結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的不利因素。病毒感染本身和其引起的局部免疫變化可能起著重要作用。肝炎病毒能夠引起特異性免疫反應(yīng)，有效地抑制和殺滅循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞；同時(shí)微環(huán)境中NK細(xì)胞和吞噬細(xì)胞的增加，大大增強(qiáng)了局部組織的免疫功能。

2.3 脂肪肝與肝轉(zhuǎn)移癌關(guān)系 Karube等[4]通過向患有脂肪肝的大鼠體內(nèi)注入鼠結(jié)腸直腸癌細(xì)胞(RCN-9)，觀察到出現(xiàn)轉(zhuǎn)移性肝臟病變的大鼠數(shù)量明顯少于無脂肪肝的對(duì)照組，同時(shí)檢測到脂肪肝大鼠轉(zhuǎn)移病灶中的微血管密度(microvesseldensity,MVD)低于對(duì)照組大鼠，提示脂肪肝的環(huán)境不利于癌細(xì)胞的生長，轉(zhuǎn)移灶不易形成。

3 肝轉(zhuǎn)移癌的治療現(xiàn)狀分析

3.1 外科手術(shù)治療 結(jié)腸癌等原發(fā)病灶切除術(shù)后，盡可能行肝轉(zhuǎn)移灶切除術(shù)，外科手術(shù)依然是可切除病灶的標(biāo)準(zhǔn)治療，一旦有切除可能時(shí)，即應(yīng)進(jìn)行手術(shù)，從而最大程度減輕患者負(fù)擔(dān)，延長生存期。

3.2 局部治療方法 主要有射頻消融(RFA)、無水酒精注射、激光導(dǎo)熱治療(LITT)、微波凝固治療(MCT)、高功率聚焦超聲療法(HIFU)、冷凍治療、電化學(xué)治療等方法，其原理主要是采用物理或化學(xué)的方法導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡。

3.3 化療 肝臟出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶是原發(fā)腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期癥狀表現(xiàn)，已處DukesD期，不管能否切除轉(zhuǎn)移灶，原則上均需根據(jù)轉(zhuǎn)移癌的病理類型選擇敏感藥物化療。給藥途徑有全身和區(qū)域性。

3.4 放療 肝轉(zhuǎn)移癌的癌細(xì)胞大多數(shù)是消化道來源的腺癌，對(duì)放療低度敏感，肝臟組織對(duì)放射線的耐受性差，全肝區(qū)放療已基本放棄不用，病灶聚焦放療有時(shí)仍在應(yīng)用，如γ刀、光子刀等的治療。

3.5 生物治療 生物治療包括免疫治療和基因治療兩大類，免疫治療是調(diào)動(dòng)機(jī)體各種積極防御因素，提高機(jī)體免疫力，能過免疫機(jī)制達(dá)到治療腫瘤的目的。基因治療是應(yīng)用基因工程技術(shù)，干預(yù)存在于靶細(xì)胞的相關(guān)基因表達(dá)水平以達(dá)到治療目的，包括直接或間接抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞，歸納為細(xì)胞因子、腫瘤疫苗、腫瘤藥物基因治療及調(diào)整細(xì)胞遺傳系統(tǒng)的基因療法，目前研究較多的是殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞生長的基因、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞免疫原性的基因、耐藥基因等。

3.6 中醫(yī)藥治療 中醫(yī)藥治療惡性腫瘤病人,應(yīng)用祛邪、扶正、化淤、軟堅(jiān)、散結(jié)、清熱解毒、化痰、祛濕及通經(jīng)活絡(luò)、以毒攻毒等原理，以中藥補(bǔ)益氣血、調(diào)理臟腑，配合手術(shù)后、放療和化療的治療、還可減輕毒副作用。

4 肝轉(zhuǎn)移癌的現(xiàn)代治療策略 近年來，圍繞提高肝轉(zhuǎn)移癌手術(shù)切除率和延長生存期，提出多學(xué)科專家組(multidisciplinaryteam，MDT)治療模式[5]。在病人治療前、治療中和治療后，由多個(gè)學(xué)科專家組成診療小組，定期進(jìn)行會(huì)議，以病人為中心，討論決定適合每個(gè)病人不同病期的診斷治療方案，以使病人獲得最佳的預(yù)后。

5 展望 各種治療方法均有不同程度的缺陷，比如手術(shù)及各種局部治療方法包括動(dòng)脈栓塞化療在內(nèi)，對(duì)于潛藏在門脈系統(tǒng)內(nèi)的微小病變不能處理，從而導(dǎo)致復(fù)發(fā)；全身靜脈化療往往因藥物副作用不能使病灶內(nèi)藥物濃度達(dá)到最佳水平，致使腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)耐藥性等。相對(duì)而言，利用氣囊導(dǎo)管實(shí)施的經(jīng)皮肝隔離灌注術(shù)值得研究[6]。

參考文獻(xiàn)

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[4] KarubeH,MasudaH,HayashiS,et al. Fatty liver suppressed the an-giogenesis in the livermetastatic lesions[J].Hepatogastroenterology,2000,47(36):1541-1545.

篇3

【摘要】 目的： 用骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)腺病毒表達(dá)載體(AdBMP2)轉(zhuǎn)染兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，研究轉(zhuǎn)染對(duì)其增殖、成骨分化的影響。方法： 用AdBMP2轉(zhuǎn)染兔BMSCs，利用免疫細(xì)胞化學(xué)法、原位雜交染色和蛋白印跡法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞BMP2的表達(dá)。流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞周期的變化，分析轉(zhuǎn)染對(duì)BMSCs增殖的影響。酶標(biāo)法檢測ALP活性；免疫熒光檢測骨鈣素（OCN）、Ⅰ型膠原表達(dá)，分析轉(zhuǎn)染對(duì)BMSCs成骨分化的影響。結(jié)果： BMP2基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)mRNA水平和蛋白水平均有較高表達(dá)，蛋白印跡法檢測到培養(yǎng)液中有BMP2蛋白陽性表達(dá)。流式細(xì)胞儀檢測G1期、S期細(xì)胞比例與空白對(duì)照組無差異。ALP活性明顯增高，骨鈣素、Ⅰ型膠原免疫熒光檢測，見胞漿內(nèi)有大量顯綠色熒光的陽性物質(zhì)。結(jié)論： 在腺病毒載體介導(dǎo)下BMP2基因成功導(dǎo)入BMSCs，細(xì)胞增殖未因轉(zhuǎn)染而受影響，并可持續(xù)表達(dá)基因產(chǎn)物，向成骨細(xì)胞分化。

【關(guān)鍵詞】 腺病毒；骨形態(tài)發(fā)生蛋白2；骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；基因治療

BMP2是最主要的骨形成調(diào)控因子之一，在體內(nèi)和體外能夠誘導(dǎo)干細(xì)胞分化和骨形成。骨組織工程中應(yīng)用緩釋技術(shù)將BMP2加入載體的方法雖然取得了一些成果，但從理論到技術(shù)均有尚不完善之處。本實(shí)驗(yàn)采用體外基因治療策略，將攜帶BMP2基因的重組缺陷型腺病毒表達(dá)載體（AdBMP2）轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，檢測BMP2基因表達(dá)，觀察基因轉(zhuǎn)染對(duì)BMSCs增殖及成骨分化的影響，探討其作為內(nèi)源性BMP2的“生物發(fā)生器”以及骨組織工程種子細(xì)胞的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 腺病毒載體及細(xì)胞 AdBMP2、攜帶β半乳糖酐酶基因的腺病毒對(duì)照載體（AdLacz）和人胚腎293細(xì)胞，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院骨科李建軍博士提供。通過感染293 細(xì)胞擴(kuò)增病毒，測定AdBMP2滴度為2×1010 PFU·ml-1。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭大耳白兔，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～2.5kg，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（遼2003-0013）。

1.1.3 主要試劑 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（北京?？寺∩镏破酚邢薰荆?；胎牛血清（天津?yàn)笊镏破酚邢薰荆籅MP2單克隆抗體、原位雜交檢測試劑盒和免疫組織化學(xué)試劑盒（武漢博士德生物工程公司）；骨鈣素、Ⅰ型膠原單克隆抗體（Santa Crus公司）；二抗FITC標(biāo)記IgG（北京中杉金橋）；Xgal（大連寶生物公司）;堿性磷酸酶檢測試劑盒（南京建成生物工程公司）。

1.1.4 主要儀器 垂直電泳儀（BioRad）；轉(zhuǎn)印電泳儀（Amersham公司）；可調(diào)溫?fù)u床（哈爾濱東聯(lián)公司）；臺(tái)式低溫離心機(jī)（Eppendorf公司）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃集團(tuán)MK3）；熒光顯微鏡（日本 Olympus）。

1.2 方法

1.2.1 兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)BMSCs，2周左右貼壁細(xì)胞基本長滿單層，即得到原代培養(yǎng)細(xì)胞。按1∶3或1∶4比例分瓶傳代培養(yǎng)。BMSCs（P2）長至基本融合時(shí)，更換成含2%FBS的DMEM培養(yǎng)液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)病毒滴度按感染倍數(shù)（MOI）為100（即1個(gè)細(xì)胞用100個(gè)病毒顆粒感染）加入相應(yīng)體積的AdBMP2，過夜。次日換成含10%FBS的DMEM正常培養(yǎng)液培養(yǎng)2 d。同等條件下AdLacz轉(zhuǎn)染細(xì)胞（MOI=100），Xgal免疫染色檢測轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)組：AdBMP2轉(zhuǎn)染；實(shí)驗(yàn)對(duì)照組：AdLacz轉(zhuǎn)染；空白對(duì)照組：未轉(zhuǎn)染。

1.2.2 原位雜交、免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測細(xì)胞內(nèi)BMP2基因表達(dá) 取各組細(xì)胞，以1×105 ml-1的密度接種于多聚L賴氨酸處理過的蓋玻片上，待貼壁細(xì)胞密度達(dá)到50%左右時(shí)取出蓋玻片，PBS漂洗3次，4％多聚甲醛固定。分別按BMP2原位雜交、免疫組化試劑盒操作步驟進(jìn)行操作，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，透明，封片，光鏡觀察。

1.2.3 Western blotting檢測培養(yǎng)液中BMP2蛋白 各組細(xì)胞換無血清培養(yǎng)液孵育12h，收集培養(yǎng)液20ml，凍干機(jī)凍干后加入50μl上樣緩沖液。取10μl樣品，煮沸5min，離心5min，上清以12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（12%SDSPAGE）分離。SDSPAGE電泳在恒壓條件下進(jìn)行，濃縮膠中為120V，分離膠中為160V。常規(guī)轉(zhuǎn)膜，封閉，然后按膜面積計(jì)算一抗用量（0.1ml·cm-2），使用Tween 20PBS按比例稀釋一抗（BMP2單克隆抗體），與濾膜4℃溫浴3h；以TPBS按比例稀釋二抗（辣根酶標(biāo)記抗體），與濾膜室溫溫浴1h；加入生色底物溶液（PBS 9ml+二氨基聯(lián)苯胺9mg+0.3%LiCl2 1ml，最后加入H2O2至0.14%），室溫?fù)u動(dòng)觀察條帶顏色清晰，PBS終止顯色反應(yīng)，洗滌，干燥，避光保存。rhBMP2標(biāo)準(zhǔn)蛋白20ng作為陽性對(duì)照組。

1.2.4 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期 每組細(xì)胞各取6 瓶（1×106瓶-1），胰酶消化收集細(xì)胞，用1ml PBS制成單細(xì)胞懸液，加入75%冰乙醇4ml固定12h，100μg·ml-1碘化丙啶避光染色30min，震蕩混勻，上機(jī)檢測，聯(lián)機(jī)軟件測定分析細(xì)胞周期各時(shí)相比例，數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理，方差分析比較。

1.2.5 ALP活性檢測 每組細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，加100μl 2％Triton100，4℃過夜，按ALP活性檢測試劑盒說明操作，測定吸光度，計(jì)算酶活性值。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。計(jì)算均數(shù)，組間差異用 t 檢驗(yàn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.6 免疫熒光檢測骨鈣素（OCN）、Ⅰ型膠原表達(dá) 將各組細(xì)胞接種于預(yù)置有蓋玻片的6孔板內(nèi)，2周后取出玻片，PBS漂洗3次，4％多聚甲醛固定。免疫熒光法分別檢測OCN、Ⅰ型膠原表達(dá)，0.2% Triton X100透化處理，10% BSA室溫封閉，一抗4℃濕盒孵育過夜，二抗FITC標(biāo)記IgG室溫避光孵育2 h，PBS漂洗3次，95%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)

果

2.1 AdBMP2轉(zhuǎn)染BMSCs及轉(zhuǎn)染率檢測

轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，邊界清晰，生長旺盛，細(xì)胞核較大，呈圓形或橢圓形，胞漿中顆粒較多，隨培養(yǎng)時(shí)間延長多角型細(xì)胞增多。AdLacz轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞可編碼產(chǎn)生β半乳糖酐酶，作用于生色底物Xgal，反應(yīng)產(chǎn)物呈藍(lán)色。與AdBMP2轉(zhuǎn)染同等實(shí)驗(yàn)條件下（MOI=100），腺病毒轉(zhuǎn)染效率高達(dá)90%以上（圖 1）。

2.2 BMP2基因在BMSCs內(nèi)的表達(dá)

原位雜交及免疫細(xì)胞化學(xué)染色均顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞質(zhì)中有較多棕黃色強(qiáng)陽性染色顆粒（圖 2、3），而實(shí)驗(yàn)對(duì)照及空白對(duì)照組則為陰性。結(jié)果表明：AdBMP2轉(zhuǎn)染的BMSCs中BMP2基因在mRNA和蛋白水平均呈高效表達(dá)。

2.3 Western blotting檢測培養(yǎng)液中BMP2蛋白

Western blotting檢測顯示AdBMP2轉(zhuǎn)染組有BMP2強(qiáng)陽性條帶，AdLacz轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組為弱陽性條帶。AdBMP2轉(zhuǎn)染BMSCs后，分泌的BMP2蛋白含量遠(yuǎn)高于實(shí)驗(yàn)及空白對(duì)照組（圖 4）。結(jié)果表明：AdBMP2轉(zhuǎn)染的BMSCs中分泌性BMP2蛋白高效表達(dá)。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期

分析細(xì)胞周期結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組及空白對(duì)照組的G1期、S期細(xì)胞比例無顯著差異（P>0.05），表明AdBMP2轉(zhuǎn)染后，BMSCs的DNA合成以及細(xì)胞的增殖未因轉(zhuǎn)染受影響(見表1)。表1 細(xì)胞周期流式細(xì)胞儀分析結(jié)果 AdBMP2轉(zhuǎn)染組ALP活性為(30.21±1.85) U·ml-1，AdLacz轉(zhuǎn)染組為(19.56±2.09) U·ml-1，未轉(zhuǎn)染組為(20.65±1.93) U·ml-1，經(jīng) t 檢驗(yàn)分析，AdBMP2轉(zhuǎn)染細(xì)胞組ALP活性較實(shí)驗(yàn)對(duì)照組及空白對(duì)照組明顯增高，差異有顯著性（P﹤0.01）。

2.6 免疫熒光檢測OCN、Ⅰ型膠原表達(dá)

AdBMP2轉(zhuǎn)染細(xì)胞的胞漿內(nèi)有大量陽性綠色熒光物質(zhì)（圖5、6），而實(shí)驗(yàn)對(duì)照組及空白對(duì)照組細(xì)胞均為陰性。結(jié)果表明，AdBMP2轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞內(nèi)有骨鈣素、Ⅰ型膠原的高效表達(dá)，提示BMSCs向成骨細(xì)胞表型分化。

3 討

論

BMSCs因其取材方便，易于分離，體外增殖能力強(qiáng)，具有多方向分化潛能，經(jīng)誘導(dǎo)可成骨分化，是目前骨組織工程中應(yīng)用最為廣泛的種子細(xì)胞。研究表明，單純BMSCs作為種子細(xì)胞向成骨分化過程較慢，并非是一個(gè)自發(fā)的過程，需要細(xì)胞因子及特定的體內(nèi)環(huán)境作用，而且成骨分化后細(xì)胞表型的維持也需要細(xì)胞因子的作用［1］。體內(nèi)移植后早期細(xì)胞外基質(zhì)形成不足時(shí)，植入的細(xì)胞也會(huì)失去依托和緊密的細(xì)胞間黏附，局部的成骨微環(huán)境形成將受到阻礙，不能及早確立優(yōu)勢(shì)成骨細(xì)胞群而將阻礙成骨。本實(shí)驗(yàn)中也觀察到 BMSCs的ALP活性較低，OCN、Ⅰ型膠原含量少，提示成骨活性較弱。因此，BMSCs需經(jīng)改造以增強(qiáng)成骨活性才能成為理想的種子細(xì)胞。

圖 6 Ⅰ型膠原免疫熒光（×100）

BMP2是被公認(rèn)最強(qiáng)的成骨誘導(dǎo)因子之一，是調(diào)控BMSCs向成骨方向定向分化的主要因子，而且已開始應(yīng)用于臨床［2］。但BMP2的制備過程復(fù)雜，產(chǎn)量低；活性不穩(wěn)定，在體內(nèi)環(huán)境代謝快，骨誘導(dǎo)時(shí)間短；作為外源性蛋白植入體內(nèi)，用量大時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生毒性反應(yīng)，還可能引起免疫排斥反應(yīng)［3］；有報(bào)道致力于采用緩釋技術(shù)來解決這些缺陷，然而支架材料中能否整合足夠量的BMP2并持續(xù)穩(wěn)定釋放，而且BMP2對(duì)理化處理是高度敏感的，在支架材料中能否保持生物活性，成為難以解決的問題［4］。應(yīng)用基因治療技術(shù)可將成骨誘導(dǎo)因子的目的基因?qū)氚屑?xì)胞，經(jīng)過基因修飾的細(xì)胞可持續(xù)表達(dá)細(xì)胞因子，可在局部根據(jù)需要持續(xù)、穩(wěn)定、靶向釋放內(nèi)源性細(xì)胞因子，促進(jìn)成骨，并起到維持成骨細(xì)胞表型的作用，克服直接應(yīng)用外源性細(xì)胞因子可能產(chǎn)生的上述缺點(diǎn)。

