導(dǎo)語：如何才能寫好一篇細(xì)胞生物學(xué)特性，這就需要搜集整理更多的資料和文獻，歡迎閱讀由公務(wù)員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

【關(guān)鍵詞】 紅斑狼瘡；系統(tǒng)性；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；生物學(xué)特性

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Marrow Mesenchymal Stem Cells，MSC)具有高度自我更新和多向分化的潛能，并具有支持造血和免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用［1］。大量的體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗［2,3］證明它具有誘導(dǎo)免疫耐受和免疫抑制的特性。MSC移植在SLE治療中具有較廣闊的應(yīng)用前景。了解SLE患者自身MSC是否異常是判斷選擇自體或異體MSC移植治療SLE的重要依據(jù)。SLE患者MSC的體外擴增及其生物學(xué)特性是協(xié)助我們評價SLE患者MSC是否存在缺陷的重要方面。

1 資料與方法

1.1 一般資料 9例SLE患者均符合1997年美國風(fēng)濕病學(xué)會修訂的SLE分類診斷標(biāo)準(zhǔn)，SLE疾病活動評分(SLEDAI)判斷疾病的活動程度。9例患者的資料見表1。另選5例性別、年齡匹配的健康者作為對照組。

1.2 骨髓MSC分離培養(yǎng) 采用羥基淀粉沉淀聯(lián)合Ficoll 密度梯度離心法和貼壁篩選法分離培養(yǎng)MSC。具體方法無菌操作下抽取骨髓液 10 ml，以 5×105 U/ml 肝素鈉抗凝，先用羥基淀粉按1∶4體積加入，靜置20 min，通過自然沉降去除下沉的大量紅細(xì)胞，剩余的含大量紅細(xì)胞的下層液體，再用淋巴細(xì)胞分離FicollHypaque常規(guī)分離單個核細(xì)胞。將上述兩步分離所得的骨髓單個核細(xì)胞充分混勻，懸浮于體積分?jǐn)?shù)為10％的 胎牛血清DMEMLG 培養(yǎng)液中，按約1×106/ml密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶， 置 37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的 CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中。當(dāng)顯微鏡下觀察細(xì)胞已達90%融合時，則可傳代。用0.5%胰酶/乙二胺四乙酸(EDTA)(Gibco，美國)消化貼壁細(xì)胞，收集細(xì)胞并懸浮于完全培養(yǎng)液中，按104/cm2的密度接種于新的培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3~4天更換1次培養(yǎng)液，約1周待細(xì)胞生長密度達90%左右時，進行再次傳代。

1.3 MTT法檢測MSC的生長情況 MTT比色法檢測SLE患者第2代MSC的生長情況，作傳代細(xì)胞培養(yǎng)的生長曲線分析。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測MSC表面分子的表達 細(xì)胞培養(yǎng)擴增到第三代時，分別取100 ul細(xì)胞懸液與鼠抗人CD29、CD44、CD34、CD45抗體室溫反應(yīng)30 min。流式細(xì)胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 MSC的傳代情況及形態(tài)

本實驗進行了9例SLE患者和5例健康對照者MSC體外培養(yǎng)。5例健康對照者MSC 均能成功體外擴增。9例患者中，5例MSC能傳代擴增，傳代率為55.6%。其中女性4例，男性1例，年齡16~26歲，平均年齡21.8歲；病程3~24月，平均病程9.8月；DAI評分為15~21， 平均評分為18.6。5例SLE患者均合并有腎損害，其中1例合并有血液系統(tǒng)損害。MSC體外擴增不成功的4例SLE患者，均為女性，年齡26~45歲，平均年齡38.2歲；病程6~60月，平均病程37.5月；DAI評分為1322， 平均評分為18.5。4例SLE患者均合并有腎損害，其中2例合并有嚴(yán)重血液系統(tǒng)損害。每例患者的臨床資料及MSC體外培養(yǎng)基本情況見表1。

2.1.1 體外擴增成功者 5例MSC體外擴增成功的SLE患者，MSC生長情況與健康對照組相比較：原代培養(yǎng)時，細(xì)胞形態(tài)上與健康對照組相似，但紡錘形、梭形細(xì)胞的出現(xiàn)稍晚，一般于2~4 d，健康對照組的一般出現(xiàn)于1~2 d內(nèi)；隨后逐漸見集落形成，原代培養(yǎng)的時間平均為(14.2±1.45)d，與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，細(xì)胞呈長梭形旋渦樣生長；傳代后細(xì)胞生長較旺盛，平均傳代時間(5.8±0.44)d，與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。消化傳代的細(xì)胞于24 h內(nèi)完全貼壁，形態(tài)與健康對照組相似。

2.1.2 體外擴增不成功者 MSC生長情況與健康對照組相比較：同等骨髓量分離得到的單個核細(xì)胞數(shù)量與健康對照組相比明顯減少，且貼壁的紡錘形、梭形細(xì)胞的出現(xiàn)時間明顯較晚，一般于6~7 d，且僅零星分布，不成集落生長，隨著培養(yǎng)時間的延長，其中2例可見細(xì)胞少量擴增，培養(yǎng)至第15天，約見20％~30％融合的短梭形細(xì)胞生長(圖3)，至第30天，細(xì)胞基本自行凋亡；另2例至第18天，見部分長梭形細(xì)胞零星分布，融合少于10％，至第30天細(xì)胞基本自行凋亡。

2.2 MSC表面分子的表達

流式細(xì)胞術(shù)檢測BMMSC細(xì)胞表面抗原，結(jié)果顯示體外擴增成功的SLE患者BMMSC均高表達CD29、CD44，而不表達CD34、CD45，第3代BMMSC純度達95%以上，且各表面標(biāo)志的表達與健康對照組相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 MSC的生長情況

SLE患者第2代MSC生長趨勢與健康對照組相似，第3~4天生長活躍，第4天后生長漸緩，第56進入生長平臺期。

3 討論

MSC是骨髓中具有高度自我更新和多向分化潛能的一群干細(xì)胞，體外培養(yǎng)易純化、擴增迅速，具有支持造血、免疫調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)免疫耐受的作用。本實驗進行了9例SLE患者和5例健康對照者MSC的體外培養(yǎng)。健康對照者MSC 均能成功體外擴增。9例SLE患者中，5例可以傳代擴增，傳代率為55.6%。有4例SLE患者MSC不能成功傳代擴增，說明部分SLE患者MSC存在缺陷。另一方面，我們發(fā)現(xiàn)能成功傳代的5例SLE患者MSC無論是從細(xì)胞形態(tài)、原代培養(yǎng)所需時間、平均傳代時間及表面特異性分子表達均與健康對照組無明顯差異，所培養(yǎng)、擴增的細(xì)胞能達到臨床應(yīng)用的要求。提示這部分SLE患者MSC生物學(xué)特性基本正常。

對兩組擴增情況不同的SLE患者的臨床資料進行比較，我們發(fā)現(xiàn)未能成功體外擴增的SLE患者具有如下的臨床特征：①年齡較大。②病程較長。③合并有較嚴(yán)重的血液系統(tǒng)損害。④長期大劑量應(yīng)用免疫抑制劑。

大量實驗發(fā)現(xiàn)，MSC的生物學(xué)特性與年齡密切相關(guān)。骨髓中MSC的含量、質(zhì)量以及細(xì)胞活性隨著年齡的增長而下降［4,5］。骨髓中MSC的克隆數(shù)隨著年齡的增長而逐漸減少，且BMMSC分泌SCF、FLT3L、IL6、TGFβ1及SDF1等與自我更新密切相關(guān)的細(xì)胞因子的能力逐漸下降，導(dǎo)致BMMSC的增殖能力逐漸減弱。另外，也有研究者指出［6］，病情較重的SLE患者，從骨髓中可提取的單個核細(xì)胞數(shù)原本就較少，所含MSC就更少。然而SLE病情輕重、病程長短及不同藥物治療是否會影響SLE患者MSC的體外擴增、生物學(xué)特性及功能，目前尚未能明確。

我們實驗說明SLE患者MSC存在一定的異質(zhì)性，因此應(yīng)用MSC治療SLE前，了解患者自身MSC是否存在缺陷是必需的。如果患者MSC本身存在缺陷，為避免治療失敗或復(fù)發(fā)，異體MSC輸注為首選；如果MSC本身基本正常，自體MSC輸注將是有效的。SLE患者MSC的體外擴增及其生長特性是協(xié)助我們評價SLE患者MSC是否存在缺陷的重要方面，為SLE患者MSC移植的治療方法提供了理論依據(jù)。

參 考 文 獻

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［2］ Tse WT， Pendleton JD， Beyer, et al. Suppression of allogeneic Tcell proliferation by human marrow stromal cells: implications in transplantation. Transplantation, 2003，(75):389397.

［3］ Tse WT， Pendleton JD， Beyer et al. Suppression of allogeneic Tcell proliferation by human marrow stromal cells: implications in transplantation. Transplantation, 2003，(75):389397.

［4］ Kotev Emeth S， Savion N， Pri2 chen S， et al. Effect of maturation on the osteogonic response of cultured stromal bone marrow cells to basic fibroblast grow th factor. B one， 2000，27:777783.

