導(dǎo)語(yǔ)：如何才能寫(xiě)好一篇免疫學(xué)分析法，這就需要搜集整理更多的資料和文獻(xiàn)，歡迎閱讀由公務(wù)員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

化學(xué)發(fā)光免疫分析包括三大類(lèi)型: 即標(biāo)記化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的化學(xué)發(fā)光免疫分析、 標(biāo)記熒光物質(zhì)的熒光化學(xué)發(fā)光免疫分析和標(biāo)記酶的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)可測(cè)定內(nèi)分泌激素、 腫瘤標(biāo)志物、 血藥濃度、 傳染病和心血管疾病標(biāo)志物、 貧血及過(guò)敏原等項(xiàng)目［1］。目前對(duì)運(yùn)動(dòng)員血清睪酮的檢測(cè)， 大多采用放射免疫法， 由于其自動(dòng)化程度低， 不適用于快速檢測(cè)， 又有放射污染。美國(guó)Beckman．Coulter公司和法國(guó)Pasture研究院合作生產(chǎn)的Access全自動(dòng)微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析儀， 其方法學(xué)具有高靈敏性、 高精確性、 高穩(wěn)定性等特點(diǎn)， 無(wú)需對(duì)樣本進(jìn)行測(cè)前處理， 簡(jiǎn)便的自動(dòng)化操作， 全程僅需15～20 min， 且無(wú)放射污染。本室引進(jìn)Access免疫分析系統(tǒng)對(duì)運(yùn)動(dòng)員血清T進(jìn)行定量測(cè)定， 現(xiàn)對(duì)該方法的臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)如下。

1 材料和方法

1.1 檢測(cè)對(duì)象 無(wú)錫市體育管理中心運(yùn)動(dòng)員122人， 年齡≥15歲， 其中男64人， 女58人。對(duì)照組為來(lái)我院正常體檢的中學(xué)生， 男、 女各30人。采運(yùn)動(dòng)員清晨靜脈血2 mL， 分離血清后進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 材料 血清睪酮的檢測(cè)采用Access磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)。Access免疫分析系統(tǒng)及配套的T試劑盒， 沖洗緩沖液， 堿性液， 酸性液， 定標(biāo)液， 基質(zhì)液(Substrste)， 反應(yīng)杯(RV管)由BeckmanCoulter公司提供。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別取0、 1.7、 5.2、 13.9、 27.8、 55.5 nmol/L T標(biāo)準(zhǔn)液， 在Access免疫分析系統(tǒng)中執(zhí)行自動(dòng)定標(biāo)程序。以2次測(cè)定結(jié)果的均值， 進(jìn)行數(shù)學(xué)邏輯處理， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 兩組間數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 精密度測(cè)試 取低、 中、 高值的混合血清分別重復(fù)測(cè)定20次， 計(jì)算變異系數(shù)CV， 反映批內(nèi)精密度。每天對(duì)不同濃度的質(zhì)控血清測(cè)定1次， 連續(xù)20 d， 評(píng)價(jià)批間精密度。低、 中、 高值批內(nèi)CV分別為4.1、 2.7、 1.6; 批間CV 分別為4.4、 3.2、 2.6。

2.2 血清睪酮檢測(cè)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)分析 運(yùn)動(dòng)員血清睪酮檢測(cè)結(jié)果顯示， 男女運(yùn)動(dòng)員與各自相同性別正常人對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 表1 運(yùn)動(dòng)員血清睪酮檢測(cè)

3 討論

Access免疫分析通過(guò)在RV管中加入包被單克隆抗體的磁性微粒、 血清樣品、 堿性磷酸酶(ALP)標(biāo)記的抗原， 經(jīng)37℃孵育后， 形成競(jìng)爭(zhēng)法抗原抗體結(jié)合成的復(fù)合物。再加入底物 AMPDD(一種金剛基二螺［4， 4］二氧乙烷的磷酸脂)發(fā)光劑。AMPDD經(jīng)ALP水解， 生成一種不穩(wěn)定的陰離子， 該陰離子分解時(shí)持續(xù)發(fā)光， 且與ALP量成正比， 通過(guò)測(cè)定相對(duì)發(fā)光單位(relative light unit， RLU)定量檢測(cè)血清中物質(zhì)的濃度［2］。

對(duì)運(yùn)動(dòng)員血清T檢測(cè)結(jié)果表明， CV％值較小， 說(shuō)明儀器重復(fù)性較好， 測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。 T的測(cè)定濃度范圍在0～55.5 nmol/L之間， 能夠滿足運(yùn)動(dòng)員正常測(cè)試的需要。自動(dòng)化的Access免疫分析系統(tǒng)， 既具有化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的高靈敏度， 又具有免疫分析的高特異性， 準(zhǔn)確性、 穩(wěn)定性， 能夠快速及時(shí)的為運(yùn)動(dòng)員訓(xùn)練監(jiān)控提供可靠的依據(jù)。另外， 它是用化學(xué)試劑來(lái)標(biāo)記抗原或抗體， 避免了因使用放射性核素而帶來(lái)的對(duì)人體和環(huán)境的危害。

但由于試劑成本的原因， Access免疫分析系統(tǒng)仍未廣泛應(yīng)用于臨床。隨著臨床需求的進(jìn)一步擴(kuò)展， 高靈敏度、 寬線性Access免疫分析系統(tǒng)的將得到廣泛應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

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[關(guān)鍵詞]梅毒；血清學(xué)檢驗(yàn)；CMIA；GICA

流行病學(xué)調(diào)查顯示梅毒是我國(guó)二類(lèi)傳染病報(bào)告中排名第三的傳染性疾病，梅毒螺旋體是梅毒的病原體。性傳播是梅毒的主要傳播途徑，占所有傳播途徑的95%，大量存在于皮膚黏膜損害表面，也見(jiàn)于唾液、乳汁、、尿液中。未經(jīng)治療的病人在感染1年內(nèi)最具傳染性，隨病期延長(zhǎng)，傳染性越來(lái)越小，病期超過(guò)4年者，通過(guò)性接觸無(wú)傳染性。目前，對(duì)于梅毒的診斷主要依據(jù)病史、臨床癥狀和血清學(xué)診斷聯(lián)合判斷，該方法耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜，給梅毒的診斷和治療帶來(lái)極大的不便。目前，梅毒的血清學(xué)檢測(cè)主要是由TPPA、ELISA和TRUST等檢測(cè)方法。TPPA是目前臨床公認(rèn)的梅毒檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)，然而該方法操作繁瑣且依賴肉眼判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)檢測(cè)者的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)有較高的要求。ELISA和TRUST法各有優(yōu)劣但均無(wú)法替代TPPA。CMIA是一種新型的TP抗體檢測(cè)試驗(yàn)，有報(bào)道稱(chēng)其具有良好的準(zhǔn)確性和特異性。GICA是在酶聯(lián)免疫吸附、單克隆抗體技術(shù)、乳膠凝集試驗(yàn)和膠體金技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展出的新技術(shù)，具有靈敏、方便等優(yōu)勢(shì)。因此，本研究擬探討CMIA和GICA的優(yōu)劣，為改善梅毒的診斷提供數(shù)據(jù)支持。

1.材料與方法

1.1材料

收集我院2014年1月至2015年1月皮膚與性病科送檢血清樣本1500例，其中男性1047例，女性453例，年齡16～89歲，平均（36.8±8.2）歲。排除：（1）已接受抗梅毒治療、免疫治療患者；（2）拒絕入組患者。本研究已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑

采用美國(guó)貝克曼公司設(shè)計(jì)生產(chǎn)的全自動(dòng)微粒子化學(xué)發(fā)光儀DxI-800及其配套試劑、定標(biāo)液和質(zhì)控品（批號(hào)：224751）。TPPA和GICA試劑盒、酶標(biāo)儀和指示板由美國(guó)羅氏公司提供（批號(hào)：20140510）。

1.3方法

空腹采血3mL，離心得到血清后分別采用TPPA、GICA、CMIA法進(jìn)行檢測(cè)，操作嚴(yán)格依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。GICA法使用TPl5、TPl7、TP44.5和TP47的金顆粒分別加入陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照及樣品中，反應(yīng)0.5h后清洗并在全自動(dòng)微粒子化學(xué)發(fā)光儀中進(jìn)行檢測(cè)，記錄各孔的發(fā)光強(qiáng)度。CMIA法從測(cè)試到結(jié)果判讀均由儀器全自動(dòng)完成，以S/CO>1.0為梅毒檢驗(yàn)陽(yáng)性。TPPA以反應(yīng)孔中細(xì)胞沉積在孔中央呈光滑紐扣狀為陰性，反應(yīng)孔出現(xiàn)凝集呈不規(guī)則沉積為陽(yáng)性。當(dāng)?shù)味取?：80時(shí)判讀為陽(yáng)性，對(duì)于弱陽(yáng)性標(biāo)本需重復(fù)測(cè)定2次，復(fù)檢2次全為陰性時(shí)判讀為陰性，否則結(jié)果判讀為陽(yáng)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0軟件分析，檢測(cè)結(jié)果采用配對(duì)四格表計(jì)算敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值，兩種方法間比較采用X2檢驗(yàn)。

2.結(jié)果

采用TPPA檢測(cè)法對(duì)1500例血液樣本進(jìn)行梅毒檢測(cè)，檢出陽(yáng)性樣本182例、陰性樣本1318例，陽(yáng)性率12.1%。

2.1兩種方法檢測(cè)結(jié)果比較

在陽(yáng)性樣本中CMIA法檢測(cè)結(jié)果優(yōu)于GICA法（P0.05）。見(jiàn)表1。

2.2兩種檢測(cè)方法實(shí)驗(yàn)特性比較

CMIA的靈敏性和陰性預(yù)測(cè)值優(yōu)于GICA法（P

3.討論

在梅毒螺旋體初次感染人體后會(huì)進(jìn)入潛伏期，潛伏期的梅毒感染臨床癥狀不顯著，診斷存在困難，而在進(jìn)入潛伏期2～4周后便會(huì)產(chǎn)生特異性的抗梅毒螺旋體抗體，因此針對(duì)這些抗體進(jìn)行檢測(cè)有助于梅毒的早期診斷和治療。同時(shí)，梅毒發(fā)病率的上升也對(duì)臨床輸血工作造成了嚴(yán)重的威脅。目前，國(guó)內(nèi)醫(yī)院或?qū)嶒?yàn)室主要使用非特異性梅毒螺旋體檢測(cè)方法進(jìn)行，檢測(cè)如性病研究實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)（VDRL）和快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片實(shí)驗(yàn)（RPR）等。

CMIA檢測(cè)梅毒的原理是將重組的梅毒螺旋體抗原（Tpnl5、17和47）包裹并與檢驗(yàn)稀釋液混合后加入樣本，若血樣中存在梅毒螺旋體抗體，則會(huì)結(jié)合在抗原包被粒子上，加入預(yù)觸發(fā)液和觸發(fā)液后，測(cè)的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)無(wú)的相對(duì)單位，進(jìn)而檢測(cè)梅毒螺旋體感染情況。張東梅等比較了CMIA法與TPPA法測(cè)定梅毒感染的效果證實(shí)，兩種檢測(cè)方法具有極高的一致性，但認(rèn)為在CMIA法S/CO值為1.0～4.0時(shí)需進(jìn)一步復(fù)檢。

GICA法是一種結(jié)合了色譜層析和免疫反應(yīng)兩種技術(shù)優(yōu)勢(shì)的體外診斷技術(shù)。通過(guò)高純度的梅毒螺旋體抗原高選擇性結(jié)合樣品中的抗體，并通過(guò)色譜層析的方式分離，僅需一次上樣不需要任何儀器設(shè)備輔助就能高效準(zhǔn)確的測(cè)定樣本中抗體含量。磁性微粒因?yàn)榫哂谐槾判砸虼朔蛛x簡(jiǎn)單且具有較大的單位表面積，因此反應(yīng)靈敏。張鵬比較了GICA和ELISA技術(shù)在梅毒檢測(cè)中的效果證實(shí)GICA與ELISA和TPPA檢測(cè)法結(jié)果差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但該方法操作更為簡(jiǎn)便。楊璐對(duì)GICA法進(jìn)行評(píng)估后認(rèn)為該檢測(cè)方法具有很高的靈敏度和特異性且簡(jiǎn)單易行，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

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【關(guān)鍵詞】化學(xué)發(fā)光免疫法；放射免疫法；AFP；分析性能；實(shí)驗(yàn)方法

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2014.01.672文章編號(hào)：1004-7484（2014）-01-0556-02