重組復(fù)制缺陷型腺病毒因其毒性低、靶細(xì)胞范圍廣泛、轉(zhuǎn)染率高、不與靶細(xì)胞發(fā)生基因整合等優(yōu)點(diǎn)，成為基因治療中常用的載體之一。本研究在重組缺陷型腺病毒載體介導(dǎo)下將BMP2基因?qū)隑MSCs，與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較，AdBMP2轉(zhuǎn)染的BMSCs中BMP2基因在mRNA及蛋白水平呈高效表達(dá)，培養(yǎng)液中BMP2含量較高。而且觀察到AdBMP2轉(zhuǎn)染的BMSCs中ALP活性增強(qiáng)，OCN、Ⅰ型膠原呈陽性表達(dá)。ALP活性被認(rèn)為是衡量BMSCs向成骨細(xì)胞方向分化程度和成骨細(xì)胞功能狀態(tài)的一個(gè)重要指標(biāo)［5］。Ⅰ型膠原蛋白主要由成熟的成骨細(xì)胞合成分泌，是成骨細(xì)胞的重要標(biāo)志物之一［6］。OCN是骨代謝細(xì)胞分化成熟、處于功能狀態(tài)的標(biāo)志［7］。因此根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以認(rèn)為，BMP2基因修飾的BMSCs向成骨細(xì)胞表型分化，提示BMP2基因的轉(zhuǎn)染使BMSCs高效表達(dá)、分泌的內(nèi)源性BMP2，通過自分泌或旁分泌增強(qiáng)了自身的成骨活性。BMP2促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的機(jī)理還不十分清楚，目前認(rèn)為BMP2并不直接作用于靶基因，而是通過BMP2、受體、信號(hào)途徑和靶基因組成的一個(gè)較完整的信號(hào)系統(tǒng)發(fā)揮成骨誘導(dǎo)作用，BMP2處于系統(tǒng)的核心和啟位點(diǎn)［8］。

細(xì)胞分化與增殖的矛盾是細(xì)胞生物學(xué)特征之一，即分化低的細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，分化高的細(xì)胞增殖能力差。本實(shí)驗(yàn)觀察到AdBMP2轉(zhuǎn)染BMSCs促進(jìn)了其向成骨細(xì)胞的定向分化，但通過流式細(xì)胞儀檢測分析細(xì)胞周期的結(jié)果顯示，AdBMP2轉(zhuǎn)染的BMSCs的增殖能力并未受影響，與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞無差異，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況也證實(shí)了這一點(diǎn)?？紤]除了與BMSCs強(qiáng)大的增殖能力有關(guān)外，可能還與BMP2對(duì)BMSCs增殖有促進(jìn)作用有關(guān)。

綜上所述，采用基因技術(shù)，通過重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體介導(dǎo)，可將BMP2基因高效導(dǎo)入BMSCs，基因轉(zhuǎn)染的BMSCs不僅提供了內(nèi)源性BMP2的局部來源，而且提供了BMP2自身效應(yīng)的靶細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了向成骨細(xì)胞的定向分化并保持了強(qiáng)大的增殖能力，有望成為骨組織工程中比較理想的種子細(xì)胞。至于基因轉(zhuǎn)染的BMSCs能否在局部根據(jù)需要持續(xù)、穩(wěn)定釋放內(nèi)源性BMP2，植入體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸，以及腺病毒載體的安全性等問題尚需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

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篇4

[關(guān)鍵詞]乙型肝炎病毒;HBV;藥物

[中圖分類號(hào)]R978[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1673-7210（2007）11（a）-028-03

乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)性肝炎是嚴(yán)重危害人民健康的常見傳染病。自1964年被發(fā)現(xiàn)后的40多年里，它成為了無數(shù)人揮之不去的陰影。全世界乙肝病毒表面抗原(HBsAg)陽性者約4億人，主要分布于亞洲、非洲和拉丁美洲地區(qū)[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年約有100萬人死于HBV感染相關(guān)性疾病，占疾病死亡原因的第9位[2]。我國HBsAg陽性者約有1.2億人，其中3 000萬人為慢性乙肝患者[3,4]。如何預(yù)防和有效治療肝炎成為當(dāng)今重要的醫(yī)學(xué)課題?，F(xiàn)將目前常用的治療乙型肝炎的現(xiàn)代藥物及臨床應(yīng)用作一綜述，供醫(yī)患參考。

1 生物類藥物

1.1 干擾素-α

IFN-α結(jié)合于其特異的細(xì)胞表面受體，誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)多種廣譜的抗病毒蛋白，包括蛋白激酶A(protein kinase A , PKA)、2'，5'-寡腺苷酸合成酶(2'，5'-oligoadenylate synthetase, OAS)、脫氨酶(adenosine deaminase, ADAR) 和Mx蛋白等。PKA可被細(xì)胞內(nèi)病毒RNA激活, 隨后使翻譯起始因子-2α(eukaryoteinitiation factor-2α,eIF-2α)磷酸化而失去活性，從而阻止病毒mRNA的翻譯，使病毒蛋白合成起始受阻；OAS在細(xì)胞內(nèi)被病毒單鏈RNA激活，合成寡腺苷酸，繼而激活細(xì)胞內(nèi)RNA酶L，病毒RNA降解；ADAR可催化病毒雙鏈RNA中的腺嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)榇吸S嘌呤，從而使病毒解聚。Mx蛋白是一類蛋白家族，可影響細(xì)胞內(nèi)病毒核殼體的轉(zhuǎn)運(yùn)及RNA的合成[7]。此外，IFN-α通過免疫機(jī)制抗HBV[8]。對(duì)HBeAg陽性患者的療效, IFN-α治療3~6個(gè)月，停藥6~12個(gè)月后，HBeAg轉(zhuǎn)陰率為33%，血清HBV DNA轉(zhuǎn)陰率為37%，HBsAg轉(zhuǎn)陰率為8%。對(duì)于HBeAg轉(zhuǎn)陰的患者，其療效一般會(huì)長期維持。有研究表明，HBeAg轉(zhuǎn)陰患者中80%~90%在4~8年內(nèi)其HBeAg持續(xù)陰性[9]。長期的臨床隨訪(7~10年)研究表明，IFN-α治療可顯著改善HBeAg轉(zhuǎn)陰患者的預(yù)后，其肝硬化并發(fā)癥及肝移植發(fā)生率顯著降低，累積生存率顯著提高[10]。目前，臨床試驗(yàn)又應(yīng)用新一代的聚乙二醇-IFN-α(PEG-IFN-α)治療乙型肝炎，并取得了不錯(cuò)的療效[11]。

HBeAg陰性的CHB患者，其體內(nèi)感染的HBV DNA的前核心區(qū)發(fā)生了突變，從而不能表達(dá)HBeAg。這類患者對(duì)IFN-α的反應(yīng)性比HBeAg陽性患者差，有報(bào)道顯示，以HBV-DNA轉(zhuǎn)陰和轉(zhuǎn)氨酶水平恢復(fù)正常為標(biāo)準(zhǔn)，其IFN-α治療的長期有效率僅為15%~18%[12]。對(duì)HBeAg陰性患者采用IFN-α治療24個(gè)月，治療結(jié)束21個(gè)月后，其有效率為30%。HBeAg陰性患者IFN-α治療后，持續(xù)應(yīng)答者發(fā)生肝硬化及其并發(fā)癥的幾率和死亡率與治療無效，治療后復(fù)發(fā)與未治療者相比明顯降低[13]。

1.2 胸腺肽α1

胸腺肽α1(thymosin alpha-1, Tα1,Zadaxin)是20世紀(jì)70年代末期從胸腺素第5組分(TF5)中分離純化出的一種小分子生物活性多肽。Tα1分子含28個(gè)氨基酸, 廣泛存在于機(jī)體的胸腺上皮細(xì)胞、外周血、大腦、垂體、、濾泡液和羊水中。Tα1在機(jī)體免疫應(yīng)答過程中充當(dāng)十分重要的角色，其抗HBV的作用機(jī)制尚未明確，目前認(rèn)為可能和增強(qiáng)T細(xì)胞及NK細(xì)胞應(yīng)答功能及增強(qiáng)IL-2及IFN產(chǎn)生有關(guān)。

Chan HL[14]等實(shí)驗(yàn)證明，胸腺肽組與安慰劑組相比治療結(jié)束，治療結(jié)束后6個(gè)月、12個(gè)月生物化學(xué)反應(yīng)無差異。結(jié)論認(rèn)為，對(duì)于慢性乙型肝炎病毒感染胸腺肽能有效抑制病毒復(fù)制，但此影響延遲直至停止治療后12個(gè)月。現(xiàn)有劑型為注射劑，療程6個(gè)月，基本和干擾素相似，無任何副作用。胸腺肽α1還可以作為疫苗輔助藥來加強(qiáng)乙肝疫苗的效果，其作用特點(diǎn)表現(xiàn)為延遲效應(yīng)。在治療結(jié)束時(shí)對(duì)胸腺肽α1的效應(yīng)率很低，但隨訪觀察中完全效應(yīng)的病例逐漸增加。單用胸腺肽α1治療的效應(yīng)率不高，主張與其他抗乙肝病毒藥物聯(lián)合應(yīng)用。

2 化學(xué)類藥物核苷類似物

2.1 拉米夫定(lamivudine,3TC)

拉米夫定是新型核苷類藥物，全稱2',3-二脫氧-3-硫代胞嘧啶(3TC)。其進(jìn)人細(xì)胞后，磷酸化為三磷酸拉米夫定而發(fā)揮作用。拉米夫定作用的靶位是HBV聚合酶反轉(zhuǎn)錄活性YMDD(酪氨酸、蛋氨酸、門冬氨酸)基序。在HBV復(fù)制周期中，HBV侵入細(xì)胞內(nèi)，其核心部分進(jìn)入胞核，部分雙鏈的環(huán)狀DNA分子轉(zhuǎn)變成超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)，然后合成前基因組RNA，再以此為模板在HBV聚合酶作用下反轉(zhuǎn)錄負(fù)鏈DNA，最后復(fù)制成部分雙鏈的環(huán)狀DNA，HBV聚合酶的抑制將抑制前基因組RNA反轉(zhuǎn)錄為負(fù)鏈DNA，阻斷新合成HBV-DNA的鏈化，從而抑制HBV的復(fù)制。 拉米夫定可快速高效抑制HBV-DNA復(fù)制。香港、臺(tái)灣等地的雙盲、安慰劑對(duì)照研究[15]發(fā)現(xiàn)，每天100 mg拉米夫定口服治療2周，病人血HBV-DNA比基礎(chǔ)值下降97%。每天100 mg拉米夫定治療52周和安慰劑的HBV-DNA陰轉(zhuǎn)率(

拉米夫定特異性抑制HBV聚合酶反轉(zhuǎn)錄活性部位，故毒性極低。迄今為止的臨床試驗(yàn)中不良反應(yīng)的發(fā)生率及嚴(yán)重程度和安慰劑組相比無顯著性差異，試驗(yàn)病人耐受良好。在臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，使用大于臨床治療劑量幾十和幾百倍的拉米夫定對(duì)大鼠、貓和狗的主要器官無毒性。拉米夫定治療中存在的問題：停藥后反跳，膽紅素升高。長期拉米夫定治療，隨著敏感株迅速被抑制，耐藥株會(huì)逐漸出現(xiàn)。對(duì)拉米夫定耐藥的HBV突變主要是HBV聚合酶C區(qū)的酶活性區(qū)YMDD基序的變異，其中蛋氨酸(M)被纈氨酸(V)或異亮氨酸(I)替代。YMDD突變株的復(fù)制能力低于野生株[17]，因此，繼續(xù)應(yīng)用拉米夫定，HBV-DNA的回升往往低于治療前的水平，一般不出現(xiàn)臨床病情加重或惡化。

2.2 阿德福韋(adefovir)

阿德福韋酯在體內(nèi)迅速完全代謝為母體藥物阿德福韋，在細(xì)胞激酶作用下磷酸化為活性代謝產(chǎn)物二磷酸鹽-PMEApp，此產(chǎn)物與酶的自然底物三磷酸脫氧腺苷(dATP)競爭，抑制HBV-DNA聚合酶(HBV逆轉(zhuǎn)錄酶)或通過整合到病毒DNA鏈后使其發(fā)生鏈終止；PMEA本身也可直接整合到HBV-DNA鏈中，形成DNA鏈終結(jié)子[18]，使HBV-DNA鏈停止復(fù)制，因而它具有較強(qiáng)的抑制HBV-DNA復(fù)制的作用。在為期48周的隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照臨床試驗(yàn)(序號(hào)分別為437及438)中阿德福韋口服劑量為10 mg/d (n=700)[19,20]。試驗(yàn)結(jié)果表明，437研究中治療組與對(duì)照組發(fā)現(xiàn)肝活檢病理改善率分別為53%和25%，血清HBV-DNA對(duì)數(shù)值分別下降lg(3.57±1.64)和lg(0.98±1.32)，ALT正常率分別為48%和16%。438研究中治療組與對(duì)照組發(fā)生肝活檢病理改善率分別為64%和35%，血清HBV-DNA對(duì)數(shù)值分別下降lg(3.65±1.41)和lg(1.32±1.25)，ALT正常率分別為72%和29%。HBeAg陰轉(zhuǎn)率在437研究中分別為12%和6%，繼續(xù)給藥阿德福韋至72周，在此期間HBV-DNA下降程度同前48周的治療期相同。同時(shí)437研究中ALT正常率增加，肝移植病人的臨床試驗(yàn)中也取得相似療效。雖然拉米夫定是抑制HBV的有效的核苷類似物，但在長期應(yīng)用之后，病人經(jīng)常出現(xiàn)耐藥性，并且隨用藥時(shí)間的延長發(fā)生耐藥性的比例增加，導(dǎo)致其療效明顯降低[22]。阿德福韋對(duì)于拉米夫定耐藥病毒株有顯著的抑制作用[23]。在迄今為止的實(shí)驗(yàn)中，阿德福韋顯示了良好的安全性及有效性。

2.3 恩替卡韋(entecavir)

恩地卡韋為新型碳環(huán)2-脫氧鳥苷，在體內(nèi)在磷酸激酶的作用下形成活性的三磷酸化合物，拮抗HBV所需要天然底物脫氧鳥苷三磷酸（dGTP），在細(xì)胞內(nèi)作用半衰期為15 h，在人體內(nèi)不被肝細(xì)胞代謝，主要從腎臟排出。恩地卡韋的作用靶點(diǎn)為HBV的逆轉(zhuǎn)錄酶，可以在所有3個(gè)環(huán)節(jié)抑制HBV逆轉(zhuǎn)錄酶活性，包括堿基引導(dǎo)（base priming）、從mRNA前體反轉(zhuǎn)錄成負(fù)鏈以及HBV-DNA正鏈合成。

在體外HBV-DNA轉(zhuǎn)染的HepG32細(xì)胞的藥物抗HBV實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，它是現(xiàn)有抗HBV核苷類似物中作用最強(qiáng)的一種。其抗HBV作用大于LAM 1 000倍，并可降低肝組織中cccDNA量和病毒抗原量。不但對(duì)野毒株具有顯著抑制作用，而且對(duì)基因突變株也具有同樣的抑制作用，并且對(duì)拉米夫定、泛昔洛韋的耐藥病毒株仍然敏感。美國FDA公布的資料表明[24]，對(duì)于核苷類似物處治者，無論HBeAg陰性還是陽性，治療48周后，恩地卡韋治療組患者的組織學(xué)改善比率均顯著高于拉米夫定對(duì)照組；HBV-DNA較基線的降低幅度以及血清ALT復(fù)常率，實(shí)驗(yàn)組均顯著優(yōu)于對(duì)照組[25]。Wong等[26]對(duì)Ⅲ期臨床研究組的部分病例進(jìn)行了肝細(xì)胞內(nèi)HBVcccDNA的檢測，初步結(jié)果顯示治療48周后恩地卡韋降低肝細(xì)胞內(nèi)HBVcccDNA的作用強(qiáng)于拉米夫定。國內(nèi)外對(duì)恩地卡韋的臨床研究結(jié)果相似，在未經(jīng)抗病毒治療的患者中，總的不良時(shí)間發(fā)生率為：恩地卡韋0.1 mg組45%、恩地卡韋0.5 mg組40%，安慰劑組42%，無1例發(fā)生藥物相關(guān)的不良事件[27]。

基本適應(yīng)證為有HBV活動(dòng)性復(fù)制和血清學(xué)或肝組織學(xué)炎癥指標(biāo)的成年慢性乙肝患者。其療程在1年以上，目前對(duì)停藥指征尚無明確規(guī)定。治療期間和停藥后密切監(jiān)察和隨訪[28]。

2.4 其他

其他抗HBV病毒的核苷類似藥物還有泛昔洛韋( famcictovir)、利巴韋林(ribavirin) 、阿糖腺苷(Ara-A)、單磷酸阿糖腺苷(Ara-AMP)，它們通過作用HBV復(fù)制不同的階段來抑制病毒。在臨床驗(yàn)證的核苷類似物新品種還有替諾卡韋(tenofovir）、特必夫定(telbivuding)、克來夫定(clevudine)和恩曲他濱(emtricitabine)等，它們比拉米夫定有相同或更高的抗病毒效果，而且對(duì)拉米夫定耐藥株有效。

