導(dǎo)語(yǔ)：妊娠晚期抗病毒免疫阻斷治療新生兒血清研究論文一文來(lái)源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀(guān)點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢(xún)客服老師，歡迎參考。

【關(guān)鍵詞】宮內(nèi)感染InfluenceonserumhepatitisBvirustranscriptsinnewbornsbyHBIGimmunoblockingtherapyduringthelaterstageofpregnancy【Abstract】AIM:ToinvestigatethesignificanceofviraltranscriptsinearlystagediagnosisofHBVverticaltransmission,andtoobservetheinfluenceofHBIGimmunoblockingtherapyonserumHBVRNAinnewbornsfromHBVcarriermothers.METHODS:FortysixHBsAgpositivepregnantwomenweretreatedwithantiHBVimmunotherapy(HBIG200IU/4weeksandLimidazolewasappliedasliniment10mg/week)since26weekpregnancy.Theother23weretakenascontrolswithoutanyantiHBVtherapy.Viralnucleicacidswereextractedfromseraofmothersbeforetherapyandfromseraofnewborns.HBVDNAandRNAs,includingthefulllengthandtruncatedRNAmolecules,wereamplifiedrespectivelythroughPCRandRTPCRtargetedtotheHBVXproteinencodingregion.RESULTS:SerumHBVDNAinnewbornswasonlyfoundwhentheirmothershadnotbeentreated.CirculatingviralRNAwasdetectedinmorethanhalfofthenewbornsirrespectiveoftreatmentofmothers.However,inthenewbornsoftreatedmothers,serumRNAwasuniformlyofthetruncatedtype.CONCLUSION:ApplicationofserumHBVRNAisgreatlyhelpfultothediagnosisofearlystageinfectionofnewbornsfromHBVcarriermothers.TruncatedRNAistranscribedfromHBVtemplatesinthenewbornsratherthanbeingtransmittedfrommothertochild,immunoblockingtherapydoesnotinterferewithintrauterineinfection.However,itmayinterferewiththemanifestionofahighreplicativeinfection.【Keywords】hepatitisBvirus;transcript;verticaltransmission;intrauterineinfection;immunotherapy【摘要】目的：探討乙型肝炎病毒（HBV）轉(zhuǎn)錄體在早期診斷HBV母嬰傳播中的意義，并觀(guān)察母親抗乙型肝炎病毒免疫球蛋白（HBIG）免疫阻斷治療對(duì)新生兒血清HBV轉(zhuǎn)錄體的影響．方法：治療組46例HBV表面抗原（HBsAg）陽(yáng)性孕婦自孕26wk開(kāi)始行抗HBV免疫治療（HBIGim,200IU/4wk;同時(shí)使用左旋咪唑涂布劑10mg/wk）；另23例HBsAg）陽(yáng)性孕婦做為對(duì)照組未給予任何抗病毒治療.從孕婦治療前血清及其新生兒血清中提取核酸，經(jīng)PCR及RTPCR擴(kuò)增HBVDNA，全長(zhǎng)型RNA（fRNA）和頓挫型RNA（trRNA），瓊脂糖凝膠電泳顯示產(chǎn)物，Southern雜交進(jìn)一步驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物.