化學(xué)發(fā)光免疫分析是一種新型的標(biāo)記免疫分析技術(shù)，是繼放射免疫、酶免疫、熒光免疫分析等分析方法之后的新一代標(biāo)記免疫分析技術(shù)，是將免疫測(cè)定與化學(xué)發(fā)光相結(jié)合的新型技術(shù)。整個(gè)過(guò)程均在全封閉的反應(yīng)體系中進(jìn)行，且能夠全自動(dòng)操作，儀器具有反應(yīng)迅速，靈敏度高，檢測(cè)限低等優(yōu)點(diǎn)，總的來(lái)說(shuō)包括抗原抗體特異性結(jié)合與化學(xué)發(fā)光兩部分過(guò)程[1]。甲胎蛋白（AFP）是原是胚胎的肝細(xì)胞，嬰兒兩個(gè)月便逐漸消失，但近些年發(fā)現(xiàn)AFP在部分成人體內(nèi)出現(xiàn)，并發(fā)現(xiàn)它是原發(fā)性肝癌最靈敏，也是最特異的腫瘤標(biāo)志物。為了進(jìn)一步考察該儀器對(duì)AFP生物檢測(cè)限和AFP功能靈敏度的測(cè)量，我院參照IUPAC（國(guó)際純粹和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)）的規(guī)定評(píng)價(jià)方案，現(xiàn)將60例臨床送檢血清標(biāo)本的臨床資料進(jìn)行報(bào)道如下：

1材料與實(shí)驗(yàn)方法

1.1應(yīng)用材料與儀器檢測(cè)樣選用我院2013年1月至2013年3月的60例臨床送檢血清標(biāo)本。

儀器采用美國(guó)Bayer Centaur 240全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀，并配套相關(guān)檢測(cè)試液（包括標(biāo)記的抗原抗體、含磁性的固相顆粒、稀釋液、AFP清洗液、發(fā)光試劑等），均采用拜耳公司提供的試劑。放射免疫法采用上海產(chǎn)的γ計(jì)數(shù)儀（SN-682 型），并配套運(yùn)用 AFP 試劑盒（中國(guó)原子能科學(xué)研究所研制）。

1.2方法檢測(cè)時(shí)運(yùn)用AFP稀釋液作為空白樣品，取一新鮮的血清作為試樣，做重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，記錄每次檢測(cè)的濃度值和光強(qiáng)度值。核實(shí)兩者的精密度、靈敏度與檢出限等，數(shù)據(jù)處理采用線性回歸處理。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法根據(jù)SPSS13.0軟件對(duì)提供的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析，計(jì)量資料為t檢驗(yàn)，對(duì)所有統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（χ±s）的形式表示，運(yùn)用軟件進(jìn)行處理（檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)）作為統(tǒng)計(jì)學(xué)的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異。

2結(jié)果

2.1線性試驗(yàn)以AFP稀釋液作為空白試劑，再根據(jù)要求將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成不同濃度的溶液，放射免疫法取5ppb、10ppb、50ppb、200ppb、400ppb為標(biāo)準(zhǔn)濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，化學(xué)發(fā)光免疫法取5ppb、10ppb、50ppb、200ppb、400ppb、800ppb為標(biāo)準(zhǔn)濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果兩組數(shù)據(jù)均有較好的線性關(guān)系。

2.2重復(fù)性試驗(yàn)取一新鮮的血清作為試樣，兩種方法均進(jìn)樣10次，查看兩者的重復(fù)性差別，兩組儀器均能滿足RSD

2.3相關(guān)性試驗(yàn)采用2.2中的方法用上述兩種檢測(cè)法對(duì)受檢血清標(biāo)本進(jìn)行適當(dāng)定量分析。結(jié)果顯示，兩種方法無(wú)顯著差異（P>0.05），且相關(guān)系數(shù)r=0.995，回歸方程為y=-1.059+0.921x，兩組方法所得數(shù)據(jù)的相關(guān)性良好。

2.4回收率試驗(yàn)取混合血清后，再加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)定值血清，用兩組方法分別對(duì)其進(jìn)行平均回歸率實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)得出，放射免疫法的回收率為91.2-108.1%，化學(xué)發(fā)光免疫法的回收率為92.0-107.8%。化學(xué)發(fā)光免疫法略優(yōu)于放射免疫法。

2.5檢出限以每次做的空白R(shí)LUs為基值，以該空白的RLUs值的3倍作為樣品中具有的AFP量，或稱(chēng)本法的檢測(cè)低限。分別對(duì)兩種方法進(jìn)行檢出限測(cè)量，得出化學(xué)發(fā)光免疫法的檢出限為0.95ppb，放射免疫法的檢出限為5ppb?；瘜W(xué)免疫法在檢出限上明顯優(yōu)于放射免疫法[2]。

2.6精密度試驗(yàn)取三個(gè)梯度濃度（分為低、中、高三個(gè)梯度）的試劑分別進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，并運(yùn)用兩種方法進(jìn)行整理對(duì)比，見(jiàn)表1。

3討論

化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)作為一種新型的分析技術(shù)，既具有運(yùn)用發(fā)光檢測(cè)時(shí)的高度敏感性，也同時(shí)具有免疫分析時(shí)的高度特異性。其原理為將激發(fā)態(tài)分子回到基態(tài)時(shí)所釋放而產(chǎn)生的發(fā)光現(xiàn)象，再運(yùn)用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)來(lái)為抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)做指示系統(tǒng)，從而進(jìn)行定量檢測(cè)抗原或抗體的濃度方法，是一種直接的運(yùn)用發(fā)光劑標(biāo)記抗體的免疫分析方法。由于運(yùn)用丫啶酯發(fā)光劑的優(yōu)點(diǎn)可以很好的減少非特異性干擾，反應(yīng)較為簡(jiǎn)單且迅速，反應(yīng)靈敏度高，據(jù)有關(guān)資料顯示，該發(fā)光劑也很穩(wěn)定（有效期可長(zhǎng)達(dá)1年以上）。

放射免疫法是目前臨床上較為常用的分析方法，其原理是放射性標(biāo)記的抗原和非標(biāo)記抗原全部同時(shí)與限量的特異性抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性可逆的結(jié)合反應(yīng)，反應(yīng)的靈敏度較低，標(biāo)記物的有效期也較短（一般只有1個(gè)月左右）。從工作人員角度來(lái)說(shuō)，也會(huì)對(duì)他們的身體健康帶來(lái)很多負(fù)面影響。從以上的結(jié)論可以看出，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差異，且相關(guān)性較好。但從檢出限、靈敏度、精密度等方面進(jìn)行比較，化學(xué)發(fā)光免疫法就明顯優(yōu)于放射免疫法，而且其試劑穩(wěn)定性高、毒性小，對(duì)環(huán)境無(wú)過(guò)大污染，方便、易操作且安全。

本實(shí)驗(yàn)采用的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀可以很好地對(duì)血清標(biāo)本進(jìn)行很好地采樣，處理和檢測(cè)，基本上能夠達(dá)到樣品隨到隨測(cè)，檢測(cè)迅速，很快可以得到檢測(cè)結(jié)果，大大縮短了檢測(cè)所用的時(shí)間，能滿足臨床上的檢驗(yàn)需求[3]。從上述數(shù)據(jù)可以確認(rèn)，該方法的檢測(cè)結(jié)果均可以達(dá)到臨床運(yùn)用水平，又基于其高度特異性、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)，值得臨床進(jìn)一步廣泛應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

[1]張紅祥.化學(xué)發(fā)光免疫法與放射免疫法檢測(cè)血清AFP臨床分析[J].中國(guó)現(xiàn)代藥學(xué)應(yīng)用，2010，4（7）：41-42.

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關(guān)鍵詞：甲狀腺疾病;化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù);應(yīng)用;效果

甲狀腺疾病為常見(jiàn)臨床疾病，常通過(guò)檢測(cè)患者甲狀腺球蛋白進(jìn)行診斷。傳統(tǒng)檢測(cè)方法為放射免疫技術(shù)、血凝法等，但檢測(cè)效果不甚理想?；瘜W(xué)發(fā)光免疫技術(shù)具有穩(wěn)定性高、靈敏度高和操作方便等優(yōu)點(diǎn)，標(biāo)本用量較少，且標(biāo)記物易得[1]。現(xiàn)搜集2013年7月―2014年7月我院接診的甲狀腺疾病45例、甲狀腺腫瘤45例、甲亢45例患者，對(duì)其化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的應(yīng)用效果進(jìn)行總結(jié)性分析，并將分析結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 將2013年7月―2014年7月我院接診的甲狀腺疾病45例患者作為甲組，平均年齡是（29.32±10.25）歲，男患者和女患者分別是23例、22例;將甲狀腺腫瘤45例患者作為乙組，平均年齡是（29.39±10.25）歲，男患者和女患者分別是24例、21例;將甲亢45例患者作為丙組，平均年齡是（29.48±10.22）歲，男患者和女患者分別是25例、20例;將同期正常體檢人群45例作為丁組，平均年齡是（30.07±1.12）歲，男性和女性分別是22例、23例。甲組、乙組、丙組和丁組的一般臨床資料相比，無(wú)明顯差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 方法 在受檢者空腹情況下采3ml血，抗凝劑選擇肝素鈉，通過(guò)放射免疫技術(shù)對(duì)血漿甲狀腺球蛋白進(jìn)行檢測(cè);后選擇化學(xué)發(fā)光免疫全自動(dòng)分析儀檢測(cè)。比較甲組、乙組、丙組和丁組假陰性、假陽(yáng)性和檢測(cè)濃度。對(duì)比不同檢測(cè)方法的符合率、特異性及靈敏度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 對(duì)本文所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行檢驗(yàn)，所得計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，所得計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 假陰性及假陽(yáng)性結(jié)果 與放射免疫技術(shù)相比，四組經(jīng)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)檢測(cè)假陰性及假陽(yáng)性率較低，有明顯差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。四組檢測(cè)結(jié)果比較情況見(jiàn)表一。

表一 四組假陰性及假陽(yáng)性結(jié)果對(duì)比

2.2 甲狀腺球蛋白檢測(cè)濃度 與放射免疫技術(shù)相比，經(jīng)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)檢測(cè)的甲狀腺球蛋白濃度較高，有明顯差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。四組不同檢測(cè)方法甲狀腺球蛋白濃度比較情況見(jiàn)表二。

表二 四組不同檢測(cè)方法甲狀腺球蛋白濃度對(duì)比

2.3 符合率、特異性及靈敏度 與放射免疫技術(shù)相比，四組化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)檢測(cè)符合率、特異性及靈敏度較高，有明顯差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。四組不同檢測(cè)方法符合率、特異性及靈敏度比較情況見(jiàn)表三。

表三 四組不同檢測(cè)方法符合率、特異性及靈敏度對(duì)比

3 討論

放射免疫技術(shù)假陰性率及假陽(yáng)性率較大，試劑有效期較短，且具有一定放射性，限制臨床應(yīng)用。該技術(shù)又分為發(fā)光反應(yīng)和免疫反應(yīng)，在抗原或抗體上標(biāo)記化學(xué)發(fā)光劑，將其與待測(cè)標(biāo)本抗體或抗原經(jīng)特異性反應(yīng)相互結(jié)合，產(chǎn)生復(fù)合物，通過(guò)磁場(chǎng)對(duì)結(jié)合態(tài)、游離態(tài)進(jìn)行分離，加入發(fā)光底物或氧化劑，促使物質(zhì)氧化，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)中間體，躍遷至基態(tài)，發(fā)射光子，經(jīng)發(fā)光強(qiáng)度檢測(cè)進(jìn)行定性檢測(cè)和定量檢測(cè)[2]。該技術(shù)主要適用于腫瘤標(biāo)志物分析、心臟疾病標(biāo)記物測(cè)定、激素分析等。甲狀腺疾病患者的甲狀腺功能主要依靠檢測(cè)甲狀腺球蛋白判斷，因此，必須加強(qiáng)對(duì)患者甲狀腺球蛋白的定量檢測(cè)[3]。在本文研究中，對(duì)甲組、乙組、丙組和丁組分別進(jìn)行放射免疫技術(shù)及化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)檢測(cè)，結(jié)果顯示，甲組經(jīng)放射免疫假陰性率為8.89%，經(jīng)化學(xué)發(fā)光免疫假陰性率為2.22%;乙組分別為11.11%、2.22%;丙組分別為6.67%、0%;丁組假陽(yáng)性率分別是4.44%、2.22%，表明化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)可有效檢測(cè)甲狀腺疾病，假陰性率及假陽(yáng)性率較低。甲組、乙組、丙組和丁組經(jīng)不同方法檢測(cè)甲狀腺球蛋白，化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)檢測(cè)濃度均高于放射免疫技術(shù)，表明化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)對(duì)有效檢測(cè)甲狀腺球蛋白具有重要作用?；瘜W(xué)發(fā)光免疫技術(shù)檢測(cè)符合率、特異性及靈敏度均高于放射免疫檢測(cè)，表明化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)具有較高的檢測(cè)特異性及靈敏度，符合率較高。

綜上認(rèn)為，化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)在臨床上應(yīng)用價(jià)值較大，能為臨床診斷甲狀腺疾病提供有力依據(jù)，應(yīng)予以推廣。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李曉霞.化學(xué)發(fā)光免疫分析[J].延安大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)科學(xué)版）.2012，16（17）：50-51.