3 免疫調(diào)節(jié)藥物

3.1 胸腺因子D

胸腺因子D 對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌的HBsAg和HBeAg有劑量依賴的抑制作用。對(duì)HBsAg的抑制效果要優(yōu)于對(duì)照藥物IFNα-2b，對(duì)HBeAg的抑制效果要略低于對(duì)照藥物IFNα-2b?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白gp90或它的N-末端片段注入乙肝患者，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)免疫應(yīng)答加強(qiáng)，顯示其可能通過增加CTL免疫應(yīng)答增加機(jī)體抗乙肝病毒和原發(fā)性肝癌的能力[29]。

3.2 樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)疫苗

樹突狀細(xì)胞作為抗原提呈細(xì)胞在激發(fā)抗病毒免疫應(yīng)答中起著重要的作用。利用HBV特異蛋白在體外預(yù)先制備的DC而制成的自體疫苗可望成為未來的治療方法[30]。

4 其他藥物

抗肝炎病毒基因治療的藥物或策略包括反義技術(shù)、核酶、基因免疫、干擾肽或蛋白質(zhì)、負(fù)性突變體、單鏈抗體、RNAi等目前正在研發(fā)之中。

5 結(jié)語與展望

抗病毒治療的成敗是慢性肝炎能否治愈的關(guān)鍵，由于乙肝病毒進(jìn)入肝細(xì)胞后產(chǎn)生的cccDNA對(duì)各種藥物的耐藥性，細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA難以清除，造成停藥后，病毒復(fù)制的反彈以及長期藥物治療所導(dǎo)致的乙肝病毒突變株的產(chǎn)生，使得到目前為止，對(duì)HBV的治療尚沒有一種特效的藥物能夠達(dá)到滿意的治療效果。

隨著分子生物學(xué)和重組DNA技術(shù)的迅速發(fā)展，基因治療及基因疫苗的進(jìn)一步研制，清除HBV，徹底治療慢性乙肝將成為一種可能，但總的說來，HBV基因治療的研究仍有相當(dāng)長的路要走。盡管HBV基因治療困難重重，但基因技術(shù)仍為HBV治療帶來了新的希望，通過廣大學(xué)者不懈的努力，相信在不久的將來會(huì)取得一定的突破。

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篇5

吉林省四平市伊通滿族自治縣第一人民醫(yī)院普外科，吉林四平 136000

[摘要] 甲狀腺癌是常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，而且目前我國的甲狀腺癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，雖然我們還沒有掌握甲狀腺癌的病因，但調(diào)查結(jié)果顯示，大部分甲狀腺癌的惡性度并不高，治愈率較高，而且愈后良好，所以對(duì)于甲狀腺癌的早期診斷和治療手段就顯得尤為重要。

[

關(guān)鍵詞 ] 甲狀腺癌；發(fā)病機(jī)制；診斷；治療

[中圖分類號(hào)] R736.1

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A

[文章編號(hào)] 1672-5654（2014）09（c）-0137-02

在人體中，甲狀腺是重要的內(nèi)分泌腺，幫助調(diào)節(jié)機(jī)體的新陳代謝，是發(fā)病率最高的內(nèi)分泌系統(tǒng)中的器官。甲狀腺癌多發(fā)于青壯年，這和一般惡性腫瘤在老年人中多發(fā)不同，且甲狀腺癌的發(fā)病率呈逐年增高的趨勢(shì)。

1導(dǎo)致甲狀腺癌發(fā)生的有關(guān)因素及發(fā)病機(jī)制

2.1導(dǎo)致甲狀腺癌發(fā)生的有關(guān)因素

①良性的甲狀腺疾病。許多甲狀腺癌出現(xiàn)前的甲狀腺癌患者都患有其他的甲狀腺疾病，這些甲狀腺疾病包括有甲狀腺良性結(jié)節(jié)、毒性彌漫性甲狀腺腫、散發(fā)性或地方性甲狀腺腫、自身免疫性慢性甲狀腺炎等。

②射線輻射。甲狀腺癌的發(fā)生和射線輻射有明顯的相關(guān)性，可以看到甲狀腺癌的發(fā)病率在原子彈爆炸后的幸存者中明顯提高，一些兒童為治療良性病癥而接受了頭頸部的放射，這明顯提升了甲狀腺狀癌的患病率，和外放射不同，當(dāng)兒童尤其是10歲以內(nèi)的兒童受到放射性碘131及其它快速衰變的放射性碘的內(nèi)放射，是甲狀腺癌的致病因素，在成人中沒有見到相同結(jié)果。放射線的照射量和甲狀腺腫瘤的發(fā)病呈線性關(guān)系，年齡越小，長時(shí)間接觸射線，都存在著較高的發(fā)病率。

③家族遺傳。在甲狀腺癌患者中，髓樣癌患者有20%存在家族遺傳背景，而甲狀腺濾泡上皮癌很少有家族史。

④甲狀腺癌和碘的關(guān)系。增加碘的攝入量可能會(huì)增加甲狀腺癌的發(fā)病率，能夠使甲狀腺癌組織類型發(fā)生變化，減少了濾泡狀甲狀腺癌的發(fā)病率，增加了狀甲狀腺癌的發(fā)病率。在缺碘和富碘地區(qū)都有較高的甲狀腺癌的發(fā)病率，但是有著不同的組織類型，甲狀腺狀癌是富碘地區(qū)多發(fā)的，濾泡癌和間變癌在缺碘地區(qū)多發(fā)。

⑤激素。其一是性激素，研究顯示甲狀腺癌組織內(nèi)存在雌激素受體、孕激素受體、雌二醇受體、雄激素受體，其中可以肯定的是甲狀腺癌和雌激素受體的聯(lián)系尤其是甲狀腺狀癌與其的聯(lián)系。其二是促甲狀腺激素，促甲狀腺激素受體在正常人和惡變甲狀腺組織中都可以查到，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明甲狀腺的正常代謝、甲狀腺細(xì)胞的生長、DNA的合成都有促甲狀腺激素的刺激，而同樣刺激著濾泡癌細(xì)胞制備FTC133細(xì)胞。

此外，抗甲狀腺藥物可能和甲狀腺癌的發(fā)生有關(guān)。

1.2發(fā)病機(jī)制

和其它的腫瘤類似，甲狀腺癌的發(fā)生、演化和癌基因及抑癌基因有關(guān)。甲狀腺濾泡細(xì)胞腫瘤和結(jié)腸腫瘤，兩者都有一個(gè)多基因參與、多步驟的類似的癌變過程。如果有射線輻射或其他事件影響到甲狀腺濾泡細(xì)胞時(shí)，癌基因會(huì)發(fā)生重排，但是濾泡細(xì)胞的惡性變還不會(huì)出現(xiàn)，當(dāng)癌基因突變發(fā)生在此基礎(chǔ)上時(shí)，會(huì)使克隆性得以進(jìn)一步的發(fā)展，導(dǎo)致出現(xiàn)了惡性變，狀甲狀腺癌便形成了。如果此時(shí)出現(xiàn)抑癌基因的缺失，就會(huì)使未分化癌由狀甲狀腺癌轉(zhuǎn)變而形成?；虮磉_(dá)的改變和DNA甲基化異常會(huì)在癌變的過程中出現(xiàn)。在甲狀腺癌發(fā)病的過程中，除相關(guān)的癌基因或抑癌基因外，以血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子家族為首的有一些細(xì)胞因子同樣在起作用。血管生成因子中以血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子為代表，直接促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長或使血管的通透性增加，基質(zhì)兩種方式提供給了成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞生長，促進(jìn)了腫瘤血管的形成。

2甲狀腺癌的分類

①狀癌。是一種惡性上皮細(xì)胞腫瘤，由濾泡細(xì)胞分化、有典型的濾泡結(jié)構(gòu)以及核特征性改變，可分為混合性甲狀腺癌和單純性狀癌。這是臨床最常見的類型，其惡性程度輕，分化度高。大多數(shù)的病例表現(xiàn)為有一無痛腫塊在甲狀腺區(qū)，而較少出現(xiàn)其他癥狀，由于它病變的過程緩慢，有很長的病程，致使就診的時(shí)間被延誤，病程都有5~10年。有的甲狀腺原發(fā)灶小，不易發(fā)現(xiàn)，形成隱癌。有的形成囊性腫物，被誤診為先天性囊腫。

②濾泡細(xì)胞癌。有濾泡細(xì)胞分化的惡性上皮性腫瘤，沒有狀癌的診斷特征，較狀癌少見，其惡性度高于狀癌，和甲狀腺腺腫相似應(yīng)細(xì)致鑒別。在包膜外的腺體組織或血管中常有癌細(xì)胞侵入，因此區(qū)別濾泡狀腺瘤和腺癌的一個(gè)重要依據(jù)是看包膜是否完整。其生長緩慢病程長，多為單個(gè)有時(shí)也為多個(gè)原發(fā)灶。少見單純的甲狀腺濾泡狀癌，多為夾雜狀癌而形成的混合類型。

③未分化癌。在臨床較少見，是高度惡性的腫瘤，對(duì)鄰近的組織侵犯迅速，并且出現(xiàn)全身廣泛轉(zhuǎn)移。瘤體生長迅速，無完整包膜，廣泛浸潤生長。巨大的甲狀腺腫塊可使頸部嚴(yán)重畸形、疼痛，會(huì)引起聲音嘶啞、吞咽困難、呼吸窘迫。患者會(huì)因腫瘤壓迫氣管而引起窒息死亡。

④髓樣癌。是發(fā)生在甲狀腺濾泡旁細(xì)胞的癌變，屬于中度惡性腫瘤，在間質(zhì)中存在淀粉樣物質(zhì)沉著，所以也稱其為淀粉樣間質(zhì)髓樣癌。分為散發(fā)性，其病灶位于一側(cè)腺葉；和家族性，常發(fā)生在雙側(cè)腺葉。其質(zhì)地較硬、呈圓形或橢圓形結(jié)節(jié)，沒有狀及濾泡狀癌的特征，一般無包膜，易侵犯甲狀腺內(nèi)淋巴管。

3甲狀腺癌的診斷

3.1病史和癥狀方面

早期的甲狀腺癌大多沒有明顯癥狀，對(duì)于任何年齡患者出現(xiàn)的甲狀腺腫大或結(jié)節(jié)，都要重視起來。要仔細(xì)詢問患者的病史，是否有家族史、頭頸部及上縱隔放射史，碘的攝入情況，是否有腹瀉、心悸、面色潮紅、血鈣降低等甲狀腺髓樣癌的癥狀。頸部觸診要仔細(xì)捫診腫塊的形態(tài)，通常的癌結(jié)節(jié)是圓形或橢圓形，呈現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)，表面不平，沒有顯著的壓痛感，質(zhì)硬，出現(xiàn)組織粘連而活動(dòng)度差或固定，注意淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移出現(xiàn)的淋巴結(jié)腫大。

3.2實(shí)驗(yàn)室診斷

包含甲狀腺功能檢查，其中最主要的是對(duì)血清TT3、TT4、TSH、FT3和FT4的測定，除此之外有時(shí)還需要對(duì)TPOAb、TGAb或TSAb進(jìn)行檢測。通常，甲狀腺癌癥患者是不會(huì)存在甲狀腺功能異常的現(xiàn)象，但也不排除有些甲狀腺癌會(huì)伴隨甲狀腺功能亢進(jìn)的情況。當(dāng)腫瘤發(fā)生出血或壞死的情況時(shí)，患者也有可能出現(xiàn)一過性甲亢，甲狀腺功能檢查也有助于醫(yī)生的診斷；還包含血清甲狀腺球蛋白測定，這是診斷甲狀腺癌癥的必要必要手段，但也要注意，有時(shí)候良性甲狀腺疾病患者也會(huì)出現(xiàn)血清Tg水平異常的現(xiàn)象，而且如果甲狀腺癌癥患者存在正常甲狀腺組織這時(shí)其血清Tg水平也會(huì)升高，但當(dāng)這些正常的甲狀腺組織被消除后，也就是已經(jīng)治愈的患者體內(nèi)應(yīng)該只存在低濃度或檢測不出Tg，這時(shí)血清Tg的檢測主要用于疾病隨訪或判斷分化型甲狀腺癌癥患者的復(fù)發(fā)；除些之外血清CT水平的測定也是術(shù)前診斷的一個(gè)必要環(huán)節(jié)，它將預(yù)示著腫瘤的發(fā)生、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)變。

3.3影像學(xué)檢查

①B超和彩色多普勒超聲檢查是一種簡便、快捷、無損傷而且可重復(fù)對(duì)比的一種檢查方法，隨著科技的不斷發(fā)展使彩色多普勒得到了廣泛的應(yīng)用，這也大大提高了診斷甲狀腺癌癥的準(zhǔn)確率。在檢查時(shí)，超聲圖像存在邊界形態(tài)欠規(guī)則，無包膜現(xiàn)象，同時(shí)腫塊呈現(xiàn)低回聲、后方回聲衰減現(xiàn)象，內(nèi)部還出現(xiàn)細(xì)小的鈣化點(diǎn)現(xiàn)象，而且內(nèi)部血流供應(yīng)豐富，還存在高阻力型血供現(xiàn)象，有時(shí)還存在勁部轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)腫大現(xiàn)象等其中四種現(xiàn)象同時(shí)出現(xiàn)時(shí)，則檢查者患甲狀腺部癌的機(jī)率較大。

②CT掃描能夠清楚地顯示檢查者的甲狀腺，當(dāng)其甲狀腺組織發(fā)生變化或癌變時(shí)，其組織中的含碘量將呈下降趨勢(shì)，這表明檢查者的儲(chǔ)碘細(xì)胞已經(jīng)被破壞，在CT圖像中也會(huì)有相應(yīng)的表現(xiàn)，其病變區(qū)呈現(xiàn)低密度區(qū)，特別是螺旋CT掃描它能夠快速地形成高質(zhì)量三維圖像，這也是判斷甲狀腺病變的一種簡單、有效的手段。

③還可以通過MRI多方位成像來斷定腫瘤的具置，這種方法具有掃描面廣、軟組織分辨率高的優(yōu)點(diǎn)，能夠突出顯示出腫瘤組織的信號(hào)變化，通過用于監(jiān)測術(shù)后甲狀腺患者的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

④核素顯像是應(yīng)用特殊的顯像裝置通過探測放射性碘所發(fā)出的Y射線分布情況，形成核素分布圖，這樣就可以了解到患者甲狀腺的基本情況。核素檢查常用藥物也包括多種，其中由于99Tc-MIBI的顯像方法簡單、成像質(zhì)量好而且對(duì)檢查者應(yīng)用的輻射劑量少，使其成為臨床應(yīng)用較為廣泛的一種甲狀腺顯像手段。

⑤FNAB是術(shù)前診斷甲狀腺疾病的一種最好的檢查方法，而且對(duì)于檢查者來說其創(chuàng)傷較傳統(tǒng)組針穿刺要小，較容易被患者接受。目前臨床診斷時(shí)通常會(huì)通過B超引導(dǎo)來進(jìn)行FNAB檢查，這樣不僅能夠有效地減少并發(fā)癥的發(fā)生還能夠提高檢查的成功率。

4甲狀腺癌的治療

4.1手術(shù)治療

不同類型的甲狀腺癌其采取的治療方法不同，大部分學(xué)者認(rèn)為分化型甲狀腺癌應(yīng)該以手術(shù)治療為主，其他治療方法輔助治療，要根據(jù)患者的實(shí)際情況，當(dāng)診斷患者無明顯手術(shù)禁忌證時(shí)應(yīng)及時(shí)對(duì)患者的原發(fā)灶和頸部轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行徹底的清除，盡量徹底地根治腫瘤。同時(shí)在手術(shù)中要對(duì)患者的頸部淋巴結(jié)進(jìn)行仔細(xì)的探查，當(dāng)發(fā)現(xiàn)為轉(zhuǎn)移陽性者時(shí)要對(duì)其進(jìn)行及時(shí)的清除，而當(dāng)檢測患者頸淋巴結(jié)呈陰性時(shí)要根據(jù)實(shí)際情況來決定是否實(shí)施清除術(shù)。隨著科學(xué)的不斷發(fā)展，由于內(nèi)鏡手術(shù)擁有切口小、術(shù)后并發(fā)癥機(jī)率小等優(yōu)勢(shì)逐漸引起醫(yī)學(xué)界的關(guān)注和重視；對(duì)于髓樣癌患者也是以手術(shù)治療首選，由于髓樣癌的轉(zhuǎn)移早、影響大，所以早期診斷和徹底手術(shù)治療顯得尤為重要，對(duì)于病灶多發(fā)或范圍較大的患者建議為其實(shí)施甲狀腺全切或次錢切除術(shù)，同時(shí)要根據(jù)患者頸部淋巴結(jié)果的實(shí)際情況來判斷是否實(shí)施淋巴結(jié)清除手術(shù)。對(duì)于未分化的甲狀腺癌由于其病情發(fā)展比較迅速而且其惡性程度也較高，大多發(fā)現(xiàn)時(shí)患者已處于晚期，運(yùn)用手術(shù)通常會(huì)在短期內(nèi)復(fù)發(fā)，很難徹底根治，所以通常在術(shù)后還要采取放化療的綜合治療法。

4.2藥物治療

狀癌和濾泡狀癌的部分腫瘤細(xì)胞內(nèi)存在促甲狀腺激素受體，應(yīng)用甲狀腺激素抑制垂體產(chǎn)生促甲狀腺激素，有可能抑制這兩種類型甲狀腺癌的生長。使用新鮮甲狀腺提取的甲狀腺片有明顯的蓄積作用；左旋甲狀腺素鈉的使用要根據(jù)個(gè)體的耐受程度進(jìn)行差異化給藥。

