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關(guān)鍵詞：高效液相色譜儀；故障處理；處理方法

DOI：10.16640/ki.37-1222/t.2017.01.182

0 引言

當(dāng)前，液相色譜儀包含示差折光、二極管陣列、熒光、紫外等多種檢測(cè)器，其在輕工、食品、農(nóng)藥、醫(yī)藥化工、生物等領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛。高效液相色譜儀的自動(dòng)化程度較高，其可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的高靈敏度、高效和高速分離測(cè)定，其不僅能夠控制液相色譜儀的各項(xiàng)操作參數(shù)，而且可以科學(xué)處理色譜圖。為了確保高效液相色譜儀保持良好使用性能，應(yīng)仔細(xì)分析故障原因，有針對(duì)性地進(jìn)行解決處理。

1 高效液相色譜儀常見故障分析

1.1 高壓輸液系統(tǒng)故障

高壓輸液系統(tǒng)包括高壓泵、貯液器等部分，過(guò)濾器安裝在流動(dòng)相輸液管頂部，貯液器主要用于盛裝流動(dòng)相，一旦流動(dòng)相、貯液器受到污染，往往會(huì)堵塞過(guò)濾器，導(dǎo)致基線發(fā)生波動(dòng)，流速不穩(wěn)定，而且色譜圖上還會(huì)顯示多余峰，使得基線底值提高，無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)出樣品的低濃度組分。高效液相色譜儀運(yùn)行過(guò)程中高壓泵是其動(dòng)力來(lái)源，高壓泵工作不穩(wěn)定，往往會(huì)造成流量相抽取量反復(fù)變化，系統(tǒng)壓力變化較大，直接影響了高效液相色譜儀測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。高壓泵常見故障主要有柱塞桿磨損、密封圈滲漏和泵頭有氣泡。

1.2 進(jìn)樣系統(tǒng)故障

進(jìn)樣系統(tǒng)主要包括兩種：自動(dòng)進(jìn)樣器和手動(dòng)進(jìn)樣器，一般情況下，手動(dòng)進(jìn)樣器是六通閥，不管是自動(dòng)進(jìn)樣器，或者手動(dòng)進(jìn)樣器，在實(shí)際應(yīng)用中易發(fā)生進(jìn)樣閥堵塞故障，往往會(huì)造成進(jìn)樣系統(tǒng)接頭滲漏、壓力不斷升高，導(dǎo)致進(jìn)樣量準(zhǔn)確性下降。

1.3 分離系統(tǒng)故障

分離系統(tǒng)是高效液相色譜儀的核心，而柱壓和柱效指標(biāo)對(duì)于色譜柱使用壽命有著直接影響，若一支色譜柱的柱壓過(guò)高或者柱效過(guò)低，一般情況下，這種色譜柱就需要進(jìn)行報(bào)廢處理，而色譜柱堵塞、鍵合相碳鏈斷裂等往往會(huì)造成這種情況。

1.4 檢測(cè)系統(tǒng)故障

檢測(cè)器是高效液相色譜儀的重要組成部分，其可以將樣品濃度轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，紫外檢測(cè)器在日常檢驗(yàn)中應(yīng)用最為廣泛，在實(shí)際應(yīng)用中往往會(huì)發(fā)生基線漂移、基線噪聲等故障。

1.5 峰拖尾故障

高效液相色譜儀在實(shí)際使用中，其色譜圖上有時(shí)會(huì)出現(xiàn)峰拖尾的情況，而造成這種情況的原因主要有：柱效下降、柱外體積較大、柱塌陷、硅羥基作用、峰干擾、柱超載等，這直接影響了高效液相色譜儀的檢測(cè)精度。

2 高效液相色譜儀故障處理方法

2.1 高壓輸液系統(tǒng)故障處理方法

對(duì)于專用貯液器，要定期用水、酸仔細(xì)清洗，然后使用超純水再蕩洗幾遍，若貯液器采用溶劑瓶，使用一段時(shí)間后應(yīng)做好廢棄處理，防止滋生微生物，并且通過(guò)超聲波每月對(duì)流動(dòng)相過(guò)濾器進(jìn)行清洗，使用高效液相色譜儀專門的試液和試劑來(lái)配制流動(dòng)相。使用流動(dòng)相之前，通過(guò)超聲波進(jìn)行脫氣，在高壓輸液系統(tǒng)中設(shè)置脫氣裝置，最大程度地控制氣泡對(duì)高效液相色譜儀的影響，并且高效液相色譜儀長(zhǎng)時(shí)間采用含鹽流動(dòng)相和運(yùn)行往往會(huì)導(dǎo)致柱塞桿磨損和密封圈滲漏，所以使用合適溶劑洗出高壓泵緩沖液，防止鹽析出后嚴(yán)重磨損柱塞桿。

2.2 進(jìn)樣系統(tǒng)故障處理方法

進(jìn)樣系統(tǒng)應(yīng)用過(guò)程中，要有針對(duì)性地處理樣品，利用高速離心機(jī)進(jìn)行離心處理，然后通過(guò)0.45m濾膜進(jìn)行過(guò)濾，對(duì)樣品的細(xì)小顆粒有效去除，從而延長(zhǎng)閥使用壽命。并且為了避免進(jìn)樣系統(tǒng)流動(dòng)相中析出緩沖鹽，每次使用完高效液相色譜儀以后，對(duì)進(jìn)樣系統(tǒng)使用不含鹽流動(dòng)相進(jìn)行反復(fù)沖洗。

2.3 分離系統(tǒng)故障處理方法

對(duì)于分離系統(tǒng)故障，應(yīng)采取有效的處理方法，其一，在色譜柱pH允許使用范圍內(nèi)合理控制流動(dòng)相pH值；其二，使用色譜純?cè)噭┖统兯?，樣品分析之前，通過(guò)針筒對(duì)樣品過(guò)濾，利用0.45m濾膜過(guò)流動(dòng)相，流動(dòng)相和樣品中的固體顆粒網(wǎng)往往會(huì)將色譜柱堵塞，造成柱壓升高，造成色譜峰形變寬；其三，使用在線過(guò)濾器或者保護(hù)柱，由于流動(dòng)相和樣品過(guò)濾以后無(wú)法將固體顆粒物質(zhì)全部消除，而一旦流動(dòng)相將這些固體顆粒帶入色譜柱，會(huì)造成柱效下降、柱壓升高；其四，對(duì)色譜柱使用強(qiáng)溶劑進(jìn)行沖洗，每次使用完高效液相色譜儀以后，利用過(guò)渡流動(dòng)相沖洗色譜柱，先使用緩沖鹽流動(dòng)相，然后再利用過(guò)度流動(dòng)相，最后使用乙腈或者甲醇進(jìn)行清洗，有效保存色譜柱。

2.4 檢測(cè)系統(tǒng)故障處理方法

對(duì)于檢測(cè)系統(tǒng)的基線漂移故障，應(yīng)仔細(xì)檢查貯液瓶、色譜柱和檢測(cè)器是否受到污染，燈能量是否過(guò)低，檢測(cè)器溫度變化幅度是否太大，有針對(duì)性地采取有效措施。對(duì)于基線噪聲，檢查高壓泵的穩(wěn)定性，檢測(cè)池是否存在氣泡和受到污染，使用高效液相色譜儀的專業(yè)溶劑，檢查檢測(cè)器和工作站輸出信號(hào)以及電壓穩(wěn)定性。

2.5 峰拖尾故障處理方法

對(duì)于高效液相色譜儀的峰拖尾故障，應(yīng)采取有效的處理方法：其一，及時(shí)更換柱，盡量在低腐蝕環(huán)境下使用，采用保護(hù)柱；其二，降低連接點(diǎn)，合理調(diào)整所有連接點(diǎn)，采用細(xì)內(nèi)徑連接管；其三，在弱腐蝕條件下更換色譜柱；其四，設(shè)置在線過(guò)濾器，對(duì)燒結(jié)的不銹鋼進(jìn)行更換；其五，降低流動(dòng)相pH值，添加堿或者三乙胺鈍化柱，增加鹽或者緩沖液濃度；其六，調(diào)整流動(dòng)相，清潔樣品；其七，增加柱直徑，降低樣品量，使用高容量固定相。

3 結(jié)束語(yǔ)

為了保持高效液相色譜儀良好的使用性能和穩(wěn)定性，應(yīng)仔細(xì)分析其常見故障，科學(xué)地進(jìn)行分析，采用邏輯推理方法，采取有效、合理的故障處理措施，消除高效液相色譜儀故障問(wèn)題，延長(zhǎng)其使用壽命。

參考文獻(xiàn)：

[1]伍音茵.高效液相色譜儀的故障分析及處理對(duì)策[J].精細(xì)化工中間體，2013（02）：56-57+67.

