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篇1

關(guān)鍵詞 QuEChERS方法； 在線(xiàn)； 凝膠滲透色譜； 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜； 煙葉； 農(nóng)藥殘留

1 引 言

為了防治病蟲(chóng)害，煙草在育種、種植、調(diào)制和保存期間要使用農(nóng)藥。殘留農(nóng)藥會(huì)降低煙葉質(zhì)量，加劇環(huán)境污染， 并威脅人類(lèi)和其它生物的健康[1]。因此，煙葉中的農(nóng)藥殘留檢測(cè)對(duì)保證煙葉質(zhì)量和環(huán)境安全具有重要意義。由于煙葉樣品基質(zhì)復(fù)雜，其中殘留農(nóng)藥含量低（低至ng/g級(jí)），因此通常需要樣品預(yù)處理過(guò)程才能進(jìn)行后續(xù)測(cè)定[2]。目前，液-液萃取[3]、固相萃取[4]、固相微萃取[5]等方法已用于煙葉中農(nóng)藥殘留測(cè)定。這些方法存在有機(jī)溶劑消耗量大、操作繁冗費(fèi)時(shí)、回收率低等不足。Anastassiades等[6]開(kāi)發(fā)了“快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、高效、耐用且安全（Quick， easy， cheap， effective， rugged and safe， QuEChERS）”的樣品前處理技術(shù)。QuEChERS方法具有回收率高、穩(wěn)定性強(qiáng)和被分析目標(biāo)物范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，因此在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中廣泛應(yīng)用[3]。常規(guī)QuEChERS方法在凈化步驟中通過(guò)離心或過(guò)濾將吸附劑與樣品液分離，耗時(shí)費(fèi)力。為了克服這一缺陷，本研究組以石墨化炭黑/乙二胺-N-丙基鍵合硅烷/四氯化三鐵（GCB/PSA/Fe3O4）復(fù)合材料為吸附劑，改進(jìn)了QuEChERS方法[7]，吸附劑可以在磁場(chǎng)作用下與提取液快速分離，具有操作簡(jiǎn)單、快速高效的優(yōu)點(diǎn)。

在線(xiàn)凝膠滲透色譜-氣相色譜-質(zhì)譜（GPC-GC-MS）是將凝膠滲透色譜和氣相色譜-質(zhì)譜在線(xiàn)聯(lián)用的分析檢測(cè)技術(shù)，不但具有抗基質(zhì)干擾能力強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，而且可以連續(xù)自動(dòng)分析，能提高分析速度和結(jié)果的準(zhǔn)確性，已被應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)[8～10]。本研究采用改進(jìn)QuEChERS方法對(duì)煙葉樣品前處理，以在線(xiàn)凝膠滲透色譜-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GPC-GC-MS/MS）檢測(cè)，選取煙草種植生產(chǎn)中對(duì)煙葉質(zhì)量和煙草制品產(chǎn)品安全有影響的常用10種除草劑、抑芽劑和殺蟲(chóng)劑為代表性化合物，建立了煙葉中農(nóng)藥殘留量的快速、準(zhǔn)確、靈敏分析方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

在線(xiàn)GPC-GC-MS/MS系統(tǒng)（日本島津公司），GPC配有LC-20AD泵，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-20AC柱溫箱，DGU-20A3R脫氣機(jī)和SPD-20A紫外檢測(cè)器；GC-MS/MS包括日本島津2010-plus氣相色譜和TQ 8030三重四級(jí)桿質(zhì)譜，由FCV-12AH電磁閥實(shí)現(xiàn)GPC和GC-MS/MS的在線(xiàn)連接。用Quanta 200 掃描電鏡（Quanta 200，F(xiàn)EI，Holland）對(duì)材料形貌進(jìn)行表征。

環(huán)己烷和丙酮（色譜純，韓國(guó)德山純化工有限公司）。所用水由Milli-Q系統(tǒng)（Milford， MA， USA）制得。10種目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)（磷酸三苯酯）均購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer 公司，以甲苯（必要時(shí)添加丙酮或甲醇）為溶劑配制目標(biāo)物母液（100 μg/mL）?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作溶液（內(nèi)標(biāo)濃度為20 ng/mL）以甲苯配制，并在-20℃下避光保存。采用溶劑熱方法制備Fe3O4[7]：在200 mL反應(yīng)釜內(nèi)將5.0 g FeCl3?6H2O 溶解在100 mL 乙二醇中并攪拌得到澄清溶液，再加入15.0 g NaAc 和50 mL乙二胺，攪拌30 min，將反應(yīng)釜于200℃下反應(yīng)8 h。待反應(yīng)釜降溫后，用水和乙醇清洗產(chǎn)物， 60℃下干燥，備用。制備磁性吸附劑時(shí)，將0.4 g GCB、 0.5 g PSA和1 g Fe3O4置于15 mL具蓋玻璃瓶?jī)?nèi)，用5 mL乙腈清洗3次后，將產(chǎn)物在60℃下干燥即可。

2.2 儀器條件

GPC條件：色譜柱為Shodex CLNpak EV-200（150 mm × 2 mm，16 μm）；柱溫為40℃；流動(dòng)相為環(huán)己烷-丙酮（70∶30， V/V）；流速0.1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；GPC收集時(shí)間為3.30～5.30 min；GC-MS/MS條件：惰性前置柱5 m × 0.53 mm空柱；預(yù)柱DB-35 ms（5 m × 0.25 mm × 0.25 μm），分離柱DB-35 ms（25 m × 0.25 mm × 0.25 μm），柱溫箱程序：初始溫度82℃，保持5.0 min，再以8℃/min升至300℃，保持7.75 min；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)間7.0 min；高純He為載氣，壓力程序：由120 kPa開(kāi)始，以100 kPa/min升至180 kPa，保持4.4 min，再以49.8 kPa/min恢復(fù)至原始?jí)毫Γ３?3.8 min；程序升溫進(jìn)樣口程序：120℃保持5 min，以100℃/min升至250℃，保持33.7 min；接口和離子源溫度為300℃和200℃；電離源為EI源；電離電壓70 eV；溶劑延遲時(shí)間15 min；目標(biāo)物及內(nèi)標(biāo)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）參數(shù)如表1所示，碰撞氣為Ar，壓力200 kPa。

2.3 樣品制備

本研究建立煙葉提取液快速凈化和檢測(cè)的方法，因此直接采用文獻(xiàn)＼[2＼]報(bào)道的方法提取煙葉： 稱(chēng)取2.00 g 煙葉于離心管中，加入10 mL水浸潤(rùn)樣品；靜置10 min后加入10 mL 乙腈和100 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，振蕩2 min；于-20℃下保持10 min后加入5 mL甲苯、4 g 無(wú)水Na2SO4、1 g NaCl＼， 1 g檸檬酸鈉和0.5 g 檸檬酸氫二鈉，振蕩2 min后離心5 min，收集上層提取液；提取液的凈化和檢測(cè)方法為：取0.5 mL提取液到裝有磁性吸附劑的離心管中，振蕩1 min；在磁場(chǎng)下將磁性吸附劑與溶液分離，所得溶液為待測(cè)液，可進(jìn)行在線(xiàn)GPC-GC-MS/MS分析。將不含目標(biāo)物的凈化液濃縮吹干，再加入相同體積、不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，混勻溶解即得到基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

3 結(jié)果與討論

3.1 磁性吸附劑的表征

如圖1a所示， PSA表面光滑，而磁性吸附劑中PSA表面粗糙（圖1b），且在PSA顆粒之間也有材料均勻分布，觀察是GCB和Fe3O4顆粒（圖1c）。Fe3O4能使吸附劑在磁場(chǎng)作用下與樣品溶液快速分離，同時(shí)PSA和GCB能分離提取液中的雜質(zhì)。

3.2 GPC收集時(shí)間考察

圖2為在線(xiàn)GPC-GC-MS/MS系統(tǒng)的示意圖。其原理為：樣品經(jīng)GPC柱分離，廢液直接排出系統(tǒng)，含有目標(biāo)物的餾分先被儲(chǔ)存在定量環(huán)（0.2 mL）中，再全部注入GC。注入GC的樣品通過(guò)打開(kāi)溶劑蒸氣出口實(shí)現(xiàn)溶劑的排出，同時(shí)目標(biāo)分析物在保留在預(yù)柱中。待溶劑排出口關(guān)閉后柱，溫箱開(kāi)始升溫，目標(biāo)物進(jìn)入分析柱分離。因此選擇收集時(shí)間顯得尤為重要。目標(biāo)物的分子量在溴氰菊酯和滅螨蜢之間，因此目標(biāo)物在GPC上的保留時(shí)間也介于二者之間，二者在GPC上的保留時(shí)間為3.50和5.08 min。考慮靈敏度和基質(zhì)去除效果，確定收集時(shí)間為3.30～5.30 min。

3.3 改進(jìn)QuEChERS方法的優(yōu)化

為了得到較好的凈化效果，優(yōu)化了磁性吸附劑的用量和凈化時(shí)間（GCB、PSA和Fe3O4之間的質(zhì)量比為4∶5∶10）。如圖3a所示，隨著吸附劑用量增加，提取液的顏色由黃色逐漸變?yōu)榻鼰o(wú)色，當(dāng)吸附劑用量達(dá)到80 mg時(shí)，繼續(xù)增加用量對(duì)凈化效果改善不大。且在考察的范圍內(nèi)，各目標(biāo)物的峰面積沒(méi)有變化，這可能是因?yàn)樵跓熑~提取液中含有甲苯，使吸附劑與含苯環(huán)目標(biāo)物之間的相互作用力減弱而引起的?？紤]凈化效果和吸附劑用量，將吸附劑的用量定為80 mg。在0.5～6.0 min范圍內(nèi)，凈化時(shí)間對(duì)凈化效果影響不大，且目標(biāo)物的峰面積沒(méi)有變化，這是因?yàn)槲絼┰趦艋瘯r(shí)是分散的，可以使吸附快速達(dá)到平衡，因此凈化時(shí)間對(duì)凈化效果沒(méi)有太大影響。為了穩(wěn)定凈化效果，凈化時(shí)間選取1.0 min。

比較了本方法與常規(guī)QuEChERS方法的凈化效果，如圖3b所示，未經(jīng)凈化的煙葉提取液顏色為黃色，經(jīng)過(guò)常規(guī)QuEChERS方法凈化后，提取液顏色變淺；經(jīng)過(guò)本方法凈化后，提取液幾乎無(wú)色（Ⅲ）。因此，本方法對(duì)色素等雜質(zhì)的去除效果較好。

3.4 方法確認(rèn)

在優(yōu)化條件下，考察了方法的檢出限、定量限、線(xiàn)性范圍和重現(xiàn)性。檢出限和定量限為目標(biāo)物信噪比為3和10時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度。以目標(biāo)物濃度及其與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為橫、縱坐標(biāo)，繪制工作曲線(xiàn)。如表2所示，10種目標(biāo)物的檢出限在0.94～100 ng/L之間，定量限在3.1～34 ng/L之間，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R2≥0.9989。本方法提取煙葉的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法[11]相同，其中9種目標(biāo)物（甲氰菊酯除外）的檢出限為40～600 ng/L。本方法能顯著提高靈敏度，是由吸附劑降低基質(zhì)干擾和在線(xiàn)GPC-GC-MS/MS提高進(jìn)樣量引起的。

為了考察本方法的重現(xiàn)性，配制3種濃度（各目標(biāo)物線(xiàn)性范圍最低值的2、10和100倍）的樣品，以一天內(nèi)配制的4個(gè)樣品和連續(xù)3天配制的樣品進(jìn)行分析，計(jì)算日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。如表3所示，目標(biāo)物的日內(nèi)及日間精密度分別小于15.1%和19.8%，其中目標(biāo)物在中濃度和高濃度下的日內(nèi)及日間精密度數(shù)值不高于8.5%，低濃度下的日內(nèi)及日間精密度數(shù)值相對(duì)較高，這可能是由于測(cè)定誤差引起的。美國(guó)分析化學(xué)家學(xué)會(huì)（Association of Official Analytical Chemists， AOAC）提出[12]，可接受的精密度數(shù)值隨著分析物的濃度或含量降低而升高。本研究中目標(biāo)物在低濃度（1.52～4.00 μg/L）下的精密度數(shù)值低于21%（目標(biāo)物濃度為10 μg/L時(shí)所能接受的精密度數(shù)值），說(shuō)明本方法的重現(xiàn)性可以接受。