篇2

【摘要】 目的 觀察不同年齡段大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adiposederived stromal cells， ADSCs)生物學(xué)特點與年齡的關(guān)系，為臨床尋找理想的種子細(xì)胞并迅速獲取所需ADSCs提供實驗依據(jù)。方法 使用密度梯度離心法分離不同年齡段脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞進行培養(yǎng)，保留貼壁細(xì)胞傳代，分析脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的純度，觀察細(xì)胞生長情況，檢測其增殖活性、細(xì)胞周期。結(jié)果 不同年齡段ADSCs均貼壁生長，呈典型ADSCs形態(tài)和生長特征，傳代細(xì)胞的增殖速度比原代細(xì)胞快，但隨著年齡的增長，原代及傳代培養(yǎng)ADSCs的增殖能力下降，生長周期延長。結(jié)論 ADSCs的增殖能力和活性隨著年齡的增長而降低，但各年齡段ADSCs均可滿足臨床不同患者組織工程種子細(xì)胞的要求。

【關(guān)鍵詞】 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；年齡；大鼠；細(xì)胞培養(yǎng)；增殖

ABSTRACT: Objective To investigate biological characteristics of rat adiposederived stromal cells (ADSCs) of different ages. Methods ADSCs were isolated by density gradient centrifugation from different age stages， and cultured in vitro. The adherent cells were preserved to passage， the purity of ADSCs was analyzed by immunocytochemistry method， and cell growth was observed， then proliferation capability and cell cycle were detected. Results All the ADSCs obtained from different age stages grew well and showed good morphology and growth characteristics. The proliferation rate of passage cells was higher than that of primary cells， but the proliferation activity reduced with aging， and cell cycle was prolonged. Conclusion The proliferation capability and activity of ADSCs decreased with aging. However， ADSCs of different age stages can all meet the needs of different patients for tissue engineering seed cells.

KEY WORDS: adipose derived stem cell; age; rat; cell culture; proliferation

組織工程的興起和迅猛發(fā)展為臨床修復(fù)重建帶來了新的治療途徑，成為目前最有前景的生理性修復(fù)技術(shù)[12]。種子細(xì)胞的選擇是組織工程的基礎(chǔ)和關(guān)鍵之一。2001年ZUK等[3]通過脂肪抽吸術(shù)獲得脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adiposederived stromal cells， ADSCs)。ADSCs具有來源豐富、易于獲取、自體移植可以避免排斥反應(yīng)以及許多倫理問題等優(yōu)點。大量研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs)的含量、質(zhì)量以及活性隨著年齡的增長而下降[4]。但是不同年齡的ADSCs在體外生長及增殖能力是否具有差異，是否能夠滿足臨床修復(fù)的需要?ADSCs能否成為組織工程新的最理想的種子細(xì)胞?本研究旨在探討不同年齡階段ADSCs的生長增殖能力及其機制，為ADSCs的體外培養(yǎng)及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM、胎牛血清(Gibco)、Ⅰ型膠原酶(Sigma)、EDTA、MTT(Amerison)、CD34、CD44、CD49d、CD106(Sigma)。

1.2 實驗動物分組 健康SD大鼠，雌雄不限，按月齡分為幼年組(1月齡)、成年組(12月齡)和老年組(24月齡)。體重分別約為150、400、750g。

1.3 ADSCs的分離培養(yǎng)及傳代 取SD大鼠，脫頸處死，消毒，無菌條件下取腹股溝部及腎下1g脂肪組織，去除其他組織，用PBS沖洗3次，將脂肪組織剪成大約1mm3小塊，置2g/LⅠ型膠原酶中，消化60min，然后1000r/min，離心10min，棄上清，用含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，計數(shù)，接種于培養(yǎng)瓶中，常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合達80%時1∶2傳代、擴增培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 每日在倒置顯微鏡下觀察原代及傳代細(xì)胞的生長情況以及形態(tài)特點。

1.5 ADSCs表面標(biāo)記的檢測 取第3代的ADSCs，分為4份，分別滴加兔抗鼠CD34、CD44、CD49d、CD106一抗，4℃反應(yīng)30min后，PBS洗滌2次，滴加異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗兔IgG，避光固定，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面CD34、CD44、CD49d、CD106陽性細(xì)胞的表達。將第3代ADSCs多聚甲醛固定后，免疫細(xì)胞化學(xué)方法染色鑒定。

1.6 ADSCs生長周期的測定 取第3代細(xì)胞達80%融合時消化制成細(xì)胞懸液，滴入4℃預(yù)冷的700mL/L乙醇中固定30min，PBS漂洗離心，RNAseA處理30min，離心，加入碘化丙啶0.5mL，4℃避光染色30min，流式細(xì)胞儀488nm檢測。

1.7 繪制ADSCs的生長曲線 取各年齡組ADSCs以1×104/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔200μL，常規(guī)培養(yǎng)。每天同一時間隨機抽取6孔細(xì)胞，加入50g/L MTT 20μL/孔，培養(yǎng)4～6h，DMSO震蕩10min，酶聯(lián)免疫測定儀測定波長490nm處的吸光度。取6孔吸光度的均值，以時間(d)為橫坐標(biāo)，吸收值(A)為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。所有數(shù)據(jù)采用±s表示。組間比較采用單因素方差分析，方差不齊組經(jīng)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后再進行方差分析；各組細(xì)胞生長曲線用重復(fù)測量的方差分析(Repeatedmeasures ANOVA)。P

2 結(jié)

果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

2.1.1 原代培養(yǎng)ADSCs的形態(tài)學(xué)觀察 通過密度梯度離心獲得的ADSCs接種后在懸液中細(xì)胞呈圓形，不能辨認(rèn)細(xì)胞核，各年齡組在原代培養(yǎng)24h，可見細(xì)胞開始貼壁，細(xì)胞呈星形，胞體較??；培養(yǎng)第4天，各組細(xì)胞形態(tài)無差別，均呈梭形、多角形；幼年組細(xì)胞數(shù)量多，形成集落明顯，克隆性生長(圖1A)；成年組細(xì)胞數(shù)量較多，克隆性生長(圖1B)；老年組細(xì)胞數(shù)量少，散在分布(圖1C)。幼年組ADSCs大約5d左右達到80%細(xì)胞融合基本鋪滿瓶底，成年組和老年組ADSCs分別需要6、8d左右才可以達到80%細(xì)胞融合，進行傳代。

2.1.2 傳代培養(yǎng)ADSCs的形態(tài)學(xué)觀察 各年齡組均呈現(xiàn)特征性生長模式，傳代培養(yǎng)的ADSCs生長模式與原代培養(yǎng)細(xì)胞相似，但細(xì)胞增殖速度比原代明顯加快(圖2)，幼年組、成年組、老年組細(xì)胞分別為3、4、5d左右傳代，ADSCs多呈短梭形。

2.2 細(xì)胞表面標(biāo)記檢測 對各組第3代ADSCs通過流式細(xì)胞儀檢測了CD34、CD44、CD49d、CD106四個細(xì)胞表面標(biāo)記，各年齡組細(xì)胞表面CD44、CD49d陽性表達，免疫細(xì)胞化學(xué)染色后胞膜為棕色，陽性率均在95%以上；而CD34、CD106為陰性表達，胞膜未著色(圖3)。

2.3 ADSCs生長周期的測定 各年齡組周期細(xì)胞所占比例見表1。老年組與成年組、幼年組相比，G0/G1期由78.77%增至88.30%；S期比例由15.23%降至8.17%，幼年組S期比例明顯高于其他組，與成年組之間的差異有顯著性意義(F0.05(1，27)=4.21

2.4 ADSCs的生長曲線 各年齡組的細(xì)胞生長曲線呈S型。接種后1～2d為滯留期，第3天左右達對數(shù)生長期，第6～7天達到最高峰，此后出現(xiàn)生長抑制狀態(tài)，進入平臺期，數(shù)目不再增長。年齡越小細(xì)胞增殖速度越快，幼年組高峰值明顯大于其他組，但與老年組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4)。圖4 不同年齡段ADSCs的生長曲線

3 討

論

組織工程中種子細(xì)胞的選擇至關(guān)重要。目前，主要的種子細(xì)胞有以下幾種：胚胎干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、臍血間充質(zhì)干細(xì)胞等。胚胎干細(xì)胞雖然可以定向誘導(dǎo)分化為各種組織細(xì)胞，但是存在倫理問題，限制了其實際應(yīng)用[5]。一般認(rèn)為BMSCs是組織工程理想的種子細(xì)胞之一，但即使在骨髓中，MSCs的含量也很低，每105～106個單核細(xì)胞中大約含一個MSCs，并且隨著增齡，MSCs含量逐漸減少[6]，并且骨髓穿刺給患者造成較大的創(chuàng)傷和痛苦，而且采集量有限，每個成人只能抽取10～20mL骨髓，因此不利于臨床大規(guī)模的培養(yǎng)與應(yīng)用。臍血間充質(zhì)干細(xì)胞來源有限且分離困難，臨床應(yīng)用潛力較小。ADSCs證實其具有分化為多種中胚層來源細(xì)胞的潛能[7]，由于人體脂肪量較多約占體重的13%，所以ADSCs的來源十分豐富，并且自體移植可以避免排斥反應(yīng)以及許多倫理問題。

本實驗中各年齡階段SD大鼠均能培養(yǎng)出ADSCs，各組細(xì)胞均呈梭形或不規(guī)則形。幼年組和成年組細(xì)胞胞體較小、集落形成較密集、形態(tài)規(guī)則、細(xì)胞密度大；老年組細(xì)胞較大并且稀疏、呈散在分布、供體形成集落小、少，幼年組以及成年組細(xì)胞提取數(shù)量明顯高于老年組。