4.3放射性治療

使用放射性碘131來治療分化型甲狀腺癌，清除術(shù)后殘留的甲狀腺組織，針對(duì)轉(zhuǎn)移灶要進(jìn)行多次階段性的大劑量碘131治療，對(duì)手術(shù)治療狀癌和濾泡狀癌不耐受的患者可直接選用碘131治療。

4.4基因治療

對(duì)患者細(xì)胞中有缺陷的基因使用DNA重組技術(shù)進(jìn)行修復(fù)，使細(xì)胞正常的功能得以恢復(fù)，實(shí)現(xiàn)疾病的治愈。目前甲狀腺癌的基因治療策略有，重新表達(dá)NIS，使攝碘能力得到大幅提高，提升碘131的治療效果；免疫基因治療，導(dǎo)入基因使腫瘤細(xì)胞的免疫原性增強(qiáng)，或使免疫細(xì)胞的抗原呈遞和識(shí)別能力得到提高，致使腫瘤細(xì)胞的殺傷能力得到提高，實(shí)現(xiàn)預(yù)防或治療的目的；自殺基因?qū)胫委?，將其?dǎo)入細(xì)胞后，會(huì)產(chǎn)生有毒性的物質(zhì)，使DNA的合成受到抑制，達(dá)到破壞腫瘤細(xì)胞的目的。

[

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篇6

達(dá)，促進(jìn)HSC-3細(xì)胞的凋亡。方法 合成針對(duì)survivin基因的小干擾RNA（siRNA），轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長期的HSC-3細(xì)胞。

采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測HSC-3細(xì)胞中survivin mRNA的表達(dá)，MTT法測定細(xì)胞活性，tunnel分析和流式細(xì)胞術(shù)檢測HSC-3細(xì)胞的凋亡，并設(shè)陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。結(jié)果 轉(zhuǎn)染siRNA組survivin mRNA的表達(dá)明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組；MTT法測定細(xì)胞活性，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組沒有明顯差別，但siRNA組的細(xì)胞活性明顯下降；tunnel分析顯示，轉(zhuǎn)染siRNA組的凋亡細(xì)胞明顯多于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組；流式細(xì)胞術(shù)分析，轉(zhuǎn)染siRNA組的凋亡率（24.99%±1.33%）明顯高于陰性對(duì)照組（1.24%±0.13%）和空白對(duì)照組（0.10%±0.02%）。結(jié)論 采用siRNA沉默survivin基因能促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的凋亡，survivin siRNA基因治療有可能成為口腔鱗狀細(xì)胞癌治療的新技術(shù)。

[關(guān)鍵詞] 口腔鱗狀細(xì)胞癌； RNA干擾； survivin基因； 凋亡

[中圖分類號(hào)] R 730.5 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.04.004

Effects of survivin gene silencing by small interfering RNA on apoptosis of oral squamous cell carcinoma Liu Shifeng， Liang Xinhua， Bao Chongyun. （State Key Laboratory of Oral Diseases， West China Hospital of Stoma-tology， Sichuan University， Chengdu 610041， China）

[Abstract] Objective To apply the small interfering RNA（siRNA） targeting survivin to inhibit expression of sur-

vivin gene in HSC-3 oral squamous cell carcinoma and to increase the apoptosis of HSC-3 cells. Methods siRNA was synthesized and transfected into oral squamous cell carcinoma HSC-3 cells. Compared with negative control group and blank control group， semi-quantitive reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR） was used to detect

survivin mRNA. Cellular viability was detected by MTT and HSC-3 cell apoptosis was determined by tunnel and flow cytometry. Results Expression of survivin mRNA was decreased significantly in siRNA group compared with negative control group and blank control group. Cellular viability was not affected in negative control group and blank control group， but cellular viability in siRNA group was significantly decreased. As to the cellular apoptosis rate， the trans-fected group（24.99%±1.33%） was significantly higher than negative control group（1.24%±0.13%） and blank control

group（0.10%±0.02%）. Conclusion Survivin gene silenced by siRNA might promote apoptosis of oral squamous cell

carcinoma. Survivin siRNA gene therapy would become a new target point for oral squamous cell carcinoma.

[Key words] oral squamous cell carcinoma； RNA interference； survivin gene； apoptosis

Survivin是一種核穿梭蛋白，在細(xì)胞核中為染色體信使蛋白，在細(xì)胞質(zhì)中是微管結(jié)合蛋白，正常表達(dá)于細(xì)胞周期的G2/M期，對(duì)細(xì)胞周期有調(diào)節(jié)的作用。若Survivin過度表達(dá)，可使細(xì)胞迅速通過G2/M期，快速進(jìn)入有絲分裂期，使細(xì)胞異常增殖，在腫瘤的發(fā)展中起著重要作用[1-3]。RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一種沉默基因表達(dá)

的新方法，其原理是以雙鏈RNA為中介降解具有相同序列的RNA。

Survivin在正常成人分化成熟的組織中表達(dá)缺失，在多種常見惡性腫瘤中的表達(dá)穩(wěn)定上調(diào)，并與腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)[4]。Survivin主要通過直接抑制caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游的終末子caspase-3和caspase-7的活性從而發(fā)揮抗凋亡作用[2-3，5]，survivin基因可通過加快腫瘤細(xì)胞由G1期到S期的轉(zhuǎn)換，并使腫瘤細(xì)胞在

G2/M期逃避對(duì)凋亡的識(shí)別而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和分化。Lo Muzio等[6]報(bào)道，Survivin在正常口腔組織

中不表達(dá)，而在大多數(shù)口腔鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)，因此本研究采用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）技術(shù)，通過干擾survivin基因的表達(dá)來治療口腔鱗狀細(xì)胞癌，為survivin在口腔癌治療中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株HSC-3，由口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（四川大學(xué)）提供；LipofectamineTM 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑和Trizol試劑（美國Invitrogen公

司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和聚合酶鏈反應(yīng)試劑（美國Prome-ga公司），siRN段（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HSC-3細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 survivin siRNA序列轉(zhuǎn)染

survivin siRNA序列實(shí)驗(yàn)分3組?？瞻讓?duì)照組：即正常組；陰性對(duì)照組：即轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照的siRNA序列；實(shí)驗(yàn)組（siRNA組）：即成功轉(zhuǎn)染survivin siRNA序列。收集HSC-3細(xì)胞（細(xì)胞密度為每毫升5×105個(gè)）鋪在6孔板內(nèi)過夜，取5 μL siRNA和100 μL不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基共同孵育5 min，同時(shí)取5 μL LipofectamineTM 2000 siRNA和100 μL不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基孵育5 min，然后再把這兩份混合孵育20 min。把6孔板中的培養(yǎng)基換成每孔800 μL不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，加入上述混合液，4 h后換液，48 h后做后續(xù)分析。

1.4 半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcrip-

tion-polymerase chain reaction，RT-PCR）測定

survivin mRNA的表達(dá)

收集處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞（細(xì)胞密度為每毫升1×106個(gè)），按Trizol Rengent說明提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳初步評(píng)價(jià)RNA質(zhì)量。按Promega兩步法試劑盒提供的說明書進(jìn)行RT-PCR，測定survivin mRNA的相對(duì)表達(dá)量。survivin上游引物序列為5’-CAGG-CGGTGATGTGGATC-3’，下游引物序列為5’-GTT-TGGCTI’GCTGGTCTC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為398 bp；內(nèi)參照β-actin的上游引物序列為5’-ATCTGGCACCACA-CCT-3’，下游引物序列為5’-CGTCATACTCCTGC-TT-3’，產(chǎn)物大小為838 bp。

1.5 MTT法檢測細(xì)胞活性

取HSC-3細(xì)胞（細(xì)胞密度為每毫升5×103個(gè)）鋪在96孔板內(nèi)，過夜后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后加入MTT，用酶標(biāo)儀在570 nm下檢測吸光度值。

1.6 tunnel分析和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

采用常規(guī)方法制備細(xì)胞爬片，用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇固定10 min，PBS沖洗3次，每次3 min；根據(jù)tunnel試劑盒說明，觀察細(xì)胞凋亡情況。通過流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行單因素方差分析及兩個(gè)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果見圖1：轉(zhuǎn)染紅色熒光標(biāo)記的siRNA 6 h后，熒光顯微鏡下觀察，80%的細(xì)胞都發(fā)紅色熒光，說明多數(shù)細(xì)胞都已經(jīng)轉(zhuǎn)染了survivin siRNA。

圖 1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 熒光顯微鏡 × 10

Fig 1 Cell transfection fluorescence microscope × 10

2.2 半定量RT-PCR檢測細(xì)胞中survivin mRNA的表

達(dá)情況

半定量RT-PCR檢測細(xì)胞中survivin mRNA的電泳結(jié)果見圖2，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)表達(dá)量分別為0.65、0.64和0.05。實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染siRNA后，survivin mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（P

A：空白對(duì)照組；B：陰性對(duì)照組；C：實(shí)驗(yàn)組。

圖 2 干擾效率的測定

Fig 2 Determination of the interference efficiency

2.3 MTT法檢測細(xì)胞生長活性

MTT法測定結(jié)果見圖3。

圖 3 細(xì)胞活性的測定

Fig 3 Determination of the cellular viability

陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞生長未受影響，而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長受到明顯抑制（圖3），細(xì)胞活性下降至47.16%±3.19%。

2.4 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

tunnel分析結(jié)果見圖4：與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染siRNA后，細(xì)胞中出現(xiàn)很多綠色亮點(diǎn)，表明有大量的細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率分別為24.99%±1.33%、1.24%±0.13%和0.10%±0.02%，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率明顯增加，高于其他兩組（P

沉默survivin的表達(dá)可增加細(xì)胞凋亡。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)成功轉(zhuǎn)染了siRNA，并成功干擾了survivin基因的表達(dá)；采用MTT法測定細(xì)胞活性發(fā)現(xiàn)，干擾survivin基因可以降低口腔鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞活性；tunnel和流式細(xì)胞術(shù)測定結(jié)果可見，干擾survivin基因可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。

口腔鱗狀細(xì)胞癌是口腔最常見的惡性腫瘤。目前，誘導(dǎo)凋亡已成為癌癥研究中的基本工具，可以據(jù)此建立新的抗癌策略。凋亡或程序性細(xì)胞死亡是一種基因控制的過程，它保持有機(jī)體形態(tài)的發(fā)生發(fā)展[7]，通過消除不必要的或者危險(xiǎn)的細(xì)胞來保持生物

體的動(dòng)態(tài)平衡。誘導(dǎo)凋亡的方法有很多，本研究采用RNA干擾的方法，經(jīng)過tunnel和流式細(xì)胞術(shù)檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾survivin基因可以明顯誘導(dǎo)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的凋亡。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員。1997年由Ambrosini等[8]在人類基因組數(shù)據(jù)庫的雜交篩選中

首先分離出來。與凋亡抑制蛋白家族的其他成員一樣，Survivin有桿狀病毒重復(fù)結(jié)構(gòu)，是其發(fā)揮抗凋亡作用的必需結(jié)構(gòu)[9]。Survivin的組織分布有特異性，

僅表達(dá)于胚胎和發(fā)育期的胎兒組織，終末分化的成人組織（胸腺、生殖腺除外）不表達(dá)，而在大多數(shù)腫瘤組織中均有表達(dá)[10]。研究[6]證實(shí)，survivin基因在口腔鱗狀細(xì)胞癌中高度表達(dá)，并且明顯高于正常黏膜組織。有文獻(xiàn)[11-12]報(bào)道，survivin可能在腫瘤細(xì)胞凋

亡抑制的過程中發(fā)揮重要作用。survivin基因持續(xù)高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞表型的惡性轉(zhuǎn)化，可能是某些惡性腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵因素。綜合上述研究的結(jié)果，本研究選擇survivin作為本實(shí)驗(yàn)的靶基因。

RNAi作為近年來發(fā)展起來的一種在mRNA水平上誘導(dǎo)特異性序列基因沉默的基因調(diào)控技術(shù)，可作為哺乳動(dòng)物基因功能研究的工具，在功能基因組學(xué)研究領(lǐng)域得到越來越多的重視。近年的研究也表明，利用RNAi技術(shù)是使survivin基因沉默的有效手段。Kappler等[13]應(yīng)用siRNA技術(shù)分別降低5種具有野生型及突變p53基因的肉瘤細(xì)胞的survivin表達(dá)，結(jié)果提示，不論肉瘤細(xì)胞是否表達(dá)野生型p53基因，靶向survivin的siRNA均可以將其特異性殺滅。

Williams等[14]發(fā)現(xiàn)，無論是體外的結(jié)腸癌細(xì)胞

HCT116還是體內(nèi)的HCT116異種移植物，應(yīng)用RNAi技術(shù)阻斷survivin基因表達(dá)可顯著抑制其生長。目前應(yīng)用RNAi靶向survivin來促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡的研究還較少。本研究發(fā)現(xiàn)，阻斷survivin基因可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞的生長和增殖，提示survivin是治療口腔鱗狀細(xì)胞癌極有潛力的腫瘤分子標(biāo)記和治療靶點(diǎn)；但是RNAi如何有效應(yīng)用于人體內(nèi)干擾survivin的表達(dá)以治療口腔鱗狀細(xì)胞癌及預(yù)防復(fù)發(fā)尚需進(jìn)一步研究。通過RNAi靶向包括survivin在內(nèi)的多個(gè)靶點(diǎn)，從多基因角度治療口腔鱗狀細(xì)胞癌也是今后研究工作的重點(diǎn)。

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篇7

1歷史回顧

早在1847年Virchow首次報(bào)道了一家數(shù)人患有多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤病。到1849年Smith對(duì)神經(jīng)纖維瘤的臨床癥狀作了較為全面的描述。隨后德國內(nèi)科醫(yī)生Von Recklinghausen于1882年通過病理學(xué)研究對(duì)其組織學(xué)特點(diǎn)及其與神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)系作了詳細(xì)的闡述。因此,本病也稱Von Recklinghausen病。1896年又加入色素變化的描述,以后Yakovler及Guthrie(1931)、Lichtesfein(1949)、Growe、Schull(1956)等也從臨床、病理、病因等方面作了全面研究。Lisch(1937)又注意到眼睛有錯(cuò)構(gòu)結(jié)節(jié),1964年,Crowe報(bào)道了腋窩雀斑痣,但直到1981年本病極為常見的Lisch結(jié)節(jié)才被人們所認(rèn)識(shí)。最近確認(rèn)此結(jié)節(jié)在20歲以上的神經(jīng)纖維瘤I型患者中的出現(xiàn)率為100%[1]。

2病因病理

本病是中胚層和神經(jīng)外胚層的病變,為常染色體顯性遺傳,現(xiàn)已明確,神經(jīng)纖維瘤病I型和Ⅱ型的遺傳缺陷在不同染色體上。NF1是第17對(duì)染色體,NF2是第22對(duì)染色體[2]。本病主要是由于神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)締組織增生所引起的各種腫瘤,包括錯(cuò)構(gòu)瘤。其典型病理改變是由棱形細(xì)胞組成的神經(jīng)纖維瘤,腫瘤成分主要是增生的神經(jīng)膠質(zhì)和雪旺氏細(xì)胞。最常見的腫瘤為聽神經(jīng)纖維瘤。且多為雙側(cè),也可發(fā)生三叉神經(jīng)纖維瘤、視神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膠質(zhì)瘤及多發(fā)性腦膜瘤等。椎管內(nèi)腫瘤好發(fā)于脊神經(jīng)根及馬尾部。皮膚及皮下神經(jīng)纖維瘤多位于真皮和侵入皮下,并累及結(jié)締組織。神經(jīng)纖維瘤一般不會(huì)形成神經(jīng)纖維肉瘤。在一組病例研究中,678例患者有21例出現(xiàn)神經(jīng)纖維肉瘤,而且在伴有叢狀神經(jīng)瘤或皮下神經(jīng)瘤時(shí)最常見。

有學(xué)者將神經(jīng)纖維瘤分為5個(gè)病理類型:I型(局限性神經(jīng)纖維瘤病):以叢狀神經(jīng)瘤為特征,即以某一區(qū)域的神經(jīng)干扭曲、增生過長、伴有結(jié)締組織及神經(jīng)組織增生為主;Ⅱ型(全身性皮膚神經(jīng)纖維瘤病):以多發(fā)性皮膚結(jié)節(jié)及皮膚色素斑為主要特征;Ⅲ型(深部周圍神經(jīng)干的神經(jīng)瘤,神經(jīng)纖維瘤和神經(jīng)鞘瘤):以深部神經(jīng)干受累為特征。IV型(顱神經(jīng)干的神經(jīng)瘤、神經(jīng)鞘瘤)常與Ⅲ型并存,V型(并發(fā)腦瘤和腦瘤樣變)多與上述各型并存[3]。

3分子遺傳學(xué)水平

NF1基因于1990年被克隆出來,定位于17q11.2,其全長約350kb,包含60個(gè)外顯子,可以轉(zhuǎn)錄形成ll～l3kb的mRNA,編碼2 818個(gè)氨基酸的蛋白,稱之為神經(jīng)纖維蛋白。NFl基因的腫瘤抑制功能被認(rèn)為主要是依賴它的下調(diào)原癌基因ras而實(shí)現(xiàn)的。NFl基因表達(dá)的丟失導(dǎo)致神經(jīng)纖維素RasGAP功能的喪失,最終導(dǎo)致Ras活性的增加,細(xì)胞增生以及腫瘤的形成[4]。