3.5 實(shí)際樣品分析

為了證明本方法在實(shí)際樣品中應(yīng)用的效果，采用本方法和現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法[11]處理3種煙葉樣品并進(jìn)行測(cè)定。在樣品A中測(cè)到了七氟菊酯、二甲戊靈和聯(lián)苯菊酯，采用本方法和標(biāo)準(zhǔn)方法均無(wú)法對(duì)其進(jìn)行定量分析；在樣品B中測(cè)到了七氟菊酯，兩種方法的測(cè)定結(jié)果為1.06和1.03 μg/L，對(duì)氟節(jié)胺和聯(lián)苯菊酯均無(wú)法進(jìn)行定量分析；在樣品C中測(cè)到了仲丁靈、二甲戊靈和氟節(jié)胺，兩種方法的測(cè)定結(jié)果為92.1和92.7 μg/L、108.2和112.2 μg/L以及3.68和3.70 μg/L，對(duì)七氟菊酯也均無(wú)法進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，本方法與標(biāo)準(zhǔn)方法[11]的檢測(cè)結(jié)果相吻合。樣品C中測(cè)到的目標(biāo)物數(shù)目最多，給出了其中被測(cè)到目標(biāo)物的典型色譜圖。如圖4所示，目標(biāo)物均不存在干擾。同時(shí)，對(duì)凈化前的煙葉提取液直接進(jìn)行在線(xiàn)GPC-GC-MS/MS分析，檢測(cè)結(jié)果與以上兩種方法不存在顯著性差異：在樣品B中測(cè)到了七氟菊酯，其濃度為1.01 μg/L；在樣品C中測(cè)到了仲丁靈、二甲戊靈和氟節(jié)胺，其濃度為92.8， 110.2和3.81 μg/L。

將上述3種樣品加標(biāo)后用本方法測(cè)定，將所測(cè)量與實(shí)際加標(biāo)量相比得到相對(duì)回收率。如表4所示，目標(biāo)物的相對(duì)回收率在68.8%～132.2%之間，不同實(shí)際樣品中目標(biāo)物在不同濃度下的回收率相差較大，可能是因?yàn)椴煌a(chǎn)地?zé)熑~樣品的基質(zhì)差異引起的。使用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)煙葉中的農(nóng)藥殘留時(shí)，基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)和基質(zhì)抑制效應(yīng)同時(shí)都存在[13]，其中含有氨基的極性農(nóng)藥化合物在氣相色譜分析時(shí)主要表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)（如二甲戊靈和聯(lián)苯菊酯，回收率最高為132.2%），但含有同一功能基團(tuán)的化合物由于理化特性的差異所呈現(xiàn)的基質(zhì)效應(yīng)也會(huì)有較大差別（如七氟菊酯，回收率最低為68.8%），而且同一化合物在不同濃度水平和樣品基質(zhì)下產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)程度也不盡相同（如甲氰菊酯）[14]。

4 結(jié) 論

采用磁性吸附劑凈化煙葉提取液，再用在線(xiàn)GPC-GC-MS/MS檢測(cè)，優(yōu)化了在線(xiàn)GPC-GC-MS/MS條件和影響凈化效果的因素，在最佳的條件下建立了煙葉樣品中10種農(nóng)藥殘留量的測(cè)定新方法，并用于實(shí)際煙葉樣品的測(cè)定。由于磁性吸附劑可以在磁場(chǎng)作用下實(shí)現(xiàn)快速回收，且在線(xiàn)GPC-GC-MS/MS系統(tǒng)可以提高進(jìn)樣量。與現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法[11]相比，本方法具有樣品前處理過(guò)程操作簡(jiǎn)單、凈化能力強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，為日常煙葉樣品中農(nóng)藥殘留量的測(cè)定提供了一種可選擇的方法。

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篇2

【摘要】

建立了凝膠滲透色譜（GPC）凈化、氣相色譜質(zhì)譜（GCMS）同時(shí)測(cè)定金銀花中33種有機(jī)氯、有機(jī)磷和擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥殘留的方法。樣品中的待測(cè)農(nóng)藥組分經(jīng)乙酸乙酯環(huán)己烷混合溶劑（1∶1， V/V）提取、GPC凈化去除色素等雜質(zhì)，GCMS采用全掃描/選擇離子監(jiān)測(cè)模式（Scan/SIM）采集數(shù)據(jù)后進(jìn)行定性/定量分析。方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）≤16.70 %（6.9～84.6 ng/g，n=5）；5種不同加標(biāo)濃度下，待測(cè)農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)加入回收率在57.4%（甲胺磷）～109.9%（馬拉硫磷）之間；各農(nóng)藥組分的定性檢出限（3σ）為0.10～10.5 ng/g，定量檢出限（10 σ）為0.33～20.0 ng/g。

【關(guān)鍵詞】 金銀花； 凝膠滲透色譜； 氣相色譜質(zhì)譜； 農(nóng)藥殘留

Abstract A method was developed for the simultaneous determination of 33 pesticide residues， including organochlorine， organophosphorus and pyrethroid pesticide， in honeysuckle by gel permeation chromatography(GPC) purification and gas chromatographymass spectrometry(GCMS) detection. The pesticides were extracted using mixed solvent of ethylacetate and cyclohexane(1∶1， V/V). The pesticides extracted from sample were separated and purified with matrices such as pigment by gel permeation chromatography. The pesticides were finally separated and detected by GCMS with full scan and selective ion monitor mode simultaneously. The precisions of developed method with relative standard deviation for 33 pesticide were lower than 16.7%(6.9－84.6 ng/g， n=5). The recoveries for 33 pesticide standards spiked samples were between 57.4%(methamidophos) and 109.9%(malathion). Limits of detection(3σ) and quantifications(10σ) of the method were 0.10－10.5 ng/g and 0.33－20.0 ng/g， respectively.

Keywords Honeysuckle; Gel permeation chromatography; Gas chromatographymass spectrometry; Multipesticide residues

1 引 言

中藥安全問(wèn)題，如中藥中的有害成分[1]、重金屬污染[2，3]、農(nóng)藥殘留[4，5]等已引起廣泛關(guān)注[6，7]。有關(guān)中藥中農(nóng)藥殘留測(cè)定方法的研究已有許多報(bào)道[4，5，8～10]，但涉及的農(nóng)藥品種較單一，多數(shù)僅局限于2000年“中國(guó)藥典”規(guī)定的六六六、滴滴涕和五氯硝基苯，同時(shí)測(cè)定中藥中有機(jī)氯、有機(jī)磷和擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥的方法尚未見(jiàn)報(bào)道。

已報(bào)道的中藥中農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法中，多數(shù)采用固相萃?。⊿PE）凈化和氣相色譜（GC）測(cè)定[11～13]。與傳統(tǒng)的SPE相比，凝膠滲透色譜（GPC）凈化具有自動(dòng)化程度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，適合于中藥材、生物等復(fù)雜基質(zhì)中農(nóng)藥殘留測(cè)定的凈化過(guò)程。氣相色譜質(zhì)譜（GCMS）不僅能準(zhǔn)確定量，而且能定性確證目標(biāo)組分［14］，避免了GC測(cè)定造成的誤判和假陽(yáng)性結(jié)果。

金銀花為傳統(tǒng)中草藥，具有清熱解毒功效，用量多，用途廣，嚴(yán)格控制農(nóng)藥殘留量顯得尤為重要[13]。本研究結(jié)合凝膠滲透色譜和氣相色譜質(zhì)譜技術(shù)，建立了同時(shí)測(cè)定中藥材金銀花中33種有機(jī)氯、有機(jī)磷和擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥殘留的方法。GPC將待測(cè)目標(biāo)農(nóng)藥與樣品基質(zhì)中的大分子物質(zhì)（如色素等）分離[14～17]，達(dá)到分離、凈化農(nóng)藥組分的目的；GCMS則根據(jù)保留時(shí)間和特征離子豐度比進(jìn)行雙重定性，避免誤判，SIM模式提高測(cè)定的靈敏度和選擇性，達(dá)到準(zhǔn)確定量的目的。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

7890A5975C 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司）， 配備自動(dòng)進(jìn)樣器和化學(xué)工作站； LC Tech全自動(dòng)凝膠滲透色譜儀， Bio Beads SX3凝膠凈化柱（40 0mm×25 mm×(38～75) μm）； EVAⅢ自動(dòng)濃縮儀（德國(guó)LC公司）； B5200SOT超聲波清洗儀（美國(guó)Branson公司）； MS2微型旋渦混勻器（德國(guó)IKA公司）； 04121離心機(jī)（上海手術(shù)器械廠）；實(shí)驗(yàn)室自制氮吹濃縮裝置。

丙酮、乙酸乙酯和環(huán)己烷(色譜純， 美國(guó)Fisher公司）; 33種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)(購(gòu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心)。

2.2 樣品預(yù)處理

將金銀花樣品磨碎，過(guò)孔徑380 μm的篩后準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0000 g于15 mL聚乙烯離心管中，加入5 mL乙酸乙酯環(huán)己烷（1∶1， V/V）混合提取劑，混勻，超聲波提取10 min后， 3000 r/min離心3 min，取上清液；重復(fù)上述操作兩次，合并3次提取液，氮吹濃縮至10 mL；0.2 μm濾膜過(guò)濾后取5 mL通過(guò)GPC進(jìn)行凈化，乙酸乙酯環(huán)己烷（1∶1， V/V）為流動(dòng)相，流速5 mL/min，收集17～36 min流出物95 mL，用EVA Ⅲ自動(dòng)濃縮儀濃縮至5 mL，乙酸乙酯環(huán)己烷（1∶1， V/V）定容至0.5 mL，供GCMS測(cè)定。

2.3 色譜質(zhì)譜條件

DB5 ms毛細(xì)管柱（30 m×250 μm， 0.25 μm），載氣為高純氦氣（純度≥99.999%）；進(jìn)樣口溫度250 ℃，恒壓模式，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1μL；以甲基毒死蜱作保留時(shí)間鎖定。色譜柱初始溫度50℃，保持1 min，以25 ℃/min升至125 ℃，再以10 ℃/min升至300℃，保持10 min。

電子轟擊源（EI），70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；接口溫度280 ℃；溶劑延遲3.5 min； 測(cè)定模式為全掃描/選擇離子監(jiān)測(cè)（Scan/SIM）同時(shí)采集模式，表1為SIM模式下的離子分組。表1 SIM離子分組（略）

3 結(jié)果與討論

3.1 多種農(nóng)藥的定性分析

各目標(biāo)農(nóng)藥的保留時(shí)間、特征離子及其相對(duì)豐度列于表2。TIon， Q1， Q2和Q3為各農(nóng)藥對(duì)應(yīng)的特征離子，其中TIon為定量離子，R1，R2和R3分別為特征離子Q1， Q2和Q3與定量離子TIon的豐度比值，即特征離子Q1， Q2和Q3的相對(duì)豐度。圖1為33種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)的總離子流圖（TIC）。實(shí)驗(yàn)中首先通過(guò)保留時(shí)間對(duì)樣品中33種農(nóng)藥殘留進(jìn)行定性，表2(The peak number is the same as in Table 2).再通過(guò)比對(duì)樣品中各農(nóng)藥特征離子的相對(duì)豐度與標(biāo)準(zhǔn)溶液中對(duì)應(yīng)農(nóng)藥特征離子的相對(duì)豐度，對(duì)目標(biāo)農(nóng)藥進(jìn)行進(jìn)一步確證。

3.2 提取和凈化條件的優(yōu)化

在金銀花樣品基質(zhì)中，加入適量的33種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，振蕩混勻后在－4 ℃冰箱中放置4 h，按2.2和2.3節(jié)的操作流程進(jìn)行樣品處理及測(cè)定。比較乙腈、乙酸乙酯和不同比例的乙酸乙酯環(huán)己烷（3∶1和1∶1，V/V）：各農(nóng)藥的預(yù)計(jì)保留時(shí)間(Expectant retention time for pesticides)。的提取效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙酸乙酯環(huán)己烷（1∶1， V/V）不僅能有效地提取33種農(nóng)藥，同時(shí)也減小了基質(zhì)共提取物對(duì)目標(biāo)農(nóng)藥定性/定量測(cè)定的干擾。此外，乙酸乙酯環(huán)己烷（1∶1， V/V）與GPC流動(dòng)相一致，因而選擇乙酸乙酯環(huán)己烷（1∶1， V/V）為農(nóng)藥目標(biāo)物的提取劑。表2 33種農(nóng)藥的保留時(shí)間、特征離子及其相對(duì)豐度（略）

通過(guò)分時(shí)段收集GPC的流出物，發(fā)現(xiàn)33種農(nóng)藥主要在16～36 min流出，但16～17 min的流出物仍含有較多色素。為避免色素對(duì)目標(biāo)物測(cè)定的干擾，最終選取17～36 min為流分收集時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明： 17～36 min之間的流出物既能保證各農(nóng)藥有較高的回收率，又可避免色素等雜質(zhì)的干擾，可達(dá)到待測(cè)組分GPC凈化的目的。