結(jié)果：HBVDNA陽(yáng)性?xún)H存在于未接受免疫治療的母親所生新生兒中；超過(guò)半數(shù)的新生兒血清中可檢測(cè)到病毒轉(zhuǎn)錄體RNA，并與其母親是否接受免疫阻斷治療無(wú)關(guān).但是，治療組母親所生新生兒中僅可檢測(cè)到頓挫型病毒轉(zhuǎn)錄體trRNA.結(jié)論：血清HBV轉(zhuǎn)錄體可早期診斷新生兒HBV感染的狀態(tài)；新生兒血清中trRNA的轉(zhuǎn)錄模板可能為新生兒體內(nèi)的病毒DNA;HBIG免疫阻斷治療不能阻斷HBV宮內(nèi)感染，但可以阻止高復(fù)制性感染的發(fā)生.【關(guān)鍵詞】乙型肝炎病毒；轉(zhuǎn)錄體；母嬰傳播；宮內(nèi)感染；免疫療法0引言母嬰傳播是形成慢性HBV感染的重要原因.據(jù)估計(jì)我國(guó)的慢性HBV感染約有30%~50%是通過(guò)母嬰傳播發(fā)生的.對(duì)于未接受治療的母親來(lái)講單獨(dú)HBsAg陽(yáng)性母親的嬰兒，約40%在半歲內(nèi)出現(xiàn)HBsAg陽(yáng)性的所謂“突破性感染”［1-3］.而HBsAg和HBeAg雙陽(yáng)性母親的嬰兒HBsAg陽(yáng)性率高達(dá)90%以上［4］.這些嬰兒多數(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)槁訦BV感染形成新的傳染源，并成為發(fā)生肝細(xì)胞癌（HCC）的高危人群.由于大部分受感染的新生兒延遲出現(xiàn)診斷性的指標(biāo)HBsAg和HBVDNA,再加上部分病毒抗原和抗體可以通過(guò)胎盤(pán)屏障進(jìn)入胎兒體內(nèi)，使得新生兒感染的早期診斷顯得極為復(fù)雜和困難［1,5］.有研究表明，新生兒延遲出現(xiàn)的“突破性感染”發(fā)生在已有的隱匿型感染的基礎(chǔ)上［1,6-7］.我們的研究表明，結(jié)合病毒轉(zhuǎn)錄體的檢測(cè)可以更精確地診斷和區(qū)分復(fù)制期和非復(fù)制期（既隱匿型感染）等不同的感染階段［8-11］.并且，我們前期的研究也顯示，在慢性HBV感染母親所生的新生兒中，HBV轉(zhuǎn)錄體是一個(gè)較早出現(xiàn)的病毒標(biāo)志物［12］.本研究擬應(yīng)用我們建立的血清HBVRNA檢測(cè)方法，進(jìn)一步分析血清病毒轉(zhuǎn)錄體在早期診斷新生兒感染狀態(tài)中的意義，以及免疫治療對(duì)它的影響.1材料和方法1.1材料1.1.1病例選擇69例HBsAg陽(yáng)性孕婦分為治療組46例及未治療組23例.69例孕婦孕期均無(wú)先兆流產(chǎn)史無(wú)急性或慢性肝炎病史癥狀及體征無(wú)肝功能受損情況.孕婦年齡孕產(chǎn)次胎齡均無(wú)明顯差異.69例孕婦分娩新生兒69(男36，女33)例.1.1.2試劑高純度核酸提取試劑盒、核糖體RNA(rRNA)、單管RT/PCR試劑盒、地高辛探針標(biāo)記及原位雜交試劑盒均購(gòu)自Roche公司(Mannheim,德國(guó))，原位雜交試劑盒、DNase和RNase滅活的吸頭購(gòu)自Biolabs，HybondN尼龍膜購(gòu)自Amersham，TaqDNA聚合酶、100bpDNAMarker及DNaseI均為Gibcol產(chǎn)品，DNase和RNase滅活的試管和離心管購(gòu)自Eppendof公司.其他常用試劑和藥品均為分析純或電泳級(jí).1.1.3引物和質(zhì)粒PCR引物由上海生工合成.用于陽(yáng)性對(duì)照的質(zhì)粒為40A和41A［13］，均由德國(guó)癌癥研究中心病毒與宿主相互關(guān)系分部制備.1.2方法1.2.169例HBsAg陽(yáng)性孕婦治療方法孕26wk開(kāi)始，按來(lái)診次序分為治療組46例，孕26wk始孕婦臀大肌注射已型肝炎病毒免疫球蛋白（HBIG）（上海生物制品研究所生產(chǎn)批號(hào)為20000712)200IU/4wk，同時(shí)使用左旋咪唑涂布劑(福建省凱華藥業(yè)有限公司生產(chǎn)批號(hào)為20000307500mg/支)5mL涂布于上下肢體內(nèi)側(cè)皮膚易吸收處2次/wk，3mo一療程.未治療組23例根據(jù)患者或其親屬的意見(jiàn)未給予上述任何主動(dòng)或被動(dòng)免疫防治措施，孕婦所生的新生兒的乙肝疫苗接種均按第0,1,6月進(jìn)行.1.2.2血清分離和核酸提取孕婦26wk肘靜脈采血2mL，新生兒分娩后24h內(nèi)采股靜脈血2mL.按照我們建立的方法［10］，于30min內(nèi)應(yīng)用低溫離心（4000r/min，20min，4℃）分離血清.