篇2

論文關(guān)鍵詞：高效液相色譜儀；水環(huán)境；監(jiān)測(cè)；前景

一、高效液相色譜儀及其技術(shù)簡(jiǎn)介

高效液相色譜（HPLC)也叫高壓液相色譜、高速液相色譜、高分離度液相色譜等。是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來(lái)的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會(huì)引起高阻力，需用高壓輸送流動(dòng)相，故又稱高壓液相色譜。又因分析速度快而稱為高速液相色譜。

高效液相色譜儀的系統(tǒng)由儲(chǔ)液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀等幾部分組成。儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相，被流動(dòng)相載入色譜柱(固定相)內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的吸附-解吸的分配過(guò)程，各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出，通過(guò)檢測(cè)器(能檢測(cè)色譜柱流出組分及其量的變化的器件。指機(jī)械的、電子的或化學(xué)器件，用于區(qū)分、記錄或指示環(huán)境中某一變量的變化，如溫度、壓力、電荷、電磁輻射、核輻射、粒子或分子等。)時(shí)，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來(lái)。

二、高效液相色譜儀的應(yīng)用

高效液相色譜儀在水環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用主要分為三個(gè)方面：一方面是對(duì)傳統(tǒng)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目指標(biāo)的監(jiān)測(cè)；一方面是針對(duì)水體中的有機(jī)物進(jìn)行監(jiān)測(cè)；另一方面是利用其高效分離的技術(shù)特點(diǎn)在對(duì)水體中污染物質(zhì)總量的監(jiān)測(cè)的基礎(chǔ)之上對(duì)不同價(jià)態(tài)及其形態(tài)的污染物進(jìn)行分類定量監(jiān)測(cè)。

（一）對(duì)傳統(tǒng)污染物的監(jiān)測(cè)

對(duì)傳統(tǒng)污染物的監(jiān)測(cè)主要是針對(duì)日常水體中常見污染物的重點(diǎn)監(jiān)測(cè)。根據(jù)國(guó)家的相關(guān)要求及其本站的實(shí)際監(jiān)測(cè)條件，對(duì)水體中主要污染物的監(jiān)測(cè)包括了重金屬元素（銅、鋅、砷、汞、鎘、鉻等）、營(yíng)養(yǎng)元素（氮、磷、鉀等）、特殊元素（硒、氯、硫等）。通過(guò)如上監(jiān)測(cè)對(duì)水體的日常污染狀況進(jìn)行把握與評(píng)價(jià)。同時(shí)，傳統(tǒng)污染物的監(jiān)測(cè)還包括了對(duì)特定企業(yè)排污點(diǎn)的污水監(jiān)測(cè)，作為其環(huán)保達(dá)標(biāo)的重要依據(jù)。

（二）對(duì)水體中的有機(jī)物

在傳統(tǒng)的污染物的基礎(chǔ)之上工業(yè)以及農(nóng)業(yè)淋容等多方面因素會(huì)對(duì)水體中造成一定的有機(jī)物污染，在針對(duì)有機(jī)物的污染監(jiān)測(cè)過(guò)程中傳統(tǒng)的監(jiān)測(cè)方法無(wú)法在精度與效率方面達(dá)到要求。在此方面應(yīng)用高效液相色譜儀在對(duì)有機(jī)物進(jìn)行定型的同時(shí)進(jìn)行定量的監(jiān)測(cè)。主要監(jiān)測(cè)的項(xiàng)目包括了，工業(yè)有機(jī)污染物（氰化物、）揮發(fā)酚、石油類、總有機(jī)物等）、農(nóng)業(yè)有機(jī)物（如殺蟲劑、除草劑、消化抑制劑）、特殊有機(jī)物（微生物代謝物、醫(yī)療污染物、生活污水等）。針對(duì)如上的有機(jī)物監(jiān)測(cè)一方面能夠?qū)λw中有機(jī)污染現(xiàn)狀進(jìn)行評(píng)價(jià)，另一方面可以鑒別污染物種類進(jìn)而對(duì)排查污染源提供一定的幫助。

（三）對(duì)不同價(jià)態(tài)及其形態(tài)的污染物的監(jiān)測(cè)

同種化學(xué)元素的不同存在價(jià)態(tài)以及形態(tài)對(duì)其生物毒性的影響至關(guān)重要。比如鉻元素在水體中存在三價(jià)與六價(jià)之分，其中三價(jià)鉻毒性較小且對(duì)在較大濃度范圍內(nèi)對(duì)人體有益，而六價(jià)鉻則表現(xiàn)為較強(qiáng)的生物毒性，在較低濃度下對(duì)人體造成較大危害。在水環(huán)境的監(jiān)測(cè)過(guò)程中傳統(tǒng)的六價(jià)鉻的監(jiān)測(cè)方法是利用六價(jià)鉻與二苯碳酰二肼的顯色反映進(jìn)行檢測(cè)的。這種檢測(cè)方式由于收到氧化還原條件的影響容易造成較大誤差，進(jìn)而使得對(duì)水體環(huán)境的判斷失準(zhǔn)。采用高效液相色譜儀能夠同時(shí)監(jiān)測(cè)同種元素的不同價(jià)態(tài)進(jìn)而對(duì)水體的污染物及其毒性進(jìn)行更好的定量分析，為后續(xù)的環(huán)境評(píng)價(jià)與治理奠定基礎(chǔ)。

三、高效液相色譜儀的特點(diǎn)

（一）高效液相色譜儀的準(zhǔn)確性

與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比較，高效液相色譜儀具有更高的準(zhǔn)確性，這種準(zhǔn)確性主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：一方面高效液相色譜儀為全自動(dòng)檢測(cè)儀器，在避免了人為誤差出現(xiàn)的同時(shí)降低了機(jī)械誤差。而機(jī)械誤差經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的校訂之后可以得到很好的控制，這就決定了高效液相色譜儀在監(jiān)測(cè)過(guò)程中誤差較小。同時(shí)，在另一方面高效液相色譜儀在監(jiān)測(cè)原理上同樣優(yōu)于傳統(tǒng)的監(jiān)測(cè)方法，以火焰原子吸收測(cè)量水體中的重金屬濃度為例，其以火焰原子激發(fā)的峰值為測(cè)定濃度結(jié)果，在測(cè)定過(guò)程中的波動(dòng)式消耗會(huì)使得測(cè)量結(jié)果較實(shí)際濃度偏低的現(xiàn)象。而采用高效液相色譜儀則是利用全部曲線的面積來(lái)代替相對(duì)體積內(nèi)的總量，在計(jì)算優(yōu)化方面更具備準(zhǔn)確性。

（二）高效液相色譜儀的高效性

高效液相色譜儀的高效性主要表現(xiàn)為三個(gè)方面：

1、高效液相色譜儀的檢測(cè)效率本身，樣品從進(jìn)樣到出結(jié)果僅需要30秒作用的時(shí)間對(duì)于單向測(cè)定，此時(shí)間還具有一定的下降空間。

2、高效液相色譜儀的多重測(cè)定效率。在針對(duì)多項(xiàng)目的測(cè)定過(guò)程中。利用高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定可以單次進(jìn)樣多指標(biāo)共同檢測(cè)的效果，大大的降低了進(jìn)樣的重復(fù)性工作，提高了整體的工作效率。 　3、高效液相色譜儀的連續(xù)進(jìn)樣機(jī)制，在前一樣品轉(zhuǎn)移到檢測(cè)室后，后一樣品既可以做進(jìn)樣處理，在監(jiān)測(cè)相同的項(xiàng)目指標(biāo)的情況下，連續(xù)進(jìn)樣與單獨(dú)進(jìn)樣的監(jiān)測(cè)效率提高越30%。

此外，通過(guò)高效液相色譜儀與質(zhì)譜儀的連用可以實(shí)現(xiàn)在定量分析的基礎(chǔ)之上進(jìn)行定性的監(jiān)測(cè)。一方面省略了定性檢測(cè)的二次步驟，另一方面降低了樣品前處理的難度與過(guò)程。進(jìn)而，降低了監(jiān)測(cè)的時(shí)間。

（三）高效液相色譜儀的廣泛性

高效液相色譜儀的廣泛性主要表現(xiàn)為對(duì)監(jiān)測(cè)物質(zhì)的廣泛性，其監(jiān)測(cè)項(xiàng)目幾乎涵蓋了水體環(huán)境監(jiān)測(cè)的所有基礎(chǔ)項(xiàng)目。包括了重金屬的測(cè)定、營(yíng)養(yǎng)元素的測(cè)定、其他離子的測(cè)定、不同價(jià)態(tài)的測(cè)定、有機(jī)物的測(cè)定等等諸多方面。尤其是其針對(duì)有機(jī)物的測(cè)定方面還可以細(xì)致劃分為多環(huán)芳烴類化合物的測(cè)定、酚類化合物的測(cè)定、苯胺類化合物的測(cè)定、鄰苯二甲酸酯類化合物的測(cè)定、氯聯(lián)苯和鹵代化合物的測(cè)定、苯基脲類化合物的測(cè)定、酞酸酯類化合物的測(cè)定等等。幾乎涵蓋了所有類別的污染物種類，使得在實(shí)際的操作過(guò)程中可以根據(jù)不同的監(jiān)測(cè)目標(biāo)與監(jiān)測(cè)目的進(jìn)行合適的項(xiàng)目選擇。

四、高效液相色譜儀的應(yīng)用前景

（一）與評(píng)價(jià)軟件連用

高效液相色譜儀與評(píng)價(jià)軟件連用主要是利用高效液相色譜儀的數(shù)據(jù)收集功能以及數(shù)據(jù)計(jì)算功能。在高效液相色譜儀對(duì)數(shù)據(jù)計(jì)算的基礎(chǔ)上結(jié)合電腦的評(píng)價(jià)軟件對(duì)獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步處理的過(guò)程。通過(guò)與評(píng)價(jià)軟件的連用可以達(dá)到在監(jiān)測(cè)的過(guò)程中根據(jù)不同的監(jiān)測(cè)目的進(jìn)行合理的評(píng)價(jià)結(jié)果輸出的方式。進(jìn)一步使得環(huán)境監(jiān)測(cè)具有高效化與準(zhǔn)確性。

在具體的操作層面其可能應(yīng)用主要分為兩個(gè)方面：一方面是利用評(píng)價(jià)軟件的評(píng)價(jià)功能對(duì)超標(biāo)樣品進(jìn)行篩選。在測(cè)定前利用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定。而在測(cè)定的過(guò)程中利用評(píng)價(jià)軟件的篩選功能自動(dòng)對(duì)超標(biāo)樣品進(jìn)行報(bào)警或者標(biāo)紅處理，而對(duì)于未超標(biāo)樣品則可以采用忽略的處理方式。最終的數(shù)據(jù)輸出結(jié)果為超標(biāo)樣品編號(hào)與濃度。這樣能夠有效的降低環(huán)境監(jiān)測(cè)站的工作強(qiáng)度。

另一方面是利用預(yù)設(shè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)以及不同污染物的環(huán)境效應(yīng)權(quán)重針對(duì)同一樣品的權(quán)指標(biāo)測(cè)定項(xiàng)目進(jìn)行評(píng)價(jià)報(bào)告的生成。在測(cè)定的過(guò)程中自動(dòng)的對(duì)比國(guó)家環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)而生成科學(xué)的環(huán)境評(píng)價(jià)報(bào)告，為后續(xù)的環(huán)境治理提供一定的依據(jù)。

