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篇1

【關(guān)鍵詞】 皂苷 抗腫瘤 溶血

【Abstract】 Objective To investigate the antineoplastic activity and blood cell haemolysis test on saponin. Methods The OD405 value of cell was detected after saponin treatment by the acid phosphatase assay (APA). The safety of saponin was examined by haemolysis and blood cell agglutination tests.Results The saponin significantly inhibited proliferation of BEL7402 cells. Apparent difference in OD405 value was detected after BEL7402 cells had been exposed to the saponin for 72 hours compared with control group（P＜0.05）. It was proved that 100μg·ml-1 saponin caused no haemolysis and blood cell agglutination in vitro.Conclusion The saponin I1 has concentrationdependent antineoplastic activity on human hepatocarcinoma cells. The safety of saponin was better in vitro.

【Key words】 saponin，antineoplastic， haemolysis

皂苷是廣泛存在于高等植物和某些低等動物中的一類具有廣泛藥理活性的三萜及甾體的糖綴合物，很多中草藥的主要活性成分都是皂苷類化合物。近年來隨著分離提取技術(shù)的不斷發(fā)展，多種薯蕷皂苷被分離出來，并不斷發(fā)現(xiàn)其新的生物活性，特別是在抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、干預(yù)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗炎、降血脂、抗艾滋病等方面的作用引起了人們的重視［1，2］。紫花茄皂苷是根據(jù)從紫花茄中分離出的甾體皂苷化學(xué)合成的薯蕷皂苷［3］，具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。我們的研究表明紫花茄皂苷可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡［4］，在肝病用藥中很有前途。本研究對紫花茄皂苷進(jìn)行體外抗腫瘤及溶血性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco BRL公司。DHanks 液，PBS緩沖液，0.1%EDTA溶液等均按常規(guī)配制［5，6］，新生牛血清（黑龍江省同江市江海生物公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（Hereus公司)，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Nunc公司），EL311酶標(biāo)免疫檢測儀（BioTek公司），相差倒置顯微鏡（Olympus）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 新西蘭大白兔，雄性，體重2.5 kg，由濱州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.3 藥物及配制 紫花茄皂苷I1由中國科學(xué)院生態(tài)研究環(huán)境中心生物技術(shù)室提供。以二甲基亞砜（DMSO）溶解后用生理鹽水稀釋至100 μg/ml，其中DMSO濃度為0.1％。

1.4 2%紅細(xì)胞懸液的制備 取10 ml新鮮新西蘭兔血，滴入含2500 IU肝素鈉的離心管中，加入10 ml生理鹽水，搖勻后2 500 r/min離心5 min，傾去上清液，再加生理鹽水混合離心，反復(fù)洗4 次，最后一遍用巴比妥鈉緩沖液洗至上清液呈無色透明，然后將所得紅細(xì)胞用巴比妥鈉緩沖液稀釋成紅細(xì)胞壓積百分比為2%的紅血細(xì)胞混懸液。

1.5 酸性磷酸酶法（acid phosphatase assay， APA）［7］檢測細(xì)胞存活率 取對數(shù)生長期細(xì)胞，消化后制成細(xì)胞懸液，按1×103/孔的密度接種于96孔板。培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)組加入先用二甲基亞砜（DMSO）溶解、再經(jīng)RPMI1640培養(yǎng)液稀釋至終濃度為1～10 μg·ml-1的皂苷；空白對照組加入RPMI1640培養(yǎng)液；溶劑對照組加入經(jīng)同樣稀釋的溶劑，含0.01%～0.1%DMSO。實(shí)驗(yàn)中每個濃度設(shè)8個平行孔，作用72 h后用APA法經(jīng)EL311酶聯(lián)免疫檢測儀在405 nm波長處測定吸光度OD值，空白孔調(diào)零，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值。

