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【摘要】目的通過觀察重癥急性胰腺炎（SAP）大鼠白介素-8（IL-8）、白介素-10（IL-10）及胰腺NF-κB的表達(dá)，探討重癥急性胰腺炎的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。方法將40只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（假手術(shù)組）、模型組（重癥急性胰腺炎組），每組20只，造模后24h測(cè)定血淀粉酶、IL-8及IL-10，切取相同部位的胰腺組織觀察組織病理學(xué)改變，進(jìn)行NF-κB的免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果模型組大鼠血清淀粉酶、IL-8及IL-10的濃度均顯著高于對(duì)照組，模型組NF-κB免疫組化染色較對(duì)照組顯著增強(qiáng)。結(jié)論IL-8、IL-10及NF-κB在重癥急性胰腺炎的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，重癥急性胰腺炎的早期即有胰腺組織NF-κB的活化。

【關(guān)鍵詞】重癥急性胰腺炎白介素-8白介素-10核因子-κB

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheexpressionofnuclearfactor-kappaB(NF-кB),seruminterleukin-8(IL-8)andinterleukin-10(IL-10)insevereacutepancreatitis(SAP)inrats.Andtoinvestigatetherolesofactivatednuclearfactor-kappaB(NF-κB)andserumIL-8andIL-10inSAP.Methods40Wistarratswererandomlydividedintonormalcontrolgroup(Shamoperationgroup)andmodelgroup(SAPgroup).Therewere20ratsineachgroup.Levelsofserumamylase,IL-8,IL-10andactivatedNF-κBinthepancreatictissueweredetected24hoursafteroperations.ResultsThelevelsofIL-8andIL-10inserumSAPweresignificantlyhigherthanthoseinnormalcontrolgroup.ActivatedNF-κBwasenhancedinSAPgroupcomparedwithShamoperationgroup.ConclusionsIL-8,IL-10andNF-κBplayanimportantroleinsevereacutepancreatitis.TherewasactivatedNF-κBattheearlystageofsevereacutepancreatitis.

【KeyWords】SevereacutepancreatitisInterleukin-8Interleukin-10Nuclearfactor-kappaB

重癥急性胰腺炎（severeacutepancreatitis,SAP）是由多因素誘發(fā)、多個(gè)臟器受累、病情兇險(xiǎn)、發(fā)展迅速、病死率高的內(nèi)科急重癥，而多器官功能障礙綜合征（multipleorgandysfunctionsyndrome,MODS）或者多器官功能衰竭（multipleorganfailure,MOF）是SAP的主要死亡原因。損傷因子（如異常激活的胰酶）導(dǎo)致各種炎癥細(xì)胞的過度激活，形成亢進(jìn)的免疫反應(yīng)，并釋放多種炎性介質(zhì)，啟動(dòng)全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemicinflammatoryresponsesyndrome,SIRS），在機(jī)體受到促炎細(xì)胞因子損傷引起SIRS的同時(shí)，機(jī)體的防御系統(tǒng)也隨之發(fā)生反應(yīng),合成并釋放抗炎細(xì)胞因子，引起代償性抗炎反應(yīng)綜合征(compensatoryanti-inflammatoryresponsesyndrome,CARS)［1］。無論失控的SIRS，還是過度的CARS，均表現(xiàn)為機(jī)體致炎-抗炎因素的失衡，機(jī)體穩(wěn)態(tài)破壞，均可導(dǎo)致炎癥損害加重。在SAP時(shí)，大量細(xì)胞因子產(chǎn)生，促炎因子和抗炎因子共存，其中包括促炎細(xì)胞因子IL-8和抗炎細(xì)胞因子IL-10［2］。核因子-κB（nuclearfactorkappaB,NF-κB）活化是眾多炎癥介質(zhì)作用機(jī)制的共同通道，諸多炎癥因子在基因水平上都受到NF-κB的調(diào)控。作者自2006年8月至2007年3月通過建立大鼠重癥急性胰腺炎模型，觀察血清中IL-8、IL-10的變化以及胰腺NF-κB的表達(dá)，探討重癥急性胰腺炎的形成機(jī)制。