本研究中ADSCs表面表達CD44、CD49d陽性；而CD34、CD106為陰性表達。CD34作為造血干細(xì)胞標(biāo)志性免疫表型，CD34陰性說明ADSCs并非來源于血液循環(huán)中的干細(xì)胞，同時說明ADSCs未受到脂肪組織中微血管內(nèi)皮細(xì)胞的污染。有研究顯示ADSCs與BMSCs都可表達CD44[8]。CD49d在ADSCs中為陽性表達，在BMSCs中則為陰性表達；而與CD106相反；本實驗CD106陰性表達，已經(jīng)排除BMSCs污染的可能。以上結(jié)論說明已經(jīng)得到純度較高的ADSCs。CD49d是調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞定居歸巢到骨髓的表面分子，CD106是調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞從骨髓中向外遷移的表面分子，CD49d與CD106是ADSCs與BMSCs很好的區(qū)別標(biāo)記，但其本質(zhì)有待進一步的研究。

不同年齡階段的ADSCs在細(xì)胞周期各時相中的分布趨勢為G0+G1期>S期>G2+M期，說明從幼年、成年一直到老年，大多數(shù)ADSCs處于G0+G1靜止期，各組細(xì)胞隨供體年齡增加，G0+G1靜止期百分比例不斷增加，說明衰老使機體內(nèi)處于靜止的ADSCs數(shù)量不斷增加；S期的細(xì)胞比例反映了細(xì)胞的增殖程度，幼年組細(xì)胞處于S期的百分比例大于其他組，與其他組有顯著性差異，呈現(xiàn)隨年齡增長而增殖期細(xì)胞減少的趨勢，說明隨著機體的不斷衰老，干細(xì)胞增殖能力也在不斷減弱。

體外培養(yǎng)的ADSCs經(jīng)歷生長滯緩期、對數(shù)增殖期和平臺期，生長曲線呈S形，這符合干細(xì)胞的生長特性。各組均在3d左右出現(xiàn)倍增，7d左右達到增殖高峰，7d以后由于細(xì)胞已經(jīng)基本長滿瓶底，出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象，細(xì)胞生長反而相對緩慢。由生長曲線可以看出隨供體年齡的增長，細(xì)胞的增殖能力和活性相應(yīng)減弱。各年齡段ADSCs均可穩(wěn)定傳至9代，按支架接種細(xì)胞數(shù)106～107的要求[9]，經(jīng)過傳代培養(yǎng)后各年齡段的ADSCs的數(shù)量均可滿足臨床需要，但是應(yīng)充分考慮不同年齡段供體脂肪的抽取量以及種子細(xì)胞的擴增時間與病情的需要。

綜上所述，明確了各年齡段從脂肪組織均可獲得ADSCs，并保持穩(wěn)定增殖力，不同年齡組經(jīng)過傳代能夠使ADSCs相對純化，并且擴增數(shù)量能滿足臨床應(yīng)用的需要，但應(yīng)考慮年齡對ADSCs增殖的影響。本實驗證實ADSCs能夠成為組織工程中新的理想的種子細(xì)胞，并為ADSCs的臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。

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篇3

【關(guān)鍵詞】骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；細(xì)胞鑒定

【中圖分類號】R392.4【文獻標(biāo)識碼】A【文章編號】1044-5511（2011）11-0346-02

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-drived mes-enchymal stem cells,BMSCs是來源于骨髓的 MSCs，具有采集方便的優(yōu)點，是理想的組織工程種子細(xì)胞［1］具有多向分化和自我復(fù)制潛能,易于自體采集、無免疫排斥反應(yīng)、避免倫理學(xué)限制等優(yōu)點,在細(xì)胞治療方面得到了廣泛的應(yīng)用。但是BMSCs在骨髓微環(huán)境中所占比例極少,使用何種簡單操作方法快速獲取形態(tài)均一和純度較高的BMSCs便成為該研究領(lǐng)域關(guān)注的焦點［2］。本實驗采用全骨髓貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法和密度梯度離心法相結(jié)合分離、純化BMSCs，通過體外培養(yǎng)擴增，以及流式細(xì)胞術(shù)鑒定，建立穩(wěn)定的BMSCs培養(yǎng)擴增方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：日本大耳白兔4只，4周齡，雌雄不限，體重250~300g，購于蘭州生物制品研究所。

1.2 主要試劑及儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱(BB16UV型,德國Heraeus公司)、超凈工作臺(VS-1300L型,蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限責(zé)任公司)、倒置相差顯微鏡、超聲波清洗儀、純凈水系統(tǒng)、酸度計、臺式高速離心機(北京科偉永鑫實驗儀器設(shè)備廠)、低糖培養(yǎng)基(GBICO公司)、胎牛血清（杭州四季青）、谷氨酰胺、青鏈霉素、胰酶、流式細(xì)胞抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

1.3 兔BMSCs的采集： 取4周齡日本大耳白兔一只，雌雄不限，20ml空針空氣栓子經(jīng)耳緣靜脈注入，待兔死亡后，將其全部浸泡于75%酒精溶液內(nèi)8~10分鐘，在無菌環(huán)境下切開前后肢皮膚，切下兔前后兩肢，剃去覆蓋于肱骨、脛骨及股骨上的肌肉組織，注意保留骨的完整性，用組織剪分離股骨、脛骨及肱骨，將其置于無菌培養(yǎng)皿中，縱向依次剪開各長骨兩端，5ml注射器沿剪開的骨端注入L-DMEM沖洗3次，收集沖洗液約10ml，用篩網(wǎng)過濾沖洗液，加入完全低糖培養(yǎng)基重懸組織沖洗液，吸管反復(fù)吹打混勻，1000 r/ min ，4 ℃，離心 5 min ，棄去上清。再次加入適量完全低糖培養(yǎng)基，吹打混勻，分別加入一次性培養(yǎng)皿中，放入37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（圖1）。

1.4 兔 BMSCs 培養(yǎng)：1.4.1 原代 BMSCs 培養(yǎng) 向分離得到的細(xì)胞組織懸液加入 10ml 含 20 %胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的 L-DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至中號塑料培養(yǎng)皿內(nèi)。將培養(yǎng)皿置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為 5 %的 CO2孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng) 72 h后使用含 20 %FBS 的 L-DMEM 完全培養(yǎng)基換液。原代培養(yǎng) 5-7 天后，細(xì)胞融合可達 80 %以上。將原代培養(yǎng)的 BMSCs 在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞集落的形成和細(xì)胞形態(tài)（圖2）。

1.4.2 傳代 BMSCs 培養(yǎng) 待原代細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底后，用EDTA胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，F(xiàn)BS 終止消化后將細(xì)胞懸液以 1:3 比例接種于新培養(yǎng)瓶中，加入含 10 %FBS 的 L-DMEM完全培養(yǎng)基 5ml 培養(yǎng)，每隔 2 天換液，約 3-4 天后細(xì)胞可鋪滿瓶底。將傳代培養(yǎng)的 BMSCs 在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。以此方法，向后傳至三代（圖3、4）。

1.5 兔 BMSCs的鑒定

對干細(xì)胞的鑒定主要是建立在對細(xì)胞表面標(biāo)記物的識別基礎(chǔ)上，采用流式細(xì)胞儀特有的細(xì)胞分析技術(shù)，可在短時間內(nèi)精確分析出細(xì)胞表型以及其所占有的比例，使用間接標(biāo)記法標(biāo)記 CD44、CD34。取第3 代 BMSCs 以 2.0×105/mL 重懸，PBS 洗滌細(xì)胞 3次，向細(xì)胞懸液中加入鼠抗兔CD44、CD34 （稀釋 1:100） 為一抗，4 ℃保存 30 min，加入羊抗鼠含 FITC、PE 的二抗，4 ℃避光保存 30min。PBS 洗滌細(xì)胞 3 次后放入流式細(xì)胞儀中檢測。記錄數(shù)據(jù)（圖5、6）。

2 討論

BMSCs具有貼壁性、具有強大的增殖能力和多向分化潛能、具有免疫調(diào)節(jié)功能、具有來源方便，易于分離、培養(yǎng)、擴增和純化，多次傳代擴增后仍具有干細(xì)胞特性，不存在免疫排斥的特性。

2.1更好地增加BMSCs的貼壁性： 在BMSCs培養(yǎng)中，細(xì)胞貼壁培養(yǎng)與傳代成功與否是本實驗的關(guān)鍵。其中存在很多問題，比如在細(xì)胞貼壁方面，用一次性塑料培養(yǎng)皿效果要優(yōu)于可重復(fù)使用的玻璃培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿。塑料培養(yǎng)皿內(nèi)壁有一層鼠尾膠原，它可以更好地促使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁。

2.2 培養(yǎng)基最佳的酸堿度： 培養(yǎng)基中加碳酸氫鈉的目的，是為了在二氧化碳培養(yǎng)箱中平衡培養(yǎng)基中的PH值。對于GBICO的DMEM培養(yǎng)基，3.7g是對應(yīng)二氧化碳培養(yǎng)箱的二氧化碳濃度設(shè)定在10%，而5%的則對應(yīng)的是2g碳酸氫鈉。暴露在空氣中的培養(yǎng)液，因為大氣中二氧化碳的濃度很低，液體中的二氧化碳會氣體分壓高于大氣，因此會逐漸溢出，濃度逐漸降低，液體的PH值也逐漸升高，如果DMEM在空氣中存放時間過長，它將有可能變成紫紅色。一般新配置的顏色正常，在多次開蓋，培養(yǎng)液接觸空氣的時間較長后，顏色會逐漸變成紫紅色，筆者的做法是，配制培養(yǎng)液時加hepes，用小容量的分裝瓶分裝，及盡量減少培養(yǎng)液與空氣的接觸時間。配培養(yǎng)基時，將酸堿度調(diào)至6.9-7.0，過濾后酸堿度會適當(dāng)增高。