1.6 溶血性實(shí)驗(yàn)［8，9］ 在2 %的兔紅血細(xì)胞混懸液中，分別加入不同體積的100 μg·ml-1的皂苷Ⅰ1，輕輕搖勻置37℃水浴中保溫1 h后，2000 r/min離心5 min，每管取上清100 μl，經(jīng)EL311酶聯(lián)免疫檢測儀于波長405 nm測量吸光度。第6組不加皂苷， 作為空白陰性對照；第7組不加皂苷并用蒸餾水代替巴比妥鈉緩沖液，作為充分溶血陽性對照（表1）?？瞻捉M調(diào)零，每組設(shè)3個平行孔，計(jì)算吸光度平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值。

根據(jù)吸光度平均值按下式計(jì)算相對溶血率：

相對溶血率＝OD實(shí)驗(yàn)組/ OD陽性對照×100％。 表1 各實(shí)驗(yàn)組配比量表

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包分析統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 紫花茄皂苷的體外抗腫瘤作用 不同濃度的紫花茄皂苷I1作用于BEL7402細(xì)胞72 h后，APA法測定結(jié)果如表2， 實(shí)驗(yàn)表明，加藥組從2.0 μg·ml-1起，與對照組的OD405比較，即有顯著性差異(P＜0.05)，而且隨著皂苷濃度的增加抗腫瘤作用也增加， 呈劑量依賴性。 表2 紫花茄皂苷I1對BEL7402細(xì)胞抗腫瘤作用 注：與空白對照比較， *P＜0.05，P＜0.001

2.2 溶血性試驗(yàn)評價 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，不同體積的100 μg·ml-1的皂苷Ⅰ1作用于新鮮兔血后，根據(jù)公式計(jì)算出1、2、3組的溶血率均小于5%，表明100 μg·ml-1的皂苷Ⅰ1體外溶血實(shí)驗(yàn)，不引起紅細(xì)胞的明顯凝集和溶血，安全性較好。

轉(zhuǎn)貼于

3 討論

惡性腫瘤或癌癥是目前威脅人類生命和健康的嚴(yán)重疾病之一，與心血管病、糖尿病并稱為現(xiàn)代社會的三大殺手，給人類的身心健康帶來巨大的損害。尋找有效的抗腫瘤方法具有強(qiáng)烈的社會需求，是多年來世界各國學(xué)者面臨的重大課題，并已取得大量成果。但目前一個重要的問題是，大部分治療腫瘤的方法給患者，尤其是晚期患者帶來的創(chuàng)傷過大。表3 皂苷Ⅰ1的溶血實(shí)驗(yàn)無論是手術(shù)還是放、化療，其痛苦和代價有時不呰于腫瘤本身。大量研究結(jié)果表明，植物來源的抗腫瘤藥具有種類多、毒副作用小、不良反應(yīng)少的特點(diǎn)。因此，從植物中尋找高效的抗腫瘤藥物已成為一種新的研究思路。

本文利用APA法，以抑制腫瘤細(xì)胞增殖為活性指標(biāo)，對紫花茄皂苷進(jìn)行活性篩選，確定出一些有較好生物活性和穩(wěn)定性，具有深入研究價值的結(jié)構(gòu)，對其進(jìn)行深入研究。本實(shí)驗(yàn)觀察了不同劑量的紫花茄皂苷I1對人肝癌BEL7402細(xì)胞的抗腫瘤作用。將BEL7402細(xì)胞與不同濃度的紫花茄皂苷共同孵育72h后測定各組吸光度值，結(jié)果表明紫花茄皂苷I1能明顯抑制體外培養(yǎng)的BEL7402細(xì)胞的生長(P＜0.05)， 并呈濃度依賴性。提示皂苷I1對BEL7402細(xì)胞具有明顯的體外抗腫瘤作用。

采用《中國藥典 》2005版中藥安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則“溶血與凝聚檢查法”，參照國家食品藥品監(jiān)督管理局制定《化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶 血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則 》相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行皂苷的體外安全性評價。體外溶血實(shí)驗(yàn)顯示皂苷不引起兔紅血細(xì)胞的溶血與凝集，安全性較好，有望成為臨床上的抗癌新藥。

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篇2

【關(guān)鍵詞】 全反式維甲酸;三氧化二砷;急性早幼粒細(xì)胞白血病

Clinical observalion of the combination of all-trans relinoic acid and arsenic trioxide for the treatment of acute promyelocytic leukemia

DONG Hai-lin,YANG Chang-jian,CHEN Xiao-liang.