1材料和方法

1.1動(dòng)物及分組

40只Wistar大鼠（購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），體重250～300g，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（假手術(shù)組）、重癥急性胰腺炎組（模型組），每組20只。各組于術(shù)后24h全部處死，留取標(biāo)本。動(dòng)物飼養(yǎng)：所有大鼠均給予普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，飼養(yǎng)環(huán)境為每籠4只，人工光循環(huán)12h/12h，溫度為(21±2.0)℃，濕度為(55±2)%。

1.2化學(xué)試劑

兔抗鼠的NF-κB單克隆抗體購自北京中山生物技術(shù)有限公司,大鼠血清IL-8和IL-10的ELISA試劑盒購自R&Dsystems。

1.3重癥急性胰腺炎模型的制備

大鼠術(shù)前禁食、不禁水12h，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉（300mg/kg）。無菌條件下取上腹正中切口入腹，尋找膽胰管十二指腸乳頭開口，使用一次性靜脈留置套管針于對(duì)系膜緣腸壁穿刺，進(jìn)入腸腔后即將針芯退出，將套管經(jīng)乳頭部逆行插入膽胰管約1cm，以無損傷小動(dòng)脈夾于肝門部阻斷膽管后，套管末端接微量泵，以0.1ml/min的速度勻速注入5%?；悄懰徕c（1ml/kg體重），注畢后拔管，胰腺組織可在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)充血、水腫，可見包膜下胰腺組織點(diǎn)狀或小片狀出血，5min后去除小動(dòng)脈夾，以無損傷縫線縫合腸壁穿刺孔處，關(guān)腹。對(duì)照組大鼠開腹后僅翻動(dòng)胰腺數(shù)次后關(guān)腹。

1.4取材方法

大鼠造模后24h以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定，經(jīng)心臟取血，測(cè)定血淀粉酶、IL-8及IL-10；切取相同部位的胰腺組織。

1.5分光光度法檢測(cè)血清淀粉酶

1.6血清IL-8及IL-10測(cè)定（ELISA法）

洗滌液用重蒸水1:20稀釋。底物工作液配制：使用前將OPD片放入底物稀釋中溶解，每片加液5ml。標(biāo)準(zhǔn)品液配制：使用前每管中加入蒸餾水200μl溶解。試劑盒設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔8孔，每孔中各加入樣品稀釋液100μl，第1孔加標(biāo)準(zhǔn)品100μl，混勻后用加樣器吸出100μl，移至第2孔，如此反復(fù)作對(duì)倍稀釋至第7孔，最后，從第7孔中吸出100μl棄去，使之體積均為100μl，第8孔為空白對(duì)照，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測(cè)品孔各加入待測(cè)樣品100ml。將反應(yīng)板充分混勻后置37℃120min。用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌5次，向?yàn)V紙上印干。每孔加第一抗體工作液1滴，將反應(yīng)板置37℃60min。同前洗板。每孔加酶標(biāo)抗體工作液2滴，將反應(yīng)板置37℃60min。同前洗板。每孔加入底物工作液2滴，置37℃暗處反應(yīng)10min。每孔加入1滴終止液混勻。在492nm處測(cè)吸光值。以標(biāo)準(zhǔn)品1000、500、250、125、62、31、16、0pg/ml之OD值在半對(duì)數(shù)紙上作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應(yīng)IL-8及IL-10含量。

1.7病理學(xué)檢查、NF-κB測(cè)定

每個(gè)標(biāo)本切片行HE染色，采用盲法由專科醫(yī)師在光鏡下閱片，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，觀察胰腺組織病理變化。NF-κB免疫組織化學(xué)染色，胰腺腺泡細(xì)胞及胰島細(xì)胞染色為棕黃色的是NF-κB陽性細(xì)胞，以積分法半定量描述所取標(biāo)本的染色情況，每張切片隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野，按染色強(qiáng)度分為4級(jí)：0=陰性染色；1=弱陽性染色；2=中度陽性染色；3=強(qiáng)陽性染色；按陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例分為5級(jí)：0=陰性；1=陽性細(xì)胞1%～25%；2=陽性細(xì)胞26%～50%；3=陽性細(xì)胞51%～75%；4=陽性細(xì)胞76%～100%；每張切片的染色積分以這二者乘積之和表示。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以(x±s)表示，用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，首先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，然后進(jìn)行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1血清淀粉酶，IL-8及IL-10的變化