2.3 傳代的注意事項

2.3.1 EDTA-胰酶最佳消化時間：具筆者在試驗中的觀察，在BMSCs傳代過程中，根據(jù)培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中貼壁細(xì)胞的覆蓋率確定，當(dāng)BMSCs貼壁達到80%-90%就可以傳代了，用玻璃尖吸管滴入EDTA-胰酶4-7滴，在倒置相差顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞70%由原來的紡錘狀、梭形變化為橢圓形時為最佳時間，一般為1至2分鐘。

2.3.2 加入EDTA-胰酶后的吹打時間與次數(shù) ：加入EDTA-胰酶后，靜置1分鐘，在鏡下觀察細(xì)胞變橢圓或圓形，并有輕度漂浮時，用尖吸管輕輕吹打3-6次即可。

2.3.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物： 雖然目前尚未發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物，Pittenger等認(rèn)為CD29、CD44、CD105、CD166、SH2、SH3為間充質(zhì)干細(xì)胞的重要標(biāo)志物［3］。

綜上所述，對 BMSCs 的形態(tài)學(xué)觀察和表型分子鑒定實驗均證實培養(yǎng)傳代的 BMSCs 的生物學(xué)特性并未發(fā)生明顯改變，說明本實驗的分離培養(yǎng)擴增方法安全有效。本實驗成功的建立了一系列分離、體外培養(yǎng)和擴增兔 BMSCs 的實驗方法，為進一步組織工程研究奠定了實驗基礎(chǔ)。

參考文獻

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［2］骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及生物學(xué)特性 陳建梅姚榮偉 李勇 張馥敏 江蘇醫(yī)藥2010年10月第36卷第19期2306-2308

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【關(guān)鍵詞】 口腔腫瘤;樹突狀細(xì)胞;表型；增殖

Biological characteristics of monocytederived dendritic cells from peripheral blood of patients with oral carcinoma

【Abstract】 AIM: To investigate the morphology， phenotype and functions of dendritic cell (DC) from peripheral blood of the healthy inpiduals and the patients with oral carcinoma. METHODS: Fifteen patients with oral carcinoma at stages of II or above were assigned to study group and 15 healthy volunteers to control group. Monocytes were isolated by density centrifugation， and cultured in the presence of GMCSF， IL4 and TNFα for 7 d in vitro. The morphological change of the cultured cells was observed by light microscopy and electron microscopy. The expressions of CD83， CD1a， CD86， CD80， HLADR were analyzed by flow cytometry. The ability of DC to stimulate the proliferation of lymphocyte in mixed lymphocyte reactions (MLR) was determined with the method of MTT. RESULTS: Morphologically and phenotypically typical DC was obtained in the 2 groups after culture for 7 d. The expression rates of CD83， CD1a on DC from the patients were 49.3±9.5 and 48.1±7.3 respectively，significantly lower than those from healthy volunteers (P0.05). Moreover， the mean fluorescence intensity of CD83， CD1a， CD80， CD86 and HLADR expressed in study group were 4.80±2.13， 3.96±1.15， 19.63±8.12， 12.33±6.75 and 39.44±7.9， respectively， which were lower but not statistically different from the control group (P>0.05). In addition， DC from the study group had the ability to stimulate the proliferation of allogeneic and autogenous lymphocytes in vitro. CONCLUSION: Monocytes in peripheral blood of the patients with oral carcinoma can be induced to differentiate into mature DC with the ability to stimulate the proliferation of lymphocytes， and so these DC might be used in immunotherapy for oral carcinoma.

【Keywords】 mouth neoplasms; dendritic cell; phenotyping; proliferation

【摘要】 目的: 研究口腔癌患者外周血樹突狀細(xì)胞(DC)的形態(tài)、表型和功能性變化及其臨床意義. 方法： 口腔癌患者（實驗組）及正常人（對照組）15例外周血單個核細(xì)胞經(jīng)GMCSF，IL4及TNFα誘導(dǎo)培養(yǎng)， 獲取成熟DC， 光鏡和電鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型如CD1a，CD83，CD80，CD86和HLADR等分子的表達變化，用噻唑藍（MTT）法檢測DC與自體和同種異體的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）中對淋巴細(xì)胞增殖的刺激能力. 結(jié)果： 正常人及口腔癌患者的外周血單個核細(xì)胞經(jīng)體外7 d誘導(dǎo)培養(yǎng)，均誘導(dǎo)出具有典型形態(tài)和表型的DC，其中實驗組細(xì)胞的CD83，CD1a表達率分別為49.3±9.5和48.1±7.3，與對照組兩者表達率62.1±7.9和60.2±6.8相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);實驗組DC細(xì)胞CD83，CD1a，CD86，CD80和HLADR表達的平均熒光指數(shù)(MFI)分別為4.80±2.13，3.96±1.15，12.33±6.75，19.63±8.12和39.44±7.9， 均低于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);口腔癌患者來源的DC在體外具有誘導(dǎo)同種異體和自體外周血T細(xì)胞增殖的能力. 結(jié)論： 口腔癌患者外周血單核細(xì)胞來源可誘導(dǎo)成為具有功能性的成熟DC，該細(xì)胞可應(yīng)用于口腔癌的免疫治療.

【關(guān)鍵詞】 口腔腫瘤;樹突狀細(xì)胞;表型；增殖

0引言

目前，對口腔癌的治療手段仍以手術(shù)為主，由于頜面部能提供的切除面積有限，有時很難實現(xiàn)距腫瘤邊緣1.5 cm清除病灶，而且手術(shù)本身造成的面部畸形嚴(yán)重破壞了患者的口腔功能和心理健康. 因此，如何縮小手術(shù)范圍、有效控制臨近亞病灶及微小病灶的發(fā)展是亟待解決的問題. 樹突狀細(xì)胞（dendritic cells， DC）是已知功能最強的抗原提呈細(xì)胞，并被認(rèn)為是抗腫瘤免疫治療的一種非常有前途的方法［1-3］，由于DC對T細(xì)胞的活化受MHC限制，故臨床應(yīng)用的DC細(xì)胞及其疫苗必須使用腫瘤患者自身來源的DC，那么從腫瘤患者的外周血單個核細(xì)胞中能否經(jīng)過體外誘導(dǎo)產(chǎn)生出功能性DC，口腔癌患者與健康人DC細(xì)胞的表型及其抗原提呈分子的表達以及刺激淋巴細(xì)胞增殖能力有何不同，因此本研究旨在為臨床以DC為基礎(chǔ)的免疫治療提供實驗依據(jù).

1材料和方法

1.1材料RPMI培養(yǎng)基(Hyclone USA)， 淋巴細(xì)胞分離液(上海恒生公司 )， 重組人單核巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGMCSF)，重組人白細(xì)胞介素4 (rhIL4)， 腫瘤壞死因子α(TNFα)均使用美國Peprotech Asia公司產(chǎn)品. 取200505/200510來我院口腔科住院治療的口腔癌患者15例作為實驗組，本組病例均經(jīng)術(shù)后病理證實；對照組為健康志愿者15例. 兩組人員均排除感染、糖尿病、血液病和自身免疫性疾病.

1.2方法無菌采集外周血50 mL，肝素鈉抗凝. 加入等量無鈣鎂DHanks緩沖液（pH 7.4），充分混勻. 取50 mL離心管加入Ficoll淋巴細(xì)胞分離液20 mL后，再沿壁小心加入上述稀釋的外周血20 mL，2000 r/min， 20 min離心，分離外周血單個核細(xì)胞. 小心吸取中間層細(xì)胞，用DHanks洗滌細(xì)胞3次，棄上清，用含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×1010個/L，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔3 mL. 于50 mL/L CO2，37℃條件下孵育2～3 h后，吸出培養(yǎng)上清和非貼壁細(xì)胞（用于其他實驗），用預(yù)熱37℃的培養(yǎng)基清洗板1次，以去除非貼壁細(xì)胞，獲得貼壁的單核細(xì)胞，加入含1 MU/L rhGMCSF和0.5 MU/L rhIL4的RPMI 1640完全培養(yǎng)基于37℃ 50 mL/L CO2進行培養(yǎng)，孵育至第5日時，每孔加入TNFα 0.2 MU/L， 7 d后得到成熟的DC［4］. 誘導(dǎo)培養(yǎng)1，3，5，7 d時用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化及DC形成，在培養(yǎng)的7 d收集DC，調(diào)細(xì)胞密度為1×107/L，分為兩份，一份用10 g/L戊二醛固定30 min，梯度乙醇脫水，叔丁醇干燥，噴金，掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài). 另一份用25 g/L戊二醛固定， 鋨酸后固定， 醋酸鈉、 檸檬酸鉛雙重染色， 透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu).