（二）與質(zhì)譜儀連用

高效液相色譜儀只能夠定性的分析被監(jiān)測(cè)物質(zhì)，或者通過(guò)對(duì)吸收光譜的設(shè)定來(lái)測(cè)定特定物質(zhì)的濃度，而對(duì)于未知物質(zhì)的監(jiān)測(cè)則存在一定的不足。此方面的缺陷使得其在使用的過(guò)程中測(cè)定項(xiàng)目具有一定的盲目性。通過(guò)高效液相色譜儀與質(zhì)譜儀的連用可以在同一樣品測(cè)定的情況下測(cè)定未知樣品中的特定物質(zhì)種類以及物質(zhì)濃度。方便并拓寬了水環(huán)境監(jiān)測(cè)的廣度。

（三）與連續(xù)進(jìn)樣裝置的連用

高效液相色譜儀具有一定的連續(xù)進(jìn)樣能力。但是，此種進(jìn)樣依舊采用手動(dòng)的模式進(jìn)行。在手動(dòng)模式下，一方面對(duì)進(jìn)樣效率的提高程度不顯著。另一方面則表現(xiàn)為對(duì)進(jìn)樣的準(zhǔn)確程度不精確。因此，采用高效液相色譜儀與連續(xù)進(jìn)樣裝置的連用在進(jìn)一步提高工作效率的同時(shí)，保障了進(jìn)樣的準(zhǔn)確性與測(cè)定的自動(dòng)化程度。在效率與精度方面對(duì)高效液相色譜儀的檢測(cè)均是一種提高。

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[關(guān)鍵詞]高效液相色譜法； 大豆異黃酮；含量測(cè)定

中圖分類號(hào)：R284 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-914X（2015）06-0197-02

曾經(jīng)1999年10月FDA了第11個(gè)健康聲明：每人每天食用25g黃豆，可以減少發(fā)生冠心病的風(fēng)險(xiǎn)。而近年來(lái)一些研究表明，大豆及豆制品具有更加廣泛的生物功效，如抗腫瘤、防治骨質(zhì)疏松和增強(qiáng)記憶等，這些功能均與大豆異黃酮有關(guān)。大豆異黃酮與防治一些和雌激素水平下降有關(guān)的疾病，延緩女性衰老、改善更年期癥狀、骨質(zhì)疏松、血脂升高、乳腺癌、前列腺癌、心臟病、疏松癥、心血管疾病等。

大豆異黃酮是大豆生長(zhǎng)中形成的一類次生代謝產(chǎn)物，是生物黃酮中的一種，也是一種植物雌激素。它主要分布于大豆種子的子葉和胚軸中，種皮中含量極少。80%～90%的異黃酮存在于子葉中，濃度為0.1%～0.3%。胚軸中所含異黃酮種類較多且濃度較高，為1%～2%，但由于胚只占種子總重量的2%，因此盡管濃度很高，所占比例卻很少（10%～20%）[1-3]。迄今為止，共發(fā)現(xiàn)有12種成分，分為游離型的苷元和結(jié)合型的糖苷兩類。苷元占總含量的2%～3%，包括軟料木黃酮、黃豆苷元和黃豆黃素3種[4]。糖苷9種，以葡萄糖苷、乙酰基葡萄糖苷、丙二?；咸烟擒?種形式存在，其中染料木苷、黃豆苷、丙二酰金雀異黃苷、丙二酰大豆苷4種成分約占總量的83%～93%[5]。

目前國(guó)內(nèi)外測(cè)定大豆異黃酮的方法主要有比色法、紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法（GC） 、紫外分光光度法和高效液相色譜法（HPLC）等。但紫外分光光度法常以染料木苷標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)表征大豆異黃酮總濃度，該方法雖然簡(jiǎn)便易行、成本低廉但僅適用于粗略測(cè)定異黃酮總量，結(jié)果有一定偏差[6]。薄層色譜法具有取樣量少，操作簡(jiǎn)單、分離效果好等優(yōu)點(diǎn)，但其薄層顯色劑用量難于準(zhǔn)確控制，人為誤差大?？导僛7]等以6種SDS、正丁醇、正庚烷、水微乳液作展開劑，通過(guò)聚酰胺薄層色譜法分離和檢測(cè)13種黃連藥材、飲片及中成藥，并且觀察了微乳液類型副I分辨率的影響，結(jié)果表明，含水量75%的微乳液為適宜的展開劑。GC 法采用了樣品衍生后進(jìn)行測(cè)定，存在操作煩瑣，條件不易控制、雜質(zhì)干擾嚴(yán)重等問(wèn)題；高效液相色譜法則具有樣品不需要預(yù)處理、測(cè)定快速、定量準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)。本研究采用高效液相色譜法（HPLC），甲醇s乙腈s磷酸水（pH=3.0）=30s10s60作為流動(dòng)相，同時(shí)對(duì)大豆異黃酮4種主要成分大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素進(jìn)行分離定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

島津LC10AT高效液相色譜儀：附帶SPD-10A紫外檢測(cè)器，色譜柱為安捷倫 Eclipse XDB-C18（250mm×4.6mm 5μm），0.45？m微孔濾膜過(guò)濾器，JP-030S型超聲波清洗器，TU-1810紫外-可見分光光度計(jì)，BSA224S-CW分析天平。大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的含量均≥98%，且均購(gòu)置于曼思特生物科技有限公司。乙腈色譜純，甲醇色譜純。樣品大豆異黃酮軟膠囊購(gòu)置于深圳醫(yī)藥公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

1.2.1 大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液：稱取大豆苷、大豆苷元、染料木苷和染料木素各1mg，置于25mL容量瓶中，加入適量甲醇，經(jīng)超聲處理10min，再用甲醇定容至刻度，制成400μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 大豆異黃酮混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液：吸取1.2.1中標(biāo)準(zhǔn)貯備液，配成200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，20μg/mL的混合標(biāo)液，使用甲醇定容。

1.3 供試液制備

膠囊去殼，將內(nèi)容物混合均勻，稱取樣品0.05g-0.5g（精確至0.1mg），加入適量80%乙醇。超聲提取30min，加水定容，離心分離5-10min，取上清液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后，收集濾液待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件確定

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

通過(guò)紫外掃描，可知四種大豆異黃酮在260nm處均有較大吸收，故選取檢測(cè)波長(zhǎng)260nm。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

分別采用甲醇-水，甲醇-磷酸水（pH3.0），甲醇-乙腈-磷酸水（pH3.0）作為流動(dòng)相。甲醇-水作流動(dòng)相時(shí)發(fā)現(xiàn)染料木素峰有嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象，且大豆苷和大豆苷元無(wú)法完全分開。當(dāng)流動(dòng)相pH3.0時(shí)，大豆苷和大豆苷元能很好的分開，但是染料木苷有前出峰現(xiàn)象，當(dāng)流動(dòng)相中加入一定比例的乙腈時(shí)，這種現(xiàn)象能夠很好的改善。因此流動(dòng)相選擇甲醇s乙腈s磷酸水=30s10s60。

2.1.3 色譜條件確定

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)，確定本實(shí)驗(yàn)的色譜條件為：流動(dòng)相為甲醇s乙腈s磷酸水（pH3.0）=30s10s60，流速為：1.0mL/min，波長(zhǎng)：260nm，進(jìn)樣量：10μL，柱溫：30℃。

2.2 檢測(cè)方法的驗(yàn)證

2.2.1 線性關(guān)系考察

分別精密吸取一系列濃度范圍的對(duì)照品混合溶液，進(jìn)樣量10μL。按照2.1.3條件注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸?；貧w方程及線性范圍見表1。

大豆苷、大豆苷元、染料木苷和染料木素的理論塔板數(shù)分別為2412、2402、6803和7115，其理論塔板數(shù)顯示各成分的分離程度，能夠滿足檢測(cè)的需要。在進(jìn)樣量為10？L時(shí)，四種大豆異黃酮最低檢測(cè)濃度均為：2.5μg/mL。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液10？L，每隔8h，按照2.1.3項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣一次，共測(cè)6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果大豆苷、大豆苷元、染料木苷和染料木素的RSD分別為1.56%、2.03%、1.05%和2.37%。表明48h內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定性良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品，按照1.3制備供試液，按照2.1.3項(xiàng)色譜條件，分別測(cè)定四種大豆異黃酮日內(nèi)含量重復(fù)性和日間重復(fù)性，結(jié)果分別見表2和表3。樣品在一天時(shí)間內(nèi)重復(fù)測(cè)定6次完成其日內(nèi)重復(fù)性。每隔2天測(cè)定一次，共測(cè)定3次完成日間重復(fù)性。表2和表3的結(jié)果顯明本方法精密度好，準(zhǔn)確度高，且操作簡(jiǎn)便，適合推廣應(yīng)用。

2.2.4 回收率試驗(yàn)

稱取已知含量的同一樣品共9份，每3份為1組，按高、中、低3個(gè)水平分別加入對(duì)照品溶液，按照1.3制備供試液，按照2.1.3的色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)行回收率試驗(yàn)。回收率見表2。

3 結(jié)論

本方法討論了用不比例的醇-水，甲醇-磷酸水（pH3.0），甲醇-乙腈-磷酸水（pH3.0）作流動(dòng)相，結(jié)果顯示甲醇s乙腈s磷酸水=30s10s60作流動(dòng)相時(shí)，四種大豆異黃酮能很好的分開。對(duì)方法的重復(fù)性考察，在6天時(shí)間內(nèi)方法是穩(wěn)定的，重復(fù)性好，精密度高。分別對(duì)四種大豆異黃酮的回收率加以考察，回收率均在90%以上，表明方法可操作性高。

本方法用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定4種大豆異黃酮苷元的含量，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，為大豆異黃酮的定量測(cè)定提供了一定的支持。

參考文獻(xiàn)

[1] Wang HJ， Murphy PA. Isoflavones composition of American and Japanese soybeans in Lowa： effects of variety. Crop year， and location. J Agric Food Chem， 1994， 4：1674～1677.

[2]楊薇.大豆植物性雌激素的構(gòu)效關(guān)系及藥理作用[J].中國(guó)新藥雜志，2001，10（12）：892.

[3]董懷海，谷文英.高效液相色譜-質(zhì)譜法在大豆異黃酮測(cè)定中的應(yīng)用[J].糧食與飼料工業(yè)，2002，（5）：48～50.

[4]張玉梅，孫學(xué)斌，高旭年.紫外分光光度法測(cè)定大豆總異黃酮的含量[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2000，12（4）：7～9.