【Abstract】 Objective To observe the eficacy and side efect of the all-trans retinoic acid(ATRA)and arsenic trioxide(As2O3)combination in acute promyeloeytic leukemia(APL).Methods Thirty-eight APL patients were treated with the ATRA and As2O3 combination.ATRA was given 25 mg/m2 every day and As2O3 was given 0.16 mg/(kg•d).Doses were adjusted according to adverse effects.Results Thirty-four patients achieved complete remission(CR),the CR rate was 89.5%.The time to achieve CR was(24.4士5.2)d.Two patients died due to intracranial hemorrhage.Conclusion The ATRA and As2O3in the treatment of APL can obtain a higher CR rate and a shorter duration for achieving CR.

【Key words】 Retinoic acid; Arsenic trioxide; Leukemia; Promyelocytic; Acute

2004年6月至2009年3月,我們采用全反式維甲酸(ATRA)聯(lián)合三氧化二砷(As2O3)治療38例急性早幼粒細(xì)胞白血病(API)患者。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本組38例初治API 患者,男20例,女18例;年齡16~64歲,平均40歲。所有患者均經(jīng)形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)確診。入院時血常規(guī):WBC 0.4×109~48.52×109/L(平均值7.71×109/L),Hb 22~148 g/L(平均值66 g/L),PLT 2×109~208×109/L(平均值26×109/L)。7例合并出凝血指標(biāo)(Pr、APIT、DDI、FDP)異常。骨髓象檢查:骨髓增生活躍或極度活躍,異常早幼粒細(xì)胞占0.346~0.997(平均值0.898),外周白血病細(xì)胞占0.02~0.97(平均值0.63)。

1.2 方法 確診者均予ATRA 25 mg/(m2•d)口服,連用30 d。As2O3 0.16 mg/(kg•d)加入5%葡萄糖液500 ml中靜滴,21~28 d為一療程。觀察ATRA相關(guān)副反應(yīng)及完全緩解(CR)時間,CR標(biāo)準(zhǔn)參照張之南主編《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[1]。每2~3 d復(fù)查血常規(guī),每周復(fù)查肝、腎功能,監(jiān)測凝血指標(biāo)。治療前或療程中如WBC≥20×109/L,加用小劑量高三尖杉酯堿1 mg/d聯(lián)合化療,根據(jù)外周WBC變化決定使用時間,一般不超過7 d。治療開始即預(yù)防性應(yīng)用保肝類藥物。ALT和(或)AST在40~120 U/L時As2O3減半,≥120 U/L時停用As2O3,待ALT或AST恢復(fù)正常后再用As2O3。若患者出現(xiàn)ATRA綜合征且不能耐受,則減少ATRA劑量或停藥,待癥狀減輕或消失后再逐漸加量應(yīng)用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析,采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 聯(lián)合治療APL的總體療效 ATRA聯(lián)合As2O3治療38例APL患者。共34例獲得CR,CR率89.5%,獲得CR所需時間平均為(24.4±5.2)d,2例在療程中因并發(fā)顱內(nèi)出血而死亡。

2.2 高WBC和低WBC APL患者的療效比較 確診時26(68.4%)WBC0.05)。見表1。

2.3 外周血象變化 33例(86.8%)治療1~2周時白細(xì)胞、血小板開始升高,第15~20天達(dá)高峰,第23~34天降至最低水平,其后逐步恢復(fù)至正常水平。紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白治療第14~21天后逐漸升高,第30~35天達(dá)正常水平。

