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摘要目的：建立NPYmRNA的細胞原位雜交檢測方法，并以NGF為誘導(dǎo)因子研究Dex對大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞中NPYmRNA表達的影響。方法：采用細胞原位雜交方法。結(jié)果：NGF具有誘導(dǎo)NPY基因表達的生物學(xué)效應(yīng)且呈劑量效應(yīng)關(guān)系；Dex對NPYmRNA表達具有雙相調(diào)節(jié)效應(yīng)，即早期(<8h)可促進NGF的誘導(dǎo)作用，而晚期(>16h)則具有抑制作用(P<0.01)，但單獨Dex對NPYmRNA表達無顯著影響。結(jié)論：可以用細胞原位雜交方法檢測NPYmRNA在細胞中的表達。

關(guān)鍵詞神經(jīng)肽Y細胞原位雜交mRNA

TheexpressionofNeuropeptideYmRNAinPC12celllinesdetectedbyinsituhybridization

ZHANGLiang-Lin,YANGGui-Zhen.

DepartmentofImmunology,NormanBethuneUniversityofMedicalSciences,Changchun130021

AbstractObjective:TheexpressionofNeuropeptideY(NPY)mRNAwasdetectedinPC12.Method:Cellularinsituhybridization.Results:NGFcaninducetheexpressionofNPYmRNAinPC12cellswiththerelationshipsofdosage-effectandtime-effect.Dexamethasone(Dex)potentiatedsignificantly(P<0.01)thestimulationbyNGFatearlytimes(<8h),butstronglysuppressed(P<0.01)itatlatertimes(16h).TheresultsalsoappearedthatNPYmRNAabundancecouldntbeeffectedbyDexalone.Conclusion:ThedetectionofexpressionNPYmRNAcanusemethodofcellularinsituhybridization.

KeywordsNeuropeptideYInsituhybridizationmRNA

NPY具有廣泛的生物學(xué)活性并參與機體的多種病理生理過程，其在體內(nèi)表達異常與許多疾病關(guān)系密切，但機制未明，因此開展NPY基因表達調(diào)控的研究對深入地認識其在疾病發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中的作用具有較重要的理論和臨床意義。在本室系列工作的基礎(chǔ)上［1-4］，本文建立了NPY基因表達的細胞原位雜交檢測方法，并初步開展NPY基因的表達調(diào)控研究。

1材料與方法

1.1材料PC12細胞(中科院上海細胞所細胞庫)。隨機引物標記試劑盒(Promega公司)；〔α-35S〕dATP(杜邦公司)；rhNGF(邦定生物醫(yī)學(xué)公司)，蛋白酶K、RNaseA(Sigma公司)，核4乳膠(北京原子能研究所)，地塞米松(Dex)、去離子甲酰胺、APES和多聚甲醛(華美公司)，小牛血清(杭州四季青)，馬血清(解放軍農(nóng)牧大學(xué))，IMDM(GIBCO公司)。OlympusPM-10AD顯微鏡。TA-NPY質(zhì)粒由本室保存。

1.2探針制備常規(guī)方法擴增質(zhì)粒后回收NPYcDN段，按隨機引物標記試劑盒說明制備35S-NPYcDNA探針，純化后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3細胞培養(yǎng)PC12細胞置含5%小牛血清、10%馬血清的IMDM中培養(yǎng)后，接種于24孔培養(yǎng)板(1×106/孔)，加不同刺激物作用不同時間后，收集細胞用于標本制備。

1.4細胞內(nèi)mRNA原位雜交

1.4.1載玻片和蓋玻片的預(yù)處理載玻片經(jīng)清洗潔凈后于180℃烤4h以上，涂APES(按1∶49比例用丙酮配制)，室溫涼干后置-20℃保存?zhèn)溆谩Ｉw玻片經(jīng)硅化液浸泡10min，95%乙醇沖洗，180℃烘烤4h以上備用。

1.4.2細胞標本制備用0.01mol/LPBS(pH7.4)洗細胞懸液2次，調(diào)細胞數(shù)至1×105ml-1，混勻后取0.1ml用Cytospin離心涂片，室溫自然涼干后于4%多聚甲醛固定10min，轉(zhuǎn)移至0.01mol/LPBS(pH7.4)10min，經(jīng)系列酒精脫水，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3原位雜交標本過95%、80%、70%序列乙醇，DEPC處理過后用ddH2O沖洗，然后依次加入0.2mol/LHCl室溫20min、2×SSC70℃30min、蛋白酶K混合液(1μg/ml蛋白酶K、200mmol/LTrisHClpH7.4、20mmol/LCaCl2)37℃15min，序列乙醇脫水涼干。將雜交液〔50%甲酰胺、100mmol/LTrisHCl(pH7.5)、1mmol/LEDTA、600mmol/LNaCl、10×Denharts溶液、變性魚精DNA(10μg/ml)和tRNA(250μg/ml)、標記探針(1×105cpm)〕30μl滴于標本上，蓋上硅化的蓋玻片或用新的parafilm于濕盒中37℃保溫16～18h。雜交結(jié)束后用2×SSC洗蓋玻片，在50%甲酰胺和2×SSC混合液中于37℃洗3次，每次10min；換50%甲酰胺和1×SSC于37℃洗3次，每次10min；1×SSC室溫洗3次，每次10min，經(jīng)序列乙醇脫水涼干。