[5]郝青南，馬超，馬兵鋼. 大豆異黃酮的生理功能及其分離檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)，2007，10（2）：383～385.

篇4

關(guān)鍵詞：恩替卡韋 對(duì)映異構(gòu)體測(cè)定 高效液相色譜法

Enantiomers of Entecavir by HPLC

Zhao Hai-qiao Wu Shuang-jun Fu Jian Su Gui-yong

（Shandong Fangming Pharmaceutical Group CO.，LTD.，Dongming 274500 ，China）

Abstract：Objective To establish a method for the enantiomers of Entecavirby HPLC.Methods The determination was carried out on CHIRALPAK AD-H，with Hexane - Isopropanol -ethanol - trifluoroacetic acid （70：10：：30： 0.5） as the mobile phase at the flow rate of 0.8ml？min-1 .The detection wavelength was 254nm. Results The method showed good linearity with a correlation coefficient （r） of 0.9999； the precision and stability were satisfactory with all RSDs below 2%. Conclusion This method is an accurate，fast and simple method for the enantiomers of Entecavirtablets.

Key word： entecavir Enantiomers HPLC

恩替卡韋（Entecavir）為最新抗乙肝病毒的一線藥物，恩替卡韋是環(huán)戊酰鳥苷類似物。II/III期臨床研究表明，成人每日口服0.5mg能有效抑制HBV-DNA復(fù)制，療效優(yōu)于拉米夫定；III期臨床研究表明，對(duì)發(fā)生YMDD變異者將劑量提高至每日1mg能有效抑制HBVDNA復(fù)制。對(duì)初治患者治療1年時(shí)的耐藥發(fā)生率為0，但對(duì)已發(fā)生YMDD變異患者治療1年時(shí)的耐藥發(fā)生率為5.8%。我國(guó)SFDA也已批準(zhǔn)用于治療慢性乙型肝炎患者。恩替卡韋對(duì)映異構(gòu)體測(cè)定目前還未有報(bào)道，本文建立的方法，方法簡(jiǎn)便，結(jié)果可靠。

一、儀器與試藥

1.儀器 日本島津 SPD-20A高效液相色譜儀。

2.試藥 恩替卡韋對(duì)照品（山東方明藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，1301001）；正己烷、三氟乙酸、無(wú)水乙醇為色譜純；對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品（山東方明藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，1205001）；恩替卡韋（山東方明藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；批號(hào)：1310001、1310002、1310003）

二、方法與結(jié)果

1.色譜條件

色譜柱為CHIRALPAK AD-H （250mm×4.6mm，5μm），以正己烷-無(wú)水乙醇-三氟乙酸（70：30：0.5）為流動(dòng)相，流速為0.8ml﹒min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20μl。

2.供試品溶液的制備

取恩替卡韋對(duì)照品約20mg，精密稱定，置20ml容量瓶中，加稀釋劑（正己烷：無(wú)水乙醇=1：1）溶解并稀釋至刻度，作為供試品溶液。

3.對(duì)照溶液的制備

精密量取恩替卡韋供試品溶液0.1ml，置100ml量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。

4.專屬性試驗(yàn)

為考察空白溶劑對(duì)本品異構(gòu)體檢測(cè)的影響，進(jìn)行專屬性試驗(yàn)。取恩替卡韋對(duì)映異構(gòu)體及恩替卡韋對(duì)照品各約5mg，分別置兩個(gè)100ml量瓶中，加稀釋劑適量超聲使溶解，放冷至室溫，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。精密量取分離度試驗(yàn)溶液20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。試驗(yàn)結(jié)果表明，空白溶劑不干擾本品異構(gòu)體的檢測(cè)。恩替卡韋與其對(duì)映異構(gòu)體能有效分離。

5.線性關(guān)系考察

通過(guò)試驗(yàn)考察本品對(duì)照溶液濃度與峰面積在一定范圍內(nèi)是否呈線性關(guān)系。①線性儲(chǔ)備液的配制：取恩替卡韋對(duì)照品約25mg，精密稱定，置25ml量瓶中，加稀釋劑超聲使溶解并稀釋至刻度；精密量取1.0ml，置100ml量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。②樣品溶液的配制：精密量取線性儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0ml，分別置10ml量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得系列線性溶液。③測(cè)定方法：精密量取上述樣品溶液各20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，采用最小二乘法，以恩替卡韋峰面積（A）為縱坐標(biāo)，其濃度（C）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示本品在濃度為0.10μg /ml～2.00μg /ml的范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=74478x-3302.1，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。

6.精密度試驗(yàn)

以在相同條件下，由同一分析人員對(duì)同一樣品重復(fù)進(jìn)樣6次峰面積的偏差為考察目的，配制本品0.1%對(duì)照溶液進(jìn)行精密度試驗(yàn)。結(jié)果顯示RSD為0.51%，小于2%，表明進(jìn)樣精密度良好。

7.穩(wěn)定性試驗(yàn)

樣品檢測(cè)過(guò)程中可能會(huì)將樣品溶液在室溫里放置數(shù)小時(shí)，為考察樣品溶液在室溫放置的穩(wěn)定性，進(jìn)行溶液穩(wěn)定性考察。試驗(yàn)結(jié)果顯示，供試品溶液室溫放置8小時(shí)，主峰峰面積的RSD為0.75%，小于2.0%，結(jié)果表明，樣品溶液在8小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

8.樣品測(cè)定

對(duì)批號(hào)為1310001，1310002，1310003的恩替卡韋樣品，按照“2.2及2.3”項(xiàng)下方法制備供試品及對(duì)照溶液，結(jié)果均未檢出。

三、結(jié)果與討論

1.流動(dòng)相的選擇

剛開始選正己烷-無(wú)水乙醇（1：1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)主峰出峰時(shí)間太長(zhǎng)，改用正己烷-無(wú)水乙醇-三氟乙酸（60：40：0.1）分離效果好，且峰形比較好，故選擇該流動(dòng)相。

2.檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

以無(wú)水乙醇為溶劑，配置 0.05 mg·mL的溶液，在 200～400nm 范圍內(nèi)掃描，結(jié)果表明，在 254nm 波長(zhǎng)有最大吸收，故將 254nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

參考文獻(xiàn)

篇5

關(guān)鍵詞 粉葛； 高效液相色譜電噴霧質(zhì)譜； 同分異構(gòu)體； 源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)解離

1 引 言

粉葛（Radix puerariae thomsonii）為豆科植物甘葛藤（ Pueraria thomsonii Benth）的干燥根, 味甘, 辛、涼,有解肌退熱、透疹、生津止渴、通經(jīng)活絡(luò)之功效 \。粉葛自古與野葛同作葛根用。研究發(fā)現(xiàn), 粉葛與葛根（野葛）HPLC指紋圖譜\及臨床應(yīng)用\存在較大差別, 2005版中國(guó)藥典首次將粉葛與葛根（野葛）分列作為中藥材記載。粉葛中主要成分為異黃酮類化合物, 大部分以苷的形式存在, 主要包括：葛根素、3′羥基葛根素、大豆苷等\, 其主要結(jié)構(gòu)見表1。該類化合物中存在多對(duì)同分異構(gòu)體, 主要分為碳苷和氧苷兩類化合物。同分異構(gòu)體結(jié)構(gòu)相似, 極性相近, 分離難度大。分離和鑒別中藥中同分異構(gòu)體化合物, 一直是藥物分析的難題。

高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（HPLCESIMS）技術(shù)結(jié)合了色譜與質(zhì)譜的優(yōu)點(diǎn), 可有效分析復(fù)雜混合物中的單個(gè)和多個(gè)組分\。文獻(xiàn)\采用高效液相色譜（二極管陣列）/電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（HPLCESIMS）方法分析葛根中異黃酮類化合物。但對(duì)粉葛中化合物質(zhì)譜分析尚未見報(bào)道。本研究采用HPLCPDAESIMSn技術(shù)鑒別分析了粉葛中C苷和O苷兩類化合物, 建立區(qū)分粉葛中異黃酮類化合物同分異構(gòu)體的電噴霧質(zhì)譜方法。表1 粉葛中主要異黃酮類化合物

譜配有電噴霧離子源（ESI）；高效液相色譜儀系統(tǒng)（Surveyor HPLC）包括 Surveyor PDA Plus檢測(cè)器、Surveyor AutoSample Plus自動(dòng)進(jìn)樣器、Surveyor MS Pump四元泵； Xcalibur 2.0化學(xué)工作站軟件； Mass Frontier 6.0軟件。

粉葛藥材購(gòu)于合肥市當(dāng)?shù)厮幍? 經(jīng)安徽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥教研室王德群教授鑒定為豆科植物甘葛藤（ Pueraria thomsonii Benth）的干燥根；葛根素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所, 批號(hào) 0752200509）; 乙腈、甲酸（色譜純, 美國(guó)Merck公司）, 實(shí)驗(yàn)用水為亞沸蒸餾水。

2.2 樣品處理

篇6

脫氫乙酸(dha，dehydroacetic)，別名 二乙?；阴Ｒ宜?，固態(tài)呈白色或淡黃色結(jié)晶粉末，無(wú)嗅、無(wú)味、熔點(diǎn)108～110℃，沸點(diǎn)270℃，是一種低毒高效防腐、防霉劑。在酸、堿條件下均有一定的抗菌作用，尤其對(duì)霉菌的抑制作用最強(qiáng)。我國(guó)自20世紀(jì)70年代中期開始用于食品防腐劑至今，曾用于果汁、醬菜、腐乳、人造奶油、乳酸菌飲料、果醬等食品的防腐劑[1]。雖然它的抗菌作用是有效的，但是它的毒性較大的缺點(diǎn)卻限制了脫氫乙酸的廣泛應(yīng)用。脫氫乙酸能迅速被人體所吸收，進(jìn)人人體后即分散于血漿和許多器官中，有抑制體內(nèi)多種氧化酶的作用。目前，脫氫乙酸的安全性受到質(zhì)疑，國(guó)際上已明確禁止使用，我國(guó)在一定范圍內(nèi)允許其使用，但最大允許使用量為0.3g/kg[2]。目前檢測(cè)脫氫乙酸的國(guó)標(biāo)方法為氣相色譜法[3]，前期樣品處理過(guò)程涉及到有機(jī)溶劑萃取、濃縮等步驟，操作起來(lái)比較麻煩，而且脫氫乙酸還容易造成色譜峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，使得難以獲得準(zhǔn)確的定性和定量的結(jié)果[4]。應(yīng)用高效液相色譜測(cè)定食品中脫氫乙酸的方法已見報(bào)道，比如采用超聲萃取、氫氧化鈉溶液浸泡等方法萃取月餅中的脫氫乙酸后再注射到色譜柱進(jìn)行分離測(cè)定[5]。這些研究為應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定果汁、罐頭、瓶裝腐乳等液態(tài)食品中的脫氫乙酸做了探索性的工作。本研究在國(guó)標(biāo)gb/t 5009.1212003的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)目前市場(chǎng)上廣泛銷售的多種液態(tài)食品中的脫氫乙酸以高效液相色譜的方法進(jìn)行分析，取得了比較滿意的結(jié)果，克服了氣相色譜法前處理復(fù)雜以及污染性大的缺點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品、主要儀器與試劑