3.3 方法精密度

以人工合成樣品進(jìn)行方法精密度實(shí)驗(yàn)。準(zhǔn)確稱(chēng)取5份各1.0000 g金銀花樣品，分別加入相同量的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，振蕩混合均勻后在－4 ℃冰箱中放置4 h，制備成含適量農(nóng)藥的人工合成樣品；然后按照2.2和2.3節(jié)進(jìn)行目標(biāo)物提取、凈化和測(cè)定。33種農(nóng)藥在添加標(biāo)準(zhǔn)濃度在6.9（毒蟲(chóng)畏E）～84 ng/g（毒蟲(chóng)畏Z）范圍內(nèi)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.9%（馬拉硫磷）～14%（氯氰菊酯）范圍內(nèi)，各種農(nóng)藥的添加標(biāo)準(zhǔn)濃度，測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和定量檢測(cè)下限詳見(jiàn)附表(analchem.cn/table/090832.pdf)。結(jié)果表明，在較低添加濃度水平時(shí)，各農(nóng)藥組分測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于16.7%。

3.4 方法的準(zhǔn)確度

以標(biāo)準(zhǔn)加入回收實(shí)驗(yàn)的回收率來(lái)驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度。準(zhǔn)確稱(chēng)取5份各1.0000 g金銀花樣品，分別在5份樣品中加入表4所列濃度的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，振蕩混合均勻后在－4 ℃冰箱中放置4 h，制備成含適量農(nóng)藥的人工合成樣品；然后按照2.2和2.3節(jié)進(jìn)行目標(biāo)物提取、凈化和測(cè)定，計(jì)算各組分的回收率。以各農(nóng)藥組分的定量離子峰面積對(duì)添加農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)濃度作圖，用線(xiàn)性回歸的方法對(duì)測(cè)得的峰面積和標(biāo)準(zhǔn)加入農(nóng)藥濃度進(jìn)行回歸，求得線(xiàn)性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。表3列出了33種農(nóng)藥在5個(gè)不同加標(biāo)濃度下的回收率、線(xiàn)性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

結(jié)果顯示，5種不同加標(biāo)濃度下，除甲胺磷（57.4%）和敵敵畏（66.0%）外，其它待測(cè)農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)加入回收率在72.3%（六氯苯）～109.9%（馬拉硫磷）之間，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)r≥0.9855，說(shuō)明本方法在各組分所添加的濃度范圍內(nèi)，各組分的回收率是穩(wěn)定的。表3 33種農(nóng)藥的加標(biāo)加入回收結(jié)果（略）

3.5 方法檢出限

以3倍信噪比(S/N)計(jì)算33種農(nóng)藥的定性檢出限（LOD）， 10倍信噪比計(jì)算定量檢出限（LOQ）。33種農(nóng)藥的檢出限列于表3。33種農(nóng)藥的定性檢出限為0.10～10.5 ng/g，定量檢出限為0.33～20.0 ng/g。 結(jié)果表明，本方法自動(dòng)化程度高、選擇性較好、檢出限低，具有穩(wěn)定的回收率和較小的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，可滿(mǎn)足典型中藥金銀花中多種農(nóng)藥殘留測(cè)定的要求。

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篇3

[關(guān)鍵詞] 熱毒寧注射液；聚山梨酯80；高效凝膠色譜-蒸發(fā)光散射法；質(zhì)量控制

[收稿日期] 2014-03-06

[基金項(xiàng)目] 國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2013ZX09402203）

[通信作者] 蕭偉，研究員級(jí)高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)橹兴幮轮苿┑难芯颗c開(kāi)發(fā)，E-mail：

[作者簡(jiǎn)介] 沈娟，工程師，主要從事中藥材規(guī)范化種植與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，Tel：（0518）81152322，E-mail：

聚山梨酯80收載于美國(guó)藥典、歐洲藥典和《中國(guó)藥典》[1]，又名吐溫-80，化學(xué)名為聚氧乙烯去水山梨醇單油酸酯，是一種穩(wěn)定的非離子型表面活性劑[2]，可用作乳化劑、分散劑、增溶劑或穩(wěn)定劑等，被廣泛應(yīng)用于藥物和食品。很多中藥注射劑在制備工藝過(guò)程中因揮發(fā)性成分增溶的需要加入了聚山梨酯 80。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，聚山梨酯 80的濃度在0.5%以?xún)?nèi)安全性較好[3]，故中藥注射劑中聚山梨酯 80的檢測(cè)與控制對(duì)于保證臨床用藥安全具有重要意義[4-5]。熱毒寧注射液處方由梔子、金銀花、青蒿3 味藥材組成，具有清熱、疏風(fēng)、解毒等功效。制劑中因青蒿藥材揮發(fā)性成分的有效利用，使用了聚山梨酯 80作為增溶劑，故增加了制劑中聚山梨酯 80的檢測(cè)。關(guān)于聚山梨酯 80的含量測(cè)定已有一定的文獻(xiàn)報(bào)道[6-9]，采用硫氰酸鈷銨顯色法測(cè)定聚山梨酯 80時(shí)會(huì)出現(xiàn)顯色干擾，影響檢測(cè)結(jié)果。本文建立了高效凝膠色譜串聯(lián)蒸發(fā)光散射法測(cè)定熱毒寧注射液中聚山梨酯 80的含量測(cè)定方法，該方法方便、快捷，可用于熱毒寧注射液中聚山梨酯80的含量測(cè)定。

1 材料

Agilent-1200液相色譜儀及工作站，Alltech 3300 ELSD，METTLER AE240電子天平；氯仿（分析純，南京化學(xué)試劑有限公司），水為重蒸餾水，聚山梨酯 80（注射級(jí)，南京威爾化工有限公司）。熱毒寧注射液（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)100906，101011，110702，110703，110704，110705，110708，110710，110711，110714）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 TSK G4000 PWxl 凝膠色譜柱（300 mm×7.8 mm，10 μm）；以水為流動(dòng)相；流速0.7 mL?min-1；柱溫30 ℃；ELSD 檢測(cè)條件： 漂移管溫度55 ℃ ， 氮?dú)饬魉?.0 L?min-1，增益 1.0；進(jìn)樣體積20 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取聚山梨酯 80適量，加水溶解并稀釋成每1 mL含50 mg的對(duì)照品貯備液。量取上述貯備液適量，用水稀釋成每1 mL含5.068 2 mg的聚山梨酯 80對(duì)照品溶液，搖勻，備用。

2.3 供試品溶液的制備 精密吸取供試品5 mL置分液漏斗中，加入氯仿萃取5次，每次10 mL，小心分取氯仿層（不能混有水層），合并氯仿液，揮干，殘?jiān)铀芙猓D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備 取不加聚山梨酯 80工藝制得樣品同供試品制備法制得溶液。

2.5 陽(yáng)性樣品溶液的制備 精密稱(chēng)取聚山梨酯 80約10 mg，加入5 mL水溶解，轉(zhuǎn)移至置分液漏斗中，按2.3項(xiàng)下自“加入氯仿萃取5次”起，同法制備溶液，作為陽(yáng)性樣品溶液。

2.6 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。供試品溶液分離度好，達(dá)到定量要求，陰性樣品的色譜圖在聚山梨酯 80保留時(shí)間的相應(yīng)位置上無(wú)峰出現(xiàn)，表明此方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，陰性無(wú)干擾。

2.7 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密量取上述貯備液0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0 mL至10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度搖勻，進(jìn)樣10 μL。測(cè)定峰面積，以濃度 對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，峰面積對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。對(duì)數(shù)方程Y=1.737 9X+2.012 8，R2+=0.999 3。表明本法在1.013 64～15.204 6 g?L-1具有良好的對(duì)數(shù)線(xiàn)性。

2.8 精密度試驗(yàn) 精密吸取110703批次熱毒寧注射液樣品5 mL按供試品溶液的制備項(xiàng)下操作，進(jìn)樣20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果聚山梨酯80峰面積的RSD 1.9%，表明儀器精密度良好。

2.9 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取110703批次熱毒寧注射液樣品5 mL按供試品溶液的制備項(xiàng)下操作，在0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣20 μL，測(cè)定峰面積。結(jié)果樣品面積的RSD 0.99%，表明本法在24 h內(nèi)有良好的穩(wěn)定性。

2.10 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取6份110703批次熱毒寧注射液樣品5 mL按供試品溶液的制備項(xiàng)下操作。進(jìn)樣，每次20 μL，測(cè)定峰面積并計(jì)算含量和RSD。結(jié)果熱毒寧注射液中聚山梨酯80的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.89 g?L-1，RSD 2.1%。表明本法具有良好的重復(fù)性。

2.11 加樣回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法。精密吸取已知含量的110703批次熱毒寧注射液樣品6份各2.5 mL，精密加入聚山梨酯 80對(duì)照品適量加水至5 mL，按供試品溶液的制備項(xiàng)下操作，吸取20 μL進(jìn)樣。測(cè)定峰面積并計(jì)算回收率，見(jiàn)表1，聚山梨酯80的平均回收率為99.37%，RSD 0.67%。表明本法回收率符合含量測(cè)定要求。

2.12 樣品測(cè)定 通過(guò)對(duì)聚山梨酯 80的線(xiàn)性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率等進(jìn)行考察，證明該方法可以用于測(cè)定聚山梨酯 80含量。按上述方法，測(cè)定10批熱毒寧注射液成品中聚山梨酯 80含量，見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 測(cè)定方法的選擇 TSK-GEL Wxl 的填充色譜柱是一種高水相的凝膠色譜柱，用于分析和制備水溶性的物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、酶、核酸。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器可以檢測(cè)不揮發(fā)的成分，其響應(yīng)值與光學(xué)性能和官能團(tuán)無(wú)關(guān)。聚山梨酯80是一種大分子物質(zhì)，不具有紫外末端吸收和不揮發(fā)的特性，因此選擇用高效凝膠色譜串聯(lián)蒸發(fā)光散射檢測(cè)法檢測(cè)熱毒寧注射液中的聚山梨酯80。

3.2 流動(dòng)相組成和比例的選擇 試驗(yàn)過(guò)程中比較了乙腈-20 mmol?L-1醋酸銨（10∶90）、乙腈-20 mmol?L-1醋酸銨（5∶95）、20 mmol?L-1醋酸銨水溶液、水溶液，結(jié)果表明以水溶液為流動(dòng)相時(shí)色譜峰分離度高，峰形較好。

3.3 色譜柱比較 本實(shí)驗(yàn)比較了Phenomenx poly Sep-GFC-P1000，Phenomenx Bio Sep-SEC-S2000，Waters UltrahgdrogelTM 120，TOSH TSK-GEL G1000PW，TOSH TSK-G2000SWxl和TOSH TSK-GEL G4000PWxl色譜柱，結(jié)果TOSH TSK-GEL G4000PWxl（可檢樣品相對(duì)分子質(zhì)量2 000～300 000）色譜柱對(duì)聚山梨酯80的分離效果更佳。

中藥注射液成分復(fù)雜， 部分品種不適合直接上凝膠柱進(jìn)行分析， 樣品的前處理方法十分重要， 需視具體情況進(jìn)行， 熱毒寧注射液根據(jù)干擾成分的性質(zhì)采用液-液萃取方法去除干擾，保證了該測(cè)定方法的準(zhǔn)確性；該方法的建立也間接的控制了熱毒寧注射液的安全性和有效性。

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（1. Jiangsu Kanion Parmaceutical Co.， Ltd.， Lianyungang 222001， China；

2. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process， Lianyungang 222001， China）

[Abstract] Objective： To establish the method for determining polysorbate 80 in Reduning injection by HPLC-ELSD， and to control the mass of polysorbate 80 in Reduning injection. Method： It was performed by HGPC-ELSD with TOSHTSK-GEL G4000PWxl （7.8 mm×300 mm，10 μm）. Water was used as mobile phase， the flow rate was 0.7 mL?min-1， and the temperature was set at 30 ℃. The evaporated light scattering detector was adopted. The drift tube temperature was 55 ℃， and nitrogen was used as carrier gas， with the flow rate of 2.0 L?min-1 and gain of 1.0. Result：The calibration curve showed good linearity of polysorbate 80 in the test range from 1.01 to 15.20 g?L-1（r2+=0.999 3）. The recovery rate was 98.10% with RSD of 2.0%.Conclusion： The method is simple， rapid， accurate and reliable and suitable for the determination of polysorbate 80 in Reduning injection.