NF2的遺傳學(xué)特征不同于NF1,1993年Rouleau、Troffater同時(shí)報(bào)道了NF2基因的克隆,前者在D22S212和D22S32之間用位置克隆策略克隆出NF2基因,后者在D22S1和D22S26之間發(fā)現(xiàn)NF2基因。NF2基因的位點(diǎn)在22號(hào)染色體長臂。現(xiàn)已將NF2基因定位于22q12,并認(rèn)為NF2基因?yàn)槟[瘤抑制基因(根據(jù)基因?qū)?xì)胞生長、分化的影響分兩類:對(duì)生長有正性影響的稱原癌基因,有負(fù)性影響的稱腫瘤抑制基因)。NF2基因定位于22號(hào)染色體長臂1區(qū)二帶(22q12),含17個(gè)外顯子,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為4.5kb mRNA,編碼一個(gè)含595個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),命名Schwannomin或Merlin。NF2的臨床表現(xiàn)有兩種:Wishart型,早期發(fā)病(20歲),癥狀較輕且局限于顱內(nèi)[5]。

4激素與神經(jīng)纖維瘤的發(fā)生

NF1患者神經(jīng)纖維瘤的外顯有明顯的年齡依從性,即青春期后出現(xiàn),成年期明顯增加,晚年則停止或減少。Cunha等[6]也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象,認(rèn)為體內(nèi)激素水平影響著NF1患者神經(jīng)纖維瘤的發(fā)生發(fā)展。激素影響的根據(jù)還不清楚,有些研究者通過研究證實(shí)了NF1患者神經(jīng)纖維瘤組織中有生長激素受體的表達(dá),由于生長激素在其他一些良惡性腫瘤中有增生活性,可通過啟動(dòng)各種信號(hào)途徑如STATS、Ras、MAP激酶、IRS等促進(jìn)細(xì)胞增生,所以生長激素在NF1散發(fā)腫瘤的生長調(diào)控中可能起一定作用。神經(jīng)纖維瘤的這種外顯規(guī)律也與體內(nèi)雌激素分泌的生理特征有明顯的相關(guān)性,提示體內(nèi)雌激素水平的變化可能也參與和介導(dǎo)了神經(jīng)纖維瘤的形成和發(fā)展[7]。宮洪基(1985)曾報(bào)道l例妊娠6次的婦女,每妊娠一次,腫瘤的數(shù)目就增多1次,首次妊娠前只有10多個(gè),而第6次妊娠已達(dá)1 000多個(gè)。國內(nèi)報(bào)道數(shù)目最多的是喻昭(1985)報(bào)道的l例患者,多達(dá)5 285個(gè)。國外報(bào)道有達(dá)到9 212個(gè)之多者。其他的皮膚腫瘤如血管瘤也可見于本病。

5臨床表現(xiàn)

神經(jīng)纖維瘤病有許多表現(xiàn),致使其診斷和治療對(duì)普外科和血管外科醫(yī)師等提出了難題,約1O%病例有Sylvian管狹窄引起顱內(nèi)畸形,如阻塞性腦積水。NF1型有25%～3O%侵犯頭頸部,需要詳盡檢查,包括神經(jīng)系統(tǒng)和影像學(xué)檢查。

5.1 胃腸道表現(xiàn):Ghrist在11年內(nèi)收集了29例NF病例,其中發(fā)現(xiàn)部分病例有胃腸道癥狀。Davis統(tǒng)計(jì)11%～25%NF病例有胃腸道侵犯,但不足5%的病例有伴隨癥狀。從組織學(xué)上,NF病的胃腸道表現(xiàn)有3種:腸道神經(jīng)組織的增生、基質(zhì)腫瘤、十二指腸或壺腹周圍內(nèi)分泌腫瘤。增生型主要表現(xiàn)為便秘,基質(zhì)腫瘤多位于胃和空腸,多良性。

5.2 血管病變:NF1引起血管病變的病因是由于血管壁異常細(xì)胞的過度增生導(dǎo)致纖維的增生,平滑肌消失,而后發(fā)生纖維變性和平滑肌結(jié)節(jié)的增生。NF1患者血管的病理改變?nèi)Q于其管徑的大小,大血管為壁內(nèi)雪旺氏細(xì)胞纖維化所致,小血管是由于血管中膜層發(fā)育不全。NF1并發(fā)血管改變使血管中膜平滑肌減少,彈性成分降低,管壁脆性增加,支持、連接功能下降,在血管內(nèi)血流沖擊和周圍組織牽拉下產(chǎn)生微小動(dòng)脈瘤及動(dòng)靜脈瘺。病變繼續(xù)發(fā)展,小動(dòng)脈瘤破裂、膨出就可形成大的假性動(dòng)脈瘤。動(dòng)脈瘤、動(dòng)靜脈畸形可破裂,嚴(yán)重者會(huì)發(fā)生失血性體克并危及生命。Reubi[8]最早描述了NFl的動(dòng)脈病變,并認(rèn)為所有NF1患者均有不同程度的血管病變,其特征性的改變包括血管內(nèi)膜的向心性生長、彈性纖維的破裂和結(jié)節(jié)的增生。綜上所述,NF1是累及全身多系統(tǒng)、多器官的疾病,如并發(fā)血管病變,可出現(xiàn)血管狹窄、閉塞、動(dòng)脈功能不全、動(dòng)脈瘤、假性動(dòng)脈瘤、動(dòng)靜脈畸形或動(dòng)靜脈瘺等并發(fā)癥,而這往往被臨床醫(yī)生所忽視。這些可引起嚴(yán)重的臨床后果,如發(fā)生血管破裂,患者的死亡率較高。血管造影在NF1并發(fā)血管病變?cè)\斷中具有重要作用,往往在患者癥狀出現(xiàn)前就具有高度提示性。NF1引起血管病變的血管造影特征為血管節(jié)段性狹窄,狹窄處近端漸進(jìn)性膨大,呈漏斗狀改變,血管壁光滑[9]。目前,對(duì)于預(yù)防和治療NF1并發(fā)的血管病變尚缺乏行之有效的方法。

5.3 心胸表現(xiàn):有人認(rèn)為NF伴有心血管畸形,如先天性心臟缺損,有報(bào)道心血管畸形的發(fā)病率為2%,且有肺動(dòng)脈狹窄發(fā)生的傾向性。NF很少直接侵及心臟本身,但叢狀NF可以侵及心臟及其周圍結(jié)構(gòu)。胸內(nèi)非心臟腫瘤是胸腔中NF的常見表現(xiàn),引起氣促、吞咽困難,侵犯肺或腐蝕肋骨。迷走神經(jīng)受侵者,尤其是左側(cè),可引起心律不齊和猝死。自發(fā)性氣胸是致命性并發(fā)癥,也有發(fā)生血胸者。

5.4 腫瘤:NF患者?；加心[瘤,顱內(nèi)腫瘤最常見的是視神經(jīng)膠質(zhì)瘤(15%～2O%),顱外腫瘤則為皮膚腫瘤,即發(fā)生于皮膚及皮下的多發(fā)性皮膚神經(jīng)纖維瘤或纖維性軟瘤。在兒童期即可出現(xiàn),到青春期后進(jìn)展明顯,大多數(shù)分布于軀干、四肢和面部。腫瘤為一圓頂狀軟結(jié)節(jié),有蒂或無蒂,表面光滑,皮膚完好,顏色為正常膚色或淡紅色、粉紅色、黃褐色,位于真皮或皮內(nèi)。位于皮內(nèi)的腫物可隆起呈囊樣,用手壓之下陷放手后復(fù)平,有疝樣感,一般無疼痛及壓痛。但位于淺表神經(jīng)的神經(jīng)纖維瘤可有疼痛,偶有壓痛,甚至出現(xiàn)沿神經(jīng)干的疼痛和感覺異常。腫瘤的大小不一,一般為數(shù)毫米到一厘米或更大,且具有隨年齡增加而增大的傾向。兒童NF患者的惡性腫瘤有星狀細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、惡性周圍神經(jīng)鞘瘤和白血病。但多數(shù)腫瘤是良性的,比常人有更大的惡變傾向性,發(fā)生第二種惡性腫瘤的機(jī)會(huì)也高。已知NF基因是抑癌基因,一旦突變易發(fā)生惡性腫瘤,有報(bào)道其發(fā)生率高于人群4～5倍。在NF的最顯著腫瘤是特征性神經(jīng)纖維瘤,有分散的和叢狀兩種。

5.5 叢狀神經(jīng)纖維瘤:叢狀神經(jīng)纖維瘤(Plexiform neurofibroma)是神經(jīng)干及其分支的彌漫性神經(jīng)纖維瘤,約占NF的30%,常伴有皮膚和皮下組織過度增生,表面皮膚增厚、褪色。并引起頸、面、唇、舌、頸后或一個(gè)肢體的彌漫性肥大。質(zhì)軟而有彈性,可自由移動(dòng),又稱橡皮病樣多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤(Elephantiasis Neurofibromatosis)。多在兒童期出現(xiàn),逐漸增大,可有壓痛。腫瘤數(shù)目不等,多在數(shù)個(gè)到數(shù)十個(gè)。多者可達(dá)數(shù)百個(gè),且多隨年齡的增長而增多,可受妊娠的影響,可惡化成惡性周圍神經(jīng)鞘瘤,生長迅速,并有壓痛。主張?jiān)诓≡钶^小時(shí)切除,但徹底切除常不可能,易復(fù)發(fā)。

5.6 牛奶咖啡斑(Cafe-au-lait spots):牛奶咖啡斑為本病的一個(gè)重要體征。約有40%～50%的患者于出生時(shí)即已存在,為棕色或牛奶咖啡色斑疹。由于出生時(shí)顏色較淺,故常不被家長注意,只有當(dāng)出現(xiàn)其他癥狀時(shí)才就診。研究表明,牛奶咖啡斑隨年齡的增長而逐漸變大,顏色變深且數(shù)目增多。據(jù)報(bào)道,80%的患兒年齡每增長l歲,此斑則增加1個(gè),4歲的患兒則100%的出現(xiàn)。多見于軀干、四肢,也可見于其他部位,但以非暴露部位多見。其大小不一,一般直徑l～2cm或更大,邊界清楚,多呈卵圓或其他形狀,不突出皮膚。約20%的患者在腋窩與會(huì)有雀斑樣色素沉著,稱為腋部雀斑(Axillary fleelding),具有診斷意義。牛奶咖啡斑在正常人也可見到,但數(shù)目很少。一般而言,正常小兒可有l(wèi)～2個(gè)牛奶咖啡斑,直徑多在0.5cm以內(nèi),3個(gè)以上者則屬異常,應(yīng)考慮本病的可能性[10]。

6神經(jīng)纖維瘤病的Riccardi分類

按照Riccardi的分類[11],神經(jīng)纖維瘤病分為8個(gè)類型。NFl型(Von Recklinghausen型)的診斷標(biāo)準(zhǔn)具備下列2條或2條以上:①6個(gè)或6個(gè)以上牛奶咖啡斑。在青春期前最大直徑超過5mm,青春期以后和成年人最大直徑超過15mm;②2個(gè)或2個(gè)以上任何類型的神經(jīng)纖維瘤或一個(gè)叢狀神經(jīng)纖維瘤;③在腋窩或腹股溝區(qū)有雀斑;④視神經(jīng)膠質(zhì)瘤;⑤2個(gè)或2個(gè)以上Lisch結(jié)節(jié)(虹膜錯(cuò)構(gòu)瘤);⑥特殊的骨性損害,如蝶骨發(fā)育異?；蜷L骨皮質(zhì)變薄,伴有或不伴有假性關(guān)節(jié)病;⑦根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn),與NF1型有關(guān)的一級(jí)親屬(雙親、兄弟姐妹或子孫后代)。NF2型(聽覺型),具備下列任何一條者即可診斷:①適當(dāng)?shù)挠跋窦夹g(shù)檢查(如CT或MR)可見雙側(cè)第8對(duì)顱神經(jīng)瘤;②與NF2型有關(guān)的一級(jí)親屬以及單側(cè)第8對(duì)顱神經(jīng)瘤或下列兩種:神經(jīng)纖維瘤、腦膜瘤、膠質(zhì)瘤、雪旺氏細(xì)胞瘤、青年后囊下晶體混濁;NF3型(混合型)的臨床特點(diǎn)是多發(fā)性腦和脊髓腫瘤,伴有牛奶咖啡斑和神經(jīng)纖維瘤;NF4型(變異型)的特點(diǎn)是牛奶咖啡斑和彌漫性神經(jīng)纖維瘤,不能進(jìn)一步分類;NF5型(局限型)的臨床特點(diǎn)是牛奶咖啡斑或神經(jīng)纖維瘤,或兩者均有,局限于某部位;NF6型(牛奶咖啡斑型)特點(diǎn)是多發(fā)牛奶咖啡斑而無神經(jīng)纖維瘤;NF7型(遲發(fā)型)的臨床特點(diǎn)是20歲以后發(fā)生的神經(jīng)纖維瘤病;NF8型僅有神經(jīng)纖維瘤而無任何其他類型的特點(diǎn)。在以上8種類型中,NF1型約占神經(jīng)纖維瘤病的85%～9O%。局限性神經(jīng)纖維瘤病(NF5)是NF1型的局部表現(xiàn),且是8型中唯一非遺傳性的。

7鑒別和診斷

當(dāng)發(fā)現(xiàn)患者有皮膚牛奶咖啡斑及皮下結(jié)節(jié)時(shí),診斷多不困難,下列方法有助于進(jìn)一步確定診斷:①詳細(xì)詢問病史,并對(duì)其家庭成員進(jìn)行體格檢查;②皮膚活檢;③詳細(xì)地進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)檢查及眼科檢查;④X線檢查:如顱骨平片、內(nèi)聽道、胸片、脊柱片等;⑤CT或MR檢查(有助于早期診斷);⑥腦電圖檢查;⑦脊髓造影。

盡管NF1和NF2是位于不同染色體的不同的基因突變所致,其臨床表現(xiàn)差別很大,但NF1和NF2之間診斷仍可能發(fā)生混淆,所以需要予以明確:①NF1患者可患有認(rèn)知障礙(智力發(fā)育遲鈍、學(xué)習(xí)障礙),有顯著數(shù)量的Lisch結(jié)節(jié),而NF2患者沒有。周列民等[12]通過中國修訂的韋氏成人智力量表對(duì)中國人NF1患者進(jìn)行智力損害和影響因素的研究發(fā)現(xiàn)NF1患者言語理解能力和知覺組織能力受損較重,而記憶力與注意力受損相對(duì)較輕且受病程及受教育程度影響;②NF2患者神經(jīng)鞘瘤很少發(fā)生惡變形成神經(jīng)纖維肉瘤;③NF2沒有明顯數(shù)量的牛奶咖啡斑,但可能比正常人數(shù)目多;④脊根部的啞鈴型腫瘤最容易引起診斷上的混亂,此類腫瘤在NF2為神經(jīng)鞘瘤,在NF1為神經(jīng)纖維瘤[13]。

8治療

NF1患者臨床表現(xiàn)千差萬別,根據(jù)腫瘤和病變的位置和數(shù)目,可以選擇相應(yīng)的手術(shù)和非手術(shù)治療。如腫瘤過大,妨礙身體活動(dòng)或面部腫瘤影響容貌,或有壓迫癥狀時(shí),可行手術(shù)切除。若腫瘤生長迅速并有劇痛時(shí),應(yīng)及時(shí)切除,以防惡變。

3.1手術(shù)治療:①瘤體較小而局限者可直接切除縫合;②瘤體較大,但與深筋膜和深部組織界限清楚者可基本切除瘤體,植皮封閉創(chuàng)面;③瘤體巨大無法完全切除,且與深筋膜和深部組織界限不清者盡可能切除瘤體,并設(shè)計(jì)皮瓣,直接縫合。對(duì)于瘤體特別巨大而分布廣泛者,我們進(jìn)行血管造影檢查,明確瘤體的營養(yǎng)動(dòng)脈并給予栓塞,術(shù)中采用控制性低血壓和自體血回輸?shù)确椒?有效地降低了出血量,提高了切除巨大瘤體的安全性;④如直接切除預(yù)計(jì)無法直接縫合或局部皮瓣無法轉(zhuǎn)移修復(fù)者,預(yù)先埋置擴(kuò)張器、二期手術(shù)切除瘤體并行擴(kuò)張皮瓣轉(zhuǎn)移修復(fù)。為減少術(shù)中出血采取的措施有:①在瘤體周圍用粗絲線預(yù)先環(huán)扎,以盡量減少切口滲血并阻斷腫瘤血供;②切口選在正常組織處;③用電刀向瘤體剝離時(shí),盡量在帽狀腱膜、筋膜或骨膜上進(jìn)行;④術(shù)中邊剝離邊止血,用大號(hào)溫?zé)猁}水紗布?jí)浩葎?chuàng)面,并置止血明膠海綿,減少創(chuàng)面滲血;⑤從瘤體基部將整個(gè)腫瘤大塊掀起后,再從皮下切除腫瘤[14];⑥術(shù)中局部采用腫脹麻醉技術(shù)止血;⑦術(shù)后72h內(nèi)間斷拆除環(huán)扎縫線;⑧低壓麻醉。

3.2非手術(shù)治療:1987年有人用肥大細(xì)胞膜穩(wěn)定劑酮替酚治療NF,發(fā)現(xiàn)能阻止皮下腫瘤生長,減輕神經(jīng)纖維瘤的瘙癢和疼痛。進(jìn)行外科治療的患者,同時(shí)服用酮替酚不出現(xiàn)過量出血。但近期療效如何,目前仍在觀察中。皮膚病變的激光治療只在短期內(nèi)有效。據(jù)報(bào)道H1和H2受體阻滯劑治療本病無效,深部X線放射治療通常無效。展望未來,基因治療可能是本病治療的一個(gè)方向 [15]。NF2的首選治療方法是手術(shù),立體定位放療如伽瑪?shù)兑彩呛蜻x治療方法。針對(duì)兒童患者的放療需要慎重,以免引起腫瘤惡變、誘發(fā)產(chǎn)生其他腫瘤等后果。治療還應(yīng)包括針對(duì)平衡失調(diào)和耳聾的治療。