1.2.1FACS測定細(xì)胞表型收集體外培養(yǎng)5，7和10 d的外周血單個核細(xì)胞，臺盼藍染色，確定細(xì)胞活力在95%以上，分別加入直標(biāo)熒光的，如PE標(biāo)記的CD1a，CD86，HLADR，IgG1（對照），F(xiàn)ITC標(biāo)記的CD83，CD80，IgG2（對照），充分均勻染色(4℃， 避光， 30 min)后FACS行細(xì)胞表型檢測.

1.2.2混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)非貼壁細(xì)胞調(diào)整密度為2×109/L，加入96孔培養(yǎng)板中，分別按10∶1， 20∶1和40∶1的比例加入上述培養(yǎng)的兩組DC（保持T細(xì)胞數(shù)為105），該DC先用25 mg/L絲裂霉素于37℃孵育45 min，然后調(diào)整細(xì)胞密度為2×108/L，加入培養(yǎng)板各孔內(nèi)，總體積200 μL/孔，各實驗組分設(shè)3復(fù)孔，混勻，同時設(shè)對照組. 37℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)72 h. 于實驗培養(yǎng)終止前4 h，加入MTT液（5 g/L） 20 μL/孔，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心培養(yǎng)板（1000 r/min， 5 min），棄上清，每孔加入DMSO（二甲基亞砜） 150 μL，充分混勻，靜置數(shù)分鐘，檢測每孔490 nm的A值，計算細(xì)胞培養(yǎng)指數(shù)［5］. 增殖指數(shù)（SI）=試驗孔A均值/對照孔A均值.

統(tǒng)計學(xué)處理： 采用SPSS11.0軟件包進行統(tǒng)計分析; 兩組樣本均數(shù)的比較用t檢驗，多樣本均數(shù)比較用方差分析， P

2結(jié)果

2.1培養(yǎng)DC的形態(tài)學(xué)特點人外周血貼壁細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞聚集成大小不等的細(xì)胞聚體， 3 d可見細(xì)胞聚集成團， 少量懸浮生長，部分細(xì)胞體積增大. 5 d懸浮細(xì)胞數(shù)量增多， 細(xì)胞表面有細(xì)小突起形成. 7 d懸浮細(xì)胞或細(xì)胞團顏色變深，有明顯樹突狀突起，掃描電鏡觀察，表面粗糙， 胞體向周圍伸出大量樹枝狀或裙褶狀不規(guī)則突起. 透射電鏡觀察， 細(xì)胞表面伸出長短不一的突起， 線粒體致密化，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張成池狀，溶酶體較少（圖1），呈明顯的DC細(xì)胞特征.

圖1人外周血單個核細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d DC形態(tài)TEM ×10 000　略

2.2體外誘導(dǎo)DC細(xì)胞的表型變化人外周血單個核細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后，實驗組（口腔癌患者）DC細(xì)胞的CD83和CD1a的表達率較對照組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);實驗組DC細(xì)胞的CD83，CD1a，CD86，CD80和HLADR表達的平均熒光指數(shù)(MFI)雖然均低于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表1）.

表1口腔癌患者外周血DC表面分子的表達比較（略）

2.3DC對淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響在自體和同種異體淋巴細(xì)胞反應(yīng)體系中，隨著DC比例增加，實驗組和對照組淋巴細(xì)胞增殖能力均明顯增強，實驗組自體AMLR增殖均值由1.8升至3.2，健康人自體AMLR增殖均值由2.2升至4.1，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P

圖2DC對T細(xì)胞增殖的影響　略

3討論

近年來，對實體瘤的免疫生物治療稱為腫瘤防治的研究熱點，免疫防御機制用于頭頸部癌的治療已顯示較好療效［6］，而DC作為體內(nèi)功能最強的專職性抗原遞呈細(xì)胞（APC），能刺激未致敏T細(xì)胞的增殖和活化、啟動機體的特異性免疫應(yīng)答，在腫瘤免疫治療中發(fā)揮著重要作用. 人體內(nèi)DC大多處于不成熟狀態(tài)，激活淋巴細(xì)胞反應(yīng)的能力較低，但具有極強的抗原內(nèi)吞能力. 在攝取抗原或接受某些刺激因素后DC可以分化成熟，由于體內(nèi)DC數(shù)量少而且分布廣泛，難以分離純化，怎樣通過簡單有效的方法制備出大量的功能性DC來滿足臨床需要，是亟待解決的問題.

目前，體外培養(yǎng)的DC主要來源于外周血、骨髓和臍血. 我們應(yīng)用口腔癌患者和健康人外周血單個核細(xì)胞誘導(dǎo)DC的產(chǎn)生. 因為外周血采集方法簡單易行，容易獲取，而且與骨髓相比不易污染腫瘤細(xì)胞. 研究表明，在決定DC是否可以發(fā)育成熟的調(diào)控因素中，GMCSF，IL4和TNFα是極其重要的誘導(dǎo)因子，其中GMCSF可促進髓系細(xì)胞發(fā)育，是維持DC發(fā)育和分化的最根本的細(xì)胞因子；IL4可促進干細(xì)胞及單核細(xì)胞分化發(fā)育成DC，并維持DC于未成熟狀態(tài)，使其具有很強的處理外源性抗原的能力［7］. 在DC培養(yǎng)過程中加入TNFα可以促進DC成熟，使其具有強的刺激T細(xì)胞的活性，并抑制DC凋亡［8-9］.

我們對口腔癌患者及健康人外周血單個核細(xì)胞經(jīng)GMCSF，IL4和TNFα 3種細(xì)胞因子體外誘導(dǎo)分化，獲得具有典型DC細(xì)胞形態(tài)特征的DC. 經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)至第7日時兩組DC均高表達CD86，CD80，HLADR，差異無顯著性，與文獻［10］報道一致. 而兩組DC之間CD83和CD1a的表達率有明顯差異. CD83是目前公認(rèn)的成熟DC標(biāo)志分子，我們考慮該差異源于兩組PBMC的貼壁率和DC轉(zhuǎn)換率不同. Onishi等［11］認(rèn)為晚期腫瘤患者的單個核細(xì)胞來源的DC中存在一種叫短壽命的亞群，培養(yǎng)超過7 d，較短命的亞群死亡，幸存的DC無論是表面分子表達、MLR和抗原提呈能力均與健康人相似. 本實驗結(jié)果顯示，患者單個核細(xì)胞來源的DC在體外同樣具有激發(fā)自體和同種異體外周血T細(xì)胞增殖的作用，并且隨著DC數(shù)量的增加對淋巴細(xì)胞增殖能力刺激作用增強. 我們認(rèn)為，口腔癌患者來源的MoDC在初始狀態(tài)可能與健康人有一定的免疫學(xué)差異，但是通過合理的因子組合培養(yǎng)后，同樣能發(fā)揮針對自身疾病的免疫治療作用，從而避免使用他人血源的排斥反應(yīng)，怎樣針對患者自身來源的DC特性選擇更合適的培養(yǎng)手段，發(fā)揮它的特異性免疫治療效果，尚需進一步研究.

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【關(guān)鍵詞】 種子細(xì)胞

【Abstract】 AIM: To purify and culture human bone marrowderived endothelial progenitor cells (EPCs) in vitro and to observe their biological characteristics. METHODS: Mononuclear cells were isolated from bone marrow suspension by density gradient centrifugation and EPCs were harvested in the endothelial growth medium (EGM2). EPCs were observed under microscope， the cell growth was calculated by cell counting and the cells were identified by electronic microscope examination and immunofluorescence staining for the expression of Ⅷ/vWF， vascular endothelial growth factor receptor2 （VEGFR2）. RESULTS: The culturedishadherent EPCs uniformly had a round or spindle shape and reformed clones with cobblestone morphology. The cells could be identified by the positive staining for VEGFR2 and Ⅷ/vWF. WeibelPaladle bodies could be seen under transmission electron microscope. CONCLUSION: EPCs are one group of stem cells in the bone marrow with the capacity of differentiating into endothelial cells. They can be purified and cultured by density gradient centrifugation and subjected to culture in vitro with endothelial growth medium (EGM2 MV). These findings suggest that EPCs may be a new seed cell of tissue engineering.

【Keywords】 bone marrow; endothelium/cytology; stem cells; tissue engineering; seed cells

【摘要】 目的： 體外分離純化人骨髓內(nèi)皮前體干細(xì)胞，研究其基本生物學(xué)特性. 方法： 利用密度梯度離心法分離成人骨髓得到單個核細(xì)胞，再用內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)得到內(nèi)皮前體干細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長特性，通過檢測細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR2）、Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體表達和透射電鏡對培養(yǎng)細(xì)胞進行鑒定. 結(jié)果： 原代培養(yǎng)后細(xì)胞貼壁生長，7~10 d形成集落或融合呈卵石形，免疫組化熒光染色后結(jié)果顯示VEGFR2， Ⅷ/vWF 陽性，透射電鏡顯示細(xì)胞內(nèi)具有特征性的WP小體. 結(jié)論： 用密度梯度離心法和條件培養(yǎng)可以從骨髓得到高純度內(nèi)皮前體干細(xì)胞，該細(xì)胞具有與血管內(nèi)皮細(xì)胞共同的特征，可以進一步分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，是理想的組織工程種子細(xì)胞.