篇4

【關(guān)鍵詞】 羊藿苷；乳增寧膠囊；高效液相色譜法；含量測(cè)定

Abstract：Objective To develop a method for determining the content of icariin in Ruzengning Capsules. Methods A HPLC method was set up to with Hypersil ODS C18 (4.6 mm×250 mm， 5 μm) column， and methanol-water (70︰30) as mobile phase， the UV detection wavelength was 275 nm and the flow rate was 1.0 mL/min. Result The calibration curve was showed good linearity (r＝0.999 8) within the range of 0.105～0.840 μg and the average recovery was 99.5%， RSD was 1.27% (n＝6). Conclusion The method is simple and rapid， and with good reproducibility for the determination of icariin in Ruzengning Capsules.

Key words：icariin；Ruzengning Capsules；HPLC；content determination

乳增寧膠囊由艾葉、羊藿、柴胡、川楝子、天門(mén)冬、土貝母6味藥材經(jīng)加工制備而成，具有疏肝解郁、調(diào)理沖任的功效，臨床上用于肝郁氣滯型及沖任失調(diào)型的乳腺增生等的治療[1]。本試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[2-3]的方法，以高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定乳增寧膠囊中羊藿苷的含量，擬建立簡(jiǎn)便快捷、專(zhuān)屬性和重復(fù)性均較好的含量測(cè)定方法。

1 儀器與試藥

日本島津LC-10ATvp型高效液相色譜儀；SPD-20Avp型紫外檢測(cè)器；KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。羊藿苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)110737-200312)；乳增寧膠囊(市售，批號(hào)分別為070901、080301、080302、080303)。甲醇為色譜純；其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(70︰30)；檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：(30.0±1)℃；保留時(shí)間：約為10 min；進(jìn)樣量：20 μL；理論塔板數(shù)按羊藿苷計(jì)應(yīng)不低于2 000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取羊藿苷對(duì)照品適量，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含25 μg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取本品裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物，研細(xì)，混勻，精密稱(chēng)定約0.5 g，置50 mL棕色量瓶中，加入70%乙醇約40 mL，超聲處理20 min(功率100 W，頻率40 kHz)，取出，放冷，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 空白試驗(yàn)

取處方項(xiàng)下除羊藿以外的其余藥材，按供試品溶液的制備方法制備陰性溶液，按上述色譜條件分析。在與對(duì)照品的相應(yīng)位置上，無(wú)明顯其他峰出現(xiàn)。見(jiàn)圖1。

2.5 線(xiàn)性范圍考察

配制52.5 μg/mL的羊藿苷對(duì)照品溶液。分別精密吸取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL轉(zhuǎn)移至10 mL棕色量瓶中，用甲醇定容。分別精密吸取上述溶液各20 μL進(jìn)樣。以羊藿苷對(duì)照品量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程為：Y＝1.288×106X－3 479.602，r＝0.999 8。結(jié)果表明，羊藿苷對(duì)照品在0.105～0.840 μg范圍與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn)

取同一對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定，羊藿苷平均峰面積為722 896，RSD＝0.41%(n＝6)，結(jié)果表明精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批供試品(批號(hào)070901)進(jìn)行6次平行的供試品溶液制備與測(cè)定，結(jié)果羊藿苷平均含量為1.126 6 mg/粒，RSD＝0.82%(n＝6)。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批供試品(批號(hào)080301)適量，按上述方法制成供試品溶液，放置0、1、3、6、10、20 h，分別進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果平均峰面積為547 734，RSD＝2.83%，表明供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量的同一批樣品粉末6份，各約0.1 g，分別加入羊藿苷對(duì)照品溶液(0.216 mg/mL)1.0、2.0、4.0 mL，按供試品溶液制備方法制備供試液。照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。表1 羊藿苷回收率試驗(yàn)結(jié)果（略）

2.10 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，按供試品溶液制備方法制備供試液，依上述色譜條件測(cè)定樣品中羊藿苷的含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。表2 3批樣品羊藿苷含量測(cè)定結(jié)果(略)

3 討論

本試驗(yàn)曾考察了多種流動(dòng)相：甲醇-水(15∶85)、乙腈- 0.4%磷酸(13∶87)、3%甲酸-甲醇(79∶21)和甲醇-0.5%醋酸(70∶30)等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇-0.5%醋酸(70∶30)能夠達(dá)到分離效果，且出峰時(shí)間適中，峰型較好。本試驗(yàn)對(duì)超聲提取時(shí)間進(jìn)行了比較，加入50%甲醇分別超聲提取10、20、30、40 min，結(jié)果顯示，羊藿苷在20～30 min提取完全，為了便于操作、提高檢驗(yàn)效率，將超聲時(shí)間確定為20 min。此方法簡(jiǎn)便快捷，重復(fù)性和穩(wěn)定性均較好，操作簡(jiǎn)便，可用于乳增寧膠囊的質(zhì)量控制。

參考文獻(xiàn)

[1] WS3-140(X-130)-2000(Z)，中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)[S].

篇5

硝磺草酮（Mesotrione），化學(xué)名2（4甲磺?；?硝基苯甲?；┉h(huán)己烷1,3二酮，又名甲基磺草酮、硝磺酮，是瑞士先正達(dá)公司發(fā)明的玉米田芽前和苗后廣譜選擇性除草劑，因具有低毒性、高活性、對(duì)環(huán)境友好等特點(diǎn)\[1,2\]，是近幾年廣泛使用的除草劑。但最近研究發(fā)現(xiàn)，硝磺草酮具有高效的起始活性和殘留活性，長(zhǎng)期食用含有硝磺草酮?dú)埩舻氖澄飼?huì)對(duì)人畜產(chǎn)生致癌作用，或引起胎兒畸形\[3,4\]。歐盟和世界貿(mào)易組織對(duì)漿果、亞麻籽、越橘、栗草料等物質(zhì)中硝磺草酮的限量為0.05 mg/kg。而美國(guó)、加拿大等國(guó)對(duì)蘆筍、草桿、草料等物質(zhì)中硝磺草酮的限量為0.01 mg/kg\[10～13\]。

目前，檢測(cè)硝磺草酮的方法主要有高效液相色譜法\[5～8\]、熒光檢測(cè)法\[9\]、液相色譜核磁共振和液相色譜質(zhì)譜法\[10\]。高效液相色譜法專(zhuān)屬性差，而液相色譜核磁共振和液相色譜質(zhì)譜法主要用于硝磺草酮代謝的研究，并且檢出限不能夠滿(mǎn)足檢測(cè)要求（0.01 mg/kg）。本研究采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法檢測(cè)食品中硝磺草酮，本方法的檢出限為0.01 mg/kg，能夠滿(mǎn)足檢測(cè)要求。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑 API4000液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（美國(guó)AB公司）；凝膠色譜（美國(guó)J2公司）；渦旋混合器（美國(guó)Vortex.Genie）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本Eyela N1100）；高速離心機(jī)（上海安亭公司）；MilliQ超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。甲醇、乙腈、乙酸乙酯、環(huán)己烷（色譜純，德國(guó)Merck公司）；硝磺草酮標(biāo)準(zhǔn)品（德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司，純度≥99.5%），根據(jù)需要用甲醇配制成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（0～4 ℃保存）。其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭瑢?shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1）提取 稱(chēng)?。Z谷、水果、蔬菜、肉類(lèi)）樣品試樣2.00 g于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈水（3∶1,V/V）溶液，用NaOH溶液調(diào)至pH 7～8，超聲5 min，加入2.0 g NaCl，渦旋混勻，以10000 r/min離心4 min，將上清液轉(zhuǎn)移至雞心瓶，在40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約1 mL；將液體轉(zhuǎn)移至試管中，以6 mL乙酸乙酯環(huán)己烷（1∶1,V/V）分3次洗滌雞心瓶，合并洗滌液于試管中，用環(huán)己烷乙酸乙酯（1∶1,V/V）定容至10 mL，過(guò)0.22

SymbolmA@ m濾膜，待凈化。（2）凈化 凝膠色譜（GPC）凈化：Bio Beads SX3凝膠凈化柱（700 mm×25 mm）；流動(dòng)相：乙酸乙酯環(huán)己烷（1∶1,V/V）；流速：3.0 mL/min；樣品定量環(huán)：10 mL；預(yù)淋洗時(shí)間：10 min；凝膠色譜平衡時(shí)間：5 min；收集時(shí)間：15～24 min。將10 mL待凈化液按此條件進(jìn)行凝膠色譜（GPC）凈化，收集組分于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約2 mL，待固相萃取凈化。 固相萃取（SPE）凈化：將濃縮液流過(guò)活性炭柱（預(yù)先用6 mL甲醇活化），用15 mL甲醇洗脫，收集流出液及洗脫液，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用甲醇定容至1.0 mL，過(guò)0.22

SymbolmA@ m濾膜，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。（3）測(cè)定 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件：ZOREAX SBC18色譜柱（150 mm×2.1 mm， 3.5

SymbolmA@ m）；

[FQ（7\.30,Y－WZ][HT6][HJ*4]表1 硝磺草酮選擇離子對(duì)和優(yōu)化參數(shù)

Table 1 Selected ion pair and optimized parameters of mesotrione

[HT6][BG（][BHDFG4*2,WK6,WK7。2,WK6,WK7W]藥物Compound母離子Precursor ion（m/z）子離子Daughter ion（m/z）去簇電壓Declustering

potential

（V）碰撞能量

Collision Energy

（eV）

硝磺草酮

Mesotrione

338.0290.9

Symbolm@@ 32.3

Symbolm@@ 12.4338.0211.9

Symbolm@@ 31.3

Symbolm@@ 42.5[BG）F][HT5”][HJ]

流動(dòng)相：甲醇0.1%甲酸溶液，梯度洗脫程序：0～5 min, 10%～50%甲醇; 5～10 min, 50%～95%甲醇；10～15 min, 95%～50%甲醇。流速：200

SymbolmA@ L/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10

SymbolmA@ L。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；負(fù)離子掃描方式；多反應(yīng)檢測(cè)方式（MRM）；其它質(zhì)譜條件見(jiàn)表1。選擇離子m/z 338.0/290.9為定量離子對(duì)。

3 結(jié)果與討論

3.1 凝膠色譜凈化條件的選擇 食品樣品中含有的脂肪、色素等雜質(zhì)干擾分析結(jié)果，GPC能有效去除這些干擾物，常用于食品中農(nóng)藥殘留的凈化\[11\]。本實(shí)驗(yàn)分別將硝磺草酮標(biāo)準(zhǔn)溶液加入水果、蔬菜、糧谷、肉等多種空白樣品溶液中，采用凝膠色譜柱凈化，在254 nm波長(zhǎng)下觀察硝磺草酮紫外光譜圖，確定凝膠色譜凈化的收集時(shí)間。凝膠色譜流出曲線(xiàn)表明，硝磺草酮在15～24 min時(shí)流出，收集此區(qū)間的洗脫液可最大程度地除去基質(zhì)干擾，同時(shí)保證農(nóng)藥組分的回收率。

3.2 固相萃取柱及洗脫液的選擇 分別以乙腈、甲醇、乙酸乙酯環(huán)己烷（1∶1, V/V）、 甲苯乙腈（3∶1,V/V）和丙酮為洗脫液，以活性炭柱、Florisil硅土柱、氨基柱、中性氧化鋁柱、HLB柱、PSA柱和C18柱為固相萃取柱，進(jìn)行硝磺草酮回收率測(cè)定。實(shí)驗(yàn)表明，采用活性炭固相萃取柱，甲醇為洗脫液時(shí)的回收率（95.2%～110.4%）最佳。

分 析 化 學(xué)第40卷

第5期張代輝等： 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食品中硝磺草酮

3.3 線(xiàn)性關(guān)系 硝磺草酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度在0.005～0.2 mg/L范圍內(nèi)與響應(yīng)值有良好線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程為y＝2.87×107x＋1.13×105，相關(guān)系數(shù)r＝0.9995（n＝6）。

3.4 方法準(zhǔn)確度和精密度 選取不含硝磺草酮的糧谷、水果、蔬菜、肉類(lèi)的空白樣品，分別添加0.01, 0.05和0.10 mg/kg的硝磺草酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行回收測(cè)定，回收率為85.5%～98.1%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%～6.1% （n＝??）。

3.5 樣品分析 采用本方法對(duì)菠菜、玉米、豬肉、土壤等23個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)定，僅在1個(gè)土壤樣品中檢測(cè)出硝磺草酮，含量為0.25

SymbolmA@ g/kg。由此可見(jiàn)，硝磺草酮農(nóng)藥在農(nóng)作物上殘留較少，但會(huì)部分殘留在土壤中。

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Determination of Mesotrione in Food by Liquid

Chromatography Tandem Mass Spectrometry

ZHANG DaiHui1,3, TENG GuoSheng2, LI ZhengQiang*1, LI AiJun3, KANG MingQin3, MOU Jun3

1（College of Life Science, Jilin University, Changchun 130012, China）

2（Changchun University of Technology, Changchun 130012, China）

3（Jilin EntryExit Inspection and Quarantine Bureau, Changchun 130062, China）

Abstract A method for the determination of mesotrione in foods by liquid chromatography tandem mass spectrometry （LCMS/MS） has been developed. The mesotrione in food samples was extracted with acetonitrilewater （3∶1, V/V）. The extract was cleaned up by gel permeation chromatography （GPC） and solid phase extraction cartridges （SPE）, and then diluted to a certain volume with methanol. The mobile phase in LC was an acetonitrile0.1% formic acid aqueous solution. Electrospray ionization （ESI） source in negative ionization mode as well as multiple reaction monitoring（MRM） mode was used in the detection. The final solution was determined and confirmed by LCMS/MS, and quantified by the external standard method. While the fortified levels of mesotrione were in the range of 0.01－0.10 mg/kg, the recoveries were 85.5%－98.1%, and the RSDs were in the range of 3.0%－6.1%. The limit of determination was 0.01 mg/kg. The method is highly sensitive and well repeatable for the determination of mesotrione in foods.