篇5

【關(guān)鍵詞】 造血干細(xì)胞 CD117+細(xì)胞 免疫磁珠分離法 小鼠 近交BALBC

造血干細(xì)胞（HSCs）研究面臨的首要問(wèn)題是獲得大量純化的造血干細(xì)胞，并去除雜質(zhì)細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾[1，2]，近年在純化技術(shù)方面的研究不多，尤其是對(duì)小鼠的研究較少。CKit或干細(xì)胞因子受體SCFR（CD117）是小鼠HSCs的主要標(biāo)志[3]，2006年采用免疫磁珠分離法(MACS)分選骨髓造血干細(xì)胞亞群CD117，并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，希望為造血干細(xì)胞的純化和大量制備提供實(shí)驗(yàn)方法和理論支持。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/C小鼠，(20±1)g，雌雄隨機(jī)，10只/組，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

1.2 試劑和儀器

BSA購(gòu)自杭州四季青生物工程材料研究所，熒光標(biāo)記小鼠抗體CD117PE磁珠試劑盒、抗生物素磁珠、MiniMACS分離器及MS分離柱，均購(gòu)自Miltenyi Biotec公司，流式細(xì)胞儀(FACS Calibur)購(gòu)自BD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠骨髓細(xì)胞收集

頸椎脫臼處死小鼠，取小鼠股骨、脛骨，放在盛有緩沖液（含2 mmol/L EDTA，0.5%BSA的PBS）的平皿中，去除骨上的肌肉組織及骨膜，切除骨的兩末端，用1 ml注射器（帶4號(hào)針頭）插入股骨膝蓋端、脛骨骨端，用緩沖液反復(fù)沖洗骨腔，直至骨發(fā)白，所得細(xì)胞過(guò)200目濾網(wǎng)，1 500 r/min離心10 min，小心去除上清液，加入5 ml緩沖液混勻，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.2 MACs分離CD117細(xì)胞

1.3.2.1 小鼠系別細(xì)胞去除 用緩沖液按40 μl/107個(gè)細(xì)胞重懸小鼠骨髓細(xì)胞。加入生物素化抗體混合物10 μl/107個(gè)細(xì)胞，混勻，4～8 ℃孵育10 min。加入緩沖液30 μl/107個(gè)細(xì)胞，20 μl抗生物素微珠，混勻，4～8 ℃孵育15 min。加入5 ml緩沖液洗滌細(xì)胞，1 500 r/min離心10 min，完全去除上清液。

1.3.2.2 磁性標(biāo)記和分選CD117細(xì)胞 將分選后得到的細(xì)胞用緩沖液按80 μl/107個(gè)細(xì)胞重懸。加入CD117微珠20 μl/107個(gè)細(xì)胞，混勻，4～8 ℃孵育15 min，緩沖液1 ml/107個(gè)細(xì)胞洗滌細(xì)胞，1 500 r/min離心10 min，完全去除上清，用500 μl緩沖液重懸，所得細(xì)胞懸液加入MS分選柱中，收集先行流出的未標(biāo)記細(xì)胞組分，并用1 500 μl緩沖液沖洗MS柱，此為CD117陰性細(xì)胞。將分選柱移出磁場(chǎng)，1 ml緩沖液快速將分選柱上滯留的細(xì)胞洗脫下來(lái)，這些細(xì)胞是磁性標(biāo)記的CD117陽(yáng)性細(xì)胞。

1.3.3 流式細(xì)胞儀分析

將分選前的標(biāo)本、對(duì)照管、分選后陰性管標(biāo)本及分選后陽(yáng)性管標(biāo)本進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。在上述富集細(xì)胞管中加入100 μl緩沖液，10 μl CD117抗體混勻，4 ℃黑暗中孵育10 min，加入1 000 μl緩沖液1 500 r/min離心10 min，完全去除上清液，加入500 μl緩沖液混勻，送流式細(xì)胞分析，設(shè)陰性對(duì)照和空白對(duì)照。

1.3.4 細(xì)胞染色計(jì)數(shù)

0.4% 臺(tái)盼藍(lán)按9∶1（V∶V，細(xì)胞懸液量：染色液量）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。鏡下觀察，死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染。細(xì)胞活力的測(cè)定: 0.4% 臺(tái)盼藍(lán)染色1 min，計(jì)算活細(xì)胞率，活細(xì)胞率（%）=活細(xì)胞總數(shù)/（活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 11.1進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析，用配對(duì)樣品t檢驗(yàn)，P

2 結(jié)果

2.1 骨髓細(xì)胞的收集

從1只小鼠股骨、脛骨可收集5.25×107個(gè)骨髓細(xì)胞，細(xì)胞活力90%，2只小鼠股骨、脛骨可收集8.48×107個(gè)骨髓細(xì)胞，細(xì)胞活力92%。

2.2 MACS分選造血干細(xì)胞

1只小鼠股骨、脛骨可收集（1.1±0.3）×105個(gè)造血干細(xì)胞。

2.3 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果

免疫磁珠純化前CD117陽(yáng)性細(xì)胞純度為（41.56±18.77)% ，純化后CD117陽(yáng)性細(xì)胞純度為(88.68±4.74)%，純化前后有明顯差異（P

3 討論

骨髓內(nèi)主要有兩類(lèi)干細(xì)胞群體，即造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells， HSCs)和間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。HSCs是卵黃囊、胎肝和骨髓中比例極小的細(xì)胞群， 成年小鼠HSCs占整個(gè)骨髓細(xì)胞的0.01%～0.05% [4]，具有自我更新的能力， 能維持宿主終生造血功能和分化，生成血液中的各種成熟細(xì)胞[5]，獲取高度均一的HSCs是開(kāi)展細(xì)胞生物學(xué)特性等各項(xiàng)研究的基礎(chǔ)。

CD117干細(xì)胞因子受體是具有酪氨酸激酶活性的跨膜受體，廣泛分布于HSCs群中，60%～75%的CD34+造血干細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD117，其配體——干細(xì)胞因子(SCF，)在HSCs的生存和增埴、分化中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)CD34+CD117+比CD34+CD117-細(xì)胞具有更高的集落形成能力，而 CD117可高頻率表達(dá)于多能干細(xì)胞表面，對(duì)HSCs的分化具有重要作用，是小鼠HSCs的重要標(biāo)志[6]。CD117也存在于肥大細(xì)胞和急性髓樣白血病細(xì)胞表面[7]。

細(xì)胞分離或純化的目的是收獲高純度保持原有活性的單一細(xì)胞群，并最大限度地減少靶細(xì)胞的丟失。免疫磁珠是一種包被有單克隆抗體的磁性微粒， 它可特異性地與靶物質(zhì)(細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA 和細(xì)菌等) 結(jié)合， 使之具有磁順應(yīng)性， 繼而在外加磁場(chǎng)的作用下被滯留， 從而與其他成分分離， 達(dá)到富集純化的目的[8，9]。MACS 根據(jù)最終選留物質(zhì)的不同可分為陽(yáng)性選擇(留取與磁珠結(jié)合的陽(yáng)性物質(zhì)) 和陰性選擇(留取不與磁珠結(jié)合的陰性物質(zhì))。本實(shí)驗(yàn)采用免疫磁珠(MACS) 陽(yáng)性選擇法分選HSCs，從1只小鼠股骨、脛骨可收集（1.1±0.3）×105個(gè)HSCs，先進(jìn)行系別細(xì)胞去除的陰性分選，去除成熟造血細(xì)胞（T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、紅系細(xì)胞及其定向前體細(xì)胞），細(xì)胞與一系列生物素化的抗系別抗原抗體和抗生物素磁珠共同孵育，磁性標(biāo)記后去除系別細(xì)胞，這種標(biāo)記過(guò)程保留了系別標(biāo)志陰性的細(xì)胞，可根據(jù)CD117的表達(dá)對(duì)這些細(xì)胞做進(jìn)一步的磁珠陽(yáng)性分選。磁珠體積極小，不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械性壓力，孵育時(shí)間短，操作過(guò)程快，磁性抗體和磁性標(biāo)記物間的反應(yīng)可在幾分鐘內(nèi)完成，從復(fù)雜的細(xì)胞混合物中分離出很高純度的細(xì)胞。

根據(jù)HSCs表達(dá)或不表達(dá)某些細(xì)胞表面分子，采用相應(yīng)的熒光素標(biāo)記抗體進(jìn)行免疫染色，根據(jù)陽(yáng)性、陰性選擇原理，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選獲得具有某些細(xì)胞表面特征的細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞儀分析計(jì)數(shù)，免疫磁珠純化前小鼠骨髓CD117陽(yáng)性細(xì)胞為(41.56±18.77)%，經(jīng)免疫磁珠純化后CD117陽(yáng)性細(xì)胞百分比為(88.68±4.74)%，表明MACS是一種安全、有效并實(shí)用的分選HSCs CD117的方法，省時(shí)、簡(jiǎn)便、純度高。

參考文獻(xiàn)

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篇6

關(guān)鍵詞 石英毛細(xì)管； 甲胎蛋白； 免疫分析； 灰度分析

1 引 言

隨著我國(guó)醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的快速發(fā)展和人們對(duì)健康保健的日益重視， 社會(huì)對(duì)實(shí)用性的檢測(cè)技術(shù)需求越來(lái)越多， 體外診斷的新方法、新技術(shù)已成為生物分析檢測(cè)的熱點(diǎn)和重點(diǎn)研發(fā)方向。目前， 低成本、操作簡(jiǎn)便、小型化的體外診斷方法和裝備的研究正受到科研機(jī)構(gòu)和醫(yī)療檢測(cè)市場(chǎng)的廣泛關(guān)注。

現(xiàn)有的體外診斷產(chǎn)品中， 免疫檢測(cè)類(lèi)產(chǎn)品占比很大， 主要采用酶聯(lián)免疫吸附法、化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)發(fā)光法、放射免疫法以及膠體金免疫層析法[1～3]。前兩者以微孔板為檢測(cè)載體， 技術(shù)較成熟， 但檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)， 一般需要2～3 h； 電化學(xué)發(fā)光法主要基于磁珠捕獲抗原進(jìn)行檢測(cè)， 檢測(cè)速度快， 一般可在30 min內(nèi)完成， 但檢測(cè)成本較高， 約為酶聯(lián)免疫吸附法的3～4倍； 放射性免疫檢測(cè)靈敏度高， 但對(duì)操作環(huán)境及操作人員要求很高； 膠體金免疫層析檢測(cè)速度快， 可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)， 但難以實(shí)現(xiàn)定量分析。近年來(lái)， 一些學(xué)者報(bào)道了基于納米材料及微流控技術(shù)的新型體外免疫診斷方法， 但納米材料的制備較難控制其穩(wěn)定性， 真正實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用的并不多見(jiàn)[4，5]。本課題組多年從事毛細(xì)管電泳生物醫(yī)藥分析研究， 所用的分離載體是熔融石英毛細(xì)管， 其性質(zhì)穩(wěn)定， 透光性好， 表面易進(jìn)行物理、化學(xué)修飾， 加工工藝成熟， 成本低廉[6～10]。本實(shí)驗(yàn)將熔融石英毛細(xì)管用于免疫檢測(cè)的載體材料， 研究基于灰度值分析的血清中甲胎蛋白的免疫檢測(cè)方法， 目的是實(shí)現(xiàn)基于石英毛細(xì)管材料和灰度分析的定量免疫檢測(cè)。傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)器大多采用光電倍增管， 檢測(cè)區(qū)域有限， 分析速度慢， 而以電感耦合器件（CCD）為代表的圖像傳感器則可以提供更加廣泛的檢測(cè)區(qū)域， 具有光電轉(zhuǎn)換效率高、動(dòng)態(tài)線性范圍寬、多通道同時(shí)分析等優(yōu)點(diǎn)， 成為未來(lái)生物傳感器的一個(gè)發(fā)展方向[11，12]。實(shí)驗(yàn)中使用的便攜式化學(xué)發(fā)光成像儀采用制冷CCD， 靈敏度高， 體積小， 僅有0.006 m3， 能夠高效捕獲化學(xué)發(fā)光信號(hào)， 形成圖片?；叶仁侵负诎讏D像中點(diǎn)的顏色深度， 灰度分析法具有結(jié)果直觀， 分析快速等優(yōu)點(diǎn)， 在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、圖像識(shí)別領(lǐng)域有廣泛的用途[13]， 很多體外診斷試劑的檢測(cè)應(yīng)用也采用灰度值分析方法[14]。

