導(dǎo)語：細(xì)胞原位雜交方法研究論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

摘要目的：建立NPYmRNA的細(xì)胞原位雜交檢測(cè)方法，并以NGF為誘導(dǎo)因子研究Dex對(duì)大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞中NPYmRNA表達(dá)的影響。方法：采用細(xì)胞原位雜交方法。結(jié)果：NGF具有誘導(dǎo)NPY基因表達(dá)的生物學(xué)效應(yīng)且呈劑量效應(yīng)關(guān)系；Dex對(duì)NPYmRNA表達(dá)具有雙相調(diào)節(jié)效應(yīng)，即早期(<8h)可促進(jìn)NGF的誘導(dǎo)作用，而晚期(>16h)則具有抑制作用(P<0.01)，但單獨(dú)Dex對(duì)NPYmRNA表達(dá)無顯著影響。結(jié)論：可以用細(xì)胞原位雜交方法檢測(cè)NPYmRNA在細(xì)胞中的表達(dá)。

關(guān)鍵詞神經(jīng)肽Y細(xì)胞原位雜交mRNA

TheexpressionofNeuropeptideYmRNAinPC12celllinesdetectedbyinsituhybridization

ZHANGLiang-Lin,YANGGui-Zhen.

DepartmentofImmunology,NormanBethuneUniversityofMedicalSciences,Changchun130021

AbstractObjective:TheexpressionofNeuropeptideY(NPY)mRNAwasdetectedinPC12.Method:Cellularinsituhybridization.Results:NGFcaninducetheexpressionofNPYmRNAinPC12cellswiththerelationshipsofdosage-effectandtime-effect.Dexamethasone(Dex)potentiatedsignificantly(P<0.01)thestimulationbyNGFatearlytimes(<8h),butstronglysuppressed(P<0.01)itatlatertimes(16h).TheresultsalsoappearedthatNPYmRNAabundancecouldntbeeffectedbyDexalone.Conclusion:ThedetectionofexpressionNPYmRNAcanusemethodofcellularinsituhybridization.

KeywordsNeuropeptideYInsituhybridizationmRNA

NPY具有廣泛的生物學(xué)活性并參與機(jī)體的多種病理生理過程，其在體內(nèi)表達(dá)異常與許多疾病關(guān)系密切，但機(jī)制未明，因此開展NPY基因表達(dá)調(diào)控的研究對(duì)深入地認(rèn)識(shí)其在疾病發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中的作用具有較重要的理論和臨床意義。在本室系列工作的基礎(chǔ)上［1-4］，本文建立了NPY基因表達(dá)的細(xì)胞原位雜交檢測(cè)方法，并初步開展NPY基因的表達(dá)調(diào)控研究。

1材料與方法

1.1材料PC12細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞所細(xì)胞庫)。隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒(Promega公司)；〔α-35S〕dATP(杜邦公司)；rhNGF(邦定生物醫(yī)學(xué)公司)，蛋白酶K、RNaseA(Sigma公司)，核4乳膠(北京原子能研究所)，地塞米松(Dex)、去離子甲酰胺、APES和多聚甲醛(華美公司)，小牛血清(杭州四季青)，馬血清(解放軍農(nóng)牧大學(xué))，IMDM(GIBCO公司)。OlympusPM-10AD顯微鏡。TA-NPY質(zhì)粒由本室保存。

1.2探針制備常規(guī)方法擴(kuò)增質(zhì)粒后回收NPYcDN段，按隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒說明制備35S-NPYcDNA探針，純化后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞置含5%小牛血清、10%馬血清的IMDM中培養(yǎng)后，接種于24孔培養(yǎng)板(1×106/孔)，加不同刺激物作用不同時(shí)間后，收集細(xì)胞用于標(biāo)本制備。

1.4細(xì)胞內(nèi)mRNA原位雜交

1.4.1載玻片和蓋玻片的預(yù)處理載玻片經(jīng)清洗潔凈后于180℃烤4h以上，涂APES(按1∶49比例用丙酮配制)，室溫涼干后置-20℃保存?zhèn)溆?。蓋玻片經(jīng)硅化液浸泡10min，95%乙醇沖洗，180℃烘烤4h以上備用。