篇6

膠原廣泛存在于動(dòng)物體的皮膚、肌腱、韌帶、軟骨等結(jié)締組織中，是細(xì)胞外基質(zhì) 4 大組分之一，屬于一種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。膠原是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最高的蛋白質(zhì)，占體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的25% ～ 30%［1 －2］。由于具有獨(dú)特的三股螺旋結(jié)構(gòu)，賦予了膠原良好的生物相容性、弱抗原性、可降解性等生物學(xué)功能。膠原應(yīng)用于醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域具有得天獨(dú)厚的條件，如具有良好的生物相容性、較弱的抗原性、親水性好、利于細(xì)胞的粘附，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)等［3］。正是由于膠原的應(yīng)用廣泛，作為生物醫(yī)用材料的潛力巨大，膠原的分離純化成為了眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)。膠原的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，且不溶于水，導(dǎo)致從動(dòng)物組織中純化較為困難。如果膠原中無(wú)機(jī)鹽含量過(guò)高，不僅影響純度，還將會(huì)影響其作為止血材料的性能，對(duì)創(chuàng)面造成不良的影響［4］。膠原的分離純化主要有以下特點(diǎn): 膠原作為一種蛋白質(zhì)，是具有生物活性的物質(zhì)，在分離純化過(guò)程中，有機(jī)溶劑、溶液 pH 值、環(huán)境溫度、離子強(qiáng)度的變化等，均可使蛋白質(zhì)變性失活; 原料的組成非常復(fù)雜; 作為醫(yī)用的生物材料，所要求的產(chǎn)品必須是高度純化的，且無(wú)菌、無(wú)致熱源等［5］。應(yīng)用色譜法分離純化生物大分子，效率高，選擇性好。其中又主要以包括凝膠色譜等液相色譜為主［6］。凝膠色譜又叫凝膠層析或凝膠過(guò)濾色譜，是混合物隨流動(dòng)相經(jīng)固定相( 網(wǎng)狀孔徑) 的層析柱時(shí)，混合物中各組分按其分子大小不同而被分離的技術(shù)，通過(guò)蛋白質(zhì)分子大小不同實(shí)現(xiàn)分離的?？讖奖饶z大的分子不能進(jìn)入凝膠內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而被排阻于凝膠之外，隨著溶劑在凝膠之間的空隙向下移動(dòng)并最先流出柱外; 比網(wǎng)孔小的分子可滲透進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，再擴(kuò)散出來(lái)，經(jīng)歷的流程長(zhǎng)，流動(dòng)速度慢，后流出［7］。與其他的色譜法相比較，凝膠色譜有其自身的優(yōu)點(diǎn)，如凝膠過(guò)濾的介質(zhì)價(jià)廉易得、可重復(fù)再生、溶質(zhì)與介質(zhì)不發(fā)生相互作用等，適合于規(guī)模化的分離純化。因而在生物大分子分離純化過(guò)程中應(yīng)用最普遍，尤其是在分離純化初級(jí)階段及成品化前的脫鹽工序被廣泛應(yīng)用［8］。本研究對(duì)凝膠色譜法分離純化膠原進(jìn)行了探索和試驗(yàn)，通過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)收集樣品的吸光值的變化趨勢(shì)，結(jié)合電導(dǎo)率的走向，分析膠原的分離效果和除鹽效果，為膠原規(guī) 模 化 的 分 離 純 化 奠 定 一 定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1． 1 主要試劑與儀器

純化豬皮［9］，經(jīng)過(guò)一系列物理化學(xué)與生物方法處理，除去脂肪、毛發(fā)等雜質(zhì)成分實(shí)驗(yàn)室自制而得;葡聚糖凝膠，Dextran Gel G － 25( 粒度 100 － 200 目) ，中 國(guó) 長(zhǎng) 征 制藥廠;牛腱 I 型膠原( 生化級(jí)) ，Sigma 公司;三羥甲基氨基甲烷( BR) 、氯胺 T( AR) ，成都科龍化工試劑廠;冰乙酸( AR) ，重慶申渝化學(xué)試劑廠;硫酸銨( AR) ，重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司;對(duì)二甲氨基苯甲醛，天津新純化學(xué)試劑研究所。精密 pH 計(jì)，PHS － 3B，上海雷磁儀器廠;電導(dǎo)率儀，DDS － 307，上海雷磁儀器廠;磁力攪拌器，84 －1A;電子天平，F(xiàn)A2004N，上海箐海儀器有限公司;層析柱，成都蜀都化驗(yàn)設(shè)備廠;微量移液器，上海榮泰生化工程有限公司;冷凍干燥機(jī)，F(xiàn)reeze 6，Labconca;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) UV751GD，上海分析儀器總廠;傅里葉變換紅外光譜儀，NicoletiS10，美國(guó) Thermo Fisher。

1． 2 試驗(yàn)方法

1． 2． 1 凝膠色譜法分離膠原

1． 2． 1． 1 凝膠的預(yù)處理

稱(chēng)取適量葡聚糖凝膠 G － 25，加入蒸餾水中; 沸水加熱溶脹，然后用浮選法除去小顆粒和碎片。

1． 2． 1． 2 凝膠的裝柱

選用柱高 20cm，內(nèi)徑 6cm 的層析柱，排除死體積內(nèi)氣泡，溶脹好的凝膠與洗脫液混合后，緩慢加入到柱體內(nèi)，將其垂直固定，少量洗脫液沖洗管壁，穩(wěn)定下沉。

1． 2． 1． 3 粗提膠原的制備

純化豬皮剪碎，經(jīng)三羥甲基氨基甲烷 － 氯化鈉緩沖溶液浸泡直至皮塊稍微溶脹，傾去緩沖液，調(diào)節(jié) pH 值 2．5，2% 胃蛋白酶，4℃ 條件下反應(yīng) 8h( 皮塊基本水解完全) ，抽濾得清液，調(diào)節(jié) pH 值至 7． 5，硫酸銨鹽析，得到膠原粗提物，上樣時(shí)做適當(dāng)?shù)南♂尅?/p>

1． 2． 1． 4 上樣

打開(kāi)柱底出口，放洗脫液至膠床面齊，關(guān)閉下口，取稀釋后的膠原溶液樣品 5mL，使移液管尖端慢慢地沿著管壁，將樣品放入床內(nèi)，再用少量洗脫液沖洗管壁 2 次，保留液面 2 ～ 3mm時(shí)開(kāi)始上樣。

1． 2． 1． 5 洗脫、收集樣品

每 4mL 收集一管，共收集 30 管。

1． 2． 2 透析方法純化膠原

將鹽析處理的膠原鹽溶液過(guò)濾，加入適量 0． 2mol/L 醋酸溶液溶解，將此膠原溶液裝入透析袋( 截流分子質(zhì)量 14kDa) ，對(duì) 0． 04mol/L 和 0． 02mol/L 的 Na2HPO4溶液各透析 1d，蒸餾水透析 2d，經(jīng)常換液( 整個(gè)透析過(guò)程于4℃ 下進(jìn)行) 。完成后，將透析袋內(nèi)的樣品均勻轉(zhuǎn)移至干凈的培養(yǎng)皿中冷凍干燥( 2d，－ 37℃ 真空冷凍干燥) ，得海綿狀膠原固體。

1． 2． 3 樣品的性能檢測(cè)

1． 2． 3． 1 紫外檢測(cè)

將收集的樣品于 225nm 處測(cè)定吸光值，以管號(hào)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線(xiàn)。

1． 2． 3． 2 電導(dǎo)率測(cè)定

測(cè)定收集到的樣品的電導(dǎo)率，以管號(hào)為橫坐標(biāo)，電導(dǎo)率為縱坐標(biāo)，繪制電導(dǎo)率變化趨勢(shì)圖。

1． 2． 3． 3 傅里葉變換紅外光譜檢測(cè)

紅外光譜的形成是以分子的振動(dòng)為基礎(chǔ)，而這些振動(dòng)可以定位到分子殊的鍵和基團(tuán)［10］。因此可以通過(guò)紅外檢測(cè)手段對(duì)分離樣品進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的表征，檢測(cè)出膠原特有基團(tuán)的特征吸收峰。收集到的吸收峰段的試樣在 －37℃ 下，真空冷凍干燥 2d。制樣采用溴化鉀壓片，進(jìn)行檢測(cè)時(shí)掃描波數(shù)為450 ～ 4 000cm－ 1，分辨率為 2cm－ 1，每次掃描重復(fù) 16 次。

1． 2． 3． 4 羥脯氨酸含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，加入少許 0. 001mol/L 鹽酸溶液，配制濃度分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9 和10mg/L的羥 脯 氨 酸 標(biāo) 準(zhǔn) 液，待 用。以 0．001mol /L 鹽酸溶液為空白液，于 2mL羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液和空白液中加入 1mL氯胺 T 溶 液，混 合 均 勻，室 溫 靜 置20min; 加入過(guò)氯酸溶液 1mL，室溫靜置 5min; 加入對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液1mL，混合均勻; 60℃ 保溫 20min 后，立即置于水中冷卻; 測(cè)定在 560nm 處的吸光值; 以羥脯氨酸含量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。取 0． 5mL 樣品溶液和 0． 5mL 鹽酸至安醅瓶( 另取 0． 5mL 蒸餾水和 0．5mL 鹽 酸 作 空 白 對(duì) 照) ，封 管 后 于120℃ 加熱 6h 進(jìn)行水解。調(diào)節(jié) pH 值至 4 ～ 6，定容至 25mL 待用。樣品的羥脯氨酸含量測(cè)定操作方法同標(biāo)準(zhǔn)液的測(cè)定方法。

2 結(jié)果與討論

2． 1 紫外分析和電導(dǎo)率分析

試驗(yàn)及文獻(xiàn)［11］表明，膠原溶液在225nm 處有強(qiáng)烈的吸收峰，故試驗(yàn)收集樣 品 在 225nm 處 檢 測(cè) 吸 光 值，225nm 處測(cè)得吸光值及電導(dǎo)率的變化如圖 1 所示。由圖 1 可以看出: 在 225nm 處的吸光值先是非常平緩，因?yàn)槭紫攘鞒鰜?lái)的洗脫液中既沒(méi)有鹽也沒(méi)有溶解的膠原分子，故吸光值較低，且都處在同等水平; 然后吸光值急劇上升到一個(gè)平臺(tái)，保持在一定的水平，說(shuō)明此刻已經(jīng)有物質(zhì)從凝膠色譜柱系統(tǒng)中流出，此物質(zhì)即為膠原。膠原是大分子物質(zhì)，不會(huì)進(jìn)入凝膠內(nèi)部的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被排阻于凝膠之外，所以會(huì)先流出柱體;由于上樣量是一定的，當(dāng)然體系中膠原分子也是一定的，隨著膠原逐漸的流出，吸光值也會(huì)下降。因此，在出現(xiàn)平臺(tái)之后，曲線(xiàn)又急劇下降到一定程度，趨于平緩。但是此時(shí)的吸光值比初始的吸光值高，說(shuō)明有一些小分子蛋白的流出，同時(shí)開(kāi)始有鹽的流出，這點(diǎn)從電導(dǎo)率的曲線(xiàn)急劇上升可以明顯看出。硫酸銨鹽是小分子物質(zhì)，能進(jìn)入到凝膠內(nèi)部，滲透進(jìn)凝膠顆粒的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，故流出較膠原大分子慢。用氯化鋇溶液檢測(cè)硫酸銨鹽的存在，結(jié)果發(fā)現(xiàn)直到第 27 管開(kāi)始才有沉淀析出，這點(diǎn)與電導(dǎo)率的變化是一致的，進(jìn)一步證實(shí)了之前吸光值變化的結(jié)果。由以上分析初步斷定第 17 －20 管( 即吸光值變化曲線(xiàn)平臺(tái)段) 收集的樣品為膠原溶液，且沒(méi)有鹽分的存在。