參加測(cè)定的樣品主要包括目前市場(chǎng)上銷售的果汁、腐乳、罐頭以及酸奶。hp1100型高效液相色譜儀、紫外分光光度計(jì)(上海光譜儀器公司);快速混勻器。甲醇(hplc級(jí)，dikma公司);甲醇(分析純，國(guó)藥);碳酸氫鈉(優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥);脫氫乙酸(國(guó)家標(biāo)物中心);脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，用甲醇定溶至100ml。再用甲醇稀釋成1、5、10、15、20、30 mg/l的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾。測(cè)定用水為二次蒸餾水。

1.2 樣品處理

果汁和酸奶混勻后直接稱取，腐乳和罐頭樣品需要先將固體物粉碎后再混勻。預(yù)先混勻的樣品稱取大約5.0g，加入到25.0ml容量瓶中，再加入10ml 2%的碳酸氫鈉溶液，用雙蒸水稀釋至刻度，搖勻。靜置10min后將上清液過(guò)0.45μm濾膜，以10μl進(jìn)樣器加入到液相色譜儀測(cè)定。

1.3 色譜條件

色譜柱c18(5um,250×4.60mm);柱溫25℃;流動(dòng)相選用甲醇0.02mol/l乙酸銨(5:95);流速1.0ml/min;進(jìn)樣量10ul;檢測(cè)波長(zhǎng)310nm;按照這種條件進(jìn)行分析，以保留時(shí)間定性，以峰面積定量，測(cè)定樣品中脫氫乙酸的濃度。

1.4 結(jié)果計(jì)算

待測(cè)樣品中脫氫乙酸的含量(g/kg)=c×v×10-3/m

式中，c:樣品中脫氫乙酸的濃度(mg/l);v: 樣品體積(ml);m:樣品質(zhì)量(g)

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

用紫外分光光度計(jì)對(duì)脫氫乙酸進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描檢測(cè)到兩個(gè)吸收峰，在310nm處有最大吸收，在230nm處有次強(qiáng)吸收。在310nm處的干擾比在230nm處要小，背景吸收少，因此選擇310nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。標(biāo)準(zhǔn)品及待檢樣品中的脫氫乙酸的檢出峰色譜圖見圖1，脫氫乙酸的保留時(shí)間在8.5min左右。

2.2 流動(dòng)相的選擇

液相色譜柱c18分析中常用的流動(dòng)相有甲醇磷酸鹽緩沖溶液系統(tǒng)、甲醇硫酸溶液系統(tǒng)以及甲醇乙酸鹽溶液系統(tǒng)。參考以前的研究結(jié)果，從流動(dòng)相的本底吸收、靈敏度的影響和色譜柱的壽命等方面來(lái)考慮，本研究選擇了甲醇-0.02mol/l乙酸銨(5:95)。在流動(dòng)相中加入甲醇，可以提高出峰的對(duì)稱性，隨著甲醇量的增加，出峰時(shí)間明顯加快，為了避開樣品中其它成分的干擾，將甲醇的比例調(diào)整到5%時(shí)，脫氫乙酸的出峰時(shí)間較為理想，且不受雜質(zhì)的干擾。

2.3 測(cè)量精密度和回收率

取同一罐頭樣品10份，每5份添加同一個(gè)濃度的脫氫乙酸標(biāo)樣，分別進(jìn)行hplc分析。從表1的結(jié)果可以看出這種方法有較好的重復(fù)性和較高的回收率，可以用來(lái)進(jìn)行定量分析。

2.4 線性實(shí)驗(yàn)和靈敏度分析

取同一果汁樣品10份，每份約5.0g，置于25ml容量瓶中，分別加入脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)液(5mg/l)1ml、2ml、3ml、4ml和5ml，樣品按照標(biāo)準(zhǔn)步驟處理后取10ul進(jìn)入色譜柱測(cè)定，以出峰面積對(duì)脫氫乙酸濃度進(jìn)行回歸分析，結(jié)果表明脫氫乙酸濃度與色譜峰面積有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為0.9993。以信噪比(s/n)為3測(cè)得各成分的最低檢出限為0.25mg/kg。

2.5 樣品的測(cè)定

取目前國(guó)內(nèi)銷售的液態(tài)食品4種，每種選取3種不同的品牌按照前面介紹的方法進(jìn)行hplc分析，結(jié)果見表2?？梢钥闯?，一般酸奶中并沒(méi)有添加脫氫乙酸，因?yàn)樗崮痰谋Ｙ|(zhì)期通常只有半個(gè)月到1個(gè)月。果汁中也基本不含脫氫乙酸，而在選取的腐乳和罐頭中則添加了少量的脫氫乙酸，但是都遠(yuǎn)低于最大添加量。總之，該法簡(jiǎn)便快速，可以在相應(yīng)類型的食品檢驗(yàn)中推廣使用。表2 常見的4種液態(tài)食品中脫氫乙酸的含量測(cè)定結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】

 

1 駱萌. 脫氫乙酸及相關(guān)化合物生產(chǎn)技術(shù). 化工中間體，2004，1(7)：31～33.

2 明立艷，張忠義. 高效液相色譜法測(cè)定食品中脫氫乙酸含量.食品研究與開發(fā)，2009，3(30):106～108.

3 衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所. gb/t 1494194 食品中脫氫乙酸的含量測(cè)定. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，1994.

4 張輝珍，馬愛國(guó)，梁惠，等. 高效液相色譜法測(cè)定食品中脫氫乙酸的方法研究. 衛(wèi)生研究，2007，6(36):748～750.

篇7

【摘要】

目的延胡索乙素作為對(duì)照品，建立高效液相色譜（HPLC）法控制復(fù)方元胡止痛膠囊的質(zhì)量。方法采用Alltima C18色譜柱（5μm，4.6 mm×250 mn），用甲醇-水-三乙胺（65∶35∶0.5）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；柱溫30℃；流速1.0 ml/min。結(jié)果延胡索乙素含量在0.102 9～1.028 8 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，得回歸方程Y＝4.840 1X +0.089 5，r=0.999 7，平均加樣回收率及RSD分別為101.17%和1.02%。結(jié)論以延胡索乙素為對(duì)照品，采用HPLC法控制復(fù)方元胡止痛膠囊質(zhì)量的方法簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，專屬性強(qiáng)。

【關(guān)鍵詞】 復(fù)方元胡止痛膠囊；高效液相色譜； 延胡索乙素

Abstract：ObjectiveTo establish the method for determining the content of tetrahydropalmatine in complex Yuanhu Zhitong capsule by HPLC. MethodsThe separation was performed on Alltima C18 column (5μm， 4.6mm×250mm) with methanol-H2O -triethylamine (65∶35∶0.5) as mobile phase .The detection wavelength was at 280 nm， the column temperature was 30 ℃， and the mobile phase speed was 1.0ml per min.ResultsThe calibration curve was linear in the range of 0.1029 to 1.0288 μg for the tetrahydropalmatine content and the linear equation was y＝4.840 1x +0.089 5(r=0.999 7). The average recovery rate was 101.17% and the relative standard deviation was 1.02%. ConclusionThe method is simple，rapid，accurate and reproducible.It can be used for the determination of tetrahydropalmatine content complex Yuanhu Zhitong capsule.

Key words：HPLC； Rhizoma Corydalis Decumbentis； Protopine； Content determination

復(fù)方元胡止痛膠囊是由延胡索（醋制）、香附（醋制）、川楝子、徐長(zhǎng)卿4味藥組成的中藥復(fù)方制劑，是在復(fù)方元胡止痛片的基礎(chǔ)上經(jīng)劑型改變而來(lái)，功能疏氣止痛，可用于肝胃氣痛，胃脘脹痛，胸肋痛，月經(jīng)痛［1］。延胡索為方中君藥，現(xiàn)代研究表明，其主要有效成分為生物堿，其中以延胡索乙素的鎮(zhèn)痛作用較強(qiáng)，另外還有延胡索甲素（d-紫堇堿）、延胡索丙素、延胡索丁素（1-四氫黃連堿）、延胡索戊素（dl-四氫黃連堿）、黃連堿、非洲防己堿、d-海罌粟堿等［2］。為了提高產(chǎn)品的質(zhì)量可控性，我們建立了HPLC測(cè)定樣品中延胡索乙素含量的質(zhì)量控制法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 器材與方法

1.1 儀器

高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司)：P200 II型高壓恒流泵，UV200 II 紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)儀，Rheodyne 7725i 高壓六通進(jìn)樣閥，20 μl定量環(huán)；HW色譜工作站（南京千譜軟件有限公司）；百萬(wàn)分之一電子天平（瑞士Mettler公司M3型）。

1.2 試藥

復(fù)方元胡止痛膠囊（由本實(shí)驗(yàn)室自制）；延胡索乙素對(duì)照品（供含量測(cè)定用，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)0726-200208）；甲醇為色譜純（中國(guó)醫(yī)藥集體上?；瘜W(xué)試劑公司）；三乙胺（中國(guó)醫(yī)藥集體上?；瘜W(xué)試劑公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Alltima C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mn）；流動(dòng)相為甲醇-水-三乙胺（65∶35∶0.5），使用前用孔徑為0.45 μm的有機(jī)濾膜減壓過(guò)濾，超聲20 min；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；柱溫30℃；流速1.0 ml/min；進(jìn)樣量10 μl。