1.4.2細(xì)胞標(biāo)本制備用0.01mol/LPBS(pH7.4)洗細(xì)胞懸液2次，調(diào)細(xì)胞數(shù)至1×105ml-1，混勻后取0.1ml用Cytospin離心涂片，室溫自然涼干后于4%多聚甲醛固定10min，轉(zhuǎn)移至0.01mol/LPBS(pH7.4)10min，經(jīng)系列酒精脫水，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3原位雜交標(biāo)本過95%、80%、70%序列乙醇，DEPC處理過后用ddH2O沖洗，然后依次加入0.2mol/LHCl室溫20min、2×SSC70℃30min、蛋白酶K混合液(1μg/ml蛋白酶K、200mmol/LTrisHClpH7.4、20mmol/LCaCl2)37℃15min，序列乙醇脫水涼干。將雜交液〔50%甲酰胺、100mmol/LTrisHCl(pH7.5)、1mmol/LEDTA、600mmol/LNaCl、10×Denharts溶液、變性魚精DNA(10μg/ml)和tRNA(250μg/ml)、標(biāo)記探針(1×105cpm)〕30μl滴于標(biāo)本上，蓋上硅化的蓋玻片或用新的parafilm于濕盒中37℃保溫16～18h。雜交結(jié)束后用2×SSC洗蓋玻片，在50%甲酰胺和2×SSC混合液中于37℃洗3次，每次10min；換50%甲酰胺和1×SSC于37℃洗3次，每次10min；1×SSC室溫洗3次，每次10min，經(jīng)序列乙醇脫水涼干。

1.4.4放射自顯影將標(biāo)本涂核4乳膠，待干后于4℃自顯影5～7d，經(jīng)D19顯影F5定影。流水沖洗后做HE染色，顯微鏡下鏡檢計(jì)數(shù)。

1.5結(jié)果判定及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果判定以計(jì)數(shù)20個(gè)細(xì)胞內(nèi)的銀粒數(shù)計(jì)算平均值，進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞原位雜交方法的特異性為確定本方法檢測(cè)NPYmRNA的特異性，特設(shè)立不同對(duì)照組包括未加刺激物的空白對(duì)照組、RNaseA消化組和無探針對(duì)照組(見圖1)。結(jié)果表明，未加任何刺激物的細(xì)胞內(nèi)銀粒數(shù)較低(4.87±1.45)，而經(jīng)NGF(50ng/ml)刺激(24h)后銀粒數(shù)顯著增高(38.61±7.76)(與對(duì)照組比P<0.01，n=20)；后者經(jīng)RNaseA酶(25μg/ml)處理30min后發(fā)現(xiàn)銀粒數(shù)(16.88±5.26)顯著低于未經(jīng)RNaseA消化組(P<0.01，n=20)；而雖然NGF刺激但未加NPYcDNA探針組則只有少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)了1～3個(gè)乳膠非特異顯影形成的銀粒(1.41±1.09)。

2.2NGF劑量與NPYmRNA表達(dá)的相關(guān)性PC12細(xì)胞經(jīng)不同劑量NGF刺激24h后，雜交結(jié)果顯示：隨著劑量增高細(xì)胞質(zhì)中的銀粒數(shù)相應(yīng)增加，具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系(r=0.9950，P<0.01)，見圖2。提示NGF具有誘導(dǎo)PC12細(xì)胞NPY基因表達(dá)的生物學(xué)效應(yīng)。另外亦觀察到隨著NGF濃度增加，PC12細(xì)胞軸突長(zhǎng)出的長(zhǎng)度增加。