2.4 骨髓象變化 治療前骨髓增生程度均為活躍或極度活躍,治療結(jié)束后,變?yōu)闇p低或活躍;粒紅細(xì)胞比例接近正常,骨髓白血病細(xì)胞比例正常;治療前全片巨核細(xì)胞計(jì)數(shù)偏低,治療后恢復(fù)正常。

2.5 不良反應(yīng) 消化系統(tǒng)癥狀(惡心、嘔吐、食欲減退)31例(81.6%)。肝功能損害17例(44.7%),皮膚損害(皮疹、皮膚及口唇干燥)5例(13.2%)。有發(fā)熱、頭痛、肌肉或關(guān)節(jié)疼痛4例(10.5%),均經(jīng)對癥處理好轉(zhuǎn)。1例在As2O3應(yīng)用6 d后出現(xiàn)急性腎功能衰竭,遂停用As2O3,予以對癥處理,1周后腎功能恢復(fù)正常。

3 討論

急性早幼粒細(xì)胞白血病(Acute Promyelocytic Leukemia,APL)是FAB分型中急性非淋巴細(xì)胞白血(Acute nonlymphocytic Leukemia,ANLL)的M3亞型,占所有ANLL的10%~15%,具有獨(dú)特的臨床表現(xiàn),細(xì)胞形態(tài)學(xué),細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)特征。ATRA治療APL的機(jī)理為誘導(dǎo)異常早幼粒細(xì)胞向成熟階段細(xì)胞轉(zhuǎn)化,而不同于化療直接殺傷腫瘤細(xì)胞。因此可降低DIC的發(fā)生率[2]。研究表明砷劑作用機(jī)制[3]:干擾細(xì)胞代謝及氧化過程、細(xì)胞調(diào)亡及誘導(dǎo)分化作用、誘導(dǎo)線粒體跨膜電位下降及調(diào)亡誘導(dǎo)分子活化,使ADCC發(fā)生程序死亡,同時延緩細(xì)胞周期,并抑制細(xì)胞生長。砷劑的使用可使APL的治療更進(jìn)一步,高濃度的As2O3選擇性地誘導(dǎo)APL細(xì)胞凋亡,低濃度則誘導(dǎo)分化,可彌補(bǔ)ATRA只能誘導(dǎo)細(xì)胞分化的不足;而兩者對NB4細(xì)胞在誘導(dǎo)分化和凋亡方面具有協(xié)同作用。另發(fā)現(xiàn),不同濃度As2O3能快速調(diào)節(jié)和降解PML-RARa[4]。

以往報道,單用ATRA治療、[5,6]ATRA+化療和單用As2O3治療的CR率均為85%~95%,本組CR率與上述療法比較無顯著差異,但獲得CR所需時間少于單用ATRA和單用As2O3者。高白細(xì)胞綜合征、肝功能損害、黏膜干燥是ATRA的主要不良反應(yīng),As2O3也有類似不良反應(yīng),且肝臟受損更明顯,所以二藥聯(lián)合使用后其不良反應(yīng)是否加重,是眾所關(guān)心的問題。從本組的治療結(jié)果來看,兩藥聯(lián)合使用引起的高白細(xì)胞綜合征和肝功能異常不良反應(yīng)并不比單獨(dú)使用ATRA或As2O3時明顯。本組兩藥聯(lián)合治療中加服小劑量高三尖杉酯堿及保肝藥物,減少了高白細(xì)胞綜合征及肝損害的發(fā)生,與高松等的研究結(jié)果相一致[7]。其他少見的不良反應(yīng)均不影響正常治療。故兩藥的聯(lián)合使用完全可在初發(fā)APL患者中進(jìn)行。但分子水平緩解狀況目前與單用ATRA或As2O3比較并未表現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢。這可能與病例數(shù)尚少,隨訪時間短有一定關(guān)系。因此ATRA聯(lián)合As2O3的長期療效仍需做進(jìn)一步的臨床研究。

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