本研究以熔融石英毛細(xì)管為載體， 建立了基于灰度分析的免疫檢測(cè)方法。以腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白（AFP）為模型蛋白， 通過(guò)雙抗體夾心方式進(jìn)行檢測(cè)， 與抗體偶聯(lián)的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）催化化學(xué)發(fā)光底物液發(fā)光， 產(chǎn)生的光信號(hào)通過(guò)成像儀轉(zhuǎn)化為圖片[12，15，16]， 進(jìn)行灰度值分析。研究結(jié)果表明， 毛細(xì)管免疫檢測(cè)和灰度分析結(jié)合， 實(shí)際使用的樣本量?jī)H為0.8 μL， 而ELISA檢測(cè)一般需要50 μL， 因此本方法大幅降低了樣本使用量。檢測(cè)過(guò)程中僅需石英毛細(xì)管、醫(yī)用注射器等常用耗材， 操作簡(jiǎn)單， 不依賴大型儀器。所建方法具有普適性， 可用于基于化學(xué)發(fā)光免疫分析的生物標(biāo)志物的快速檢測(cè)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑：

便攜式化學(xué)發(fā)光成像儀（國(guó)家納米科學(xué)中心研制）； 熔融石英毛細(xì)管（北京華陽(yáng)利民儀器有限公司）； 醫(yī)用注射器（北京科龍生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司）； 表面活化劑（美國(guó)Anteo Technologies公司）； 磷酸鹽緩沖液（PBS）和小牛血清白蛋白（BSA）（德國(guó)Merck公司）； AFP捕獲抗體、AFP的HRP酶標(biāo)抗體及AFP標(biāo)準(zhǔn)液（北京科躍中楷生物技術(shù)有限公司）； 癌胚抗原（CEA）標(biāo)準(zhǔn)液、前列腺特異性抗原（PSA）標(biāo)準(zhǔn)液、糖類(lèi)抗原125（CA125）標(biāo)準(zhǔn)液及糖類(lèi)抗原199（CA199）標(biāo)準(zhǔn)液（北京沫之東生物技術(shù)有限公司）； 化學(xué)發(fā)光底物液（美國(guó)Millipore公司）； 實(shí)驗(yàn)用水由Millipore純水儀制備。

2.2 分析方法

2.2.1 實(shí)驗(yàn)操作步驟 實(shí)驗(yàn)步驟如圖1所示：（1）活化毛細(xì)管 將毛細(xì)管裁剪為10 cm長(zhǎng)， 使用醫(yī)用注射器將表面活化劑注入毛細(xì)管， 室溫靜置30 min， 對(duì)毛細(xì)管內(nèi)壁進(jìn)行活化后， 用水沖洗。（2）固定捕獲抗體及封閉 將AFP的捕獲抗體按照一定比例用PBS稀釋?zhuān)?將稀釋液注入毛細(xì)管內(nèi)部， 室溫靜置1 h后再用PBS清洗， 將含5% BSA的PBS溶液注入毛細(xì)管中， 室溫靜置30 min進(jìn)行封閉。（3）注入待測(cè)蛋白 將待測(cè)蛋白AFP溶液注入到毛細(xì)管， 室溫孵育30 min后用PBS清洗。（4）注入酶標(biāo)抗體及化學(xué)發(fā)光底物液 將稀釋為一定濃度的HRP酶標(biāo)抗體注入毛細(xì)管， 室溫孵育30 min， PBS沖洗后注入化學(xué)發(fā)光底物液。

2.2.2 成像分析 將化學(xué)發(fā)光信號(hào)轉(zhuǎn)化為圖片形式， 進(jìn)行成像灰度分析。毛細(xì)管置于成像儀中， 選擇一定的曝光時(shí)間， 檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)。毛細(xì)管中的化學(xué)發(fā)光底物在酶標(biāo)抗體上HRP酶的催化作用下產(chǎn)生的光信號(hào)轉(zhuǎn)化為圖片。圖片上的灰度值表示待測(cè)蛋白AFP抗原的濃度。通過(guò)ImageJ軟件分析圖片， Origin 8.0軟件處理數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 毛細(xì)管內(nèi)徑對(duì)檢測(cè)的影響

市售毛細(xì)管有多種內(nèi)徑， 考察了不同內(nèi)徑毛細(xì)管對(duì)檢測(cè)的影響。毛細(xì)管內(nèi)徑不同， 可提供抗體結(jié)合的位點(diǎn)面積不同。內(nèi)徑較小的毛細(xì)管， 可節(jié)省樣品， 但內(nèi)壁表面積較小， 可吸附的捕獲抗體的量較小， 因而后續(xù)可結(jié)合的抗原以及酶標(biāo)抗體也較少， 故化學(xué)發(fā)光信號(hào)較弱， 灰度低， 不利于靈敏檢測(cè)。較大內(nèi)徑的毛細(xì)管所提供的內(nèi)壁表面積大， 可吸附的捕獲抗體量增加， 可結(jié)合的抗原及酶標(biāo)抗體也增加， 化學(xué)發(fā)光信號(hào)增強(qiáng)?？疾炝?0， 75， 100， 150和200 μm內(nèi)徑的毛細(xì)管， 分別檢測(cè)相同濃度的AFP， 比較其灰度強(qiáng)度。結(jié)果表明， 灰度強(qiáng)度所指示的化學(xué)發(fā)光信號(hào)與AFP濃度呈正相關(guān)（圖2和圖3）?；叶日掌突叶葟?qiáng)度均顯示毛細(xì)管內(nèi)徑對(duì)AFP檢測(cè)有明顯影響。使用50 μm毛細(xì)管， 灰度強(qiáng)度較弱； 內(nèi)徑增加到75 μm， 灰度強(qiáng)度增大； 使用100 μm內(nèi)徑毛細(xì)管， 灰度較強(qiáng)且均勻； 當(dāng)內(nèi)徑大于100 μm時(shí)， 信號(hào)強(qiáng)度降低， 且在橫截面方向上信號(hào)分布不均。理論上， 大內(nèi)徑的毛細(xì)管可提供的內(nèi)壁表面積大， 可吸附的捕獲抗體量多， 可結(jié)合的抗原及酶標(biāo)抗體也多， 可使信號(hào)線性增強(qiáng)， 直至趨于飽和。然而由圖2可見(jiàn)， 150 μm內(nèi)徑時(shí)信號(hào)不均。 可能是由于與拍攝方向相切的內(nèi)壁上下沿區(qū)域光程較長(zhǎng)， 出現(xiàn)內(nèi)壁上下沿信號(hào)較強(qiáng)， 中部信號(hào)偏弱的現(xiàn)象?；叶刃盘?hào)不均勻不利于準(zhǔn)確分析， 且增加了各種試劑和樣品用量。因此， 實(shí)驗(yàn)選擇內(nèi)徑100 μm的毛細(xì)管。

3.2 免疫分析的條件優(yōu)化

3.2.1 捕獲抗體濃度 捕獲抗體在毛細(xì)管內(nèi)的固定效果很大程度上決定了檢測(cè)的靈敏度。通常捕獲抗體在毛細(xì)管內(nèi)壁的密度越高， 檢測(cè)靈敏度越高， 但過(guò)高濃度的捕獲抗體， 會(huì)造成過(guò)飽和， 浪費(fèi)抗體試劑。本實(shí)驗(yàn)中， 固定AFP濃度和酶標(biāo)抗體濃度， 對(duì)捕獲抗體濃度進(jìn)行優(yōu)化， 將所購(gòu)的捕獲抗體稀釋?zhuān)?稀釋倍數(shù)為25， 50， 100， 150， 200， 250和300倍， 比較檢測(cè)的灰度值。當(dāng)捕獲抗體的稀釋倍數(shù)為150， 200， 250和300倍時(shí)， 隨稀釋倍數(shù)增大， 溶液濃度降低， 灰度值即化學(xué)發(fā)光信號(hào)逐漸減小， 說(shuō)明溶液中的捕獲抗體濃度偏低， 固定到毛細(xì)管內(nèi)壁的捕獲抗體量較少， 不能充分結(jié)合抗原， 故化學(xué)發(fā)光值隨稀釋倍數(shù)增大而降低， 灰度值減??； 當(dāng)稀釋倍數(shù)為50和25倍時(shí)， 捕獲抗體的濃度因稀釋比例小而保持較高的水平， 但其化學(xué)發(fā)光信號(hào)卻與捕獲抗體稀釋100倍時(shí)相當(dāng)， 并未增強(qiáng)， 說(shuō)明當(dāng)捕獲抗體稀釋倍數(shù)為100時(shí)， 灰度值即化學(xué)發(fā)光信號(hào)趨于飽和， 增加濃度不再使抗體在毛細(xì)管內(nèi)壁的分布密度增加， 且當(dāng)稀釋倍數(shù)為100時(shí)， 結(jié)合到毛細(xì)管內(nèi)壁上的捕獲抗體能夠完全結(jié)合抗原。因此， 選擇稀釋100倍為捕獲抗體最佳的稀釋比例（圖4）。

3.2.2 酶標(biāo)抗體溶度

酶標(biāo)抗體的濃度也直接影響檢測(cè)結(jié)果。如果酶標(biāo)抗體濃度偏低， 不能與抗原充分結(jié)合， 就會(huì)造成實(shí)際檢測(cè)信號(hào)值偏低。如果酶標(biāo)抗體濃度偏高， 雖然反應(yīng)充分， 但是可能浪費(fèi)試劑。實(shí)驗(yàn)中， 固定捕獲抗體稀釋倍數(shù)和AFP抗原濃度， 對(duì)檢測(cè)抗體濃度進(jìn)行優(yōu)化。將所購(gòu)的酶標(biāo)抗體稀釋?zhuān)?稀釋倍數(shù)為100， 150， 200， 250， 300和350倍， 比較不同稀釋濃度的灰度值。結(jié)果表明， 酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)為250， 300， 350倍時(shí)， 隨稀釋比例增大， 酶標(biāo)抗體濃度降低， 灰度值即化學(xué)發(fā)光信號(hào)逐漸減小， 說(shuō)明酶標(biāo)抗體濃度偏低， 反應(yīng)不充分； 稀釋倍數(shù)為150和100倍時(shí)， 酶標(biāo)抗體濃度隨稀釋比例減小而增大， 但灰度值與稀釋倍數(shù)200時(shí)相比未見(jiàn)增加。說(shuō)明稀釋倍數(shù)為200時(shí)， 灰度值趨于飽和， 抗原抗體結(jié)合較為充分。因此， 酶標(biāo)抗體最佳的稀釋倍數(shù)為200倍。

3.2.3 孵育時(shí)間

孵育時(shí)間是免疫檢測(cè)的重要參數(shù)。如孵育時(shí)間過(guò)短， 反應(yīng)進(jìn)行不充分， 影響檢測(cè)的靈敏度。若孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)， 則耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)孵育時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。室溫下， 將AFP抗原及AFP酶標(biāo)抗體的孵育時(shí)間分別設(shè)定為5， 15， 30， 60和90 min， 比較灰度值變化。結(jié)果表明， 孵育15 min 的灰度值即化學(xué)發(fā)光信號(hào)比孵育5 min時(shí)明顯升高， 說(shuō)明5和15 min的孵育時(shí)間偏短， 反應(yīng)尚不充分； 孵育時(shí)間設(shè)為30， 60和90 min時(shí)， 灰度值沒(méi)有增加。說(shuō)明孵育時(shí)間為30 min時(shí)， 灰度值趨于飽和， 免疫反應(yīng)較為充分。因此， 選擇最佳孵育時(shí)間30 min（圖5）。

3.2.4 曝光時(shí)間優(yōu)化 曝光時(shí)間是化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)的重要參數(shù)。曝光時(shí)間過(guò)長(zhǎng)， 會(huì)造成高濃度AFP檢測(cè)信號(hào)過(guò)飽和； 曝光時(shí)間過(guò)短， 會(huì)造成低濃度AFP檢測(cè)信號(hào)微弱， 都不利于圖像分析， 因此有必要對(duì)曝光時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。固定捕獲抗體及酶標(biāo)抗體濃度， 對(duì)高濃度（100 ng/mL）和低濃度（3 ng/mL）的AFP分別進(jìn)行檢測(cè)， 曝光時(shí)間為5， 10， 15， 20 和25 s， 選擇同時(shí)滿足高濃度和低濃度AFP抗原檢測(cè)的合適曝光時(shí)間。當(dāng)曝光時(shí)間為15 s時(shí)， 3 ng/mL AFP抗原灰度值較弱， 無(wú)法進(jìn)行圖像分析， 增加曝光時(shí)間， 灰度值增加。當(dāng)曝光時(shí)間為25 s時(shí)， 100 ng/mL AFP抗原灰度值出現(xiàn)過(guò)飽和， 不利于分析。因此， 20 s為最佳曝光時(shí)間， 能夠滿足檢測(cè)需求。