【關(guān)鍵詞】 骨髓；內(nèi)皮/細(xì)胞學(xué)；干細(xì)胞；組織工程；種子細(xì)胞

0引言

隨著干細(xì)胞研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮前體細(xì)胞（endothelial progenitor cells， EPCs）是具有活躍分化潛能的干細(xì)胞，具有游走特征并能進一步增殖分化為內(nèi)皮細(xì)胞.它不僅參與胚胎期的血管發(fā)育，也存在于成年機體的骨髓和外周血中，在成體血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育中起重要作用，可以作為種子細(xì)胞用于人工血管、組織工程瓣膜內(nèi)皮化的研究與應(yīng)用［1］. EPCs的研究愈來愈受到關(guān)注，但分離相對困難，關(guān)于其培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究少見報道. 為進一步探討EPCs作為組織工程種子細(xì)胞的可能性與優(yōu)越性，我們進行人骨髓內(nèi)皮前體細(xì)胞的分離培養(yǎng)和生物學(xué)特性的研究.

1材料和方法

1.1材料

骨髓取自健康志愿者. 內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基（EGM2， Clonetics， USA），內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基補充物（EGM2 MV SingleQuots， Clonetics， USA），其中包含有胎牛血清（FBS）、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF）、成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF2）、胰島素樣生長因子1(IGF1）以及抗生素等，黏連蛋白（FibronectinFn，Sigma），淋巴細(xì)胞分離液與PBS液（TBD公司），胰蛋白酶（Gibco），Hanks平衡鹽液（Gibco），VEGFR2兔抗（NeoMarkers，USA），第Ⅷ因子鼠抗(北京中山公司），二抗（FITC羊抗鼠與Cy3羊抗兔，Sigma），F(xiàn)ITCconjugated CD34鼠抗（R & D公司）.

1.2方法

1.2.1骨髓中單個核細(xì)胞的分離［2］無菌條件下，取人骨髓液5 mL，加入肝素，用PBS液充分混勻，轉(zhuǎn)入離心管，輕輕地層加到1077 g/L的淋巴細(xì)胞分離液上，2000 r/min離心20 min，收集中間的單個核細(xì)胞層，用PBS液1000 r/min離心洗滌2次×10 min以洗除殘余淋巴細(xì)胞分離液，然后收集細(xì)胞備用.

1.2.2EPCs的培養(yǎng)收集骨髓中單個核細(xì)胞，用含胎牛血清和多種生長因子的內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基混勻，制成細(xì)胞懸液，接種于以黏連蛋白（Fn）包被的培養(yǎng)瓶中，置37℃含50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)，第4日換液，去除非貼壁細(xì)胞，此后每3~4 d換液1次. 相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞長滿瓶底的80%，用0.125 g/L胰酶消化，并以2×107/ L細(xì)胞數(shù)傳入24孔培養(yǎng)板中，每日取4孔細(xì)胞進行計數(shù)并求均數(shù)，繪制細(xì)胞生長曲線，計算細(xì)胞群體倍增時間.

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測取對數(shù)生長期骨髓EPCs， 以0.125 g/L胰酶消化后制備單細(xì)胞懸液，測定細(xì)胞生長周期；同時，檢測細(xì)胞表面抗原CD34表達，鑒定所得細(xì)胞純度.

1.2.4EPCs細(xì)胞表面抗原免疫熒光染色檢測培養(yǎng)10 d的細(xì)胞進行免疫熒光化學(xué)染色，檢測細(xì)胞表面抗原VEGFR2與Ⅷ/vWF等表達情況，選取培養(yǎng)10 d的成纖維細(xì)胞進行免疫熒光化學(xué)染色作為對照組. 過程如下： 細(xì)胞片用PBS液洗，然后用40 g/L多聚甲醛常溫處理30 min，再用含50 mg/L馬血清和50 mg/L小牛血清的PBS液浸泡30 min，去除非特異性標(biāo)記，再加入VEGFR2， Ⅷ因子mAb （1∶100），37℃孵育過夜，用PBS液洗3次，加入熒光標(biāo)記二抗，37℃搖床孵育1 h，熒光顯微鏡下拍照.

1.2.5電鏡檢查體外培養(yǎng)10 d，離心收集EPCs，用3 g/L戊二醛固定過夜，細(xì)胞團用PBS 洗3 次×10 min，1 g/L四氧化鋨4℃固定30 min， PBS洗3次×10 min，丙酮系列脫水，包埋并制作超薄切片，透射電鏡觀察拍照.

轉(zhuǎn)貼于

2結(jié)果

2.1骨髓EPCs體外培養(yǎng)及擴增用梯度密度離心法從骨髓中分離出單個核細(xì)胞層后，用內(nèi)皮細(xì)胞生長條件培養(yǎng)基培養(yǎng)，并通過換液去除非貼壁細(xì)胞，所得貼壁細(xì)胞即為骨髓內(nèi)皮前體細(xì)胞. 原代培養(yǎng)4 d內(nèi)，細(xì)胞呈圓形（Fig 1A）；培養(yǎng)7 d后，細(xì)胞鋪展呈橢圓形或短梭形，并迅速增殖，10 d后出現(xiàn)細(xì)胞融合呈“鋪路卵石樣”（Fig 1B），約14 d可傳代. 傳代后細(xì)胞于24 h內(nèi)完全貼壁，接種后第1~3日為潛伏適應(yīng)期，從第4日起細(xì)胞增殖迅速并進入對數(shù)生長期，第7日達高峰，此后進入平臺期，細(xì)胞生長曲線如Fig 2所示. 同時，依據(jù)生長曲線計算細(xì)胞群體倍增時間約為36 h.

2.2流式細(xì)胞儀檢測貼壁細(xì)胞消化后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原CD34表達，結(jié)果顯示細(xì)胞均一性較好（陽性表達率72%），說明采用本實驗中分離細(xì)胞的方法可得到較高純度的骨髓EPCs. 同時，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞生長周期，結(jié)果顯示： G0/G1期細(xì)胞為71.1%，G2/M期細(xì)胞為14.7%，S期細(xì)胞為14.2%，說明EPCs細(xì)胞增殖比較活躍.

2.3骨髓EPCs表面標(biāo)記的檢測EPCs細(xì)胞均表達Ⅷ/vWF，免疫熒光染色呈陽性，細(xì)胞胞質(zhì)呈綠色，胞核不染色（Fig 3A）；EPCs細(xì)胞均表達VEGFR2，免疫熒光染色呈陽性，細(xì)胞胞質(zhì)呈磚紅色，胞核不染色（Fig 3B）. 對照組成纖維不表達Ⅷ/vWF與VEGFR2，免疫熒光染色呈陰性，細(xì)胞胞質(zhì)和胞核均不染色.

2.4骨髓EPCs超微結(jié)構(gòu)觀察細(xì)胞邊緣可見較多絨毛狀突起，胞質(zhì)內(nèi)還見一種短棒狀小體，即Weibel Palade氏小體，是內(nèi)皮細(xì)胞特征性的細(xì)胞器（Fig 4）.

3討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，EPCs具有游走特征并能進一步增殖分化為內(nèi)皮細(xì)胞，它不僅參與胚胎期的血管發(fā)育，也存在于成年機體的骨髓和外周血中，在成體血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育中起重要作用. 1997年Asahara等［3］成功地在體外將CD34+細(xì)胞誘導(dǎo)生成血管內(nèi)皮細(xì)胞，并于體內(nèi)證明其生血管能力，說明EPCs是CD34+細(xì)胞重要亞群. 因此，EPCs有望成為血管組織工程內(nèi)皮種子細(xì)胞的新來源.

EPCs是CD34+細(xì)胞重要亞群，多采用吸附單克隆抗體－磁珠分離系統(tǒng)(MACS)進行分離得到，此法所得細(xì)胞均一性好，純度高，但價格昂貴，實用價值欠佳，同時，EPCs吞噬的磁性微粒也必然影響細(xì)胞的代謝及功能［4］. 本實驗中，根據(jù)細(xì)胞密度的差異，針對EPCs屬于單核類細(xì)胞的特點，抽取骨髓后，用密度梯度離心法分離出單個核細(xì)胞層，再利用內(nèi)皮細(xì)胞生長條件培養(yǎng)基外加黏連蛋白黏附特性，最終所得貼壁細(xì)胞即為EPCs. 同時，我們對所得到的骨髓EPCs用流式細(xì)胞儀檢測表面抗原表達，結(jié)果顯示細(xì)胞均一性較好，CD34陽性表達率72%，也進一步鑒定了所得到的細(xì)胞為較高純度的骨髓內(nèi)皮前體細(xì)胞. 此方法簡單、經(jīng)濟、高效，具用較高的應(yīng)用價值.

VEGFR2是內(nèi)皮細(xì)胞生長的早期表面受體，主要出現(xiàn)在內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的早期［5］. Ⅷ因子是內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原，可以通過vWF的測定對內(nèi)皮細(xì)胞進行鑒定［6］. 本實驗中人骨髓EPCs呈貼壁生長，隨體外培養(yǎng)時間延長，其形態(tài)由早期圓形鋪展呈橢圓形或短梭形，并迅速增殖，出現(xiàn)細(xì)胞融合呈“鋪路卵石樣”. 培養(yǎng)一定時間后，細(xì)胞增殖速度由快變慢，胞體變大、胞質(zhì)疏松，提示EPCs增殖活力下降. 原代培養(yǎng)生長曲線顯示，EPCs的體外培養(yǎng)經(jīng)歷了生長滯緩期、對數(shù)增殖期和生長平臺期，其增生分裂能力活躍，體外培養(yǎng)可以實現(xiàn)快速擴增. 此外，分離得到的骨髓EPCs具有與血管內(nèi)皮細(xì)胞共同的特征，細(xì)胞呈鵝卵石狀貼壁生長，均表達VEGFR2， Ⅷ/vWF，胞質(zhì)內(nèi)還可見內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記短棒狀小體，即Weibel Palade氏小體.