9并發(fā)癥及預(yù)后

NF并發(fā)癥較為常見和復(fù)雜,其中35%伴中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常,如腦腫瘤、癲癇、精神病、反應(yīng)遲鈍、學(xué)習(xí)能力差等。5%伴周圍神經(jīng)腫瘤。除此之外,NF尚可伴發(fā)其他腫瘤:白血病、胃腸道平滑肌瘤。而NF本身尚有一定惡變率,具體原因尚不清楚,可能與本病病因中基因異常有關(guān)。本病預(yù)后不一,大部分患者發(fā)展緩慢,有時(shí)呈靜止?fàn)顟B(tài),可生存多年乃至終生。但也有個(gè)別患者發(fā)生惡變而危及生命。一般認(rèn)為周圍神經(jīng)腫瘤遠(yuǎn)期預(yù)后較好,而顱內(nèi)腫瘤不論單發(fā)或多發(fā),其預(yù)后取決于其部位、性質(zhì)及治療措施等。手術(shù)治療后,如果腫瘤過大,含有不成熟成分時(shí),術(shù)后常有復(fù)發(fā),且復(fù)發(fā)次數(shù)愈多,惡性程度亦逐漸增加。由于目前產(chǎn)前還沒有可靠的方法予以診斷,且本病患者子女發(fā)病率約為50%,故婚后絕育為最佳預(yù)防措施。

10小結(jié)

目前,對(duì)于NF的治療方法雖然很多,但無論是手術(shù)治療還是非手術(shù)治療,要達(dá)到徹底治愈都十分困難,對(duì)于體積較大位置較差的瘤體,術(shù)中仍顯得較為被動(dòng)。近幾年來基因治療NF雖已取得長足發(fā)展,但由于NF基因有許多潛在突變位點(diǎn),突變類型復(fù)雜,而且病變涉及全身多種器官,我們尚不能完全糾正NF突變的基因,因此,對(duì)于NF的治療我們還需要進(jìn)一步的研究及探索。

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篇8

[關(guān)鍵字] 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;股骨頭壞死;治療;進(jìn)展

[中圖分類號(hào)] R681.8[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1673-7210(2010)01(a)-016-04

股骨頭壞死(osteonecrosis of femoral head,ONFH)是一種嚴(yán)重危害人類健康、致殘率極高的常見疾病,常累及中青年,呈進(jìn)展性和致殘性發(fā)展,80%的患者在1～4年內(nèi)進(jìn)展為股骨頭塌陷,最終因股骨頭變形、毀損、髖關(guān)節(jié)劇烈疼痛而不得不行人工關(guān)節(jié)置換術(shù)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)具有良好的多向分化潛能、活躍的增殖特性、對(duì)外源基因的高效轉(zhuǎn)染表達(dá)能力以及促進(jìn)造血、在體外較易分離和培養(yǎng)等特性,較多地用于股骨頭壞死的研究,顯示了良好的應(yīng)用前景。

1 股骨頭壞死的機(jī)制

ONFH發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣,病因主要是創(chuàng)傷、應(yīng)用激素、酗酒及結(jié)締組織病因素等。微循環(huán)障礙是原發(fā)性股骨頭壞死的共同病理機(jī)制,決定其病理演變的因素可概括為3個(gè)方面:病因、破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收與骨的有效重建速度的平衡關(guān)系、生物力學(xué)作用。病因最終造成微循環(huán)損害,骨細(xì)胞、骨髓組織壞死、骨髓間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化能力下降,破骨細(xì)胞對(duì)失去保護(hù)的骨小梁吸收增強(qiáng),骨小梁因而吸收變得稀疏、細(xì)小。另一方面,因骨小梁中的骨細(xì)胞壞死失去了礦物代謝功能,其機(jī)械強(qiáng)度隨之下降。當(dāng)應(yīng)力傳導(dǎo)時(shí),骨小梁極易骨折,在骨壞死吸收的同時(shí)伴隨修復(fù),修復(fù)的強(qiáng)弱取決于供血狀態(tài)及骨髓的功能狀態(tài)。骨髓間質(zhì)細(xì)胞分裂增生,在骨壞死區(qū)出現(xiàn)富含成纖維樣細(xì)胞的結(jié)締組織,毛細(xì)血管再生,成骨細(xì)胞及來自于骨髓間質(zhì)細(xì)胞分化的成骨細(xì)胞合成骨基質(zhì),重建壞死的骨小梁,骨的吸收速度及新生骨的有效重建速度應(yīng)保持一定的平衡關(guān)系,而這種關(guān)系最終由破骨細(xì)胞的活動(dòng)、骨髓間質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的能力及成骨細(xì)胞的功能狀態(tài)決定[1]。總之,股骨頭壞死的特征是股骨頭缺血、壞死,隨之出現(xiàn)修復(fù)反應(yīng),進(jìn)而發(fā)生股骨頭塌陷及髖關(guān)節(jié)退行性關(guān)節(jié)炎。

2 BM-MSCs的生物學(xué)特性

BM-MSCs來源于胚胎發(fā)育期中胚層,存在于骨髓組織中,較多用于ONFH的治療研究中。在光學(xué)顯微鏡下BM-MSCs顯示出類似成纖維細(xì)胞的外觀,體積小,核漿比大;只有少數(shù)正在活躍地復(fù)制,細(xì)胞周期每個(gè)階段的檢控點(diǎn)和時(shí)間跨度均不明確;高比例的G0/G1期細(xì)胞暗示BM-MSCs具有高度的分化潛能;傳代培養(yǎng)多數(shù)樣本于P10代以后開始出現(xiàn)衰老現(xiàn)象。

BM-MSCs的主要生物學(xué)性狀如下:細(xì)胞因子及生長因子有白細(xì)胞介素-1α、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-7、白細(xì)胞介素-8、白細(xì)胞介素-11、白細(xì)胞介素-12、白細(xì)胞介素-14、白細(xì)胞介素-15、LIF、SCF、Flt23配體、GM-CSF、G-CSF、M-CSF;細(xì)胞活素及生長因子受體有:IL-1、RIL-7、RIL-4R、IL-6R、IL-7R、LIFR、SCFR、G-CSFR、IFNR、TNF-ⅠR、TNF-ⅡR、TGF-β1R、TGF-β2R、bFGFR、PDGFR、EGFR。目前尚未找到BM-MSCs的特異性標(biāo)志物,通常以其較強(qiáng)的貼壁生長特性、不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物(如CD14、CD34、CD45等)、形態(tài)似成纖維樣細(xì)胞、具有多向分化潛能等特征來辨認(rèn)。由于BM-MSCs可表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞和肌細(xì)胞等其他細(xì)胞的表面抗原,故常用SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124等來篩選BM-MSCs[2]。

3 BM-MSCs向骨、軟骨的定向誘導(dǎo)分化

Tamir等[3]用一個(gè)細(xì)胞來源的BM-MSCs分別進(jìn)行骨、軟骨和脂肪的定向誘導(dǎo)分化,結(jié)果顯示BM-MSCs具有多向分化能力。細(xì)胞因子與骨形成、骨愈合及骨重建有著密切的關(guān)系。這些物質(zhì)有胰島素樣生長因子(IGFs)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs)、轉(zhuǎn)移生長因子-β(TGF-β)、血小板源生長因子(PDGF)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)等。胰島素樣生長因子-1(IGF-1)可刺激細(xì)胞分化和骨細(xì)胞基質(zhì)合成。PDGF對(duì)骨細(xì)胞分化有著強(qiáng)大的作用。在兔脛骨缺損模型中,缺損處局部單純注射PDGF可以提高傷處膠原的體積和密度。FGFs有多種調(diào)節(jié)作用,如細(xì)胞的有絲分裂、分化、蛋白酶的合成及受體的調(diào)節(jié)。有學(xué)者通過體外細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)對(duì)BM-MSCs有促進(jìn)增殖作用[4]。TGF-β可刺激成骨細(xì)胞增殖,也是成骨細(xì)胞化學(xué)誘導(dǎo)因子和成骨細(xì)胞合成的抑制劑。實(shí)驗(yàn)表明,TGF-β可刺激兔顱骨缺損處成骨細(xì)胞的募集和增殖,從而導(dǎo)致骨愈合。BMPs家族由14個(gè)成員組成,它們可促進(jìn)骨形成,而且能促進(jìn)異位成骨[5]。李廣恒等[6]將重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4(BMP-4)加入體外培養(yǎng)的兔骨髓細(xì)胞內(nèi),發(fā)現(xiàn)其表達(dá)骨鈣素和堿性磷酸酶。Lane等[7]做了重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP-2)與骨髓修復(fù)鼠股骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究,通過放射學(xué)和生物力學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)其無論在愈合率還是在生物力學(xué)性能上都比單純自體松質(zhì)骨組和單純骨髓組優(yōu)越。骨形成是多因子、多時(shí)相協(xié)調(diào)作用的結(jié)果,其詳細(xì)調(diào)節(jié)機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

4 BM-MSCs與ONFH的治療

目前對(duì)于股骨頭缺血性壞死的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。研究表明,股骨頭壞死的發(fā)生與成骨細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞的功能下降有關(guān)。如Hernigou發(fā)現(xiàn)股骨頭壞死患者的造血干細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞活性較正常人均有明顯降低。Gangji等[8]比較了13例股骨頭壞死,顯示股骨頭壞死患者轉(zhuǎn)子部成骨細(xì)胞的增殖能力下降,結(jié)果提示,股骨頭缺血性壞死可能是在多種因素的作用下,通過全身途徑致使成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的功能下降,進(jìn)而導(dǎo)致股骨頭再生血管和成骨能力降低。而BM-MSCs是具有成骨作用且能夠自我復(fù)制的細(xì)胞,對(duì)促進(jìn)股骨頭壞死重建起到重要作用。Kocher等[9]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí),BM-MSCs或內(nèi)皮前體細(xì)胞可以促進(jìn)缺血模型的血流恢復(fù)。Kinnaird等[10]在給鼠缺血性后肢肌肉注射培養(yǎng)的骨源性干細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)其可以促進(jìn)側(cè)支循環(huán)及肢體功能恢復(fù),并且與血管生成有關(guān)的細(xì)胞因子(如VEGF、FGF-2、IL-6等)基因表達(dá)水平增高。BM-MSCs可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞也已在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。可見通過BM-MSCs移植既有利于股骨頭血液供應(yīng)的恢復(fù),又能提高局部成骨能力,從而促進(jìn)壞死骨的修復(fù),目前BM-MSCs的應(yīng)用多與其他療法聯(lián)合應(yīng)用[11]。

4.1 髓芯減壓BM-MSCs移植

髓芯減壓加BM-MSCs移植是臨床治療早期股骨頭壞死的主要手段之一,已經(jīng)有大量動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)報(bào)道都取得了良好的效果。劉長安等[12]在液氮造模后,采用髓芯減壓并植入復(fù)合有自體BM-MSCs的明膠海綿,8周后鉆孔區(qū)形成骨小梁結(jié)構(gòu),組織學(xué)顯示鉆孔區(qū)內(nèi)充滿新生骨小梁結(jié)構(gòu)并成熟,小梁內(nèi)骨髓組織填充。王江泳等[13]植入含有體外培養(yǎng)的自體BM-MSCs的明膠海綿和異體BM-MSCs的明膠海綿,8周時(shí)兩組的鉆孔區(qū)均出現(xiàn)骨小梁結(jié)構(gòu);骨小梁趨于成熟,可以看出同種異體和自體BM-MSCs移植均對(duì)兔股骨頭缺血性壞死有良好的修復(fù)作用。

臨床研究結(jié)果顯示,骨髓干細(xì)胞移植治療早期股骨頭壞死,對(duì)緩解疼痛、阻止病變進(jìn)展有較好的作用。Gangji等[14]對(duì)13例股骨頭壞死患者18髖進(jìn)行單純髓芯減壓和聯(lián)合移植BM-MSCs髓芯減壓的隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn),60個(gè)月后實(shí)驗(yàn)組10髖中僅1髖行關(guān)節(jié)置換,而對(duì)照組8髖中有4髖不得不進(jìn)行置換,生存分析表明,兩組關(guān)節(jié)塌陷有顯著性差異。Hernigou等[15]共治療116例189髖,隨訪5~10年,平均7年,結(jié)果塌陷前期(Ⅰ、Ⅱ期)145髖中有9髖進(jìn)行髓關(guān)節(jié)置換,塌陷后期(Ⅲ、Ⅳ期)的44髖中有25髖做全髖關(guān)節(jié)置換。結(jié)果顯示,移植的細(xì)胞數(shù)量越多,療效越好。郭小偉等[16]對(duì)Ficat分期為三期的20例患者進(jìn)行自體周圍血BM-MSCs移植,12個(gè)月隨訪顯示,所有患者疼痛、關(guān)節(jié)功能顯著改善、Harris評(píng)分與術(shù)前比較顯著提高,且優(yōu)于單純髓芯減壓術(shù)。汪學(xué)松[17]在病灶搔刮術(shù)后,直接自套管針內(nèi)快速加壓注入BM-MSCs到壞死區(qū)。治療早期股骨頭壞死27例,結(jié)果大部分患者疼痛、關(guān)節(jié)功能、X線片均有不同程度的改善。徐軍等[18]應(yīng)用髖關(guān)節(jié)鏡及自體外周血BM-MSCs移植術(shù),采用Harris髖關(guān)節(jié)評(píng)分評(píng)價(jià)優(yōu)良率達(dá)94.7%,所有患者疼痛消失,行走正常,髓關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍正?；蚪咏?X線片示股骨頭輪廓清晰,囊性變消失,為微創(chuàng)治療ONFH提供了思路。上述研究說明股骨頭髓芯減壓BM-MSCs移植手術(shù)治療早期ONFH具有損傷小、簡便、準(zhǔn)確、有效的優(yōu)點(diǎn),可改善關(guān)節(jié)功能。然而大規(guī)模、多中心樣本試驗(yàn)長期療效尚有待更多的臨床觀察進(jìn)行驗(yàn)證。

4.2 BM-MSCs介入移植

近年來有學(xué)者采用介入方法移植BM-MSCs治療ONFH,取得了很好的效果。楊曉鳳等[19]分別向動(dòng)物模型兔經(jīng)DSA動(dòng)脈注入BM-MSCs,移植后4周移植組兔右后肢股骨頭區(qū)供血?jiǎng)用}較對(duì)照組股動(dòng)脈明顯增多。移植后12周右側(cè)股骨頭軟骨、板層骨及骨小梁明顯修復(fù)。季衛(wèi)鋒等[20]在DSA介入下向動(dòng)物模型兔旋股內(nèi)、外動(dòng)脈插管分別注射BM-MSCs后,X線表現(xiàn)示骨質(zhì)密度改變明顯好轉(zhuǎn);病理組織學(xué)表現(xiàn)為空骨陷窩減少,成骨細(xì)胞增多,新骨形成;四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記顯示壞死修復(fù)區(qū)熒光帶鮮亮,邊界增寬。上述研究證明高選擇性股動(dòng)脈灌注BM-MSCs治療股骨頭壞死能加速兔股骨頭的再血管化和再骨化進(jìn)程,從而達(dá)到治療ONFH的目的。

楊曉鳳等[21]將導(dǎo)管超選擇插入旋股內(nèi)、外動(dòng)脈及閉孔動(dòng)脈,分次緩慢將自體BM-MSCs懸液注入動(dòng)脈內(nèi)。結(jié)果關(guān)節(jié)疼痛緩解85.7%,關(guān)節(jié)功能改善30.2%,旋股內(nèi)、外動(dòng)脈及閉孔動(dòng)脈管徑增粗,新生血管增多,股骨頭區(qū)血液供應(yīng)明顯改善,2例18個(gè)月復(fù)查股骨頭壞死區(qū)縮小,可見新骨形成。史沛等[22]采用介入方法將自體骨髓干細(xì)胞注入5例股骨頭壞死患者治療側(cè)旋股內(nèi)、外動(dòng)脈及閉孔動(dòng)脈內(nèi),1年隨訪結(jié)果顯示,患者臨床癥狀明顯緩解,髖關(guān)節(jié)臨床癥狀Harris評(píng)分顯著提高,髖關(guān)節(jié)活動(dòng)度無明顯改變,未發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥。介入移植BM-MSCs治療ONFH是一種安全有效、便捷的方法,還可以免除開放性手術(shù)的痛苦,為治療早期ONFH開辟了新的思路。