3.3 灰度分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線

選擇3.1～50 ng/mL濃度范圍的AFP樣品溶液， 測(cè)定其灰度值。 灰度值Y與AFP濃度X的關(guān)系為：

Y=

42.9328+53.8242log（X1.5625 ng/mL）2

式中， X的單位為ng/mL。Y與X二者呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系（圖6）， R=0.992。稀釋AFP樣品， 通過(guò)灰度分析， 測(cè)定方法的檢出限為2.7 ng/mL。

在目前的臨床檢驗(yàn)中， 只有當(dāng)AFP濃度超過(guò)20 ng/mL時(shí)， 該結(jié)果才具有一定的臨床診斷意義[17，18]。本方法對(duì)AFP的檢測(cè)范圍在3.1～50 ng/mL之間， 為進(jìn)一步臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

3.4 檢測(cè)特異性

特異性是評(píng)價(jià)免疫檢測(cè)的重要指標(biāo)之一， 通常用交叉反應(yīng)率表示。實(shí)驗(yàn)中， 分別在血清加入中可能存在的干擾物CEA、 PSA、 CA125和CA199， 在最佳條件下測(cè)定。結(jié)果表明， 交叉反應(yīng)率均小于0.5%， 說(shuō)明上述潛在的干擾組分對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響小， 方法的檢測(cè)特異性好[19]， 抗干擾能力強(qiáng)。

3.5 檢測(cè)準(zhǔn)確性

評(píng)估體外診斷試劑準(zhǔn)確性的方法主要有方法學(xué)比對(duì)和回收實(shí)驗(yàn)兩種。方法學(xué)比對(duì)是將兩種不同的檢測(cè)體系所得結(jié)果進(jìn)行比較， 在臨床化學(xué)文獻(xiàn)報(bào)道中較為常見(jiàn)[20～22]。將本方法與目前大型醫(yī)院廣泛使用的Roche電化學(xué)發(fā)光方法進(jìn)行方法學(xué)比對(duì)。實(shí)際臨床樣本來(lái)源于總醫(yī)院， 使用采血管收集人全血， 在室溫中沉降30 min后， 3000 r/min離心5 min， 收集上層血清， 4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。獲取的20例血清樣本分別采用兩種方法進(jìn)行分析檢測(cè)， 結(jié)果見(jiàn)圖7。兩種方法的線性回歸方程為y=0.148+11095x， R=0.980， 說(shuō)明兩種方法的相關(guān)性良好， 本方法具有較高準(zhǔn)確性， 能夠滿足臨床檢測(cè)要求。通過(guò)回收實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)本方法的準(zhǔn)確性。選用3份人血清， 在最佳實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定其AFP濃度， 然后分別向血清中加入AFP標(biāo)準(zhǔn)液， 再次測(cè)定其AFP濃度。重復(fù)5次， 計(jì)算得回收率在96.0%～106.7%之間（表1）， 說(shuō)明本檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性較好[20]。

4 結(jié) 論

以熔融石英毛細(xì)管為免疫分析載體材料， 通過(guò)化學(xué)發(fā)光成像和灰度分析， 建立了血清甲胎蛋白的定量免疫分析檢測(cè)方法。本方法可在3.1～50 ng/mL 濃度范圍實(shí)現(xiàn)甲胎蛋白檢測(cè)， 覆蓋了臨床應(yīng)用的關(guān)鍵濃度， 為本方法的進(jìn)一步臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)?；诿?xì)管為載體的灰度分析免疫檢測(cè)方法的樣本消耗少、載體材料簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低廉， 且不依賴大型儀器， 適用化學(xué)發(fā)光免疫分析， 具有普適性和較好的臨床檢驗(yàn)應(yīng)用前景。

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篇7

【關(guān)鍵詞】血管緊張素Ⅰ 固相抗體法 放射免疫分析

1引言

采用固相抗體包被聚苯乙烯試管，并對(duì)抗體包被條件進(jìn)行了研究，建立了血管緊張素Ⅰ放射免疫分析法。結(jié)果表明在2―8℃下過(guò)夜包被，抗體滴度在1：9萬(wàn) 時(shí)，制備的包被管用于血管緊張素Ⅰ放射免疫分析，結(jié)合達(dá)到最大；不同滴度下包被，包被溫度和時(shí)間對(duì)制備的包被管的影響不同；不同的反應(yīng)時(shí)間以及125I―AI和標(biāo)準(zhǔn)品加樣量的不同也會(huì)對(duì)包被管的結(jié)合產(chǎn)生影響。血管緊張素Ⅰ包被管法放射免疫分析靈敏度為（42.2Pg/ml）；回收率為（90.3%―102.2%）；批內(nèi)、批間變異系數(shù)分別為（5.1%―9.0%）和（8.3%―10.2%）。

2實(shí)驗(yàn)材料

血管緊張素Ⅰ多克隆抗體由原子高科醫(yī)學(xué)二部提供；聚苯乙烯六角試管（mm×mm）為（哪個(gè)）塑料廠產(chǎn)品；125I―AI及AI藥盒標(biāo)準(zhǔn)品由原子高科醫(yī)學(xué)二部提供；蛋白G填料親合層析柱由美國(guó)進(jìn)口；牛血清白蛋白（BSA）為上海生物制品廠產(chǎn)品。對(duì)照藥盒由原子高科股份有限公司生產(chǎn)（國(guó)藥準(zhǔn)字：）。其他試劑均為分析純。

3實(shí)驗(yàn)方法

3.1兔IgG的純化

采用蛋白―G柱進(jìn)行親合層析純化，純化后IgG濃度由紫外分光光度法測(cè)定。

用包被緩沖液（0.1M PH9.5碳酸緩沖液）將兔IgG配制10μg /ml?；旌暇鶆蚝?50？L /管包被，然后放2―8℃過(guò)夜，棄去包被管中第一層包被液，各管用500？L洗滌液（0.02 mol/L，pH7.4磷酸緩沖液）清洗1次。待包被第二層（兔二抗）用。

3.2用驢抗兔二抗進(jìn)行第二層包被

用0.05 mol/L，pH7.4磷酸緩沖液（含1%BSA）將兔二抗配成合適的濃度后250？L /管包被，然后放2―8℃過(guò)夜，棄去包被管中第二層包被液，各管用500？L洗滌液（0.02 mol/L，pH7.4磷酸緩沖液）清洗1次。待包被第三層（兔一抗）用。

3.3不同滴度兔抗（一抗）包被實(shí)驗(yàn)

將兔抗用封閉液配制成1：2萬(wàn)，1：4萬(wàn)，1：6萬(wàn)，1：8萬(wàn)，1：9萬(wàn)，1：12萬(wàn)，1：14萬(wàn)，1：16萬(wàn)不同的滴度，分別加250？L于已經(jīng)包有兔二抗的包被管中，每個(gè)滴度做雙復(fù)管，之后在每管中加入100？L 125I―AI，然后放2―8℃靜置過(guò)夜；棄去管中溶液，各管用500？L洗滌液清洗3次后測(cè)量各管放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算其結(jié)合率，選擇合適的抗體滴度作為工作稀釋度。

3.4溫度，時(shí)間對(duì)抗體包被的影響

用封閉液將兔抗（一抗）稀釋成不同滴度（1：2萬(wàn)，1：4萬(wàn)， 1：8萬(wàn)，1：9萬(wàn)，1：12萬(wàn)，1：14萬(wàn)），分別在不同溫度和時(shí)間下包被，實(shí)驗(yàn)中抗體加入體積均為250？L，各管均加入100？L 125I―AI，將不同條件下制備的包被管進(jìn)行放射免疫結(jié)合分析，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較。

3.5抗體包被管的制備

每管加250？L兔IgG溶液（10μg /ml），2―8℃靜置過(guò)夜，棄溶液，各管加500？L洗滌液清洗1次后加入250？L驢抗兔二抗溶液，2―8℃靜置過(guò)夜，棄溶液，各管加500？L洗滌液清洗1次后加入250？L兔一抗溶液（1：9萬(wàn)），2―8℃過(guò)夜，棄溶液，各管加500？L洗滌液清洗1次，棄溶液，自然晾干，密閉，于2―8℃下保存。

3.6體系反應(yīng)時(shí)間，溫度的選擇

設(shè)計(jì)不同的反應(yīng)條件為37℃1h，37℃3h，4℃15h，4℃24h。

3.7加樣量的選擇

設(shè)計(jì)4組不同的加樣量為：第一組125I―AI加100？L，標(biāo)準(zhǔn)品加100？L；第二組：125I―AI加100？L，標(biāo)準(zhǔn)品加50？L；第三組125I―AI加50？L，標(biāo)準(zhǔn)品加100？L；第四組125I―AI加50？L，標(biāo)準(zhǔn)品加50？L。

3.8放射免疫分析程序

標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品、質(zhì)控血清）100？L和標(biāo)記物100？L加于包被管中，混勻，然后放2―8℃靜置過(guò)夜（15―24h），棄溶液，加500？L洗滌液清洗2―3次，測(cè)各管放射性計(jì)數(shù)。

3.9方法學(xué)考核

靈敏度：以20個(gè)零標(biāo)準(zhǔn)管的計(jì)數(shù)平均值―2S對(duì)應(yīng)的劑量值表示。準(zhǔn)確度：任取一份血漿標(biāo)本，測(cè)定基值后分別加入0pg/ml ，250pg/ml，625 pg/ml，1560 pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品，再次測(cè)定，計(jì)算回收率。精密度：測(cè)定批內(nèi)和批間變異系數(shù)（CV%）。健全性：將一份高濃度樣品稀釋成1：1、1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64分別測(cè)定其含量。經(jīng)回歸處理后成一條直線，y=1.000 x +0.4673，r=1.000。

4結(jié)果與討論

4.1不同滴度的兔抗（一抗）包被實(shí)驗(yàn)

不同滴度抗體包被實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表1，表1結(jié)果表明，當(dāng)抗體滴度為1：16萬(wàn)―1：8萬(wàn)時(shí)，隨著抗體滴度的減小，包被管的結(jié)合率逐步升高；當(dāng)抗體滴度為1：8萬(wàn)―1：2萬(wàn)時(shí)，包被管的結(jié)合率沒(méi)有出現(xiàn)明顯升高，基本保持同一水平。所以在不影響放免藥盒靈敏度的前提下，選擇1：9萬(wàn)作為抗體的工作稀釋度，用于包被。（該處可以作圖，不列表）

4.2包被時(shí)間，包被溫度對(duì)包被的影響

結(jié)果列于表2由表2可知，包被溫度和包被時(shí)間對(duì)包被管免疫結(jié)合的影響依賴于包被時(shí)加入抗體的濃度。當(dāng)加入抗體的滴度為1：2萬(wàn)和1：4萬(wàn)時(shí)，升高包被溫度使包被管的免疫結(jié)合增加，而延長(zhǎng)包被時(shí)間對(duì)包被管的免疫結(jié)合無(wú)顯著影響；當(dāng)加入抗體滴度為1：14萬(wàn)

和1：16萬(wàn)時(shí)，升高包被溫度包被管的免疫結(jié)合顯著減少，原因可能是抗體在低濃度時(shí)較不穩(wěn)定，包被過(guò)程中較高的溫度使抗體的活性損失；當(dāng)加入抗體滴度為1：8萬(wàn)和1：9萬(wàn)時(shí)，包被溫度對(duì)包被管的免疫結(jié)合影響減少，且包被時(shí)間從3h延長(zhǎng)到24h，包被管的免疫結(jié)合有所增加。此結(jié)果提示，在較高溫度下，采用較大抗體濃度，只需要較短的包被時(shí)間，即可獲得具有較高免疫結(jié)合的抗體包被管。但考慮到實(shí)際生產(chǎn)中低成本和包被工藝簡(jiǎn)便性的需要，在滿足免疫分析要求的前提下，選擇抗體滴度為1：9萬(wàn)，2―8℃過(guò)夜（15―24h）作為包被條件。

4.3體系反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度的選擇

結(jié)果列于表3，由表3可知，當(dāng)反應(yīng)溫度在37℃時(shí)，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間從1 h到3 h，免疫分析的最大結(jié)合S0%從46.4%增加到59.2%，但是標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高濃度點(diǎn)的抑制不好，分別為37℃1 h為16.1%；37℃3 h為14.6%，這可能是反應(yīng)不充分造成的。而反應(yīng)溫度在2―8℃時(shí)，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間從15―24h，免疫反應(yīng)的幾個(gè)指標(biāo)都比較好，同時(shí)也克服了37℃反應(yīng)曲線抑制不好的問(wèn)題，所以在考慮實(shí)際操作簡(jiǎn)便，節(jié)省時(shí)間的需要，在滿足免疫分析要求的前提下，選擇反應(yīng)條件為2―8℃過(guò)夜。