2.2 可行性實(shí)驗(yàn)精密稱取供試品2 g，精密加入濃氨試液-甲醇（1∶20）50 ml，稱定重量，回流90 min（75℃），放冷，再稱定重量，用濃氨試液-甲醇(1∶20)補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液25 ml置水浴鍋上蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜? ml，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，作為HPLC檢測(cè)的供試品溶液。取配制好的延胡索乙素對(duì)照品溶液、供試品溶液分別進(jìn)樣，原兒茶醛峰保留時(shí)間為9.275 min（見圖1～3）。由圖1～3可知，延胡索乙素保留時(shí)間為16.5 min左右，與其它組分分離很好，且陰性對(duì)照無(wú)干擾峰。理論板數(shù)以延胡索乙素計(jì)算為3 000。

2.3 線性關(guān)系的考察精密稱取延胡索對(duì)照品1.286 mg，置25 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，濃度為0.051 44 mg/ml。從中分別精密吸取2，5，10，15，20 μl注入色譜儀，測(cè)定其峰面積，以延胡索乙素進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。見圖2。由圖2可知，延胡索乙素在0.102 9～1.028 8μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積有良好線性關(guān)系，回歸方程為Y＝4.840 1X +0.089 5，r=0.999 7（n=5）。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液10 μl注入液相色譜儀，記錄峰面積，重復(fù)測(cè)定6次，RSD為0.64%。結(jié)果見表1。結(jié)果表明精密度好。表1 精密度測(cè)定結(jié)果（略）

2.5 樣品回流時(shí)間考察取本品50粒，去膠囊殼后，混勻，取約2 g（批號(hào)20040501），精密稱定，稱取4份，分別置平底燒瓶中，精密加入濃氨-甲醇（1∶20）50 ml，密塞，稱定重量，分別回流30，60，90，120 min（75℃），放冷，再稱重，用濃氨-甲醇(1∶20)補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，精密取續(xù)濾液25 ml置水浴鍋上蒸干，殘?jiān)眉状既芙舛ㄈ葜? ml，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。依上述的方法測(cè)定。結(jié)果見表2。由表2可知，樣品回流90 min即可。表2 不同回流時(shí)間測(cè)得的延胡索乙素含量（略）

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取供試品溶液（批號(hào)20040501），間隔一定時(shí)間進(jìn)針1次，共考察12 h，測(cè)定延胡索乙素峰面積積分值，結(jié)果表明本品12 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD為0.97%。結(jié)果見表3。表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取本品50粒（批號(hào)20040501），去膠囊殼后，稱定重量，混勻，稱取5份，2 g/份，精密稱定，按供試品制備方法，制備供試品溶液，照樣品含量測(cè)定方法測(cè)定。結(jié)果見表4。結(jié)果表明本測(cè)定方法重復(fù)性較好。表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)取本品已知含量，同一批號(hào)（批號(hào)20040501）樣品共6份，每份約1 g，精密稱定，置平底燒瓶中。另取延胡索乙素對(duì)照品用濃氨試液-甲醇(1∶20)配制成濃度為0.055 mg/ml的溶液，每份樣品中精密加入50 ml此溶液，稱定重量，回流90 min，放冷，再稱定重量，用濃氨試液-甲醇(1:20)補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液25 ml置水浴鍋上蒸干，殘?jiān)眉状既芙猓ㄈ葜? ml，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

照上述供試品制備方法制備供試品溶液，按含量測(cè)定方法測(cè)定延胡索乙素含量，按以下公式計(jì)算回收率。結(jié)果見表5。結(jié)果表明本法回收率較高，方法可行。表5 延胡索乙素含量測(cè)定加樣回收率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）

2.9 樣品含量測(cè)定按上述方法制備供試品溶液和對(duì)照品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μl，依上述色譜條件測(cè)定10批樣品延胡索乙素的含量（n＝4）。結(jié)果見表6。由表可知，本品的延胡索含量為0.068 5～0.083 5 mg/粒，暫定本品每粒含延胡索乙素（C21H25NO4 ）不得少于0.05 mg。表6 樣品含量測(cè)定結(jié)果（略）

3 討論

延胡索對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，并能使肌肉松弛具有解痙效應(yīng)，口服能產(chǎn)生類似嗎啡以及可待因的效果，能緩解一般神經(jīng)痛、頭痛、腰痛、關(guān)節(jié)痛、月經(jīng)痛、腫瘍疼痛等。延胡索乙素是延胡索生物堿中具有較強(qiáng)鎮(zhèn)痛作用的成分，因此選擇延胡索乙素作為控制質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的指標(biāo)之一，有一定意義。

在原劑型復(fù)方元胡止痛片的部頒標(biāo)準(zhǔn)中，只有3個(gè)理化性質(zhì)鑒別，專屬性不強(qiáng)，也沒(méi)有含量測(cè)定項(xiàng)，顯然已經(jīng)不符合我國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代化的要求。本實(shí)驗(yàn)室在參考文獻(xiàn)［4～6］的基礎(chǔ)上，先后考察了不同的預(yù)處理方法與流動(dòng)相，最終選用了甲醇-水-三乙胺（65∶35∶0.5）為流動(dòng)相，分離效果好。方法學(xué)考察結(jié)果表明，采用HPLC法測(cè)定延胡索乙素在復(fù)方元胡止痛膠囊制劑中的含量，穩(wěn)定性好、精密度高、結(jié)果可靠、專屬性強(qiáng)，而且它是一個(gè)主要的活性成分，這樣就可以更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，使產(chǎn)品更符合我國(guó)中藥現(xiàn)代化的要求。

參考文獻(xiàn)

［1］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥政局.中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑，第7冊(cè)［S］.

［2］中國(guó)藥材公司. 中國(guó)常用中藥材［S］.北京：科學(xué)出版社， 1995：289.

［3］徐婷， 金昔陸， 曹惠明.延胡索乙素藥理作用的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)臨床藥學(xué)雜志， 2001， 10(1):58.

［4］朱才慶，范其坤，熊勝泉，等. 高效液相色譜法測(cè)定夏天無(wú)注射液中原阿片堿的含量［J］.中草藥， 2005， 36(5):699.

篇8

[關(guān)鍵詞]小兒氨酚黃那敏顆粒；對(duì)乙酸氨基酚；高效液相色譜法

中圖分類號(hào)：U164 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-914X（2016）10-0335-01

小兒氨酚黃那敏顆粒是一種適用于緩解兒童普通感冒及流行性感冒引起的發(fā)熱、頭痛、四肢酸痛、打噴嚏、流鼻涕、鼻塞、咽痛等癥狀常用的復(fù)方制劑，由對(duì)乙酸氨基酚、馬來(lái)酸氯苯那敏、人工牛黃等組成，是臨床常用的小兒抗感冒藥。

現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中僅采用紫外分光光度法測(cè)定對(duì)乙酸氨基酚的含量，專屬性不強(qiáng)，結(jié)果重現(xiàn)性差，因此產(chǎn)品質(zhì)量可控性差。我們?cè)谖墨I(xiàn)工作的基礎(chǔ)上，建立了一種快速檢測(cè)小兒感冒藥中對(duì)乙酸氨基酚含量的高效液相色譜法，并取得滿意效果。

1、儀器與試藥

Agilent1200型高效液相色譜儀、61328B一級(jí)管陣列檢測(cè)器，關(guān)國(guó)安捷倫公司；KQ5200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DZF}型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)

儀器有限公司；ME254S電子天平，德國(guó)Sartorius公司；UV-2550紫外分光光度計(jì)，日本島津公司。

對(duì)乙酸氨基酚對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為100018200408）；甲醇（色譜純，Methane、公司，美國(guó)），娃哈哈純水。小兒氨酚黃那敏顆粒均購(gòu)自不同廠家（產(chǎn)品批號(hào)分別為：1001321，100607，100885；其中每袋含對(duì)乙酸氨基酚125mg，馬來(lái)酸氯苯那敏0.5mg，人工牛黃5mg）。

2、方法與結(jié)果

2.1 確定色譜的應(yīng)用條件

選擇C18色譜柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，該色譜柱為150×4.6mm，波長(zhǎng)為5um，而實(shí)驗(yàn)選擇的流動(dòng)相則為甲醇：水，兩者的配比為40：60，流動(dòng)相的流速控制為1.0ml?min-1，選用的進(jìn)樣量需要設(shè)定為20ul，確保色譜柱的溫度保持在25℃點(diǎn)上，并且將檢測(cè)波長(zhǎng)的峰值設(shè)定為275nm，選用相應(yīng)的對(duì)照品，將其與樣品的色譜柱圖進(jìn)行對(duì)比分析，詳情可見圖1。

2.2 制備對(duì)照品溶液

選用精確的稱量?jī)x器進(jìn)行對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品的稱取，對(duì)照品的溫度要控制為105℃，將其進(jìn)行干燥處理后達(dá)到恒重的狀態(tài)，確保其重量為0.0146g，將其放置選用的容量瓶中，該容量瓶為50ml，然后在容量瓶中加入適量的水進(jìn)行稀釋，充分搖勻后，將其作為對(duì)照品溶液備用。

2.3 制備樣品溶液

從五個(gè)不同的生產(chǎn)廠家各選擇一袋小兒氨酚黃那敏顆粒，將這五袋小兒氨酚黃那敏顆粒進(jìn)行混合磨碎，然后精確的稱取出一袋的藥品粉末重量，將粉末放置到準(zhǔn)備好的容量瓶中，該容量瓶為100ml，加入適量的水，使得藥品粉末可以稀釋到制定的濃度刻度，搖勻，并利用微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾處理，將過(guò)濾后的溶液留用。