2． 2 紅外光譜分析

通過(guò)紅外光譜的檢測(cè)，可以反映物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，圖譜中的吸收峰與分子中的各個(gè)基團(tuán)的振動(dòng)形式相對(duì)應(yīng)，因此可以得到試樣的官能團(tuán)化學(xué)鍵的基本信息。酰胺Ⅰ帶的特征吸收位于 1 600 ～1660cm－ 1左右，是由羰基的伸縮振動(dòng)引起的強(qiáng)烈吸收。文獻(xiàn)［10］表明，α － 螺旋的酰胺Ⅰ帶吸收波數(shù)范圍在 1 650 ～ 1658cm－ 1處。酰胺Ⅱ帶的特征吸收峰在1 550cm－ 1附近，與 N—H 彎曲振動(dòng)和C—N 伸縮振動(dòng)有關(guān)。位于 1 220 ～ 1 330cm－ 1區(qū)域的吸收歸屬于酰胺Ⅲ帶，酰胺Ⅲ帶的振動(dòng)能明顯區(qū)分 α － 螺旋與無(wú)規(guī)則卷曲這 2種二級(jí)結(jié)構(gòu)。另1 450cm－ 1附近的吸收峰是由 C—H 的彎曲振動(dòng)引起。圖 2 中 a 和 b 是凝膠色譜分離得到膠原樣品和常規(guī)透析方法得到的膠原的紅外光譜圖，圖 3 為 SigmaⅠ型膠原的紅外圖譜，各吸收峰的歸屬情況見(jiàn)表1。比較3 條紅外圖譜可以發(fā)現(xiàn):不論是凝膠色譜分離膠原還是常規(guī)透析法制得的膠原，均與 SigmaⅠ型膠原有相似的主要吸收峰。據(jù)文獻(xiàn)［12］表明，于1 235 ～1 450cm－ 1范圍的吸收峰可以表明膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)的存在。圖 2a 中波數(shù)為 1 239. 37、1 338. 98 和1 404. 83cm－ 1等處存在吸收峰，圖2b 中1 240. 8、1 338. 6 和 1 402. 5cm－ 1等處，也同樣明顯存在吸收峰，圖 3 中1 239. 58、1 337. 35、1 402. 49cm－ 1等處存在吸收峰。3 條圖譜中在 1 235cm－ 1和1 450cm－ 1附近的吸收峰的吸光度比值均在 0. 9 以上，較接近Ⅰ型膠原特征值1．0，而不是同等條件下的變性膠原和明膠的 0. 59［12］。因此，由紅外光譜分析可初步認(rèn)為凝膠色譜法分離的膠原基本保持了三股螺旋的結(jié)構(gòu)，且與同等條件下常規(guī)透析方法純化得到的膠原和 Sigma 公司的Ⅰ型膠原類(lèi)似。

2． 3 羥脯氨酸含量分析

羥脯氨酸是膠原的一種特征氨基酸，通過(guò)檢測(cè)溶液中羥脯氨酸的含量，可以較好地反映膠原含量及純度，按照 Woessner 法( 第 I 法)［13］測(cè)定羥脯氨酸 含 量，此 法 操 作 簡(jiǎn) 單，且 重 復(fù)性好。根據(jù)此方法測(cè)得羥脯氨酸含量為8． 02% ，與文獻(xiàn)值［14］7% ～ 14% 接近，基本符合羥脯氨酸在膠原中所占的比例，表明所分離得到的膠原樣品的純度較高，可初步判定應(yīng)屬于 I 型膠原。對(duì)于采用凝膠色譜法分離得到的豬皮膠原的結(jié)構(gòu)的分析，還需要進(jìn)一步通過(guò)電泳法，氨基酸全分析、圓二色譜法和原子力顯微鏡等檢測(cè)手段加以確證。

篇7

護(hù)理

【關(guān)鍵詞】  僵蠶　抗凝活性部位　化學(xué)成分　凝膠色譜法　高效液相色譜法　氮測(cè)定法

Abstract：Objective To explore the anticoagulating active components in water extraction, alcohol sedimentation and fraction separated by gelfiltration chromatography of Bombyx Batryticatus. Methods Anticoagulating active fractions were prepared by the methods of water extraction, 70% alcohol sedimentation and gelfiltration chromatography. Components (such as porteins or polypeptide, amino acids, oxalic acid ammonium) in each fraction were determined by chemical reaction indentification, Kjeldahl method, conductance, UV and HPLC. Results Polypeptide, amino acids and oxalic acid ammonium were the main components in anticoagulating active fractions, content of which reached more than 80%. The content of oxalic acid ammonium decreased about 52% processed by alcohol sedimentation, while the content of polypeptide and amino acids only decreased about 8%. The content of peptides and amino acids increased about 28% purified by gelfiltration chromatography compared with the one in water extraction and about 39% compared with the one in alcohol sedimentation. The content of oxalic acid ammonium was the same as the one in alcohol sedimentation, but decreased about 1 time compared with the one in water extraction. The content of 15 kinds of amino acids were 40%～50% in the solids of each fractions, which maked up to 60%～76% of the content of proteins determined by Kjeldahl method. Molecular weight range of peptides is 1.0～4.4 kDa. Conclusion This study provides a experimental basis for further separation and purification of anticoagulating active components from Bombyx Batryticatus.

Key words：Bombyx Batryticatus；anticoagulating active fractions；chemical components；gelfiltration chromatography；HPLC；Kjeldahl method

  　  僵蠶為蠶蛾科昆蟲(chóng)家蠶Bombyx mori L.4～5齡的幼蟲(chóng)感染(或人工接種)白僵菌而致死的干燥體,為傳統(tǒng)中藥,性味咸、辛、平,歸肝、肺、胃經(jīng)[1]。具熄風(fēng)止痙、活血通絡(luò)、化痰散結(jié)等功效,可用于治療急性驚風(fēng)、癲癇、中風(fēng)、面癱及頑固性頭痛等。僵蠶含有蛋白質(zhì)、脂肪酸、氨基酸、草酸銨、白僵菌素以及微量元素等成分[2-4],其水提液在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗凝、抗血栓、促纖溶及抗內(nèi)毒素所致紅細(xì)胞膜損傷等作用[5-7],草酸銨和蛋白質(zhì)(或多肽)、氨基酸等可能為其主要活性成分[8]。為進(jìn)一步研究僵蠶的抗凝活性成分,本實(shí)驗(yàn)探討了僵蠶水煎煮液的醇沉液和凝膠色譜分離凈化,及其抗凝活性成分中氨基酸和草酸銨等的定性定量分析,現(xiàn)報(bào)道如下。

1  實(shí)驗(yàn)材料

護(hù)理

Waters 515 HPLC系統(tǒng)(Waters 公司)；BS100A自動(dòng)部分收集系統(tǒng)(上海市滬西儀器廠)；Start-4半自動(dòng)四通道血凝儀(法國(guó)STAGO公司)；4300-Pro紫外分光光度計(jì)(瑞士安瑪西亞公司)；HR2838型勻漿機(jī)(菲力普公司)；LP115 pH計(jì)(METTER TOLEDO公司)；DDS-ⅡA電導(dǎo)率儀(上海理達(dá)儀器廠)；移液槍(0.1 mL和1.0 mL,日本)；半微量凱氏定氮裝置；Z-16和Z-26層析柱(上?；瘜W(xué)儀器廠)。制僵蠶(購(gòu)自湖南振興中藥飲片有限公司)；葡聚糖凝膠(Biotech公司)；凝血酶試劑(上海太陽(yáng)生物技術(shù)公司,批號(hào)N25006)；兔血漿(自制)；15種氨基酸對(duì)照品(Sigma公司)；水為超純水；甲醇(色譜純)、三氟乙酸(THF)、2-巰基乙醇、鄰苯二甲醛(OPA)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)等化學(xué)試劑均為分析純。

2  方法與結(jié)果

2.1  樣品溶液的制備

   

稱(chēng)取制僵蠶1 500 g(樣品A),用8倍量水浸泡過(guò)夜,以3 000 r/min勻漿,然后煎煮2次,每次30 min,過(guò)濾,合并濾液,離心,得提取液8 450 mL(樣品B),將其濃縮至含原藥材2 g/mL,加無(wú)水乙醇濃度至60%,4 ℃放置過(guò)夜,3 000 r/min離心,取上清液水浴濃縮至含原藥材約6 g/mL,即得粗提液240 mL(樣品C)。將30 mL該液加到用0.05 mol/L NaCl的0.02 mol/L Tris-HCl (pH 7.4)緩沖液平衡的Sephadex G-25凝膠柱(φ2.6 cm×80 cm)上,用相同緩沖液洗脫,自動(dòng)分步收集器收集,2.5 mL/ (10 min·管),每2～3管按文獻(xiàn)方法[8]測(cè)定凝血酶時(shí)間(TT,s)、紫外吸收光譜,用重量法測(cè)定質(zhì)量百分濃度(m/v)、電導(dǎo)率儀測(cè)定溶液電導(dǎo)率,得洗脫曲線(xiàn)(見(jiàn)圖1)。將TT在40～100 s之間的組分合并得洗脫液69 mL(樣品D),TT≥100 s的組分合并得洗脫液82.5 mL(樣品E),E即為抗凝活性部位。

圖1表明, 紫外吸收光譜法(UV)檢測(cè)的最強(qiáng)色譜峰的前半部分為具有抗凝活性的部位,與UV法測(cè)得的G-25凝膠色譜峰值不重合,而按質(zhì)量百分濃度(M/V)和電導(dǎo)率法測(cè)得的色譜峰值與抗凝活性峰值基本重合。

2.2  抗凝活性部位的化學(xué)成分理化鑒別

2.2.1  茚三酮反應(yīng)、pH值、電導(dǎo)率、AgNO3/HNO3反應(yīng)和CaCl2/HNO3反應(yīng)  分別取B～E樣品溶液進(jìn)行理化測(cè)定,結(jié)果表明,僵蠶提取分離后的B～E樣品所檢測(cè)的理化性質(zhì)結(jié)果一致,提示所含主要成分基本相同。茚三酮反應(yīng)陽(yáng)性,活性部分電導(dǎo)很大,與AgNO3產(chǎn)生白色沉淀,滴加HNO3后沉淀部分溶解,與CaCl2產(chǎn)生沉淀,滴加HNO3沉淀溶解。提示抗凝活性成分可能是鹽類(lèi)(如氯化物、草酸鹽等)、蛋白質(zhì)、肽類(lèi)或其它含氨基酸的化合物。

2.2.2  紫外吸收光譜

取各樣品稀釋適當(dāng)后在200～400 nm掃描,其紫外吸收光譜見(jiàn)圖2。

圖2表明,樣品B～E的UV光譜形狀均不相同,表明提取分離所得樣品化學(xué)成分有所不同。提取分離后除去了大量的無(wú)活性物質(zhì),特別是經(jīng)過(guò)凝膠色譜純化后,UV光譜變化較大。

2.2.3  樣品E的凝膠色譜分析及其分子量分析

取樣品E中TT≥600 s的餾分2 mL上Sephadex G-15(φ1.6 cm×50 cm)柱,用水洗脫鹽,4.0 mL/(10 min·管),自動(dòng)分步收集器收集,測(cè)定各管的TT值、260 nm和280 nm處的吸光度及化學(xué)反應(yīng)特性,結(jié)果見(jiàn)表1。表1  TT≥600 s餾分的凝膠柱脫鹽中餾分的抗凝活性和理化特性檢

測(cè)結(jié)果（略）注：*必要時(shí),通過(guò)稀釋餾分,測(cè)定吸光度在0.2～0.8之間,計(jì)算而得

2.3  定量分析護(hù)理

2.3.1  固形物含量測(cè)定

精密吸取樣品B～E各2.0 mL,80 ℃下烘至近干,100 ℃下烘至恒重,精密稱(chēng)定,按每1 mL樣品溶液扣除5.0 mg的Tris和NaCl重量,得固形物重量和濃度(各樣品均為n＝3,RSD不超過(guò)0.8%),結(jié)果見(jiàn)表2。表2  僵蠶各部位中的固形物和蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果（略）注：*與樣品A比