4.4加樣量對(duì)免疫分析的影響

結(jié)果列于表4由表4可知，當(dāng)加入標(biāo)記物的量都是50？L時(shí)，加入100？L標(biāo)準(zhǔn)品的包被管的免疫分析主要指標(biāo)最大結(jié)合S0%，曲線的抑制都好于加入50？L標(biāo)準(zhǔn)品的包被管免疫分析主要指標(biāo)，加50？L標(biāo)準(zhǔn)品的包被管的曲線抑制不好，標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度點(diǎn)的B/B0%為94.1%，最高濃度點(diǎn)的B/B0%為14.6%。但是考慮到加50？L標(biāo)記物的各管計(jì)數(shù)都比較低，還有計(jì)數(shù)器的效率等問(wèn)題，所以標(biāo)記物的加樣量就不采用50？L加樣。當(dāng)加入標(biāo)記物的量都是100？L時(shí)，加入100？L標(biāo)準(zhǔn)品的包被管的免疫分析主要指標(biāo)最大結(jié)合S0%，曲線的抑制都很好，并且各管的放射性計(jì)數(shù)也比較高，各種因素對(duì)測(cè)量的影響也相對(duì)較小。當(dāng)加入50？L標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線出現(xiàn)倒勾現(xiàn)象，曲線的最低濃度點(diǎn)B/B0%為101%，出現(xiàn)這種情況就是因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線的各包被管中加入 的非標(biāo)記抗原的量不夠造成的。所以通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)的比較，選擇比較合適的加樣量為標(biāo)記物加100？L，標(biāo)準(zhǔn)品加100？L。

4.6方法學(xué)鑒定

（1）靈敏度。以20個(gè)零標(biāo)準(zhǔn)管計(jì)數(shù)的平均值-2S對(duì)應(yīng)的劑量值表示，靈敏度為（42.2Pg /ml）pg/ml。

（2）準(zhǔn)確度 已知量的一份血漿樣品中分別加入4種不同劑量的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果列于表5。由表5可知本法回收率為90.3%―102.2%，說(shuō)明本法準(zhǔn)確性較好。

（3）精密度

采用本方法對(duì)3份含有不同濃度的人血漿樣品重復(fù)測(cè)定，計(jì)算批內(nèi)、批間變異系數(shù)，結(jié)果列于表6。由表6可知，批內(nèi)變異系數(shù)為（5.1%―9.0%）；批間變異系數(shù)為（8.3%―9.5%）。

（4）健全性（同質(zhì)性）。將一份較高濃度的血漿樣品倍比稀釋成1：1、1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64，測(cè)定結(jié)果列于表7。由表中數(shù)據(jù)計(jì)算其相關(guān)方程為：y=1.000 x +0.4673，r=1.000

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明研制的血管緊張素Ⅰ放射免疫分析法（固相抗體法）的健全性良好。

5結(jié)語(yǔ)

（1）采用 固相抗體 包被聚苯乙烯試管的包被條件為：選擇抗體滴度為1：9萬(wàn)，2―8℃過(guò)夜（15―24h）。在此條件下所得包被管用于血管緊張素Ⅰ放射免疫分析，可達(dá)到最大結(jié)合。

（2）用該包被管進(jìn)行血管緊張素Ⅰ放射免疫分析時(shí)，其靈敏度為（42.2Pg /ml）；回收率為（90.3%―102.2%）；批內(nèi)、批間變異系數(shù)分別為（5.1%―90%）和（8.3%―10.2%）。

參考文獻(xiàn)：

[1]燕強(qiáng)奮，賀佑豐，王衍真.固相抗體包被管法TSH免疫放射分析[J].同位素，2001（3）.

[2]翟士軍，杜曉慶，吳娜靜，蘇成海.B7-1單克隆抗體固相包被管的制備[J].放射免疫學(xué)雜志，2010（6）.

[3]呂玨.ACI患者血漿ET-1和t-PA、PAI-1水平的相關(guān)性分析[J]. 放射免疫學(xué)雜志，2010（6）.

篇8

[關(guān)鍵詞]　共詞分析　專(zhuān)利引文分析　知識(shí)關(guān)聯(lián)

[分類(lèi)號(hào)]　G255.53

1　科學(xué)―技術(shù)知識(shí)關(guān)聯(lián)的概念

“科學(xué)―技術(shù)知識(shí)關(guān)聯(lián)”是近年來(lái)專(zhuān)利計(jì)量學(xué)領(lǐng)域的重要研究?jī)?nèi)容之一，在Scientometrics、World PatentInformation等權(quán)威期刊的相關(guān)文獻(xiàn)中通常被表述為Science Technology Linkage、Science Technology Interac-tion、Science Dependence of Technology。研究科學(xué)一技術(shù)知識(shí)關(guān)聯(lián)的意義在于：通過(guò)揭示哪些基礎(chǔ)研究學(xué)科與哪些技術(shù)發(fā)明領(lǐng)域之間存在知識(shí)關(guān)聯(lián)，預(yù)見(jiàn)二者間可能的推動(dòng)或啟示作用，從而為國(guó)家創(chuàng)新體系的管理者提供科技資源配置方面的決策參考，以便目標(biāo)明確地扶持更具產(chǎn)出能力的基礎(chǔ)學(xué)科，發(fā)掘已具備基礎(chǔ)儲(chǔ)備的未來(lái)技術(shù)創(chuàng)新領(lǐng)域。

2　揭示科學(xué)一技術(shù)知識(shí)關(guān)聯(lián)的各種途徑和方法

目前，揭示科學(xué)一技術(shù)知識(shí)關(guān)聯(lián)的途徑多種多樣，不同學(xué)科都在為此作出各自的貢獻(xiàn)。

在科學(xué)社會(huì)學(xué)和技術(shù)社會(huì)學(xué)視野下，研究公共基礎(chǔ)研究機(jī)構(gòu)(公共科研院所、研究型大學(xué)、國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)與企業(yè)的合作研發(fā)活動(dòng)，是揭示科學(xué)一技術(shù)知識(shí)關(guān)聯(lián)的有效途徑。技術(shù)社會(huì)學(xué)認(rèn)為，公共基礎(chǔ)研究是技術(shù)變遷過(guò)程的基本要素，它通過(guò)提高社會(huì)整體創(chuàng)新水平間接推動(dòng)企業(yè)的開(kāi)發(fā)活動(dòng)。科學(xué)社會(huì)學(xué)的雙螺旋理論(Double Helix Model)認(rèn)為，科學(xué)與技術(shù)是一對(duì)舞者(a pair of dancer)的關(guān)系，二者在相互推動(dòng)下呈螺旋狀上升發(fā)展?；A(chǔ)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)之間的知識(shí)交互過(guò)程和合作活動(dòng)是實(shí)現(xiàn)技術(shù)突破的能量?jī)?chǔ)備過(guò)程，是實(shí)現(xiàn)技術(shù)躍遷的重要前提。文獻(xiàn)[1―3]通過(guò)統(tǒng)計(jì)大學(xué)及公共基礎(chǔ)研究機(jī)構(gòu)與企業(yè)的合作研發(fā)活動(dòng)，揭示了激光、分子生物學(xué)等領(lǐng)域的科學(xué)一技術(shù)知識(shí)關(guān)聯(lián)、知識(shí)擴(kuò)散和成果應(yīng)用情況。

在技術(shù)經(jīng)濟(jì)學(xué)視野下，挖掘基礎(chǔ)科研機(jī)構(gòu)和技術(shù)開(kāi)發(fā)機(jī)構(gòu)(各類(lèi)企業(yè))在地理空間分布上所表現(xiàn)出的關(guān)聯(lián)規(guī)則，是揭示科學(xué)一技術(shù)知識(shí)關(guān)聯(lián)的又一途徑。技術(shù)經(jīng)濟(jì)學(xué)認(rèn)為，區(qū)域經(jīng)濟(jì)管理者在制定科技政策時(shí)，通常會(huì)從有利于本地經(jīng)濟(jì)和技術(shù)發(fā)展的角度出發(fā)，利用基礎(chǔ)科研對(duì)本地技術(shù)創(chuàng)新的影響，在同一地域范圍內(nèi)統(tǒng)籌規(guī)劃創(chuàng)新型企業(yè)和基礎(chǔ)科研機(jī)構(gòu)，從而構(gòu)建起兩者間知識(shí)關(guān)聯(lián)和轉(zhuǎn)移的通道?；谏鲜黾夹g(shù)經(jīng)濟(jì)基礎(chǔ)，基礎(chǔ)科研機(jī)構(gòu)和企業(yè)的地理鄰近性與兩者間的知識(shí)關(guān)聯(lián)和轉(zhuǎn)移強(qiáng)度之間通常會(huì)表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性。文獻(xiàn)[4―6]分別通過(guò)研究美國(guó)、法國(guó)、東歐范圍內(nèi)基礎(chǔ)科研機(jī)構(gòu)和創(chuàng)新型企業(yè)的地理空間凝聚現(xiàn)象，揭示了對(duì)應(yīng)的科學(xué)一技術(shù)知識(shí)關(guān)聯(lián)和知識(shí)轉(zhuǎn)移強(qiáng)度。

在科學(xué)計(jì)量學(xué)和文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)視野下，解析科研期刊論文與技術(shù)專(zhuān)利文獻(xiàn)間的關(guān)聯(lián)關(guān)系，也是揭示科學(xué)一技術(shù)知識(shí)關(guān)聯(lián)的另一途徑?？茖W(xué)計(jì)量學(xué)家Verbeek認(rèn)為，企業(yè)創(chuàng)新人員對(duì)科研文獻(xiàn)的理解、認(rèn)同和利用是引發(fā)科學(xué)一技術(shù)知識(shí)關(guān)聯(lián)和最終造就技術(shù)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Garfield指出，發(fā)明不可能來(lái)源于魔術(shù)或真空，它是發(fā)明人對(duì)若干已有的概念進(jìn)行重新組合的知識(shí)成果。Narin等認(rèn)為，幾乎所有的科技成果都是在前人工作的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，知識(shí)的關(guān)聯(lián)性在專(zhuān)利引文中有著明顯的體現(xiàn)?？蒲衅诳撐呐c技術(shù)專(zhuān)利文獻(xiàn)之間的共詞關(guān)系和引用關(guān)系是新知識(shí)向技術(shù)部門(mén)轉(zhuǎn)移的顯性表現(xiàn)。

3　利用共詞分析法揭示科學(xué)一技術(shù)知識(shí)關(guān)聯(lián)的局限

共詞分析法以某一(或一系列)主題檢索詞(科學(xué)概念或技術(shù)術(shù)語(yǔ))為“關(guān)聯(lián)點(diǎn)”，分析該詞在科研論文和專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)中的“共現(xiàn)”情況，從而推理和判斷基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)科與技術(shù)創(chuàng)新領(lǐng)域之間關(guān)聯(lián)關(guān)系的方法。共詞分析法直觀、有效，但同時(shí)也存在著明顯的問(wèn)題和局限。

3.1　科學(xué)概念與技術(shù)術(shù)語(yǔ)之間存在部分不對(duì)應(yīng)問(wèn)題

盡管INSPEC和INPADOCDB等詞表能夠提供某一科學(xué)概念和技術(shù)術(shù)語(yǔ)的多種詞匯表達(dá)，但它們不能解決“部分科學(xué)概念與技術(shù)術(shù)語(yǔ)不對(duì)應(yīng)”的基本矛盾。例如：專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)中的技術(shù)術(shù)語(yǔ)thin film(納米絕緣薄膜)及其同義術(shù)語(yǔ)ion sol-gel(離子溶膠凝膠)、polyerys-talline film(硅多晶薄膜)等在科研論文中并沒(méi)有絕對(duì)對(duì)應(yīng)的概念，通常只能被近似地映射為chemical vapordeposition(化學(xué)氣相沉積)、carbon nanotubes(納米碳管)、amorphous nitride(無(wú)定形氮化膜)等詞匯形式。

3.2　同一概念術(shù)語(yǔ)在科研論文和技術(shù)專(zhuān)利中的表達(dá)方式各不相同

科研論文中的化合物名稱(chēng)在專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)中往往以分子式、化學(xué)鍵結(jié)構(gòu)式或馬庫(kù)什結(jié)構(gòu)式(Mm-kush strue-ture)表示，例如，pantoprazole作為一種常用的抗?jié)兯幬锏幕瘜W(xué)名稱(chēng)常出現(xiàn)在科研論文中，但在專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)中這一詞匯很少出現(xiàn)，取而代之的是其馬庫(kù)什結(jié)構(gòu)式，如圖1所示：