核酸的提取采用高純度病毒核酸提取試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)操作，僅將其中的poly(A)RNA替換為rRNA作為載體RNA，以免與后面使用的oligod(T)引物結(jié)合而干擾HBV3′端的結(jié)構(gòu)分析.200μL血清標(biāo)本提取后可得到50μL的核酸提取物.1.2.3目的核酸擴(kuò)增按我們建立的方法［10］，針對(duì)HBV基因X區(qū)血清核酸的PCR，RTPCR所用上游引物包括txs（1445）：5′GGACCGTGTGCACTTCGCTT3′，txs1（1454）：5′GCACTTCGCTTCACCTCTGC3′，txs2（1464）：5′TCACCTCTGCACGTCGCATG3′；下游引物包括：txas（1574）：5′CCTCAAGGTCGGTCGTTGAC3′，xas1（1668）：5′AATTTATGCCTACAGCCTCC3′，txas5（1683a）：5′(T)15GCTGG3′.擴(kuò)增病毒DNA采用50μL反應(yīng)體系，TagDNA聚合酶5U，引物為txs/txas，循環(huán)條件：93℃100s，90℃40s，58℃50s，70℃40s，35個(gè)循環(huán)，72℃15min.trRNA的RTPCR系統(tǒng)在逆轉(zhuǎn)錄后采用半巢式PCR，引物txas5分別與txs和txs2配對(duì).trRNA擴(kuò)增用的錨定oligod(T)引物與fRNA的末端1803~1806位置的結(jié)構(gòu)也有一定的親和力，故也同時(shí)檢測(cè)fRNA［10］.20g/L瓊脂糖凝膠電泳后觀(guān)察結(jié)果.1.2.4地高辛標(biāo)記探針的制備和原位雜交按我們建立的方法采用PCR法合成2種地高辛標(biāo)記探針，用于區(qū)分fRNA和trR[1][2][3]NA［10］.在這些PCR反應(yīng)中，Dig11dUTP部分取代了dTTP作為T(mén)aq多聚酶的底物.各種核苷的使用濃度為：200μmol/LdATP,dGTP,dCTP;180μmol/LdTTP和20μmol/LDIG11dUTP.地高辛標(biāo)記探針的合成嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行（Roche,Cat.No.1093088）.作為分析血清RNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，DIG11dU/dT的最佳比例為1∶10.地高辛標(biāo)記探針的顯影，采用一種堿性磷酸酶鏈接的抗地高辛抗體，當(dāng)堿性磷酸酶與底物BCIP結(jié)合后，其產(chǎn)物可進(jìn)一步與NBT反應(yīng)，在膜上產(chǎn)生持久的藍(lán)色或棕色的沉淀.2結(jié)果2.1母親和新生兒血清中HBVDNA，fRNA(全長(zhǎng)型)trRNA(頓挫型)的檢測(cè)圖1所示為4對(duì)治療組母親新生兒血清中相應(yīng)的PCR和RTPCR擴(kuò)增結(jié)果［10］.第1和第2對(duì)的母親DNA，fRNA，trRNA和HBeAg陽(yáng)性，第3對(duì)的母親僅DNA和trRNA陽(yáng)性，第4對(duì)的母親僅trRNA陽(yáng)性.而所有4名新生兒僅顯示trRNA陽(yáng)性.2.2治療組與非治療組母親和新生兒血清病毒RNA和DNA檢測(cè)結(jié)果表1總結(jié)了治療組與非治療組母親和新生兒血清中HBVDNA，fRNA和trRNA檢測(cè)結(jié)果.HBVDNA和fRNA等病毒復(fù)制的指標(biāo)僅存在于非治療組新生兒，而trRNA在治療組與非治療組新生兒中普遍存在.未治療組新生兒HBVDNA和fRNA陽(yáng)性率明顯高于治療組新生兒（P<0.01），而兩組新生兒血清trRNA陽(yáng)性率無(wú)顯著性差異（P>0.05）.圖中所示119bpPCR擴(kuò)增產(chǎn)物為HBVXDNA，360bp和235bp分別為fRNA和trRNA擴(kuò)增產(chǎn)物.m1n1到m4n4表示4對(duì)母親/新生兒.cDNAf和cDNAtr：包含fcDNA和trcDNA的陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒；符號(hào)“-”表示陰性對(duì)照；M：100bpDNA標(biāo)志物.圖14對(duì)母親/新生兒血清中HBV核酸檢測(cè)的代表性結(jié)果（略）表1HBsAg陽(yáng)性母親及其新生兒血清中HBV核酸的檢測(cè)結(jié)果（略）2.3HBIG免疫阻斷治療對(duì)trRNA和fRNA的影響表2對(duì)比了僅僅trRNA陽(yáng)性和fRNA與trRNA共同陽(yáng)性新生兒的例數(shù).