2.3.2  指標(biāo)檢測(cè)

蛋白質(zhì)：按《中華人民共和國(guó)藥典》中半微量氮測(cè)定法操作,計(jì)算總氮含量。將該氮含量扣除銨態(tài)氮含量,再與6.25相乘,即為蛋白質(zhì)質(zhì)量和百分濃度(W/V)。各樣品均為n＝3,RSD不超過(guò)1.4%。銨根[9]：按《中華人民共和國(guó)藥典》中半微量氮測(cè)定法操作(40% NaOH試液用120 g/L氧化鎂懸濁液代替),計(jì)算銨根質(zhì)量和百分濃度(W/V)。各樣品均為n＝3,RSD不超過(guò)1.2%。草酸根[3]：精密取B～E樣品液約5 mL,氯化鈣沉淀-高錳酸鉀滴定法測(cè)定(各樣品均為n＝3,RSD不超過(guò)1.0%)。結(jié)果見(jiàn)表3、表4。表3  僵蠶各部位中銨根和草酸根的測(cè)定結(jié)果（略）注：*與樣品B比表4  僵蠶各部位固形物中蛋白質(zhì)和草酸銨含量比較（略）

2.3.3  HPLC法測(cè)定氨基酸含量

2.3.3.1  色譜條件

色譜柱：Agilent ODS(4.6 mm×200 mm, 5 μm)；流動(dòng)相A為50 mmol/L NaAc(pH 6.8)-甲醇-THF(82∶17∶1),流動(dòng)相B為50 mmol/L NaAc(pH 6.8)-甲醇-THF(22∶77∶1),梯度洗脫；柱溫：27 ℃；流速：1.0 mL/min；熒光檢測(cè)器：λex 338 nm,λem 425 nm。

2.3.3.2  樣品測(cè)定  樣品溶液B～E經(jīng)5.7 mol/L鹽酸液,在110 ℃水解24 h,OPA試劑衍生化,然后取20 μL注入液相色譜儀。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。表5  僵蠶各部位中氨基酸的測(cè)定結(jié)果(略)

3  討論

  

本研究表明,僵蠶的水煎煮提取、醇沉和凝膠色譜分離所得抗凝活性部位中,多肽、氨基酸類(lèi)和草酸銨都是其中的主要成分。已有報(bào)道,草酸銨具有抗凝活性[8],本研究表明,凝膠色譜分離部位中不含草酸銨,但含多肽和氨基酸類(lèi)成分的餾分具有抗凝活性,因此,僵蠶中的多肽類(lèi)或氨基酸類(lèi)成分可能是抗凝活性成分之一。本研究對(duì)僵蠶抗凝活性部位的化學(xué)成分和理化特性進(jìn)行的初步探索,也為今后對(duì)僵蠶抗凝成分的分離純化提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

【參考文獻(xiàn)】

 

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護(hù)理

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篇8

【關(guān)鍵詞】紅外光譜；凝膠色譜；聚羧酸減水劑

The application of micro equipments in analysing polycarboxylate high preformace water reducer

Wang Lei,Chi Pei-yun,Yang Pei-dong,Niu chang-hui

(School of Architecture and Civil Engineering, Qingdao Technological UnivercityQingdaoShandong266033)

【Abstract】High performance water reducing agent especially polycarboxylate water reducer has increasingly been come under recognition because of its remarkable water-reducing ability and slump retention ect. And micro test methords lay an important foundation and server a supporting power for exploring new kinds of polycarboxylate water reducer. In this paper, detailed discription has been made about the priciple of infrared spectorscopy technology and its application in detecting functional groups of polycarboxylic acid, and priciple of Gel permeation Chormtography techonlogy and its using in calculating molecular weight and molecular weight distribution of polycarboxylate water reducer is also been systematically introduced.

【Key words】 Infrared spectorscopy;Gel permeation Chromtography technology;Polycarboxylate water reducer

1. 紅外光譜分析（infrared spectrum analysis）

1.1紅外光譜分析原理

當(dāng)PC樣品受到頻率連續(xù)變化的紅外光照射時(shí)，分子會(huì)吸收與其振動(dòng)頻率一樣的紅外光波使其從振動(dòng)――轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)的基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，相應(yīng)與這些區(qū)域的投射光波強(qiáng)度就會(huì)降低，記錄百分透過(guò)率他T%對(duì)波數(shù)或波長(zhǎng)的曲線(xiàn)即可得到PC樣品的紅外光譜。由于聚合物中的官能團(tuán)的紅外光譜特征吸收峰總是在一定范圍之內(nèi)變動(dòng)，因此通過(guò)分析PC樣品的紅外光譜即可得出該聚合物所含有的官能團(tuán)。下表1為PC減水劑中常見(jiàn)官能團(tuán)的特征吸收峰。

1.2實(shí)驗(yàn)及分析。

1.2.1實(shí)驗(yàn)儀器和樣品制備。

（1）實(shí)驗(yàn)儀器。

傅里葉交換紅外光譜儀，德國(guó)bruker公司，分辨率優(yōu)于0.09cm-1，光譜范圍12500～50cm-1。

（2）試樣制備。

采用薄膜法制樣，樣品先經(jīng)過(guò)異丙醇和丙酮的分離，然后將PC溶液倒入到低沸點(diǎn)（5～8倍）溶劑中反復(fù)沉淀，在60℃濃縮一定時(shí)間后再真空抽濾，除去水分然后涂抹在NaCl鹽片上成膜。

1.2.2圖譜分析。

下圖1為兩種聚羧酸減水劑MPC-1和MPC-2的紅外圖譜，通過(guò)分析紅外光譜結(jié)合減水劑中各基團(tuán)特征峰的位置，可以看到MPC-1和MPC-2有相似的結(jié)構(gòu) 3300，2850，1725，1575，1460，1350，1280，1107，951，845，622及523cm-1等波數(shù)附近都有 吸收峰，可見(jiàn)這兩種減水劑分子結(jié)構(gòu)上具有磺酸基，羧基，聚氧化乙烯基，酯基和羥基等基團(tuán)。由于MPC-1比MPC-2具有更長(zhǎng)的聚氧化乙烯基長(zhǎng)鏈，因此其在 1120～1110 cm-1之間有更寬闊的吸收峰，隨著環(huán)氧乙烷加成數(shù)增加，在1105 cm-1的吸收帶也隨之增強(qiáng)，O-H基團(tuán)的伸縮振動(dòng)在3300～2500 cm-1范圍處出現(xiàn)，酯基的吸收峰出現(xiàn)在了1725 cm-1處，羧酸衍生物的水解羧基C=O對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)吸收峰在1563 cm-1和1430 cm-1處生成，硫酸酯吸收峰可以在1230 cm-1處找到，而磺酸基S-O伸縮振動(dòng)的吸收峰出現(xiàn)在1220 cm-1，1105 cm-1和1045 cm-1處出現(xiàn)。

圖1聚羧酸減水劑MPC-1和MPC-2的紅外光譜

2. 凝膠滲透色譜分析

聚合物分子量具有多分散性，不同的聚合方法、聚合工藝會(huì)使聚合物具有不同的分子量和分子量分布。分子量和分子量分布對(duì)PC減水劑的性能有十分密切的關(guān)系，因此測(cè)定其分子量和分子量分布就顯得尤為重要。通過(guò)人們不斷探索，改進(jìn)和創(chuàng)新測(cè)定分子量和分子量分布的方法，凝膠色譜法在60年代末應(yīng)運(yùn)而生并成為現(xiàn)今最有效的分子量和分子量分布的測(cè)試方法。

2.1凝膠滲透色譜原理。

凝膠滲透色譜（Gel Permeation Chromatography，簡(jiǎn)稱(chēng)GPC）是對(duì)同一聚合物種不同分子量的高分子組份進(jìn)行分離。當(dāng)樣品中不同分子量的各組份的分子量和含量被確定后，就可得到聚合物的分子量分布，然后可以很方便地對(duì)分子量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得到各種平均值。一般認(rèn)為，GPC是根據(jù)溶質(zhì)體積的大小，在色譜中由于體積排除效應(yīng)即滲透能力的差異進(jìn)行分離。高分子在溶液中的體積決定于分子量、高分子鏈的柔順性、支化、溶劑和溫度，當(dāng)高分子鏈的結(jié)構(gòu)、溶劑和溫度確定后，高分子的體積主要依賴(lài)于分子量。

凝膠滲透色譜的固定相是多孔性微球，可由交聯(lián)度很高的聚苯乙烯、聚丙烯酸酰胺、葡萄糖和瓊脂糖的凝膠以及多孔硅膠、多孔玻璃等來(lái)制備。色譜的淋洗液是聚合物的溶劑。當(dāng)聚合物溶液進(jìn)入色譜后，溶質(zhì)高分子向固定相的微孔中滲透。由于微孔尺寸與高分子的體積相當(dāng)，高分子的滲透幾率取決于高分子的體積，體積越小滲透幾率越大，隨著淋洗液流動(dòng)，它在色譜中走過(guò)的路程就越長(zhǎng)，用色譜術(shù)語(yǔ)就是淋洗體積或保留體積增大。反之，高分子體積增大，淋洗體積減小，因而達(dá)到依高分子體積進(jìn)行分離的目的。

圖2是GPC的構(gòu)造示意圖，淋洗液通過(guò)輸液泵成為流速恒定的流動(dòng)相，進(jìn)入緊密裝填多孔性微球的色譜柱，中間經(jīng)過(guò)一個(gè)可將樣品送往體系的進(jìn)樣裝置。聚合物樣品進(jìn)樣后，淋洗液帶動(dòng)溶液樣品進(jìn)入色譜柱并開(kāi)始分離，隨著淋洗液的不斷洗提，被分離的高分子組份陸續(xù)從色譜柱中淋出。濃度檢測(cè)器不斷檢測(cè)淋洗液中高分子組份的濃度響應(yīng)，數(shù)據(jù)被記錄最后得到一張完整的GPC/SEC 淋洗曲線(xiàn)。

圖2GPC的構(gòu)造

淋洗曲線(xiàn)表示GPC對(duì)聚合物樣品依高分子體積進(jìn)行分離的結(jié)果，并不是分子

量分布曲線(xiàn)。實(shí)驗(yàn)證明淋洗體積和聚合物分子量有如下關(guān)系：

lnM = A -BVe （1）

式中M為高分子組分的分子量，A、B與高分子鏈結(jié)構(gòu)、支化以及溶劑溫度等影響高分子在溶液中的體積的因素有關(guān)，也與色譜的固定相、體積和操作條件等儀器因素有關(guān)，因此（1）式稱(chēng)為GPC的標(biāo)定關(guān)系。（1）式的適用性還限制在色譜固定相滲透極限以?xún)?nèi)，也就是說(shuō)分子量過(guò)高或太低都會(huì)使標(biāo)定關(guān)系偏離線(xiàn)性。一般需要用一組已知分子量的窄分布的聚合物標(biāo)準(zhǔn)樣品（標(biāo)樣）對(duì)儀器進(jìn)行標(biāo)定，得到在指定實(shí)驗(yàn)條件，適用于結(jié)構(gòu)和標(biāo)樣相同的聚合物的標(biāo)定關(guān)系。

2.2用凝膠滲透色譜法計(jì)算聚羧酸高效減水劑的分子量。

2.2.1實(shí)驗(yàn)方法。

2.2.1.1所用儀器和試劑。

組合式GPC/SEC 儀（美國(guó)Waters 公司），電子天平，13mm 微孔過(guò)濾器；配樣瓶，注射針筒等。

四氫呋喃（AR）（淋洗液）；聚羧酸減水劑（被測(cè)樣品）；窄分子量分布的聚羧酸減水劑（標(biāo)準(zhǔn)樣品）；

2.2.1.2標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)樣品的GPC，求得A、B的值。

選取5個(gè)不同分子量的單分散標(biāo)樣，按分子量順序1、2、3、4、5，分別稱(chēng)取標(biāo)樣2mg，混在一個(gè)配樣瓶中，用針筒注入約2ml 溶劑，溶解后，用裝有0.45 微米孔徑的微孔濾膜的過(guò)濾器過(guò)濾。在配樣瓶中稱(chēng)取約 4mg 被測(cè)樣品，注入約2ml 溶劑，溶解后過(guò)濾。

待儀器基線(xiàn)穩(wěn)定后，用進(jìn)樣針筒將混合標(biāo)樣進(jìn)樣，進(jìn)樣量為 100 微升，等待色譜淋洗，最后得到完整的淋洗曲線(xiàn)。作logM- Ve 圖，得GPC/SEC 的標(biāo)定關(guān)系，得A，B值。