EPCs存在于成年機體的骨髓和外周血中，可以自體取材，避免新的機體創(chuàng)傷和免疫排斥反應(yīng). 同時，EPCs增生分裂能力活躍，體外培養(yǎng)可以實現(xiàn)快速擴增，能進一步分化為內(nèi)皮細(xì)胞，參與成體血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育、創(chuàng)傷愈合、腫瘤生長等病理生理過程［7］. 因此，EPCs可以作為理想的內(nèi)皮種子細(xì)胞來源，用于人工血管、組織工程瓣膜內(nèi)皮化研究，具有潛在的臨床應(yīng)用價值.

【參考文獻】

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［3］ Asahara T， Murohara T， Sullivan A. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis ［J］. Science， 1997;275(14):964-967.

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篇6

[關(guān)鍵詞]醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué) 教學(xué)改革

[中圖分類號]G622 [文獻標(biāo)識碼]A [文章編號]1009-5349（2015）12-0233-01

臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)是一門實踐性很強的應(yīng)用科學(xué)專業(yè)。它致力于培養(yǎng)具備基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)的基本理論和醫(yī)療預(yù)防的基本技能，能在醫(yī)療衛(wèi)生單位、醫(yī)學(xué)科研等部門從事醫(yī)療及預(yù)防、醫(yī)學(xué)科研等方面工作的醫(yī)學(xué)高級專門人才。該專業(yè)學(xué)生主要學(xué)習(xí)醫(yī)學(xué)方面的基礎(chǔ)理論和基本知識，人類疾病的診斷、治療、預(yù)防方面的基本訓(xùn)練。要具有對人類疾病的病因、發(fā)病機制做出分類鑒別的能力。隨著細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的相關(guān)知識和理論在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用的不斷深入，“細(xì)胞生物學(xué)”已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的重要基礎(chǔ)，在醫(yī)學(xué)教育中占有重要的地位。對于現(xiàn)代醫(yī)科學(xué)生來說，具備“細(xì)胞生物學(xué)”的相關(guān)基礎(chǔ)知識和基本技能，是進一步學(xué)習(xí)其他醫(yī)學(xué)課程必不可少的條件。

一、醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)課程內(nèi)容體系和結(jié)構(gòu)

我校醫(yī)學(xué)本科專業(yè)自1978年開設(shè)以來，在教育部組織的1997年、2006年本科教學(xué)工作水平評估中分別達到“優(yōu)”和“良”的水平。為內(nèi)蒙古、吉林、遼寧等全國各地區(qū)培養(yǎng)了一萬多名合格的高級醫(yī)學(xué)專業(yè)人才，臨床專業(yè)畢業(yè)生遍布全國各省及美國、日本等國家。所招學(xué)生范圍逐年擴大，并分為漢班和蒙班，其中蒙班學(xué)生為蒙古族，他們主要為蒙古族中小學(xué)考上來的，蒙語授課兼修漢語。

醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)以細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)為基礎(chǔ)，是探索研究人體細(xì)胞發(fā)生、發(fā)育、增殖、衰老、死亡以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的異常與人類疾病關(guān)系的學(xué)科。課程基本內(nèi)容有13章，包括細(xì)胞生物學(xué)緒論、細(xì)胞膜的化學(xué)組成與特性、細(xì)胞表面與細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞膜的功能、細(xì)胞的內(nèi)膜系統(tǒng)、線粒體、核糖體、細(xì)胞骨架、細(xì)胞核與遺傳物質(zhì)儲存、細(xì)胞中遺傳信息的傳遞及調(diào)控、細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、細(xì)胞衰老與死亡。第1章，引領(lǐng)學(xué)生進入醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)課程，指導(dǎo)學(xué)生如何學(xué)習(xí)這門課；第2―9章為基礎(chǔ)理論知識，學(xué)習(xí)醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)特有的細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能及其與疾病關(guān)系；第10―13章，主要以細(xì)胞為整體，看細(xì)胞的“一生”變化。通過這三部分的學(xué)習(xí)，能夠使學(xué)生掌握人體細(xì)胞的知識，同時把細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的異常與人類疾病關(guān)系滲透到各個章節(jié)。

二、醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)與其他課程的聯(lián)系

醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)在臨床專業(yè)培養(yǎng)計劃中，大一開課，這充分體現(xiàn)了該課程的基礎(chǔ)性。其后的課程有生物化學(xué)、組織學(xué)與胚胎學(xué)、生理學(xué)、病理學(xué)、免疫學(xué)等。組織學(xué)與胚胎學(xué)是相互關(guān)聯(lián)的兩門學(xué)科，習(xí)慣列為一門專業(yè)基礎(chǔ)課程。組織學(xué)是研究機體微細(xì)結(jié)構(gòu)及其相關(guān)功能的科學(xué)。胚胎學(xué)主要是研究從受精卵發(fā)育為新生個體的過程及其機理的科學(xué)，其研究內(nèi)容包括生殖細(xì)胞發(fā)生、受精、胚胎發(fā)育、胚胎與母體的關(guān)系、先天性畸形等。在其內(nèi)容中涉及細(xì)胞的知識較多，比如什么是生殖細(xì)胞、細(xì)胞分化的原理、細(xì)胞分裂產(chǎn)生新的細(xì)胞等等。如果沒有學(xué)習(xí)相應(yīng)的細(xì)胞生物學(xué)課程，很難理解這些基本概念與原理。生理學(xué)是研究機體正常生命活動規(guī)律的一門課程，學(xué)生能夠?qū)W習(xí)人體各器官的基本功能，認(rèn)識機能與結(jié)構(gòu)的聯(lián)系，理解機體的整體統(tǒng)一性及與環(huán)境的對立統(tǒng)一關(guān)系。其內(nèi)容包括細(xì)胞、組織、器官和系統(tǒng)的基本功能及功能調(diào)節(jié)。該課與細(xì)胞生物學(xué)關(guān)聯(lián)緊密，很多人體生理活動，都是以細(xì)胞為基礎(chǔ)。比如細(xì)胞的Na-K離子泵工作原理闡釋了物質(zhì)在細(xì)胞兩側(cè)的運輸，從而調(diào)節(jié)人體內(nèi)環(huán)境滲透壓平衡。

生物化學(xué)是運用化學(xué)的理論與方法，從分子水平研究生命現(xiàn)象的科學(xué)，能夠使學(xué)生獲得生物化學(xué)的基本理論、基本知識和基本技能。其內(nèi)容包括蛋白質(zhì)與核酸化學(xué)、維生素、酶、生物氧化、物質(zhì)代謝及其調(diào)節(jié)、肝臟生化和酸堿平衡等。這里提到的核酸是細(xì)胞內(nèi)的遺傳信息載體，生物氧化、物質(zhì)代謝多發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)，可見，離開了細(xì)胞，生物化學(xué)這門課程將無法開展。病理學(xué)是一門研究疾病的病因、發(fā)病機制、病理改變（包括代謝、機能和形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變）和轉(zhuǎn)歸的醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)學(xué)科。其目的是認(rèn)識和掌握疾病的本質(zhì)的發(fā)生發(fā)展的規(guī)律，從而為防治疾病提供必要的理論基礎(chǔ)和實踐依據(jù)。人類很多疾病的本質(zhì)是特定細(xì)胞的損傷，比如高膽固醇血癥，主要發(fā)病原因是細(xì)胞膜上的受體缺失或無法識別供體。因此，在介紹這類疾病時，就需要掌握細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜的功能等細(xì)胞生物學(xué)內(nèi)容。醫(yī)學(xué)免疫學(xué)研究機體免疫系統(tǒng)的組織結(jié)構(gòu)和生理功能的科學(xué)，其基本定義概念如抗原、抗體，這些都是細(xì)胞內(nèi)外存在的物質(zhì)。

因此，隨著我校臨床專業(yè)培養(yǎng)計劃的改革發(fā)展，醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)必定成為必不可少的專業(yè)基礎(chǔ)課程，需要加以重視。

【參考文獻】

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篇7

【關(guān)鍵詞】中醫(yī)；生物學(xué)；生物技術(shù)；研究

【中圖分類號】Q81 【文獻標(biāo)識碼】A 【文章編號】1008-6455（2010）11-0248-02

Study of TCM bioengineeing

Ouyang Xuejian

【Abstract】From angle of TCM bioengineering probe into TCM basic theory and way of study, to basis of TCM and clinical research mean much.