未治療23位母親所生23名新生兒中，12名表現(xiàn)為僅trRNA陽(yáng)性，而治療組46位母親所生新生兒全部表現(xiàn)為僅trRNA陽(yáng)性（表2）.結(jié)果提示，單獨(dú)trRNA陽(yáng)性新生兒的出現(xiàn)與免疫治療無(wú)關(guān)，免疫治療導(dǎo)致新生兒fRNA消失，相應(yīng)地trRNA單獨(dú)陽(yáng)性的例數(shù)增加.在HBsAg和HBeAg共同陽(yáng)性母親所生的新生兒中，免疫治療導(dǎo)致新生兒?jiǎn)为?dú)trRNA陽(yáng)性例數(shù)相對(duì)增加的作用表現(xiàn)得更加明顯（表2）.未治療母親所生新生兒中，fRNA和trRNA共同陽(yáng)性者占7/11，而在治療組中則為0/14.3討論本研究立足于應(yīng)用血清HBVRNA和DNA區(qū)分新生兒的不同感染類(lèi)型.既往研究表明，fRNA是一個(gè)病毒復(fù)制的標(biāo)志物，而trRNA單獨(dú)陽(yáng)性提示無(wú)復(fù)制階段的病毒基因表達(dá)［8,9,14］.先前基于肝組織和血清的研究提示，trRNA的來(lái)源與染色體整合的和游離的病毒DNA均有一定關(guān)系［14-15］.而新生兒的感染處于病毒感染的早期階段，此時(shí)染色體整合的病毒DNA不占主導(dǎo)地位.因此更支持游離的病毒DNA為trRNA的轉(zhuǎn)錄模板.表2頓挫型RNA在全長(zhǎng)型RNA陰性(tr)和陽(yáng)性(ftr)母親/新生兒血清中的表達(dá)（略）不難理解，新生兒的HBV感染是由于暴露于受感染母親體內(nèi)的病毒所導(dǎo)致的宮內(nèi)感染.但是，這種感染不一定伴隨高復(fù)制階段.這可能是由于前基因組RNA缺乏反轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，原因可能為轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄體成熟的相關(guān)因素與肝臟的發(fā)育程度有關(guān)［16］.接受免疫阻斷治療的母親所生新生兒普遍缺乏fRNA和病毒DNA(以及HBeAg)，但trRNA陽(yáng)性較為普遍.這一方面反映了免疫阻斷治療可以有效預(yù)防新生兒的高復(fù)制性的感染.另一方面，治療組與非治療組新生兒trRNA陽(yáng)性率無(wú)明顯差異，提示病毒感染本身并沒(méi)有被有效預(yù)防.如果新生兒血清trRNA是宮內(nèi)感染的產(chǎn)物，我們推測(cè)病毒感染和表達(dá)的模式可能有兩種：一種導(dǎo)致病毒的高復(fù)制，而另一種則檢測(cè)不到病毒的復(fù)制.前者對(duì)免疫治療敏感，而后者不敏感.但是，后者有可能會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)楦邚?fù)制狀態(tài)，這有助于解釋部分新生兒在出生后1歲以?xún)?nèi)甚至更晚出現(xiàn)的“突破性感染”［1,3,17］.雖然本研究明確地顯示了血清HBVtrRNA在新生兒HBV感染血清學(xué)診斷中的潛在意義，但在推廣至臨床應(yīng)用之前，有必要進(jìn)行包括動(dòng)態(tài)追蹤觀(guān)察在內(nèi)更大規(guī)模的研究.【參考文獻(xiàn)】［1］WangZ,ZhangJ,YangH,etal.QuantitativeanalysisofHBVDNAlevelandHBeAgtiterinhepatitisBsurfaceantigenpositivemothersandtheirbabies:HBeAgpassagethroughtheplacentaandtherateofdecayinbabies［J］.JMedVirol,2003,71(3):360-366.［2］ZhuQ,YuG,YuH,etal.ArandomizedcontroltrialoninterruptionofHBVtransmissioninuterus［J］.ChinMedJ(Engl)，2003,116(5):685-687.［3］DentingerCM,McMahonBJ,ButlerJC,etal.PersistenceofantibodytohepatitisBandprotectionfromdiseaseamongAlaskanativesimmunizedatbirth［J］.PediatrInfectDisJ,2005,24:786-792.［4］朱啟熔,呂晴,愈蕙,等.宮內(nèi)感染HBV嬰兒接種乙肝疫苗失敗的機(jī)制和預(yù)后研究［J］.中華兒科雜志，1997,35(7):349-351.