1.4.4放射自顯影將標本涂核4乳膠，待干后于4℃自顯影5～7d，經(jīng)D19顯影F5定影。流水沖洗后做HE染色，顯微鏡下鏡檢計數(shù)。

1.5結(jié)果判定及統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果判定以計數(shù)20個細胞內(nèi)的銀粒數(shù)計算平均值，進行t檢驗。

2結(jié)果

2.1細胞原位雜交方法的特異性為確定本方法檢測NPYmRNA的特異性，特設(shè)立不同對照組包括未加刺激物的空白對照組、RNaseA消化組和無探針對照組(見圖1)。結(jié)果表明，未加任何刺激物的細胞內(nèi)銀粒數(shù)較低(4.87±1.45)，而經(jīng)NGF(50ng/ml)刺激(24h)后銀粒數(shù)顯著增高(38.61±7.76)(與對照組比P<0.01，n=20)；后者經(jīng)RNaseA酶(25μg/ml)處理30min后發(fā)現(xiàn)銀粒數(shù)(16.88±5.26)顯著低于未經(jīng)RNaseA消化組(P<0.01，n=20)；而雖然NGF刺激但未加NPYcDNA探針組則只有少數(shù)細胞出現(xiàn)了1～3個乳膠非特異顯影形成的銀粒(1.41±1.09)。

2.2NGF劑量與NPYmRNA表達的相關(guān)性PC12細胞經(jīng)不同劑量NGF刺激24h后，雜交結(jié)果顯示：隨著劑量增高細胞質(zhì)中的銀粒數(shù)相應(yīng)增加，具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系(r=0.9950，P<0.01)，見圖2。提示NGF具有誘導(dǎo)PC12細胞NPY基因表達的生物學(xué)效應(yīng)。另外亦觀察到隨著NGF濃度增加，PC12細胞軸突長出的長度增加。

2.3NGF誘導(dǎo)NPY基因表達的時間效應(yīng)及Dex對NGF刺激的調(diào)節(jié)作用PC12細胞達50%融合度時用NGF(60ng/ml)和/或Dex(1μmol/L)處理不同時間，包括長時程(1、2、3、4、5、6d)和短時程(1、2、4、8、16、32h)，原位雜交結(jié)果顯示短時程時，NGF的刺激作用與NPYmRNA表達具有明顯的時間效應(yīng)關(guān)系：Dex單獨作用不明顯，但對NGF的誘導(dǎo)作用具有雙相調(diào)節(jié)效應(yīng)，即早期(<8h)具有顯著促進作用(P<0.01)，而晚期(>16h)則抑制NGF的刺激作用(P<0.01)，見圖3。長時程時，NGF的刺激作用仍具有時間效應(yīng)關(guān)系，在第4天后出現(xiàn)“平臺”；Dex與NGF聯(lián)合作用時可下調(diào)NGF的誘導(dǎo)作用，而單獨Dex則提高NPYmRNA表達水平，但并無顯著差異，見圖4。

3討論

細胞原位雜交方法涉及細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)兩方面技術(shù)，在保持細胞形態(tài)完整情況下與待檢細胞內(nèi)特定的未知核酸序列相結(jié)合，直接觀察單個細胞內(nèi)特定基因表達水平，所需樣品量少(104細胞即可)，mRNA表達相對較低時更為實用，故該方法用于體外較難培養(yǎng)的細胞(如神經(jīng)細胞)中基因表達的研究則更實用。本文建立的NPYmRNA表達的細胞原位雜交檢測方法，通過建立陽性、陰性對照及RNaseA加NGF作用組，結(jié)果顯示這一方法的準確性和可靠性。目前檢測原位雜交結(jié)果(包括細胞和組織原位雜交)國外已較普遍使用圖像掃描分析進行定量；國內(nèi)目前尚未普及，大多仍采用顯微鏡(油鏡)下計數(shù)銀粒的半定量方式統(tǒng)計原位雜交檢測結(jié)果。本文在研究過程中采用盲法以三人計數(shù)結(jié)果的平均值為準，每份標本計數(shù)20個細胞內(nèi)的銀粒數(shù)，求均值后進行統(tǒng)計學(xué)分析，以排除主觀因素的干擾。

機體內(nèi)NPY基因表達異常與多種疾病有關(guān)，如近年研究顯示NPY參與肥胖基因表達調(diào)控，提示對NPY基因表達調(diào)控研究具有重要的理論和臨床意義。本文建立NPYmRNA原位雜交檢測方法為進一步基因表達調(diào)控研究打下了基礎(chǔ)。

用細胞原位雜交方法檢測NPYmRNA在PC12細胞中的表達本課題受國家自然科學(xué)基金資助(39370622)

張亮林通信地址：中科院上海生化所55號信箱，上海200031

作者簡介：張亮林，男，33歲，醫(yī)學(xué)博士，現(xiàn)為中科院上海生化所博士后

作者單位：(白求恩醫(yī)科大學(xué)免疫教研室，長春130021)

4參考文獻

1麻彤暉，于永利，楊貴貞.大鼠NPY前體融合蛋白在大腸桿菌中的超表達.中國免疫學(xué)雜志，1994；10(5)：298

2張亮林，楊貴貞.大鼠神經(jīng)肽YcDNA克隆、測序及哺乳動物細胞表達載體的構(gòu)建.中國免疫學(xué)雜志，1996；12(2)：1

3張亮林，楊貴貞.截肢應(yīng)激大鼠HPAA-脾靶器官中NPY陽性細胞數(shù)的變化.中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，1996；1(1)：23

4張亮林，楊貴貞.大鼠神經(jīng)肽Y基因在COS-7細胞中的表達.中國免疫學(xué)雜志，1996；12(6)：331