4.3 基因轉(zhuǎn)染BM-MSCs移植

將目標(biāo)基因通過載體轉(zhuǎn)入BM-MSCs內(nèi)再與不同載體材料復(fù)合后植入股骨頭壞死區(qū)治療股骨頭壞死,也是目前的研究方向,取得了許多令人振奮的結(jié)果。BMPs可促進(jìn)骨形成,而且能促進(jìn)異位成骨。陸斌等[23]利用人BMP-2基因轉(zhuǎn)染的自體BM-MSCs復(fù)合多孔β-磷酸三鈣材料治療股骨頭壞死,植入后1、2、3周BMP-2組在股骨頭局部有BMP-2蛋白的高表達(dá),有明顯成骨;16周時(shí)壞死區(qū)被完全修復(fù),且新骨體積明顯大于對(duì)照組;BMP-2組股骨頭形態(tài)規(guī)則,無塌陷,植入?yún)^(qū)松質(zhì)骨標(biāo)本的最大抗壓強(qiáng)度、軟骨下骨的最大抗壓強(qiáng)度參數(shù)均與正常骨接近。Xiao等[24]聯(lián)合rhBMP-2的BM-MSCs培養(yǎng)的支架材料干預(yù),組織學(xué)也提示有正常骨修復(fù),提示BMP-2基因轉(zhuǎn)染的BM-MSCs是治療ONFH的有效途徑。張曄等[25]以脂質(zhì)體介導(dǎo)Pcdna-Ang-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兔BM-MSCs,與磷酸三鈣(TCP)陶瓷復(fù)合,結(jié)果細(xì)胞與TCP材料復(fù)合生長良好。組織學(xué)檢查見毛細(xì)血管生長及新骨形成活躍,電鏡顯示實(shí)驗(yàn)組成骨細(xì)胞和膠原纖維多于對(duì)照組,細(xì)胞器成熟,Ang-1修飾的BMSC預(yù)構(gòu)人工骨也有助于股骨頭壞死的修復(fù)。而陳超等[26]將hVEGF-165質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSC與凍干松質(zhì)骨作載體回植于兔股骨頭壞死部位,在植入后2、4、8周對(duì)植入物進(jìn)行形態(tài)學(xué)及組織學(xué)觀察,結(jié)果顯示股骨頭壞死情況得到改善。杭棟華等[27]研究hVEGF-165基因轉(zhuǎn)染的犬BM-MSCs移植、BM-MSCs移植對(duì)修復(fù)自體股骨頭壞死的效果實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)第2、4、8周骨小梁定量分析提示轉(zhuǎn)基因的間充質(zhì)干細(xì)胞移植組成骨修復(fù)好于單純干細(xì)胞移植組;12周時(shí),轉(zhuǎn)基因間充質(zhì)干細(xì)胞移植組中血管數(shù)量最多。余開湖等[28-29]報(bào)道,攜帶血管生成素基因(Ang-1)的BM-MSCs介入治療不僅能促進(jìn)毛細(xì)血管的生成,而且能定向進(jìn)行骨分化,對(duì)ONFH有明顯的修復(fù)作用。此外,溫茜等[30]用重組方法產(chǎn)生重組腺病毒人肝細(xì)胞生長因子(Ad-HGF)轉(zhuǎn)染BM-MSCs,轉(zhuǎn)染后的BM-MSCs在mRNA和蛋白水平均有HGF高表達(dá),為其用于早期ONFH的治療奠定了基礎(chǔ)。利用生物技術(shù)將轉(zhuǎn)染某些基因的BM-MSCs細(xì)胞用于治療ONFH將是我們今后的研究方向之一。

4.4 聯(lián)合填充材料BM-MSCs移植

BM-MSCs聯(lián)合什么樣的載體到目標(biāo)區(qū)域也值得我們探索,并且也有很多學(xué)者做了相關(guān)研究。在支架材料的選擇上,Fialkov等使用聚乳酸/聚羥基乙酸共聚物(polylactic/glycolic acid copolymer,PLGA)作為體內(nèi)研究的支架材料,徐曉良等使用骨形成蛋白/膠原/珊瑚復(fù)合人工骨用于股骨頭缺損模型。由于PLGA降解產(chǎn)物酸性過強(qiáng),對(duì)組織有副作用;膠原/珊瑚復(fù)合人工骨很難降解等缺點(diǎn),限制了它們的使用。孫偉等[31]在兔雙側(cè)股骨頭內(nèi)骨缺損區(qū)填充納米人工骨和BM-MSCs的復(fù)合材料。術(shù)后4周即有明顯的成骨反應(yīng)和新骨形成,填充納米晶膠原基骨(nHAC)和BM-MSCs的復(fù)合材料組骨小梁結(jié)構(gòu)形成,12周基本修復(fù)股骨頭的骨缺損區(qū),說明nHAC有較強(qiáng)的傳導(dǎo)成骨作用,是修復(fù)兔股骨頭骨缺損的良好移植材料,適合MSCs細(xì)胞黏附、生長、增殖和分化,有較強(qiáng)的組織相容性和適當(dāng)?shù)目山到庑?能在降解過程中逐漸被新骨替代;復(fù)合BM-MSCs后能促進(jìn)骨缺損的修復(fù),對(duì)股骨頭壞死的治療有較大價(jià)值。付松等[32]則證實(shí)牛松質(zhì)骨可以作為一種較好的載體應(yīng)用于骨組織工程學(xué)。黃炎等[33]將小牛脫鈣松質(zhì)骨(DBCB)作為載體聯(lián)合一定量的BMPs與不同濃度的含有BM-MSCs的單核細(xì)胞懸液治療股骨頭兔模型也取得了很好的效果。陳觀華等[34]證實(shí)使用自體松質(zhì)骨及BMP聯(lián)合自體BM-MSCs治療股骨頭壞死實(shí)驗(yàn)兔效果良好。陸驊等表示作為BM-MSCs載體,目前凍干松質(zhì)骨要優(yōu)于羥基磷灰石。陳雙濤等植入復(fù)合同種異體BM-MSCs的膠原蛋白海綿,同時(shí)植入腹壁淺動(dòng)、靜脈束,12周后缺損區(qū)可見成熟的骨小梁組織及新生骨髓。股骨頭冠狀截面的血管密度及新生骨小梁在骨缺損區(qū)所占的面積大,說明定向誘導(dǎo)的同種異體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與腹壁淺動(dòng)、靜脈束相輔相成,聯(lián)合應(yīng)用可以快速、有效地修復(fù)股骨頭壞死骨缺損,防止股骨頭塌陷。目前對(duì)于局部聯(lián)合材料移植BM-MSCs也是治療ONFH的一個(gè)方向,但尋求組織相容性高、副作用少、便捷有效的材料依然值得探索。

5 目前BM-MSCs在治療ONFH中存在的問題

BM-MSCs治療早期ONFH是目前骨科研究熱點(diǎn),有很好的應(yīng)用前景,但是也存在很多問題,如:①不同個(gè)體、不同疾病狀態(tài)和不同部位的BM-MSCs數(shù)量和質(zhì)量均可能有差異。因此,必須建立一套高效率的BM-MSCs體外擴(kuò)增或活化技術(shù),保證有足夠數(shù)量的細(xì)胞滿足臨床需要。②移植治療策略是BM-MSCs臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。目前已經(jīng)報(bào)道的治療策略有BM-MSCs動(dòng)員、靜脈輸入、靶器官動(dòng)靜脈血管介入、定位移植等,這些方法各有所長,針對(duì)不同的疾病采用哪種方法最合適還值得深入探討。③目前有部分研究用不同類型的填充材料作為載體,但究竟哪種更加有利于BM-MSCs發(fā)揮作用且副作用小,值得我們繼續(xù)研究。④臨床療效、體內(nèi)可控性和安全性評(píng)價(jià)問題是BM-MSCs特別是轉(zhuǎn)入某些基因后臨床治療需要明確的根本問題,雖然沒有人報(bào)道BM-MSCs移植治療的負(fù)面影響,但體外長期培養(yǎng)的BM-MSCs移植到體內(nèi)后是否會(huì)發(fā)生突變和導(dǎo)致腫瘤或者畸胎瘤可能是BM-MSCs臨床治療中最令人擔(dān)憂的問題,因此,必須建立可靠的技術(shù)方法和評(píng)價(jià)體系。⑤BM-MSCs治療是一種有別于常規(guī)藥物和手術(shù)治療的新技術(shù),需要有相應(yīng)的技術(shù)規(guī)范和管理機(jī)制,保證BM-MSCs治療技術(shù)健康發(fā)展。

盡管目前BM-MSCs在治療股骨頭缺血性壞死方面應(yīng)用較少,但我們相信隨著研究的深入,BM-MSCs的應(yīng)用必將為廣大股骨頭壞死患者帶來巨大的福音。

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篇9

膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、生長、損傷及修復(fù)等過程中發(fā)揮重要的神經(jīng)營養(yǎng)作用，在神經(jīng)系統(tǒng)中的分布廣泛，其神經(jīng)營養(yǎng)活性較高，不僅可以保護(hù)多巴胺（DA）運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，對(duì)于中樞及外周的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、感覺神經(jīng)元及交感神經(jīng)元等多種神經(jīng)元具有同等的營養(yǎng)作用，在神經(jīng)系統(tǒng)變性性疾病及缺血性腦血管疾病等治療中發(fā)揮重要作用，已經(jīng)成為當(dāng)前神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

1 GDNF的基本結(jié)構(gòu)

GDNF最先由Lin等［1］于1993年從大鼠膠質(zhì)細(xì)胞B49的條件培養(yǎng)液中分離出來，因其主要來源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，故人們將其命名為膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子。每個(gè)GDNF成熟蛋白質(zhì)氨基酸序列中都有7個(gè)保守的半胱氨酸殘基［2］，并且半胱氨酸出現(xiàn)的位置與轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族的所有成員相似，故因其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)將其歸屬于TGF-β超家族的新成員。

2 GDNF及其受體的分布

GDNF在全身各種組織中均有表達(dá)［3］，并不單一表達(dá)于富含多巴胺能神經(jīng)元的部位，如中腦的黑質(zhì)。GDNF的mRNA在體內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)非多巴胺能神經(jīng)元部位也可以檢測到，在外周非神經(jīng)組織中也有表達(dá)，在小腦蒲肯野細(xì)胞、三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核等與運(yùn)動(dòng)有關(guān)的結(jié)構(gòu)以及三叉神經(jīng)感覺核、脊髓后角Clarksy核等與感覺有關(guān)的結(jié)構(gòu)中也可以檢測到。GDNF在機(jī)體各個(gè)組織及器官中的廣泛表達(dá)均提示其作用廣泛。

3 GDNF受體信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)

GDNF發(fā)揮作用的機(jī)制主要是與其受體結(jié)合，從而發(fā)揮其生物學(xué)作用。GDNF 受體系統(tǒng)并不是TGF-β超家族的受體：跨膜絲氨酸或者蘇氨酸受體，它們有自己的受體部分，為GDNF家族受體α（GDNF family receptor α，GFRα）和Ret蛋白組成的復(fù)合受體系統(tǒng)。一部分通過糖基磷脂酰肌醇（glycosyl-phosphatidylinositol，GPI）結(jié)合位點(diǎn)錨定于細(xì)胞膜外表面的GFRα，信號(hào)不能通過細(xì)胞膜；另一部分通過跨膜的酪氨酸激酶Ret蛋白，信號(hào)得以傳遞。GDNF受體α目前已知有4種亞型，分別為GFRα-1～4型。而其中GFRα-1是GDNF最主要的受體?？缒さ腞et蛋白是原癌基因c-ret的編碼產(chǎn)物，它屬于受體酪氨酸激酶超家族成員，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)的酪氨酸激酶區(qū)構(gòu)成，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化［4］。GDNF與細(xì)胞表面的GFRα 結(jié)合形成GDNF-GFRα復(fù)合體后激活Ret受體［5］，促使細(xì)胞內(nèi)Ret-Shc-Grb2蛋白復(fù)合體形成。而后，Ret-Shc-Grb2蛋白復(fù)合體激活相關(guān)蛋白，從而引起一系列信號(hào)傳導(dǎo)，發(fā)揮其生物學(xué)作用。GDNF可能通過的信號(hào)傳導(dǎo)通路［6-8］：①通過Ras/MAPK通路和PI3K/Akt信息系統(tǒng)刺激神經(jīng)元的存活、增殖、分化、遷移和軸突的發(fā)生、生長。②通過神經(jīng)營養(yǎng)因子（NTFs）/Src家族蛋白激酶（SFKs）信號(hào)通路促進(jìn)脊髓背根神經(jīng)元軸突生長。③GDNF通過MEK1/2或者ERK1/2等影響膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）的分泌來調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生。④通過PLC-γ/IP3調(diào)控Ca2+釋放。最新研究表明［9-10］，GDNF可以不依賴Ret而只通過GFRα-1或者神經(jīng)細(xì)胞黏附因子（neural cell adhesion molecule，NCAM）激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路。在缺乏Ret蛋白時(shí)，GDNF可以通過GFRα-1受體引起促分裂原活化蛋白激酶、磷脂酶C-γ、cAMP反應(yīng)要素結(jié)合蛋白等蛋白磷酸化以及c-fos mRNA的表達(dá)［7］而發(fā)揮作用。

4 GDNF的生物學(xué)功能

4.1 GDNF對(duì)帕金森病(PD)的作用

GDNF一直被認(rèn)為是對(duì)多巴胺能神經(jīng)元具有高特異性、相對(duì)專一性的營養(yǎng)因子。GDNF能夠保護(hù)和恢復(fù)軸索損傷或者1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropy-ridine，MPTP)損傷的DA能神經(jīng)元的功能。研究表明［11］：腺病毒介導(dǎo)的GDNF基因腦內(nèi)直接轉(zhuǎn)移可阻止6-OHDA誘發(fā)的大鼠DA 能神經(jīng)元進(jìn)行性變性，在PD保護(hù)治療方面起到重要作用；另外GDNF 直接注入黑質(zhì)附近也能促進(jìn)存活DA能神經(jīng)纖維發(fā)芽及功能恢復(fù)。經(jīng)GDNF處理后的紋狀體DA能神經(jīng)元酪氨酸羥化酶免疫活性可以升高。同時(shí)GDNF能夠阻止或逆轉(zhuǎn)PD動(dòng)物模型中黑質(zhì)紋狀體DA系統(tǒng)的進(jìn)行性退變，含有GDNF基因的質(zhì)粒注射到PD病鼠的紋狀體內(nèi)，可以明顯改善大鼠的功能［12］。因此GDNF是迄今為止所鑒定出的對(duì)中腦DA能神經(jīng)元神經(jīng)營養(yǎng)作用最強(qiáng)大的營養(yǎng)因子之一。

4.2 GDNF在腦缺血中的作用

在大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型中，缺血可誘導(dǎo)GDNF mRNA蛋白表達(dá)，且反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞可分泌GDNF。大腦缺血可以使GFRα-1、GFRα-2表達(dá)上升。短暫結(jié)扎大鼠大腦中動(dòng)脈后檢測到GDNF受體GFRα-1和Ret的表達(dá)，GFRα-1和Ret表達(dá)與同樣條件下GDNF的誘導(dǎo)表達(dá)相關(guān)。所有研究均表明GDNF系統(tǒng)在腦缺血/再灌注損傷中被激活，從而發(fā)揮著內(nèi)源性的神經(jīng)保護(hù)作用。GDNF可能通過以下途徑對(duì)缺血起到保護(hù)作用：①對(duì)于腦缺血后腦內(nèi)微環(huán)境的研究提示，神經(jīng)營養(yǎng)因子不僅可促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，還對(duì)腦損傷的修復(fù)起重要作用，其能夠促進(jìn)多種神經(jīng)元的存活和分化，促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)化［13-14］。GDNF可以抑制一氧化氮合酶（NOS）活性，減少缺血激活NO本身誘導(dǎo)的毒性反應(yīng)。導(dǎo)入GDNF重組腺病毒可以提高受損神經(jīng)元的存活率。②抑制細(xì)胞凋亡。凋亡是細(xì)胞程序性自殺，凋亡的調(diào)節(jié)受到凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2基因家族的控制，Bcl-2和Bax是Bcl-2家族的重要成員，Bcl-2是抗凋亡基因，而Bax是促凋亡基因，二者比例決定著細(xì)胞的命運(yùn)。Yu等［15］在短暫性前腦缺血模型中用GDNF預(yù)處理后，死亡的神經(jīng)元數(shù)明顯減少，證明GDNF可以通過抑制caspase-3的活性而并不是caspase-1途徑抑制缺血刺激后星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)Par-4與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，實(shí)驗(yàn)表明應(yīng)用GDNF可以通過抑制Par-4的表達(dá)從而抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡［16］。此外，GDNF可以增強(qiáng)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）增殖和分化［13-14］。Chen等［17］發(fā)現(xiàn)加入重組人類GDNF(rhGDNF)后，存活神經(jīng)元數(shù)目明顯增加， 呈現(xiàn)顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。Gomes等［18］的研究也揭示了GDNF可以抑制谷氨酸受體NMAD，從而降低其毒性反應(yīng)。以上途徑均可以減少神經(jīng)元的凋亡，同時(shí)促進(jìn)神經(jīng)元恢復(fù)。將GDNF目的基因與相關(guān)載體在體外連接形成的重組DNA分子轉(zhuǎn)染至人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs），通過靜脈將其輸注到體內(nèi)，成為卒中治療的新策略。③抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞過度增生。星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、突觸傳遞、神經(jīng)組織修復(fù)與再生、神經(jīng)免疫以及多種神經(jīng)疾病的病理機(jī)制等方面起著十分重要的作用。在腦缺血缺氧發(fā)生后，膠質(zhì)細(xì)胞在缺血區(qū)反應(yīng)性的增生，一方面可以對(duì)神經(jīng)元有一定的保護(hù)作用；另一方面，由于膠質(zhì)細(xì)胞的過度增生引起膠質(zhì)化，形成膠質(zhì)瘢痕影響神經(jīng)元的修復(fù)。Fukuda等［19］的研究表明GDNF可以部分抑制細(xì)胞周期蛋白，從而阻止細(xì)胞增生進(jìn)程。研究指出NCAM成為GDNF的受體，Krushel等［20］研究表明NCAM無論在體內(nèi)還是體外的實(shí)驗(yàn)中都可以抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，是否二者有一定的相關(guān)性需要進(jìn)一步探究。這與1993年Lin等［1］發(fā)現(xiàn)中腦培養(yǎng)物中加入GDNF后星形膠質(zhì)細(xì)胞的密度并沒有增加，其GFAP的表達(dá)也沒有增加部分吻合。最近的研究還表明阻斷P2Y1受體可以抑制GFAP的表達(dá)，但是同時(shí)可以促進(jìn)GDNF的生成。這將為后續(xù)GDNF對(duì)細(xì)胞增生抑制的研究提供基礎(chǔ)。④抑制鈣超載。腦缺血后因?yàn)槎虝r(shí)間內(nèi)ATP即可耗盡，細(xì)胞膜Ca2+泵因此受到破壞，Ca2+平衡失調(diào)，Ca2+內(nèi)流從而形成鈣超載。進(jìn)一步激活蛋白酶，破壞細(xì)胞膜和線粒體，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。與此同時(shí)，一個(gè)細(xì)胞內(nèi)游離鈣的升高能夠在相鄰的細(xì)胞間傳播，使周圍的細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣亦升高，形成細(xì)胞間鈣波（interceellular calcium waves）。復(fù)雜的鈣離子信號(hào)與星形膠質(zhì)細(xì)胞鈣波的存在給這些細(xì)胞提供了易興奮的環(huán)境。縫隙連接介導(dǎo)的鈣波傳導(dǎo)參與了抑制性擴(kuò)散（SP）的形成，引起了其周圍的神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣的升高，使其去極化，激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元釋放K+和谷氨酸，K+和谷氨酸則促進(jìn)神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣的進(jìn)一步升高，這一正反饋形成了SP的連續(xù)不衰減的傳導(dǎo)。有實(shí)驗(yàn)證明，GDNF參與細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)，影響細(xì)胞膜Ca2+通道蛋白的表達(dá)，減少Ca2+內(nèi)流和自由基引起的損傷，可以對(duì)神經(jīng)元起到營養(yǎng)和保護(hù)作用。體外的實(shí)驗(yàn)也表明，在缺血的海馬中加入GDNF能夠有效地降低谷氨酸引起的Ca2+升高，對(duì)海馬隔區(qū)及皮質(zhì)神經(jīng)元Ca2+的升高有抑制作用。