3.3　專(zhuān)利技術(shù)的核心特征詞難以被確定

科研論文由作者給出關(guān)鍵詞，指明論文的核心知識(shí)概念，但專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)中沒(méi)有“關(guān)鍵詞”，發(fā)明人沒(méi)有歸結(jié)出專(zhuān)利的核心技術(shù)特征。目前的共詞分析主要依據(jù)“詞頻”和詞出現(xiàn)在專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)中的“位置”來(lái)間接推斷某術(shù)語(yǔ)是否表達(dá)了技術(shù)的核心特征。但核心特征詞的“詞頻”的分布閾值和詞出現(xiàn)在專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)中的什么“位置”能否代表技術(shù)的核心特征也還是一個(gè)爭(zhēng)論性話題，如有人重視“標(biāo)題”、“摘要”位置，也有人重視“權(quán)利要求條款”位置。

3.4　語(yǔ)種差異有時(shí)會(huì)引發(fā)技術(shù)術(shù)語(yǔ)缺失

例如，中國(guó)專(zhuān)利中的中醫(yī)治療方法專(zhuān)利和中藥配方專(zhuān)利所涉及的人體穴位和草藥名稱(chēng)等都沒(méi)有對(duì)應(yīng)的英語(yǔ)詞匯。

目前，上述問(wèn)題都還沒(méi)有有效的解決方案，這就局限著共詞分析法在揭示科學(xué)一技術(shù)知識(shí)關(guān)聯(lián)方面的效度和信度。

4　利用專(zhuān)利引文揭示科學(xué)一技術(shù)知識(shí)關(guān)聯(lián)的優(yōu)勢(shì)

本文所討論的專(zhuān)利引文主要是指專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)所引證的相關(guān)科研期刊論文。Jaffe等將“專(zhuān)利引文分析法”(patent citation analysis)定義為：利用各種數(shù)學(xué)與統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法，對(duì)專(zhuān)利引文進(jìn)行分析并揭示其中存在的數(shù)量特征和內(nèi)在規(guī)律的方法。1994年Narin首創(chuàng)了“專(zhuān)利計(jì)量學(xué)”(Patentbibliometric)并構(gòu)建了專(zhuān)利計(jì)量指標(biāo)(Science Linkage，sL)，用以度量技術(shù)發(fā)明與基礎(chǔ)研究之間的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度。利用專(zhuān)利引文揭示科學(xué)一技術(shù)知識(shí)關(guān)聯(lián)的方法，以專(zhuān)利引文為紐帶，通過(guò)專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)對(duì)科研期刊論文的引證映射，揭示對(duì)應(yīng)的基礎(chǔ)研究學(xué)科與技術(shù)創(chuàng)新領(lǐng)域之間的知識(shí)關(guān)聯(lián)，其基本原理如圖2所示：

篇9

關(guān)鍵詞：食品 分析 檢驗(yàn) 方法

食品是人類(lèi)生存不可缺少的物質(zhì)條件之一，是人類(lèi)進(jìn)行一切生命活動(dòng)的能源。因此，食品品質(zhì)的好壞直接關(guān)系著人們的身體健康。食品分析與檢驗(yàn)就是研究和評(píng)定食品品質(zhì)及其變化的一門(mén)專(zhuān)業(yè)性很強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)科學(xué)。它依據(jù)物理、化學(xué)、生物化學(xué)的一些基本理論和國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)。運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)和分析手段，對(duì)各類(lèi)食品（包括原料、輔助材料、半成品及成品）的主要成分及其含量和有關(guān)工藝參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，以保證生產(chǎn)出質(zhì)量合格的產(chǎn)品。

1.感官檢驗(yàn)法

感官檢驗(yàn)作為食品檢驗(yàn)的重要方法之一，具有簡(jiǎn)便易行、快速靈敏、不需要特殊器材等特點(diǎn)，特別適用于目前還不能用儀器定量評(píng)價(jià)的某些食品特性的檢驗(yàn)，如水果滋味的檢驗(yàn)、食品風(fēng)味的檢驗(yàn)以及煙、酒、茶的氣味檢驗(yàn)等。

依據(jù)所使用的感覺(jué)器官的不同，感官檢驗(yàn)可分為視覺(jué)檢驗(yàn)、嗅覺(jué)檢驗(yàn)、味覺(jué)檢驗(yàn)、觸覺(jué)檢驗(yàn)和聽(tīng)覺(jué)檢驗(yàn)五種。

感官分析法存在一定缺陷，由于感官分析是以經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的評(píng)價(jià)員的感覺(jué)器官作為一種"儀器"來(lái)測(cè)定食品的質(zhì)量特性或鑒別產(chǎn)品之間的差異的，因此，判斷的準(zhǔn)確性與檢驗(yàn)者的感覺(jué)器官的敏銳程度和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)密切相關(guān)。同時(shí)檢驗(yàn)者的主觀因素（如健康狀況、生活習(xí)慣、文化素養(yǎng)、情緒等），以及環(huán)境條件（如光線、聲響等）都會(huì)對(duì)鑒定的結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。另外，感官檢驗(yàn)的結(jié)果大多數(shù)情況下只能用比較性的用詞（優(yōu)良、中、劣等）表示或用文字表述，很難給出食品品質(zhì)優(yōu)劣程度的確切數(shù)字。

感官檢驗(yàn)是與儀器檢驗(yàn)并行的重要的檢測(cè)手段，其重要性不僅在于有些產(chǎn)品的特性目前還不能用儀器檢驗(yàn)，只能靠感官，即使能夠得到先進(jìn)的測(cè)量?jī)x器，感官檢驗(yàn)的重要性也不隨之降低，因?yàn)楦泄僦笜?biāo)與理化指標(biāo)是互相補(bǔ)充的，只有儀器分析與感官分析相結(jié)合才能得到產(chǎn)品的完整信息。因此，感官檢驗(yàn)法是食品重要的分析手段之一。

2.物理分析法

通過(guò)對(duì)被測(cè)食品的某些物理性質(zhì)（如溫度、密度、折射率、旋光度、沸點(diǎn)、透明度等）的測(cè)定，可間接求出食品中某種成分的含量，進(jìn)而判斷被檢食品的純度和品質(zhì)。

物理分析法簡(jiǎn)便、實(shí)用，在實(shí)際工作中應(yīng)用廣泛。如密度法可測(cè)定糖液的濃度、酒中酒精含量，檢驗(yàn)牛奶是否摻水、脫脂等等；折光法可測(cè)定果汁、番茄制品、蜂蜜、糖漿等食品的固形物含量，牛乳中乳糖含量等；旋光法可測(cè)定飲料中蔗糖含量、谷類(lèi)食品中淀粉含量等。

3.物理化學(xué)分析法

物理化學(xué)分析法是通過(guò)測(cè)量物質(zhì)的光學(xué)性質(zhì)、電化學(xué)性質(zhì)等物理化學(xué)性質(zhì)來(lái)求出被測(cè)組分含量的方法。它包括光學(xué)分析法、電化學(xué)分析法、色譜分析法、質(zhì)譜分析法和光電化學(xué)分析法等，食品分析與檢驗(yàn)中常用的是前三種方法。光學(xué)分析法又分為紫外-可見(jiàn)分光光度法、原子吸收分光光度法、熒光分析法等，可用于分析食品中無(wú)機(jī)元素、碳水化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸、食品添加劑、維生素等成分。電化學(xué)分析法又分為電導(dǎo)分析法、電位分析（離子選擇電極）法、極譜分析法等。電導(dǎo)分析法可測(cè)定糖品灰分和水的純度等；電位分析法廣泛應(yīng)用于測(cè)定pH、無(wú)機(jī)元素、酸根、食品添加劑等；極譜分析法已應(yīng)用于測(cè)定重金屬、維生素、食品添加劑等，這些方法解決了一些食品的前處理和干擾問(wèn)題。色譜法是近些年迅速發(fā)展起來(lái)的一種分析技術(shù)，極大地豐富了食品分析與檢驗(yàn)的內(nèi)容，解決了許多常規(guī)化學(xué)分析法不能解決的微量成分分析的難題，為食品分析與檢驗(yàn)技術(shù)開(kāi)辟了新途徑。色譜法包含許多分支，食品分析與檢驗(yàn)中常用的是薄層層析法、氣相色譜法和高效液相色譜法，可用于測(cè)定有機(jī)酸、氨基酸、糖類(lèi)、維生素、食品添加劑、農(nóng)藥殘留量、黃曲霉毒素等。

人們常將物理分析法和物理化學(xué)分析法歸結(jié)為儀器分析法，即指以物質(zhì)的物理或物理化學(xué)性質(zhì)為基礎(chǔ)，利用光電儀器來(lái)測(cè)定物質(zhì)含量的方法。儀器分析法具有靈敏、快速、操作簡(jiǎn)單、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，儀器分析法已越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于食品分析與檢驗(yàn)中。

4.化學(xué)分析法

化學(xué)分析法包括定性分析和定量分析兩部分。但對(duì)于食品分析與檢驗(yàn)來(lái)說(shuō)，由于大多數(shù)食品的來(lái)源及主要成分是已知的，一般不必作定性分析，僅在個(gè)別情況下才作定性分析。因^此，最經(jīng)常的工作是定量分析?；瘜W(xué)定量分析法包括重量法和容量法，食品中水分、灰分、脂肪、果膠、纖維等成分的測(cè)定，常規(guī)方法都是重量法。容量法又包括酸堿滴定法、氧化還原滴定法、配合滴定法和沉淀滴定法四種，其中前兩種最常用，如酸度、蛋白質(zhì)的測(cè)定用到酸堿滴定法，還原糖、維生素0的測(cè)定用到氧化還原滴定法。

化學(xué)分析法是食品分析與檢驗(yàn)的基礎(chǔ)。即使是現(xiàn)代的儀器分析，也都是用化學(xué)方法對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理及制備，而且儀器分析的原理大多數(shù)也是建立在化學(xué)分析的基礎(chǔ)上的。為檢驗(yàn)儀器分析的準(zhǔn)確度和精確度，還需用規(guī)定的或推薦的化學(xué)分析標(biāo)準(zhǔn)方法作對(duì)照，以確定兩種方法分析結(jié)果的符合程度。因此，化學(xué)分析法是食品分析與檢驗(yàn)最基本的、最重要的分析方法。食品中大多數(shù)成分的分析都可以靠化學(xué)分析法完成。

5.生物分析法

目前，應(yīng)用于食品分析與檢驗(yàn)中的生物分析法主要包括微生物分析法與PCR技術(shù)的應(yīng)用等。

微生物分析法是基于某些微生物生長(zhǎng)需要特定的物質(zhì)來(lái)進(jìn)行分析的，方法條件溫和，克服了化學(xué)分析法和儀器分析法中某些被測(cè)成分易分解的弱點(diǎn)，此方法的選擇性也高。此法廣泛應(yīng)用于維生素、抗生素殘留量、激素等類(lèi)物質(zhì)的分析中。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DN段，然后采用電泳法或熒光探針檢測(cè)食品中致病菌或用于轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)。

6.生物化學(xué)分析法

酶分析法是目前應(yīng)用得比較多的一種生物化學(xué)分析法。

酶分析法是利用酶的反應(yīng)對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性、定量的方法。酶是生物催化劑，它具有高效和專(zhuān)一的催化特性，而且可在溫和的條件下進(jìn)行催化。酶作為分析試劑應(yīng)用于食品分析與檢驗(yàn)中，可從復(fù)雜的組分中檢測(cè)某一成分而不受或很少受其他共存成分干擾，具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。目前已應(yīng)用于食品中有機(jī)酸、糖類(lèi)、淀粉、維生素等成分的測(cè)定。

此外，食品分析方法還包括綜合了分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微電子學(xué)、微機(jī)械學(xué)、化學(xué)、物理、計(jì)算機(jī)等多項(xiàng)技術(shù)的生物芯片技術(shù)等。