2.2.1.3計(jì)算樣品的Mn和Mw。

GPC的數(shù)據(jù)處理，一般采用“切割法”。在譜圖中確定基線(xiàn)后，基線(xiàn)和淋洗曲線(xiàn)所包圍的面積是被分離后的整個(gè)聚合物，以橫坐標(biāo)對(duì)這塊面積等距離切割。切割的含義是把聚合物樣品看成由若干個(gè)具有不同淋洗體積的高分子組份所組成，每個(gè)切割塊的歸一化面積（面積分?jǐn)?shù)）是高分子組份的含量，切割塊的淋洗體積通過(guò)標(biāo)定關(guān)系可確定組份的分子量，所有切割塊的歸一化面積和相應(yīng)的分子量列表或作圖，得到完整的聚合物樣品的分子量分布結(jié)果。因?yàn)榍懈钍堑染嚯x的，所以用切割塊的歸一化高度就可以表示組份的含量。切割密度會(huì)影響結(jié)果的精度，當(dāng)然越高越好，但是一般認(rèn)為，一個(gè)聚合物樣品切割成20 塊以上，對(duì)分子量分布描述的誤差已經(jīng)小于GPC/SEC 方法本身的誤差。當(dāng)用計(jì)算機(jī)記錄、處理數(shù)據(jù)時(shí)，可設(shè)定切割成近百塊。用分子量分布數(shù)據(jù)，很容易計(jì)算各種平均分子量。

式（2）、（3）、（4）分別是多分散高分子的數(shù)均分子量，重均分子量和其多分散系數(shù)。

3. 結(jié)論

紅外光譜用于分析聚羧酸高效減水劑的官能團(tuán)種類(lèi)的作用是巨大而顯著的，凝膠滲透色譜技術(shù)為計(jì)算聚羧酸減水劑的分子量和分子量分布提高了精確的結(jié)果。這兩種現(xiàn)代化微觀分析設(shè)備的使用大大提高了新型聚羧酸減水劑的研發(fā)力度，極大的提高了新型減水劑的研制速度。

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篇9

Abstract: In the process of using high-performance liquid chromatography, unavoidably will encounter all sorts of problems, from the valve, chromatographic column and flow equal to introduce the correct use of chromatography, common failure causes and eliminating methods.

關(guān)鍵詞:高效液相色譜儀;故障排除;正確使用

Key words: high performance liquid chromatography;troubleshooting;used correctly

中圖分類(lèi)號(hào):TS207 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1006-4311(2010)20-0097-01

0引言

高效液相色譜儀是分析實(shí)驗(yàn)室常用的測(cè)試儀器之一,其應(yīng)用越來(lái)越廣泛。此種儀器在使用過(guò)程中,難免會(huì)出現(xiàn)各種各樣的問(wèn)題,并將直接影響到所測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和儀器的正常工作。

1使用試管的問(wèn)題

①試管的潔凈問(wèn)題。高效液相色譜分析法是一個(gè)很靈敏的分析方法,如果因使用不潔凈的試管,便會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。②塑料試管的溶解問(wèn)題?？捎孟嗤膶?shí)驗(yàn)條件先行試驗(yàn)一下,看看不含被抽提物時(shí),提取液在檢測(cè)器上能否產(chǎn)生干擾信號(hào),如確有干擾信號(hào)存在,就只能換用耐有機(jī)溶劑的玻璃試管了。③被測(cè)樣品在試管壁上的吸附問(wèn)題。操作中宜采用聚丙烯管,為防止提取中吸附現(xiàn)象發(fā)生,可采用0.5%的已二胺已烷液做為提取劑,可有效地防止吸附。

2操作進(jìn)樣閥的問(wèn)題

在高效液相色譜法的試驗(yàn)過(guò)程中,有時(shí)會(huì)有異常色譜峰的出現(xiàn)以及重現(xiàn)性不好的問(wèn)題,這主要是由于操作方法不當(dāng)所引起,要想解決此類(lèi)問(wèn)題,需從以下幾個(gè)方面入手。①進(jìn)樣量的控制。用進(jìn)樣閥來(lái)進(jìn)樣時(shí),閥內(nèi)的樣品環(huán)是定量的,由于進(jìn)樣時(shí),注射到進(jìn)樣閥內(nèi)的樣品溶液在樣品環(huán)的管路中有徑向的速度梯度。因此,要想使樣品環(huán)中充滿(mǎn)樣品溶液,從而使用進(jìn)樣閥來(lái)準(zhǔn)確地定量,則必須使進(jìn)樣量大于樣品環(huán)體積的兩倍。②進(jìn)樣閥的清潔問(wèn)題。如果樣品環(huán)中有上次進(jìn)樣時(shí)樣品的殘留,必然會(huì)污染下次注射進(jìn)的樣品,為防止這種現(xiàn)象的發(fā)生,應(yīng)按下列步驟操作:1)進(jìn)樣閥有兩個(gè)位置,INJECT和LOAD。首先在LOAD位置時(shí),以注射器將流動(dòng)相注入進(jìn)樣閥內(nèi)清洗幾次,每次用量大約40ul;2)然后將進(jìn)樣閥板手扳至INJECT位置時(shí),再以流動(dòng)相清洗幾次,每次用量還是40ul;3)再將樣品注射到進(jìn)樣閥里.按照上述的步驟操作,可以避免由進(jìn)樣閥引起的污染,從而使干擾峰消除并提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。③進(jìn)樣閥溢流管的堵塞。堵塞的原因多半是由于溶解樣品的流動(dòng)相用的是鹽溶液,而其中的鹽在溢流管的排空端口處結(jié)晶所致。此時(shí),可用小燒杯盛少量蒸餾水對(duì)溢流管口稍加浸泡,端口處鹽的結(jié)晶就能被溶解掉,故障排除。如能在每次進(jìn)樣完成之后,用蒸餾水反復(fù)沖洗至溢流管中的鹽分全部沖出,則可避免此故障的發(fā)生。

3流動(dòng)相的問(wèn)題

甲醇和乙腈在高效液相色譜分析法中常常被用來(lái)配制流動(dòng)相。高效液相色譜法中常用的試劑最好是高等級(jí)的專(zhuān)用試劑,如色譜純?cè)噭８咝б合嗌V分析法中常用的是紫外檢測(cè)器,因此,從降低基線(xiàn)噪音和提高分析靈敏度上來(lái)考慮,應(yīng)該使用紫外吸收小且雜質(zhì)含量少的色譜純?cè)噭?。①流?dòng)相的過(guò)濾。配制好的流動(dòng)相在使用前一定要先用0.5um孔徑的微孔濾膜來(lái)過(guò)濾。這是因?yàn)槿芤褐泻泻芏嗳庋垭y以發(fā)現(xiàn)的微小顆粒,如果不把它們?yōu)V除掉,就會(huì)堵塞泵口、柱頭上的過(guò)濾器,這樣就堵塞了流動(dòng)相的正常通道,使色譜柱的阻力增加,柱壓升高,柱效下降。碰到這種情況時(shí),要換用經(jīng)過(guò)濾的流動(dòng)相,并將堵塞的濾器拆下來(lái)浸泡在20%的硝酸水溶液中以超聲波清洗機(jī)清洗20分鐘,以除去濾片上的堵塞物。②流動(dòng)相的脫氣。流動(dòng)相在使用前必須脫氣,以盡可能的除去溶解在流動(dòng)相中的氣體,否則,這些氣體會(huì)使柱填料的性能降低,還能夠?qū)z測(cè)器的信號(hào)產(chǎn)生很大的干擾。水和甲醇混合后會(huì)產(chǎn)生大量的氣泡,如果不脫氣就使用,氣泡就會(huì)進(jìn)入色譜柱和檢測(cè)器,并將影響分析工作的正常進(jìn)行。

4色譜柱的使用和保養(yǎng)

色譜柱是高效液相色譜儀最主要的部件,被測(cè)物質(zhì)能否被很好的分離和測(cè)定,色譜柱的性能起著決定性的作用。在日常工作中,應(yīng)特別注意色譜柱的正確使用和維修保養(yǎng),以延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命。

4.1 使用預(yù)柱和保護(hù)柱預(yù)柱安裝于泵和進(jìn)樣器之間,它給色譜柱中的流動(dòng)相提供了完全的平衡,并防止了對(duì)柱填料有破壞作用的組分或污染物進(jìn)入色譜柱。保護(hù)柱可以阻擋能夠牢固地吸附于色譜柱上的組分進(jìn)入色譜柱,保護(hù)柱應(yīng)與色譜柱的填料相同。

4.2 防止氣體進(jìn)入色譜柱有些色譜柱是不允許氣泡進(jìn)入的,否則將會(huì)使柱效降低甚至形成微小的難以驅(qū)除的氣室。因此,為了防止氣泡進(jìn)入色譜柱,一定要使用經(jīng)過(guò)脫氣的流動(dòng)相,并且要嚴(yán)格按照下列步驟來(lái)安裝色譜柱。①拆卸下色譜柱入口處的密封螺絲,觀察是否有溶劑滲出;②如有溶劑滲出,即可將色譜柱接到管路上,以避免氣泡的進(jìn)入;③如無(wú)溶劑滲出時(shí),表明色譜柱的此端已經(jīng)進(jìn)去空氣了,可將色譜柱的出口端接到進(jìn)樣閥上,以流動(dòng)相來(lái)反方向沖洗色譜柱,以便將柱內(nèi)的空氣排除。④如果流出的溶劑里不含有氣泡,說(shuō)明柱內(nèi)的氣體已經(jīng)被排出了,再將色譜柱以正確的方向接好,這樣氣泡就進(jìn)不到色譜柱里面了。

4.3 色譜柱的清洗為了不使被測(cè)物質(zhì)和雜質(zhì)停留在色譜柱中,在每次的樣品分析工作完成之后,都應(yīng)及時(shí)地清洗色譜柱。首先要用對(duì)被測(cè)樣品洗脫能力強(qiáng)的溶劑來(lái)洗脫色譜柱,以分析工作中常用的反相色譜分析法為例,因其先流出的物質(zhì)是極性大的物質(zhì),此時(shí)應(yīng)用100%的甲醇或使用異丙純、四氫呋喃等極性稍弱的溶劑將吸附在柱內(nèi)的極性小的物質(zhì)洗脫下來(lái),洗脫液的用量一般為柱體積的20倍即可。凝膠濾過(guò)色譜法中所使用的凝膠柱常用緩沖溶液做流動(dòng)相,用完之后當(dāng)然要用蒸餾水來(lái)沖洗。

4.4 色譜柱的存放如果色譜柱暫時(shí)不用,存放時(shí)要注意:①幾天之內(nèi)的短期放置,應(yīng)先用溶劑沖洗好色譜柱,再把色譜柱的兩頭用密封螺絲密封好即可。②如果色譜柱長(zhǎng)期不用,僅用上述方法來(lái)處理就不行了,這時(shí)應(yīng)使用色譜柱使用說(shuō)明書(shū)中所指明的溶劑來(lái)充滿(mǎn)色譜柱,反相柱一般使用甲醇,正相柱則可用正已烷或庚烷,而凝膠柱則不能用水了,因柱內(nèi)如果有微生物的生長(zhǎng)則會(huì)使柱效降低,此時(shí)應(yīng)用0.05%的NaNs水溶液來(lái)沖洗色譜柱,再將色譜柱封嚴(yán)。

篇10

1、色譜分離技術(shù)又稱(chēng)層析分離技術(shù)或色層分離技術(shù)，是一種分離復(fù)雜混合物中各個(gè)組分的有效方法。它是利用不同物質(zhì)在由固定相和流動(dòng)相構(gòu)成的體系中具有不同的分配系數(shù)，當(dāng)兩相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，這些物質(zhì)隨流動(dòng)相一起運(yùn)動(dòng)，并在兩相間進(jìn)行反復(fù)多次的分配，從而使各物質(zhì)達(dá)到分離。

2、色譜有多種，按固定相類(lèi)型和分離原理可分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、親和色譜、大孔吸附樹(shù)脂、凝膠色譜、聚焦色譜等。最常用的是吸附色譜分離技術(shù)。

3、吸附色譜法是指混合物隨流動(dòng)相通過(guò)吸附劑時(shí)，由于吸附劑對(duì)不同物質(zhì)具有不同的吸附力而使混合物中各組分分離的方法。此法特別適用于脂溶性成分的分離。被分離的物質(zhì)與吸附劑、洗脫劑共同構(gòu)成吸附層析的三要素，彼此緊密相連。

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