4.3 GDNF對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的作用

GDNF是一種運(yùn)動(dòng)神經(jīng)營養(yǎng)因子，GDNF對(duì)發(fā)育或者成熟的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有神經(jīng)營養(yǎng)活性，是目前發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)因子中作用最強(qiáng)的，其不僅能夠促進(jìn)正常運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活，降低自然發(fā)生的細(xì)胞死亡，還能夠阻止運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的退行性病變，對(duì)軸突損傷后神經(jīng)元胞體有保護(hù)作用，對(duì)已經(jīng)受損的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有營養(yǎng)作用［21］。其功能目前考慮部分與GDNF能夠阻止運(yùn)動(dòng)神經(jīng)乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活性下降的因素有關(guān)。外源性的GDNF能夠支持新生鼠面神經(jīng)元橫斷后的存活，GDNF可以完全阻止新生小鼠脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元橫斷造成的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡和幸存的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的萎縮。研究發(fā)現(xiàn)在含有腦和脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的培養(yǎng)液中加入GDNF基因轉(zhuǎn)染載體細(xì)胞，可以延長這些運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸索的長度，減少正常凋亡。

4.4 GDNF對(duì)神經(jīng)性疼痛和感覺纖維再生的作用

神經(jīng)病理性疼痛是指由中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病引起的疼痛綜合征，目前其發(fā)生機(jī)制尚未完全清楚，正越來越受到醫(yī)學(xué)界的重視，如何更好地控制疼痛的發(fā)作成為研究的重點(diǎn)。雖然臨床上已經(jīng)采用了多種藥物混合治療和其他的鎮(zhèn)痛手段，但療效卻并不十分理想。近來研究表明，GDNF對(duì)初級(jí)傳入神經(jīng)元具有營養(yǎng)和促進(jìn)再生作用，而且與脊髓背角的傷害性感覺形成有關(guān)，因此與神經(jīng)病理性疼痛有著密切的聯(lián)系［22］。這為疼痛的治療提供了一個(gè)新的平臺(tái)。GDNF在缺血損傷后能減輕損傷部位炎癥細(xì)胞的聚集，從而減少了損傷引起的后角Ⅳ～Ⅷ板層神經(jīng)元丟失并提高了突觸素的表達(dá)［23-24］。有研究顯示GDNF在大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)扎(chronic congtriction injury，CCI)疼痛模型實(shí)驗(yàn)中具有明顯的鎮(zhèn)痛作用［25］。Boucher等［26］將大鼠的一側(cè)坐骨神經(jīng)或腰部脊神經(jīng)結(jié)扎后使用GDNF，結(jié)果顯示GDNF可預(yù)防神經(jīng)痛，同時(shí)發(fā)現(xiàn)手術(shù)前后給予GDNF均可逆轉(zhuǎn)手術(shù)所引起的感覺異常，考慮GDNF可能通過阻止了神經(jīng)病理性疼痛時(shí)河豚毒素敏感型鈉通道的過度表達(dá)而發(fā)揮作用。GDNF可以促進(jìn)纖維生長并具有保護(hù)作用，從而可以促進(jìn)感覺纖維的再生。在對(duì)大鼠面神經(jīng)切斷的動(dòng)物模型的研究中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用GDNF后有髓神經(jīng)纖維長入8 mm長的神經(jīng)斷裂缺損溝。

4.5 GDNF對(duì)癲疒間的作用

局部神經(jīng)元同步化的異常放電是癲疒間發(fā)病的重要機(jī)制，目前有證據(jù)表明在神經(jīng)元間、神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞間都存在縫隙連接，而縫隙連接是鈣信號(hào)傳導(dǎo)的主要通路之一。在癲疒間的發(fā)生中，鈣波的傳導(dǎo)起到明顯的作用，同時(shí)在慢性癲疒間模型中可以看到星形膠質(zhì)細(xì)胞普遍增生，有文獻(xiàn)表明GFRα-2受體也是GDNF的受體之一，而GFRα-2受體敲除小鼠又可以明顯減少癲疒間的發(fā)作。更好地調(diào)控膠質(zhì)細(xì)胞增生，調(diào)控鈣信號(hào)從而控制癲疒間發(fā)作成為治療的一個(gè)方向。研究報(bào)道GDNF基因治療可以明顯控制癲疒間發(fā)作［27］。這使GDNF將來用于治療癲疒間成為可能，有望為臨床帶來更好的治療前景。

5 問題與展望

GDNF作為近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的廣譜、高效能的神經(jīng)營養(yǎng)因子，臨床應(yīng)用還不是很完善，對(duì)于其作用途徑還需要進(jìn)一步探究。大腦是人的高級(jí)中樞，腦血管疾病目前已經(jīng)成為第一位致死致殘疾病，腦血管病的二級(jí)預(yù)防尤為重要，如何使難以透過血腦屏障的GDNF進(jìn)入腦內(nèi)，如何更好地調(diào)控GDNF蛋白及其受體的分泌和高表達(dá)，從而發(fā)揮其保護(hù)作用成為目前研究的熱點(diǎn)及重點(diǎn)。隨著對(duì)亞低溫的深入研究，許多研究已證實(shí)亞低溫對(duì)缺血/再灌注損傷后腦組織具有明顯的保護(hù)作用［28-29］，亞低溫是否可以調(diào)控GDNF分泌以及受體的表達(dá)從而在中樞、周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及其他臨床疾病的治療中更好地發(fā)揮作用，仍需要進(jìn)一步的探討與研究。

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篇10

大量事實(shí)證明,癌癥患者生命期不僅取決于病情和醫(yī)療措施,而且與患者自身的精神狀態(tài)密切相關(guān)。調(diào)查結(jié)果表明:癌癥患者確診后產(chǎn)生否認(rèn)、多疑、緊張、悲觀、恐懼、絕望等負(fù)性情緒,對(duì)機(jī)體免疫功能有明顯的抑制作用,嚴(yán)重影響生存率和生活質(zhì)量。所以心理護(hù)理對(duì)癌癥患者非常重要,也是整體護(hù)理的核心內(nèi)容,心理護(hù)理質(zhì)量的高低決定著護(hù)理質(zhì)量的高低。和藹的態(tài)度、精湛的技術(shù)、強(qiáng)烈的責(zé)任心是心理護(hù)理的基礎(chǔ)。護(hù)士要盡可能和患者建立起良好的護(hù)患關(guān)系,為患者創(chuàng)造溫馨舒適的生活環(huán)境,解開患者的心結(jié)醫(yī)學(xué)|教育網(wǎng)搜集,激發(fā)患者生存欲望,使他們走出心理陰霾,樹立和醫(yī)護(hù)人員緊密配合的心理認(rèn)同感。由于患者的思維層次、溝通意愿和對(duì)腫瘤認(rèn)識(shí)存在的差異,實(shí)現(xiàn)與他們的心靈溝通,護(hù)士要有高度的同情心,理解患者的心理活動(dòng)規(guī)律,運(yùn)用一定的技巧,根據(jù)患者情況采用相應(yīng)的方法。有移情法、暗示法、開導(dǎo)法、集體心理治療等。要因人而異,有的放矢。

2、癌癥飲食護(hù)理

由于癌癥導(dǎo)致患者代謝紊亂、負(fù)氮平衡,免疫力低下,白細(xì)胞減少,脫發(fā)等,最終成為惡病質(zhì)。因此對(duì)患者進(jìn)行飲食護(hù)理,改善營養(yǎng)狀況十分必要。護(hù)士要采取各種方法鼓勵(lì)患者進(jìn)食,經(jīng)常更換食譜,變化烹調(diào)方式,注意色、香、味的調(diào)配,給予高熱量、高蛋白,少油膩、易消化的清淡飲食,醫(yī)學(xué)教|育網(wǎng)搜集少食多餐。每天攝入新鮮蔬菜水果,以提高食欲,補(bǔ)充微量營養(yǎng)素,對(duì)進(jìn)行放、化療的患者,要常吃動(dòng)物肝臟、豬血、瘦肉、黑芝麻,蓮子、大棗、枸杞子、桂圓等,以維持正常的血細(xì)胞數(shù)量和功能;建議多進(jìn)食含鉀高的水果,如苷橘、香蕉等,同時(shí)忌煙酒、濃茶、咖啡及粗糙的食物;如果出現(xiàn)咽喉有灼熱感,口干,吞咽困難等口腔粘膜反應(yīng),應(yīng)給患者經(jīng)常漱口,保持口腔濕潤,食物制成肉汁、肉湯一起進(jìn)食,有助于吞咽,從而提高患者的進(jìn)食量。盡力創(chuàng)造干凈、舒適、清潔的病房進(jìn)食環(huán)境。

3、癌癥姑息護(hù)理

姑息護(hù)理是新興的學(xué)科,是對(duì)根治性治療無反應(yīng)的患者積極的整體關(guān)懷護(hù)理,即通過早期識(shí)別、積極評(píng)估、控制疼痛和治療其他痛苦癥狀,擺脫軀體、心理、社會(huì)和宗教的困擾,從而改變患者及親人的生活質(zhì)量。姑息護(hù)理強(qiáng)調(diào)四全服務(wù),即全人、全家、全程、全隊(duì)。通過團(tuán)隊(duì)的方法提供整體護(hù)理,把患者、家屬作為照護(hù)單元。不主張實(shí)施可能給患者增添痛苦和無意義的治療或過度治療,強(qiáng)調(diào)減輕痛苦,讓患者平靜、安然、有尊嚴(yán)地離開人世,即優(yōu)化生命末端質(zhì)量。

姑息護(hù)理的基本內(nèi)容有:

①控制癥狀,特別是控制疼痛,包括PCA技術(shù),WHO推薦癌癥鎮(zhèn)痛三階梯止痛法,藥物阻滯,放射治療,基因治療等。

②支持患者,讓患者參與決策,尊重其自。告知病情及進(jìn)程,與患者商量護(hù)理計(jì)劃,及時(shí)反饋治療效果,提供必要的信息來源和社會(huì)支持。

③支持家屬,姑息護(hù)理視患者和家屬為整體?；颊哂H屬存在遷就、絕望、厭煩、疑慮、恐懼死亡的心理,護(hù)士應(yīng)同情和理解他們,耐心傾聽他們意見和要求,并指導(dǎo)他們承認(rèn)現(xiàn)實(shí),從容應(yīng)對(duì),在患者面前保持良好心態(tài)。

④死亡教育:要讓患者清楚,死亡是人生發(fā)展的必然結(jié)果,從某種意義上講,死亡是痛苦的自然解脫方式。面對(duì)死亡,不要惋惜,要順其自然,更無須后顧之憂,親人自會(huì)平安生活,未盡事業(yè)后繼有人,讓患者達(dá)到“生如春之燦爛,死如秋之靜美”的境界.

4、癌癥音樂護(hù)理

音樂作為一種非語言性溝通手段,常常在進(jìn)入人的深層意識(shí)時(shí),能優(yōu)于單純于運(yùn)用語言治療的方法,起到普通心理療法達(dá)不到的效果。不同樂曲作用于人的感覺器官,產(chǎn)生鎮(zhèn)靜情緒、改善睡眠、增進(jìn)食欲、緩解疼痛等不同作用。

音樂護(hù)理的方法:

①音樂演奏法:由患者自己演奏音樂,以達(dá)到充分散發(fā)壓力和感情的目的。也可以組合演奏。

②音樂欣賞法:護(hù)士根據(jù)情況安排一定的時(shí)間聽音樂或播放歌曲?；颊咄ㄟ^聽覺、視覺等欣賞音樂,用音樂本身具有的內(nèi)在涵義及魅力幫助患者康復(fù)。

音樂對(duì)癌癥患者生活質(zhì)量有較好的干預(yù)作用。李桂蘭等報(bào)道:音樂療法有助于癌癥患者情緒穩(wěn)定,減輕其在化療過程中產(chǎn)生的焦慮、恐懼等不良心理反應(yīng),提高機(jī)體的自我調(diào)節(jié)能力。萬永慧等?認(rèn)為:音樂療法可減少癌癥患者的狀態(tài)焦慮和特質(zhì)焦慮,是一種受患者歡迎的輔助治療方法。王保勝等研究結(jié)果表明:音樂療法可較快改善癌癥患者的焦慮、抑郁的心理狀態(tài),對(duì)患者有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛作用,并能減輕因放療引起的惡心、乏力等癥狀。

5、癌癥疼痛護(hù)理

據(jù)報(bào)道每天有350萬以上的癌癥患者有疼痛癥狀,晚期癌癥患者70%左右以疼痛為主訴,其中5O%屬于劇烈疼痛,對(duì)患者生存產(chǎn)生極大負(fù)面影響。近年來,國內(nèi)外控制疼痛的方法不斷發(fā)展及完善。

大家普遍認(rèn)為,護(hù)士首先要掌握癌性疼痛的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),英國的Weng—Baker面部表情量表,采用六種面部表情,從微笑到悲傷甚至哭泣來表達(dá)疼痛的程度,各年齡組從三歲至很虛弱的老人,該方法經(jīng)大量使用后,都肯定了其實(shí)用性和合理性疼痛護(hù)理方法包括:①建立家庭式病室,給患者創(chuàng)造一個(gè)良好的環(huán)境,病室的布置要安靜整潔,優(yōu)美溫馨。②建立良好的護(hù)患關(guān)系,護(hù)士要做到語言文明,醫(yī)學(xué)教|育網(wǎng)搜集舉止端莊,操作熟練,以取得患者的信任,使患者敢于面對(duì)現(xiàn)實(shí),積極配合治療,頑強(qiáng)地與疼痛作斗爭。③藥物止痛,在止痛藥的應(yīng)用上要有長期安排,打破按需給藥的舊觀念,采用分階段復(fù)合給藥方式,使疼痛在尚未開始或剛開始便得到控制,保證藥物在體內(nèi)維持一定濃度,這樣不僅能避免劑量的逐漸增大,還可減少患者對(duì)疼痛的恐懼感。④其他方法:包括患者的自我控制止痛法(PCA)、藥物阻滯,破壞神經(jīng)痛覺通路法及神經(jīng)外科手術(shù)方法等。

護(hù)士要掌握患者疼痛的信息,正確評(píng)估疼痛的程度,根據(jù)患者不同情況,做出及時(shí)有效的處理。

6、癌癥社會(huì)支持護(hù)理

社會(huì)支持指來自家庭、親屬、同事、工會(huì)等社會(huì)各方面所給予的精神、物質(zhì)上的幫助和支援。社會(huì)支持能促使患者使用更多的積極應(yīng)對(duì)策略,提高患者免疫力和適應(yīng),減輕心身癥狀。癌癥的診斷使幾乎所有的患者產(chǎn)生適應(yīng)困難,他們需要來自多方面的支持醫(yī)學(xué)教|育網(wǎng)搜集。護(hù)士有責(zé)任做好這方面的工作,為患者提供社會(huì)支持的有效途徑,調(diào)動(dòng)有效的社會(huì)支持來源,指導(dǎo)患者積極尋求支持,讓患者有心理歸屬感。在癌癥護(hù)理中向患者提供有效的社會(huì)支持可以通過以下途徑。

①學(xué)習(xí)有關(guān)社會(huì)支持及其與心身健康關(guān)系的知識(shí),掌握有關(guān)社會(huì)支持及其與心身健康關(guān)系的知識(shí)是護(hù)士提供支持的前提。

②熟悉對(duì)社會(huì)支持進(jìn)行評(píng)定的手段,護(hù)士通過觀察、訪談,了解患者社會(huì)支持及其變化,護(hù)士還要使用社會(huì)支持問卷等專門的測評(píng)工具,以便更為精確地對(duì)患者的社會(huì)支持進(jìn)行定量。

③使用支持、表達(dá)式心理治療,護(hù)士本身就是患者的十分重要的社會(huì)支持來源。護(hù)士通過勸導(dǎo)、啟發(fā)、鼓勵(lì)、支持、解釋、積極暗示、提供保證等,讓患者發(fā)泄消極情緒,樹立戰(zhàn)勝疾病的信心,感受社會(huì)支持的強(qiáng)大力量。

④加強(qiáng)患者間的互相支持,護(hù)士在病房創(chuàng)建一種積極的氣氛,讓患者受到正性的影響。同時(shí)護(hù)士應(yīng)主動(dòng)地獲得有關(guān)康復(fù)患者的資料,用典型事例,現(xiàn)身說法,使自己的說教更有說服力和權(quán)威性。