［5］WangJS,ChenH,ZhuQR.TransformationofhepatitisBserologicmarkersinbabiesborntohepatitisBsurfaceantigenpositivemothers［J］.WorldJGastroenterol,2005,11(23):3582-3585.［6］WheeleySM,BoxallEH,TarlowMJ,etal.HepatitisBvaccineinthepreventionofperinatallytransmittedhepatitisBvirusinfection:finalreportonaWestMidlandspilotstudy［J］.JMedVirol,1990,30(2):113-116.［7］NguiSL,OConnellS,EglinRP,etal.LowdetectionrateandmaternalprovenanceofhepatitisBvirusSgenemutantsincasesoffailedpostnatalimmunoprophylaxisinEnglandandWales［J］.JInfectDis,1997,176(5):1360-1365.［8］BreitkreutzR,ZhangW,LeeM,etal.HepatitisBvirusnucleicacidscirculatingintheblood:distinctpatternsinHBscarrierswithhepatocellularcarcinoma［J］.AnnNYAcadSci,2001,945:195-206.［9］SuQ,WangSF,ChangTE,etal.CirculatinghepatitisBvirusnucleicacidsinchronicinfection:Representationofdifferentlypolyadenylatedviraltranscriptsduringprogressiontononreplicativestages［J］.ClinCancerRes,2001,7(7):2005-2015.［10］ZhangW,HackerHJ,MildenbergerM,etal.2004.DetectionofHBVRNAinserumofpatients(Invitedpaper)［J］.MethodsMolMed,2004,95:29-40.［11］吳濤，張偉，蘇勤，等.中國(guó)人終末期肝病組織中乙肝病毒轉(zhuǎn)錄體的檢測(cè)［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004,25（7）:587-589.［12］崔云，張偉，蘇勤，等.乙型肝炎病毒轉(zhuǎn)錄體血清學(xué)檢測(cè)及其在母嬰垂直傳播中的意義［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005,26（12）:1089-1092.［13］HilgerC,VelhagenI,ZentgrafH,etal.DiversityofhepatitisBvirusXgenerelatedtranscriptsinhepatocellularcarcinoma:AnovelpolyadenylationsiteonviralDNA［J］.JVirol,1991,65(8):4284-4291.［14］KairatA,BeerheideW,ZhouG,etal.TruncatedhepatitisBvirusRNAinhumanhepatocellularcarcinoma:Itsrepresentationinpatientswithadvancingage［J］.Intervirology，1999,42(4):228-237.［15］Zhang[1][2][3]W,HackerHJ,TokusM,etal.PatternsofcirculatinghepatitisBvirusserumnucleicacidsduringlamivudinetherapy［J］.JMedVirol，2003,71(1):24-30.［16］ZhaoR,DuncanSA.Embryonicdevelopmentoftheliver［J］.Hepatology,2005,41(5):956-967.［17］YuenMF,LimWL,ChanAO,etal.18yearfollowupstudyofaprospectiverandomizedtrialofhepatitisBvaccinationswithoutboosterdosesinchildren［J］.ClinGastroenterolH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