2.4 測(cè)定線性關(guān)系

針對(duì)制備的對(duì)照品溶液進(jìn)行稱量，分別稱出1-5ml的溶液，分別將稱取出的溶液，加入五個(gè)容量為50ml的容量瓶中，并利用水進(jìn)行定容處理，在完成定容處理后，容量瓶中溶液的溶度分別為5.84mg?L-1，17.52mg?L-1，29.2mg?L-1，40.88mg?L-1，58.4mg?L-1，而且將進(jìn)樣量也設(shè)定為標(biāo)準(zhǔn)溶液量，標(biāo)準(zhǔn)溶液量為20ul，然后就可以總結(jié)得出色譜的流出曲線圖。將對(duì)乙酰胺基酚的濃度作為X軸，其濃度單位設(shè)定為mg?L-1，而Y軸則設(shè)定為峰面積，進(jìn)行線性回歸方程的計(jì)算，計(jì)算結(jié)果為Y=20.96X+0.8787，r=0.9998。從計(jì)算的結(jié)果就可以看出，對(duì)乙酰氨基酚的濃度范圍以及峰面積之間在對(duì)乙酰氨基酚的濃度達(dá)到5.84mg?L-1以上，58.4mg?L-1以下的時(shí)候，呈現(xiàn)出線性關(guān)系。

2.5 測(cè)定精密度

嚴(yán)格的依據(jù)相應(yīng)的方法進(jìn)行對(duì)照品溶液的選取，分別選取6次，而且選取的對(duì)照品溶液溶度需要控制為58.4mg?L-1，每一次選用的值均為20ul，通過(guò)實(shí)驗(yàn)計(jì)算可知，RSD=1.19%（n=6），這就表明所選用的儀器有著較高的精度值。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

分別取制備樣品溶液項(xiàng)下3種藥品供試液按制備對(duì)照品溶液項(xiàng)下的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣3次，分別測(cè)得各種藥品供試液中對(duì)乙酸氨基酚色譜峰峰而積的RSD值，結(jié)果分別為0.29%，0.17%，0.73%（n=3），表明本法重復(fù)性好。

2.7 穩(wěn)定性測(cè)定

分別取制備樣品溶液項(xiàng)下3種藥品供試液，在時(shí)間0，1，2，3，4，5h按2.2項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，分別計(jì)算其RSD值。結(jié)果分別為2.68%，0.86%，0.89%（n=6），表明樣品在5h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加標(biāo)回收率測(cè)定

取同一批（批號(hào)：1001321，4g/袋）已知含量的小兒氨酚黃那敏顆粒樣品5份，每份約0.800g，分別精密加入對(duì)乙酸氨基酚2.500mg，依法測(cè)定，對(duì)乙酸氨基酚總平均回收率為116.6%，RSD為1.46%（表1）。

2.9 樣品測(cè)定

取制備樣品溶液項(xiàng)下處理好的樣品溶液各20ul，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)法（峰而積）計(jì)算含量，結(jié)果3批樣品1001321，100607，100885的含量分別為：83.2%，84.1%，84.5%（標(biāo)示量）。

3、討論

3.1 選擇適宜的溶液

就相關(guān)的文獻(xiàn)資料可以了解到，流動(dòng)相作為溶劑溶解樣品經(jīng)常被應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究。通過(guò)本文的研究可以了解到，將水作為對(duì)照品，分別針對(duì)水和流動(dòng)相進(jìn)行溶劑溶解檢定，對(duì)比的結(jié)果就是兩者之間沒(méi)有明顯的不同。所以，可以選擇價(jià)格較低的純凈水作為溶劑溶解樣品進(jìn)行應(yīng)用。

3.2 選擇適宜的流動(dòng)相

就相關(guān)的文獻(xiàn)資料表明，在利用高效液相色譜法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，應(yīng)用的流動(dòng)相多選擇甲醇：磷酸二氫鉀溶液：三乙胺溶液，或者是選用的甲醇：乙腈：磷酸溶液。而就本文的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)說(shuō)，選擇的溶液則為甲醇：水，兩者的比例為40：60，這樣的溶液在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行應(yīng)用，具有操作便利的特點(diǎn)，而且也很容易出峰，并且在分離度上也相對(duì)較高，出現(xiàn)的峰形具有一定的對(duì)稱性，而且在實(shí)驗(yàn)完成后，也很容易對(duì)色譜柱實(shí)施清洗。

3.3 合理的選用適宜的測(cè)定波長(zhǎng)

測(cè)定對(duì)乙酰胺基酚紫外吸收波長(zhǎng)后，根據(jù)測(cè)定的結(jié)果可以了解到，樣品溶液的峰值在275nm的時(shí)候，吸收率表現(xiàn)為最大。所以，本文在展開實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，選用的檢測(cè)波長(zhǎng)峰值為275nm，就依據(jù)該檢測(cè)波長(zhǎng)所檢測(cè)到的結(jié)果表明，基線處于較為穩(wěn)定的狀態(tài)，不會(huì)對(duì)對(duì)乙酰氨基酚中的雜質(zhì)造成嚴(yán)重的影響。

參考文獻(xiàn)

[1] 田磊.HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方銀翹氨敏膠囊中維生素C及對(duì)乙酰氨基酚的含量[J].安徽醫(yī)藥.2010（09）.

[2] 冀愛芬，裴小勇，王紅燕，華麗云，張勇.HPLC法測(cè)定復(fù)方對(duì)乙酰氨基酚片中三種成分的含量[J].中國(guó)藥師.2010（08）.

篇9

[關(guān)鍵詞] 含量測(cè)定；高效液相色譜法

中圖分類號(hào)：O657 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2055-5200（2014）01-069-03

Doi：10.11876/mimt201401018

HPLC Determination of Content of Isoquinoline H-4 and its Related Substances

XU Chao1.2， YANG Jian-yun2，XIAO Bing-kun2，HUANG Rong-qing2

（1.Jiangxi university of TCM，Nanchang 330004；2.Academy of military medicine science，Peking 100850）

[Abstract] Objective： To establish a method for the determination of the content of H-4 and its related substances. Methods：RP-HPLC method was established. Column： Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 （250mm×4.6mm，5μm）；Mobile phase： water-methanol， Linear gradient elution， at a flow rate of 1mL/min with a diode array detector set at 236 nm； the temperature of column is 40℃.Results： Good linearity of the H-4 curve range of 20μg/mL～400μg/mL （r=0.9990）.The limited of detection is 0.8ng.Conclusion： The method is simple， rapid， sensitive and convenient which can be used to control the quality of H-4.

[Key words] Determination of content； HPLC

1 概述

近年來(lái)，環(huán)境污染、快節(jié)奏的生活規(guī)律已讓癌癥的發(fā)病率越來(lái)越高，目前已成為世界性的難題。臨床上治療癌癥的方法有化療、放療、手術(shù)，免疫療法和其他方法 [1]。H-4是新型研發(fā)的異喹啉抗腫瘤藥物，為組蛋白去乙酰化酶抑制劑，能引起細(xì)胞周期阻斷和細(xì)胞凋亡基因的激活，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[2]。本文采用高效液相色譜法對(duì)H-4及其在合成中產(chǎn)生的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，該法靈敏度、精密度和重現(xiàn)性均能滿足要求，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

2 儀器與試劑

Waters高效液相色譜儀（waters2695泵，2 9 9 6型二極管陣列檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器，EMPOWER數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）；BP211D型電子天平（德國(guó)SARTORIUS）；甲醇、乙腈為色譜純（FISHER生產(chǎn)商），水為純凈水（娃哈哈有限公司）；H-4對(duì)照品（純度99.6%），原料藥（批號(hào)20120715，20120716，20120717）均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所提供。

3 實(shí)驗(yàn)部分

3.1 對(duì)照品溶液的制備

取對(duì)照品H-4 12mg，精密稱量，置100mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻即得對(duì)照品溶液。

3.2 供試品溶液的制備

取供試品12mg，精密稱量，置100mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻即得供試品溶液。

3.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱：流動(dòng)相為甲醇-水，線性梯度洗脫（0-25min 35%甲醇75%甲醇，25-45min 75%甲醇，45-50min 75%甲醇35%甲醇），檢測(cè)波長(zhǎng)為236nm；流速1.0mL/min；柱溫40℃，進(jìn)樣體積20μL。在該色譜條件下，理論塔板數(shù)大于10000，分離度大于1.5，色譜行為良好（如圖1）。

4 方法學(xué)考察

4.1 線性關(guān)系

取對(duì)照品約10mg，精密稱定，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。精密取對(duì)照品貯備液0.5 mL，1.0mL，2.0 mL，4.0 mL，5.0 mL，6.0mL，分別置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得一系列濃度的溶液。取上述溶液及貯備液20μL，按“3.3”色譜條件下分別進(jìn)樣兩次，記錄色譜圖。以對(duì)照品進(jìn)樣濃度（X，μg?mL-1）為橫坐標(biāo)，以對(duì)照品峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸分析，得線性方程：Y=109261X+899070，r=0.9990（n=7），結(jié)果表明H-4在 20μg/mL～400μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

4.2 檢測(cè)限與定量限的確定

以信噪比3：1時(shí)注入儀器的量為檢測(cè)限，以信噪比約為10：1時(shí)注入儀器的量為定量限。結(jié)果H-4的檢測(cè)限為0.8ng，定量限為3.2ng。

4.3 精密度試驗(yàn)

取3.1項(xiàng)下得對(duì)照品溶液，連續(xù)吸取6次，每次20μL，以峰面積計(jì)算其RSD為0.50%（n=6）。結(jié)果表明測(cè)定是儀器精密度良好。

4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

分別精密稱取樣品（批號(hào)20120717）9份，按3.2項(xiàng)下方法操作，配制成濃度為100μg/mL，120μg/mL，150μg/mL的低中高三個(gè)濃度，每個(gè)濃度溶液制備3份，按3.3色譜條件下測(cè)定H-4的含量，平均含量為99.4%，RSD為0.87%（n=9），表明該方法重復(fù)性良好。

4.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取4.4項(xiàng)下配制好的高、中、低3個(gè)濃度的供試品溶液，在0，4，8，12，24，48，72h分別進(jìn)樣20μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算高、中、低三個(gè)濃度的峰面積的RSD分別為1.45%、1.21%及0.93%。表明供試品溶液在室溫放置72h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

4.6 樣品含量測(cè)定

按3.1，3.2項(xiàng)下的方法分別制備對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別進(jìn)樣20μL，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品含量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表1，3批樣品H-4含量均在99.0%以上。