2.3NGF誘導(dǎo)NPY基因表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)及Dex對(duì)NGF刺激的調(diào)節(jié)作用PC12細(xì)胞達(dá)50%融合度時(shí)用NGF(60ng/ml)和/或Dex(1μmol/L)處理不同時(shí)間，包括長(zhǎng)時(shí)程(1、2、3、4、5、6d)和短時(shí)程(1、2、4、8、16、32h)，原位雜交結(jié)果顯示短時(shí)程時(shí)，NGF的刺激作用與NPYmRNA表達(dá)具有明顯的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系：Dex單獨(dú)作用不明顯，但對(duì)NGF的誘導(dǎo)作用具有雙相調(diào)節(jié)效應(yīng)，即早期(<8h)具有顯著促進(jìn)作用(P<0.01)，而晚期(>16h)則抑制NGF的刺激作用(P<0.01)，見圖3。長(zhǎng)時(shí)程時(shí)，NGF的刺激作用仍具有時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，在第4天后出現(xiàn)“平臺(tái)”；Dex與NGF聯(lián)合作用時(shí)可下調(diào)NGF的誘導(dǎo)作用，而單獨(dú)Dex則提高NPYmRNA表達(dá)水平，但并無顯著差異，見圖4。

3討論

細(xì)胞原位雜交方法涉及細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)兩方面技術(shù)，在保持細(xì)胞形態(tài)完整情況下與待檢細(xì)胞內(nèi)特定的未知核酸序列相結(jié)合，直接觀察單個(gè)細(xì)胞內(nèi)特定基因表達(dá)水平，所需樣品量少(104細(xì)胞即可)，mRNA表達(dá)相對(duì)較低時(shí)更為實(shí)用，故該方法用于體外較難培養(yǎng)的細(xì)胞(如神經(jīng)細(xì)胞)中基因表達(dá)的研究則更實(shí)用。本文建立的NPYmRNA表達(dá)的細(xì)胞原位雜交檢測(cè)方法，通過建立陽性、陰性對(duì)照及RNaseA加NGF作用組，結(jié)果顯示這一方法的準(zhǔn)確性和可靠性。目前檢測(cè)原位雜交結(jié)果(包括細(xì)胞和組織原位雜交)國(guó)外已較普遍使用圖像掃描分析進(jìn)行定量；國(guó)內(nèi)目前尚未普及，大多仍采用顯微鏡(油鏡)下計(jì)數(shù)銀粒的半定量方式統(tǒng)計(jì)原位雜交檢測(cè)結(jié)果。本文在研究過程中采用盲法以三人計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值為準(zhǔn)，每份標(biāo)本計(jì)數(shù)20個(gè)細(xì)胞內(nèi)的銀粒數(shù)，求均值后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以排除主觀因素的干擾。

機(jī)體內(nèi)NPY基因表達(dá)異常與多種疾病有關(guān)，如近年研究顯示NPY參與肥胖基因表達(dá)調(diào)控，提示對(duì)NPY基因表達(dá)調(diào)控研究具有重要的理論和臨床意義。本文建立NPYmRNA原位雜交檢測(cè)方法為進(jìn)一步基因表達(dá)調(diào)控研究打下了基礎(chǔ)。

用細(xì)胞原位雜交方法檢測(cè)NPYmRNA在PC12細(xì)胞中的表達(dá)本課題受國(guó)家自然科學(xué)基金資助(39370622)

張亮林通信地址：中科院上海生化所55號(hào)信箱，上海200031

作者簡(jiǎn)介：張亮林，男，33歲，醫(yī)學(xué)博士，現(xiàn)為中科院上海生化所博士后

作者單位：(白求恩醫(yī)科大學(xué)免疫教研室，長(zhǎng)春130021)

4參考文獻(xiàn)

1麻彤暉，于永利，楊貴貞.大鼠NPY前體融合蛋白在大腸桿菌中的超表達(dá).中國(guó)免疫學(xué)雜志，1994；10(5)：298

2張亮林，楊貴貞.大鼠神經(jīng)肽YcDNA克隆、測(cè)序及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建.中國(guó)免疫學(xué)雜志，1996；12(2)：1

3張亮林，楊貴貞.截肢應(yīng)激大鼠HPAA-脾靶器官中NPY陽性細(xì)胞數(shù)的變化.中國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，1996；1(1)：23

4張亮林，楊貴貞.大鼠神經(jīng)肽Y基因在COS-7細(xì)胞中的表達(dá).中國(guó)免疫學(xué)雜志，1996；12(6)：331