模型組大鼠血清淀粉酶、IL-8及IL-10的濃度均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。表1各組大鼠血清淀粉酶、IL-8、IL-10及NF-κB水平（略）

2.2各組大鼠胰腺的組織病理學(xué)變化

胰腺組織學(xué)改變：對(duì)照組胰腺組織光鏡下各時(shí)段無明顯改變，胰腺腺泡細(xì)胞排列緊密，可見胰島，無中性粒細(xì)胞浸潤；模型組則見間質(zhì)水腫，大片腺泡細(xì)胞變性壞死，伴有大量粒細(xì)胞浸潤。對(duì)照組大鼠胰腺組織NF-κB免疫組織化學(xué)染色，腺泡細(xì)胞未見陽性細(xì)胞，胰島細(xì)胞的胞漿呈淡黃色；模型組可見多數(shù)胰腺腺泡細(xì)胞胞漿呈棕黃色，胰島細(xì)胞胞漿呈棕黃色，部分胰島細(xì)胞的胞核亦呈棕黃色，染色范圍較對(duì)照組明顯增大，染色強(qiáng)度較對(duì)照組明顯增強(qiáng)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表1、圖1～4）。

3討論

急性胰腺炎是常見急腹癥，約10%～15%發(fā)展為重癥急性SAP。其最直接的原因是病程早期出現(xiàn)嚴(yán)重的SIRS及其它系統(tǒng)并發(fā)癥，如急性呼吸窘迫綜合征和MODS。諸多研究己證實(shí)炎癥細(xì)胞過度激活及炎性細(xì)胞因子的過度表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡在SAP中起著關(guān)鍵性作用，并同上述并發(fā)癥密切相關(guān)。NF-κB活化是眾多炎癥介質(zhì)作用機(jī)制的共同通道，諸多炎癥因子在基因水平上都受到NF-κB的調(diào)控。NF-κB是一種具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的蛋白，p50/p65異源二聚體是NF-κB活化的最常見形式。生理情況下NF-κB同其抑制因子（inhibitorofNF-κB,IκB）結(jié)合以無活性狀態(tài)存在于細(xì)胞漿內(nèi)；疾病過程中，多種因素如病毒、內(nèi)毒素、氧自由基、TNF-a、IL-6、IL-8等均可使其激活，NF-κB由胞漿進(jìn)入核內(nèi)，與其靶基因上的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控多種細(xì)胞因子和免疫介質(zhì)的表達(dá)，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)，促炎因子和抗炎因子共存,其中包括促炎細(xì)胞因子IL-8和抗炎細(xì)胞因子IL-10［2］。

1997年Dunn等［3］首先發(fā)現(xiàn)NF-κB的活化是AP發(fā)生中的重要早期事件，隨后Altavilla等［4］發(fā)現(xiàn)雨蛙素誘導(dǎo)的大鼠水腫性AP胰腺組織中NF-κB的活性在疾病的早期有明顯的升高。Osman等［5］把IL-10類似劑應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)性AP動(dòng)物模型后，發(fā)現(xiàn)血清TNF-a和IL-8水平下降，腹水量減少，中性粒細(xì)胞浸潤和趨化以及肺組織CD11B/CD18陽性細(xì)胞功能明顯受到抑制，生存率明顯改善。在體外試驗(yàn)中，Olivier［6］發(fā)現(xiàn)IL-10可以通過抑制IκB激酶復(fù)合體來抑制NF-κB的活性，從而減少支氣管上皮細(xì)胞中IL-8的表達(dá)。

本研究表明在重癥急性胰腺炎的早期胰腺組織即有NF-κB的活化，IL-8，IL-10及NF-κB在重癥急性胰腺炎的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，重癥急性胰腺炎時(shí)機(jī)體致炎-抗炎因素失衡，IL-10可能有助于促進(jìn)致炎-抗炎因素的平衡，減輕重癥急性胰腺炎時(shí)的炎癥反應(yīng)。

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3DunnJA,LiC,HaT,etal.TherapeuticmodificationofnuclearfactorkappaBbindingactivityandtumornecrosisfactor-alphageneexpressionduringacutebiliarypancreatitis.AmSurg,1997,63(12):1036～1043.

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