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篇10

【摘要】 目的 探討早發(fā)冠心病血瘀證、痰濁證面部光電血流容積特征及與一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素(ET)含量的關(guān)系。方法 早發(fā)冠心病血瘀證36例，痰濁證35例，健康對(duì)照組31例，采用GD-3型光電血流容積面診儀檢測(cè)光電血流容積參數(shù)，硝酸還原酶法測(cè)定NO，放射免疫分析法測(cè)定ET。結(jié)果 血瘀證患者Hb、He、Hf、Hb/Tab、Hf/Hb較正常組顯著降低(P＜0.01)，痰濁證患者Hb、He、Hf及Hf/Hb較正常組顯著降低(P＜0.01)，血瘀證患者與痰濁證患者比較，Hb、Hb/Tab顯著降低(P＜0.01)。3組間Hb、ET、NO比較：血瘀證組Hb最小，痰濁證組次之，正常組最高；而ET含量各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；NO含量血瘀證組低于正常組(P＜0.01)；隨著光電血流容積主波幅的增高，ET均數(shù)值逐漸下降，NO均數(shù)值逐漸上升，低波幅組與高波幅組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ET與Hb成負(fù)相關(guān)，NO則呈正相關(guān)關(guān)系。結(jié)論 心臟功能減退與大動(dòng)脈順應(yīng)性降低是本證基本病理改變之一。血流容積主波幅與NO、ET含量具備相關(guān)關(guān)系，從而準(zhǔn)確反映血管的舒縮狀態(tài)及體內(nèi)生物活性物質(zhì)的變化，三者可作為早發(fā)冠心病血瘀證、痰濁證輔助診斷指標(biāo)之一。

【關(guān)鍵詞】 早發(fā)冠心病；血瘀證；痰濁證；光電血流容積；一氧化氮；內(nèi)皮素

Abstract：Objective To research photoelectric facial blood flow volume characteristic of premature coronary heart disease of heart blood stasis syndrome (HBSS) and phlegm syndrome (PS)， and its relation with NO and ET. Methods Patients of premature coronary heart disease of HBSS (36 cases) and PS (35 cases) were selected， with 31 health people as control. The parameter of photoelectric facial blood flow volume was detected with GD-3 photoelectric blood stream plethysm (PBSP) of the facial color-diagnosis. NO was determined by nitrate reductase method and ET was determined by RIA. Results Hb， He， Hf， Hb/Tab and Hf/Hb of HBSS decreased obviously compared with the control (P＜0.01). Hb， He， Hf and Hf/Hb of PS decreased obviously compared with the control (P＜0.01). Hb， Hb/Tab of HBSS decreased obviously compared with PS (P＜0.01). Comparison of Hb， ET， NO among the three groups was as follows：Hb of HBSS was the lowest， followed by PS， the highest was the control. There was no significance in the content of ET among the three groups， the content of NO in HBSS was lower than the control (P＜0.01). With the main volume of PBSP flow increased， ET values gradually declined， NO values gradually rose， there was significantly different between low amplitude group and high amplitude group. ET and Hb correlated negatively， NO and Hb correlated positively. Conclusion It is one of the basic pathological changes of the syndrome that cardiac function and artery compliance reduced. There were correlationship between the main volume of PBSP and content of NO and ET， so the systolic and diastolic blood vessels in the body and the state of bio-active substances can be accurally responsed. All those can be used as the auxiliary diagnostic indexes of premature coronary heart disease HBSS and PS.

Key words：premature coronary heart disease；heart blood stasis syndrome；phlegm syndrome；photoelectric blood stream plethysm；nitrogen monoxide；endothelin

血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放的主要內(nèi)分泌因子內(nèi)皮素(ET)與一氧化氮(NO)是一對(duì)具有拮抗效應(yīng)的血管活性物質(zhì)。ET是內(nèi)源性收縮因子中研究最多、且是最強(qiáng)的血管收縮劑之一[1]，而NO作為內(nèi)皮源性舒張因子[2]，具有極強(qiáng)的舒張血管的作用。在生理情況下，NO/ET水平保持動(dòng)態(tài)平衡；病理情況下，其平衡遭到破壞，導(dǎo)致血管舒縮功能紊亂，血管內(nèi)皮受損及通透性改變，血液流變學(xué)異常，引發(fā)痰濁閉塞、瘀阻血絡(luò)，最終導(dǎo)致冠心病。因此，通過(guò)檢測(cè)早發(fā)冠心病血瘀證與痰濁證的光電血流容積指標(biāo)，探討其與NO、ET含量的相關(guān)性及臨床診斷價(jià)值，具有重要意義[3]。

1 資料與方法

1.1 觀察對(duì)象

健康對(duì)照組31例，參照WHO確定健康的定義與10項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)[4]，平均年齡(55.07±7.19)歲；其中男11例，女20例，經(jīng)病史調(diào)查、體格檢查和必要的理化檢查，皆證實(shí)為健康人。冠心病血瘀證36例，痰濁證35例，冠心病診斷參照1979年國(guó)際心臟病學(xué)會(huì)和WHO臨床命名標(biāo)準(zhǔn)化聯(lián)合專(zhuān)題報(bào)告[5]及第一屆全國(guó)內(nèi)科學(xué)術(shù)會(huì)議心血管病專(zhuān)業(yè)組(1980年12月，廣州)關(guān)于冠心病命名及診斷標(biāo)準(zhǔn)的建議[6]；中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn)參照2002年國(guó)家中醫(yī)藥管理局醫(yī)政司胸痹急癥組、中國(guó)中醫(yī)藥學(xué)會(huì)內(nèi)科學(xué)會(huì)心病專(zhuān)業(yè)委員會(huì)《中醫(yī)心病診斷療效標(biāo)準(zhǔn)與用藥規(guī)范》[7]。血瘀證患者平均年齡(56.32±7.35)歲，男20例，女16例；痰濁證患者平均年齡(57.24±7.46)歲，男21例，女14例。3組觀察對(duì)象男性年齡均＜55歲，女性年齡均＜65歲。經(jīng)病史調(diào)查、心電圖、實(shí)驗(yàn)室相關(guān)檢查、臨床病癥舌脈象，均確診為早發(fā)冠心病血瘀證與痰濁證患者。組間性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.2.1 面部光電血流容積圖檢測(cè)

應(yīng)用湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷研究所研制的GD-3型光電血流容積面診儀，與Pclab生物機(jī)能信號(hào)采集系統(tǒng)匹配，Pclab系統(tǒng)采用動(dòng)物心電(mV)、三通道(CH3、壓縮比為20)、低通濾波(10 Hz)，記錄面頰部光電血流容積圖。被檢者采取仰臥位，自然放松，用95%的酒精棉球在檢測(cè)部位脫脂后，將光電換能器探頭緊貼檢測(cè)部位，中等壓力，以不漏光為佳。按步驟在計(jì)算機(jī)Pclab軟件中測(cè)量波形時(shí)間指標(biāo)(Tag、Tab、Tae、Teg、Tw)、波幅指標(biāo)(Hb、Hd、He、Hf)，再計(jì)算比值指標(biāo)(Hb/Tab、Hd/Hb、He/Hb、Hf/Hb等)[8]。

1.2.2 血漿一氧化氮和內(nèi)皮素測(cè)定

采用北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司血漿ET放射免疫藥盒(放射免疫分析法)測(cè)定ET，采用南京建成生物工程研究所NO試劑盒(硝酸還原酶法)測(cè)定NO。按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

檢測(cè)值用x±s表示，3組間兩兩比較用單因素方差分析，各因素之間關(guān)系用直線相關(guān)分析。所有資料用SPSS 14.0版統(tǒng)計(jì)軟件在計(jì)算機(jī)上完成。

2 結(jié)果

2.1 3組間光電血流容積主波幅、內(nèi)皮素、一氧化氮的比較

在不同的證型之間，光電血流容積主波幅(Hb)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中血瘀證組波幅最小，痰濁證組次之，正常組最高；而ET含量變化各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，NO含量血瘀證組低于正常組，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，血瘀證組與痰濁證組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。表1 3組間ET、NO含量與光電血流容積Hb的比較(略)注：與血瘀證比較，*P＜0.01；與痰濁證比較，#P＜0.01；與正常組

比較，P＜0.01

2.2 不同光電血流容積主波幅組內(nèi)皮素和一氧化氮含量的變化

在不考慮證的前提下，根據(jù)光電容積主波幅的高低將其分為6組(A、B、C、D、E、F組)，可以看出，隨著光電血流容積主波幅的增高，ET均數(shù)值逐漸下降，NO均數(shù)值逐漸上升，低波幅組與高波幅組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NO的變化與ET相反，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。表2 不同光電血流容積主波幅組內(nèi)ET和NO含量的變化(略)注：與A組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與B組比較，#P＜0.05；

與C組比較，P＜0.05；與D組比較，P＜0.05

2.3 面部光電血流容積波幅與比值指標(biāo)的比較

血瘀證患者與正常組比較，Hb、He、Hf、Hb/Tab、Hf/Hb均有顯著降低(P＜0.01)；痰濁證患者與正常組比較，Hb、He、Hf及Hf/Hb均有顯著降低(P＜0.01)；血瘀證患者與痰濁證患者比較，Hb、Hb/Tab有顯著降低(P＜0.01)。見(jiàn)表3。表3 早發(fā)冠心病患者及健康人面部光電血流容積指標(biāo)比較(略)注：與血瘀證比較，*P＜0.01；與正常組比較，#P＜0.01

3 討論

NO和ET是由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成、釋放的一對(duì)血管舒縮因子。ET是已知的最有力的內(nèi)源性血管收縮因子，主要由血管內(nèi)皮產(chǎn)生的一種作用強(qiáng)烈且持久的血管收縮肽，過(guò)量釋放可引起冠狀動(dòng)脈痙攣，促進(jìn)心肌收縮，加重心肌缺血和心肌再灌注損傷[9-12]。NO是血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的作用極強(qiáng)的舒血管因子，是維持血管舒張的主要來(lái)源，具有舒張血管平滑肌的作用，并對(duì)抗內(nèi)皮源性收縮因子。NO為ET的生理拮抗劑， 持續(xù)基礎(chǔ)釋放對(duì)維持心血管系統(tǒng)恒定的舒張、調(diào)節(jié)冠狀動(dòng)脈基本張力、保持心肌血流灌注有著重要作用[13]。正常情況下，機(jī)體中NO和ET都有少量分泌，以維持機(jī)體正常需要，二者含量相對(duì)穩(wěn)定，達(dá)到一種平衡狀態(tài)。但缺血后，由于血塊對(duì)血管的刺激、血管內(nèi)壓增高及炎癥反應(yīng)，使內(nèi)皮素mRNA表達(dá)增加，內(nèi)皮素合成及釋放增加，引起動(dòng)脈的強(qiáng)烈收縮，進(jìn)而使局部腦組織缺血缺氧，導(dǎo)致腦缺血，尤其是側(cè)枝循環(huán)不良的組織；而由內(nèi)皮素引發(fā)的白細(xì)胞粘附血管壁以及其激活的炎性因子均可加強(qiáng)腦血管痙攣、組織缺血，并且損傷組織細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞，使得內(nèi)皮源性NO合成減少或者拮抗了其舒張作用；另一方面，紅細(xì)胞裂解釋放出的氧合血紅蛋白可使NO滅活，ET/NO之間的平衡被打破，從而破壞了正常的血管舒張功能。Sakowitz[12]認(rèn)為，血管痙攣與可利用的NO減少以及繼發(fā)的血管收縮因子和血管舒張因子失衡有關(guān)。

在本研究中，將血瘀證組、痰濁證組和正常組進(jìn)行比較時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)光電血流容積主波幅在這3組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中在血瘀證組波幅最低，痰濁證組次之，而正常組最高[14]。這與中醫(yī)理論中有形之邪或有形的病理產(chǎn)物阻塞脈絡(luò)，氣血運(yùn)行不暢而致痰阻血瘀，脈來(lái)不暢的理論相一致。同時(shí)，NO血瘀證組的含量明顯低于正常組，而痰濁證組與血瘀證組及正常組無(wú)差異，ET各組間無(wú)差異，考慮為光電血流容積主波幅能夠敏感、及時(shí)、直接地反映血流容積的變化，側(cè)重于血管功能的反應(yīng)，而作為血管擴(kuò)張的物質(zhì)基礎(chǔ)的NO和ET則反應(yīng)沒(méi)有那么敏感。說(shuō)明光電血流容積主波幅能夠及時(shí)反映血流的變化，敏感于生物活性物質(zhì)的釋放，能為臨床及科研提供及時(shí)的資料。

在按光電血流容積主波幅的高低對(duì)NO及ET進(jìn)行觀察，我們發(fā)現(xiàn)，隨著光電血流容積主波幅的增加，NO值逐漸增加，與之呈正相關(guān)；而ET值逐漸下降，與光電血流容積主波幅呈負(fù)相關(guān)，并且在高波幅組和低波幅組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明隨著NO/ET值逐漸增大，血管舒張功能加強(qiáng)而處于擴(kuò)張狀態(tài)，血流容積增大，所以光電容積主波幅增高?？梢?jiàn)，光電血流容積主波幅的變化與NO及ET的變化關(guān)聯(lián)性很好，可以準(zhǔn)確反映血管的擴(kuò)張狀態(tài)及血管擴(kuò)張時(shí)體內(nèi)生物活性物質(zhì)的變化，為科研及臨床提供可靠的證據(jù)。

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