4.7 有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定

取3.2項(xiàng)下的供試品溶液1mL，精密量取，置100mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得自身對(duì)照溶液。以3.2項(xiàng)下配置的溶液為供試品溶液，按不加校正因子主成分自身對(duì)照法計(jì)算有關(guān)物質(zhì)的含量。結(jié)果表明，有關(guān)物質(zhì)均在1%以內(nèi)（見表1）。

5 討論

5.1 流動(dòng)相溶劑的優(yōu)化

流動(dòng)相是改善分離度的重要參數(shù)，分別考察甲醇―水、乙腈―水以及混合溶劑（甲醇乙腈）―水三種流動(dòng)相對(duì)樣品的分離。試驗(yàn)表明乙腈―水系統(tǒng)主峰與有關(guān)物質(zhì)峰分離度小于1.5。而混合溶劑（甲醇乙腈）―水則表現(xiàn)出理論塔板數(shù)低的缺點(diǎn)。所以最終選擇甲醇―水系統(tǒng)。在該流動(dòng)相系統(tǒng)條件下能較好的改善峰型，且分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于10000。

5.2 波長(zhǎng)的選擇

H-4溶解在甲醇中最大吸收波長(zhǎng)為236nm，有關(guān)物質(zhì)也在此波長(zhǎng)處有較強(qiáng)吸收；且在此波長(zhǎng)處溶劑無(wú)干擾，故選擇236nm波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)。

5.3 色譜柱的考察

選擇了不同填料、規(guī)格及廠家的色譜柱進(jìn)行比較，包括Phenomenex LUNA C18 Column（250mm×4.6mm，5μm）、Diamonsil C18 Column（250mm×4.6mm，5μm）、 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 （250mm×4.6mm，5μm）。結(jié)果表明Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18最佳，所得色譜圖分離度良好，柱效高，而且相對(duì)于其他兩類色譜柱，保留時(shí)間也有一定的提前。

6 結(jié)論

綜上所述，該法靈敏度高，重復(fù)性好，專屬性強(qiáng)，可為H-4樣品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供可靠的依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

篇10

[關(guān)鍵詞]小兒氨酚黃那敏顆粒；對(duì)乙酰氨基酚；高效液相色譜法；含量測(cè)定

中圖分類號(hào)：TM459 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-914X（2016）10-0343-01

小兒氨酚黃那敏顆粒是一種臨床比較常用的復(fù)方制劑，主要適用于緩解兒童普通感冒及流行性感冒所引起的發(fā)熱、頭痛以及打噴嚏、流鼻涕等癥狀，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)小兒感冒藥中乙酰氨基酚的含量測(cè)定存在一定的局限性，因而采取高效液相色譜法對(duì)小兒氨酚黃那敏顆粒中乙酰氨基酚進(jìn)行含量測(cè)定，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，并取得了較好的測(cè)定效果。

1 測(cè)定實(shí)驗(yàn)中儀器與試藥

在高效液相色譜法測(cè)定小兒感冒藥中乙酰氨基酚含量的實(shí)驗(yàn)中，選用國(guó)外先進(jìn)的高效液相色譜儀和二級(jí)管陣列檢測(cè)器作為乙酰氨基酚含量測(cè)定的專用設(shè)備，確保這兩種設(shè)備的實(shí)際性能滿足實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)。先用專業(yè)化的超聲波清洗器和電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，確保乙酰氨基酚含量測(cè)定的精準(zhǔn)性和可靠性，與此同時(shí)，選用國(guó)外先進(jìn)的紫外分光光度計(jì)，以促進(jìn)含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。

在試藥方面，選用乙酰氨基酚的對(duì)照品，確保其質(zhì)量和規(guī)格滿足國(guó)家藥品生物制品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，與此同時(shí)進(jìn)行甲醇、娃哈哈純凈水的配備。所選用的小兒氨酚黃那敏顆粒均購(gòu)自于不同的廠家，其中每袋內(nèi)乙酰氨基酚以及人工牛黃等的含量具有一定的一致性。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1明確色譜條件。在高校液相色譜法對(duì)小兒氨酚黃那敏顆粒中乙酰氨基酚的含量進(jìn)行測(cè)定的實(shí)驗(yàn)操作中，對(duì)色譜條件以及流動(dòng)相進(jìn)行明確，流動(dòng)相為甲醇-水，并將實(shí)際流速和進(jìn)樣量控制在合理范圍內(nèi)，對(duì)實(shí)驗(yàn)中的檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行明確，乙酰氨基酚對(duì)照品與樣品的色譜圖分別建圖1。

2.2對(duì)照品溶液的制備操作。在本實(shí)驗(yàn)中，精密稱取標(biāo)準(zhǔn)溫度條件下干燥至標(biāo)準(zhǔn)重量的乙酰氨基酚的對(duì)照品適量，置于容量瓶?jī)?nèi)，并通過(guò)娃哈哈純凈水進(jìn)行稀釋，至刻度后進(jìn)行搖勻，即可能到標(biāo)準(zhǔn)的乙酰氨基酚對(duì)照品溶液。

2.3樣品溶液的制備操作。在本實(shí)驗(yàn)中，分別選取購(gòu)買自不同廠家的不同規(guī)格的小兒氨酚黃那敏顆粒數(shù)袋，經(jīng)研磨至標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)后，精密稱取適量并置于標(biāo)準(zhǔn)的容量瓶?jī)?nèi)，加哇哈哈純凈水進(jìn)行稀釋，稀釋至刻度后可采用專業(yè)的濾膜進(jìn)行過(guò)濾，留作備用。

2.4對(duì)實(shí)驗(yàn)中的線性關(guān)系進(jìn)行測(cè)定和明確。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，分別稱取對(duì)照品溶液適量，加入50ml容量瓶?jī)?nèi)進(jìn)行定容操作，并對(duì)定容后的濃度進(jìn)行準(zhǔn)確的記錄，從而得出色譜流出曲線。在此基礎(chǔ)上，以乙酰氨基酚濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)化的線性回歸方程，線性回歸顯示，乙酰氨基酚濃度范圍與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.5對(duì)實(shí)際精密度進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)定。在本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)同一種對(duì)招聘溶液進(jìn)行重復(fù)進(jìn)樣操作，并對(duì)每次進(jìn)樣的對(duì)照品溶液的量進(jìn)行合理的控制，可以發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中儀器具有良好的精密度。

2.6進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)操作。在本實(shí)驗(yàn)中，按照色譜條件，對(duì)藥品供試品溶液進(jìn)行重復(fù)進(jìn)樣，并對(duì)各種藥品溶液中的乙酰氨基酚色譜峰峰面面積進(jìn)行明確，實(shí)驗(yàn)表明高效液相色譜法具有良好的重復(fù)性和應(yīng)用性。

2.7對(duì)穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，嚴(yán)格按照色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣操作，并對(duì)峰面積進(jìn)行準(zhǔn)確的記錄，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)中樣品溶液在5小時(shí)之內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

2.8對(duì)加標(biāo)回收率進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)定。在實(shí)驗(yàn)中，選取同一批的含量已定的小兒氨酚黃那敏顆粒樣品適量，分別加入對(duì)乙酰氨基酚適量，在高效液相色譜法測(cè)定條件下進(jìn)行測(cè)定，可以明確乙酰氨基酚的總平均回收率，詳情見表1。

2.9對(duì)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確可靠地測(cè)定。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，選取處理好的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液適量，按照高效液相色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并嚴(yán)格按照外標(biāo)法對(duì)乙酰氨基酚含量進(jìn)行計(jì)算，實(shí)際樣品含量均在80%以上。

3 討論

3.1溶劑的選取。實(shí)驗(yàn)研究顯示，以流動(dòng)相和純凈水分別作為溶劑對(duì)乙酰氨基酚含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)并不存在明顯差異，因而在高效液相色譜法對(duì)小兒感冒藥中乙酰氨基酚含量進(jìn)行測(cè)定時(shí)，可以選用廉價(jià)易得的純凈水作為溶劑，來(lái)對(duì)式樣樣品進(jìn)行溶解操作。

3.2對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行選取。相關(guān)資料研究顯示，高效液相色譜法進(jìn)行乙酰氨基酚含量測(cè)定的過(guò)程中，流動(dòng)相對(duì)位甲醇、三乙胺溶液、磷酸溶液等。而在本實(shí)驗(yàn)中，主要采用甲醇：水（40：60）作為流動(dòng)相，實(shí)際操作具有一定的便捷性和可靠性，操作簡(jiǎn)單且出峰時(shí)間較快。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行觀察和分析可以發(fā)現(xiàn)，甲醇：水（40：60）作為流動(dòng)相時(shí)，實(shí)際分離度較高且峰形對(duì)稱，試驗(yàn)后色譜柱的沖洗也比較簡(jiǎn)便，具有良好的適用性。

3.3測(cè)定波長(zhǎng)的選擇。對(duì)對(duì)乙酰氨基酚紫外吸收波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示樣品溶液在275 nm處有最大吸收。因此本實(shí)驗(yàn)選擇275 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。此時(shí)檢測(cè)基線穩(wěn)定，對(duì)乙酰氨基酚前后雜質(zhì)干擾小。

3.4高效液相色譜法，又稱“高壓液相色譜”、“近代柱色譜”等。高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)。

高效液相色譜法分析速度快、載液流速快，分離效能高?？蛇x擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。應(yīng)用范圍廣，百分之七十以上的有機(jī)化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢(shì)。

高效液相色譜還有色譜柱可反復(fù)使用、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點(diǎn)，但也有缺點(diǎn)，與氣相色譜相比各有所長(zhǎng)，相互補(bǔ)充。高效液相色譜的缺點(diǎn)是有“柱外效應(yīng)”。在從進(jìn)樣到檢測(cè)器之間，除了柱子以外的任何死空間中，如果流動(dòng)相的流型有變化，被分離物質(zhì)的任何擴(kuò)散和滯留都會(huì)顯著地導(dǎo)致色譜峰的加寬，柱效率降低。高效液相色譜檢測(cè)器的靈敏度不及氣相色譜。

參考文獻(xiàn)

[1] 閆海燕-高效液相色譜法測(cè)定小兒氨酚黃那敏顆粒中對(duì)乙酰氨基酚的含量《安徽醫(yī)藥》，2011.