【Key words】traditional chinese medicine (TCM); biology; biotechnology; study

隨著TCM的不斷創(chuàng)新，用現(xiàn)代中醫(yī)生物學(xué)的研究手段，完善TCM的基礎(chǔ)理論是必經(jīng)之路。

1生命之書

1960年首次被破譯遺傳密碼，分子生物學(xué)家對復(fù)雜的細(xì)胞分子進行了分類。人類基因從遠(yuǎn)古到現(xiàn)代以密碼的形式表達出來，展現(xiàn)在科學(xué)家面前。常有一種誤解基因代表每個特性，這種誤解并沒有因基因測序而被消除，并被加強了這是因為單基因病被討論[1]，事實上許多遺傳性疾病是由多個基因以某種未知方式相互作用的結(jié)果。人類基因組的解譯，象征著思想變革的始點走向未來。

2生物學(xué)革命

細(xì)胞生物學(xué)革命并不是基因組的解譯，而是基因行為方式和序列間相互作用的發(fā)現(xiàn)，但必須通過實驗才能得到體現(xiàn), 即閱讀細(xì)胞故事要歸功于生物學(xué)-DNA芯片[2]。它能同時觀測許多基因行為的是基因組測序。即一個細(xì)胞隨時有數(shù)千個基因開啟，它不僅開啟一個或兩個基因來完成任務(wù)，并在任務(wù)完成后再將它們關(guān)閉，但其理論的構(gòu)建并不是輕易獲得的。分子和細(xì)胞生物學(xué)[8]，簡潔一流的理論很少見，蛋白質(zhì)A開啟了蛋白質(zhì)B，然后激活蛋白質(zhì)C，如果大家能理解將對研究很有幫助。生物學(xué)家并引入了物理學(xué)概念，尋找簡潔一流理論，但是并不表明研究的系統(tǒng)是簡潔的。物理學(xué)家設(shè)計的理論用于解釋大量分子行為，如氧的彌散在介質(zhì)的作用下，個體特性會淹沒在團體行為的模式下?；蚝偷鞍踪|(zhì)更具挑戰(zhàn)性，因為它們不移動，不隨機相互作用，但能選擇性的參與某一功能性活動。化學(xué)提供了另一組工具，一些非生命系統(tǒng)中的化學(xué)過程與生物化學(xué)過程一樣復(fù)雜混亂，但并不妨礙被計算機模型所獲取，其結(jié)論是使復(fù)雜的模型簡單化，原因是一些成分可以被忽略。

3計算機模擬藝術(shù)

它不僅分析數(shù)據(jù)也是一種重要工具。物理學(xué)家把其藝術(shù)帶入到了精密狀態(tài)，天體物理學(xué)家能模擬整個星系世界，生物學(xué)家就能模擬細(xì)胞的微觀世界。計算機模擬復(fù)雜的真實細(xì)胞，預(yù)測基因活性與細(xì)胞功能變化的基因組，并建立了數(shù)據(jù)庫。研究細(xì)胞中多種過程的比較模型，許多蛋白質(zhì)能同時催化大范圍化學(xué)反應(yīng)，不同反應(yīng)的相對重要性會因基因被激活而產(chǎn)生某種蛋白而再次關(guān)閉，來模擬整個細(xì)胞行為。工程學(xué)認(rèn)為一個細(xì)胞事件不會簡單的導(dǎo)致某一事件發(fā)生，有時一個過程會影響某個過程發(fā)生，用工程學(xué)術(shù)語描述就是反饋。即角加速時人體向一側(cè)傾倒，此時膜半規(guī)管內(nèi)淋巴液向相反方向流動刺壺腹嵴產(chǎn)生神經(jīng)沖動，傳至平衡中樞維持人體平衡，這就是人置與平衡中樞間的反饋，這種自我調(diào)節(jié)在工程學(xué)中十分常見。即可用“控制論”和“系統(tǒng)論”來描述它，生物學(xué)家已應(yīng)用在細(xì)胞中。描述生物學(xué)功能包含擴大、改編、加強、絕緣、糾錯和一致性檢測等概念。描述新的生物學(xué)語言將來源于綜合科學(xué)，即計算機科學(xué)或生物工程學(xué)等學(xué)科[3、4]。

4網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)

世界范圍互聯(lián)網(wǎng)中的信息總是最新的，那里有通信、高速公路、鐵路、航運等，為網(wǎng)路提供能量、電流、水、物質(zhì)、友誼等，細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)它們是如此相似。細(xì)胞中每一類分子都視為網(wǎng)絡(luò)的組成部分，任何兩個分子之間均有聯(lián)系，共同參與生物化學(xué)反應(yīng)，結(jié)論就是細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)與許多社會網(wǎng)絡(luò)一樣，有著相同的連通結(jié)構(gòu)。這樣的共性對于定義基因間的相互作用很有幫助，但并不是所有網(wǎng)絡(luò)都相同[5、6]，有時幾個連接破壞而迅速瓦解，有時即便有許多連接被破壞，任何兩個節(jié)點間仍可保持通暢，細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)也是如此。理解了生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)的特點，為組建細(xì)胞自身系統(tǒng)對其研究奠定了基礎(chǔ)。

5生物學(xué)模塊

基因通常結(jié)隊工作當(dāng)細(xì)胞分解糖產(chǎn)生能量，激活一組基因來產(chǎn)生各自所需要的酶[7]。理論生物學(xué)家提示如果能夠找出這類“聯(lián)合作業(yè)”，并將其視為獨立分子來理解細(xì)胞的復(fù)雜活動。即一部分制造蛋白質(zhì)，一部分復(fù)制細(xì)胞分裂的DNA，其他部分對特殊的酶做出響應(yīng)等等。但這些分子不是基因簡單的組合,它們包括了蛋白質(zhì)，RNA小信號分子和富含能量的分子，即酶等共同執(zhí)行其功能, 蛋白質(zhì)組學(xué)顯示了它的特殊貢獻。即細(xì)胞分裂模塊包裹在膜內(nèi)，如線粒體是能量的“工廠”。就像組建大樓一樣，模塊之間通過一類或幾類介質(zhì)分子相互聯(lián)系，各部門備有“辦公室備忘錄”這就解決了每個突發(fā)件事的需要?？上胂笤O(shè)計一種更精密的特定模塊，其小部分分子間相互作用的模塊延伸到整個細(xì)胞。模塊的功能來自其他模塊一部分輸入，并產(chǎn)生輸出影響其他模塊。其集體行為的概念類似于生物物理學(xué)概念，能表現(xiàn)模塊的特性。即模塊大部分功能特征，來自于潛在成分的特征與它們之間相互作用集合的特征。這對于生物學(xué)家來說是陌生的，但將來會習(xí)慣這樣的描述。

6TCM生物學(xué)

TCM生物學(xué)家用生物學(xué)微觀實驗手段，即分子與細(xì)胞生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)工程、生物學(xué)工程、生物物理學(xué)等[8-11]，模擬與解釋TCM的基本理論。需要生物工程、網(wǎng)絡(luò)工程與程序工程等共同參與形成綜合性科學(xué)。TCM把“天體”對生物體的影響都考慮進去了，在疾病診治基本原則的基礎(chǔ)上還考慮了季節(jié)變化。即冬天益氣活血，溫腎助陽；春天滋陰潤肺，滋腎柔肝；夏天養(yǎng)心安神，清熱解毒；秋天健脾溫腎，滋陰補血。TCM早已認(rèn)識到天體變化對人體的影響，并應(yīng)用在臨床實踐中。至于經(jīng)絡(luò)到底是什么還沒有誰在人體內(nèi)剖析出來，但臨床工作中銀針證實了它的存在，并以唯物主義的客觀事實傳承下來，如何完善它是今后研究的方向。

7TCM診療技術(shù)

TCM的基礎(chǔ)理論與臨床診療技術(shù)是根本，特別是中草藥、民間醫(yī)學(xué)很多精髓尚未開發(fā)。如西醫(yī)治療感冒居高不下的體溫(40℃)什么手段都用上了，TCM一付湯藥就能控制體溫即治愈。腫瘤壓迫所致的面神經(jīng)麻痹，TCM不用開刀減壓針灸就能矯正，這說出來好象不可思議但TCM做到了，TCM就是這么神氣有待進一步挖掘。TCM不僅應(yīng)懂得自身的基礎(chǔ)理論，并從生物學(xué)角度解釋出來，讓世人相信TCM接受TCM，讓TCM走向世界。

參考文獻

篇8

【關(guān)鍵詞】糧食深加工 生物 教學(xué) 課程建設(shè)

【中圖分類號】G642 【文獻標(biāo)識碼】A 【文章編號】1674-4810（2013）22-0005-02

糧食深加工專業(yè)，是以發(fā)酵工程和酶工程等生物技術(shù)為專業(yè)知識基礎(chǔ)，以淀粉水解制品及其衍生物、氨基酸等淀粉發(fā)酵制品、變性淀粉等加工技術(shù)方面的知識和能力培養(yǎng)為主的學(xué)科。生物基礎(chǔ)課程教學(xué)始終著眼于專業(yè)發(fā)展的前沿性和應(yīng)用性，把培養(yǎng)高素質(zhì)應(yīng)用型人才作為教學(xué)目標(biāo)。

一 創(chuàng)新教學(xué)理念，明確教學(xué)目標(biāo)

教學(xué)理念是人們對教學(xué)和學(xué)習(xí)活動內(nèi)在規(guī)律的認(rèn)識的集中體現(xiàn)，同時也是人們對教學(xué)活動持有的基本態(tài)度和觀念，是人們從事教學(xué)活動的信念。教學(xué)理念對教學(xué)活動有著極其重要的指導(dǎo)意義。

我校堅持把提高人才培養(yǎng)質(zhì)量作為教學(xué)工作的核心內(nèi)容，目標(biāo)是根據(jù)吉林省糧食經(jīng)濟的特色與發(fā)展對人才的客觀需求，培養(yǎng)具備所從事專業(yè)的基本理論知識，能在生物技術(shù)與工程領(lǐng)域從事設(shè)計、生產(chǎn)管理和新技術(shù)研究、新產(chǎn)品開發(fā)的技術(shù)應(yīng)用型專門人才。在重視學(xué)生的智力品質(zhì)的同時還強調(diào)學(xué)生良好的非智力品質(zhì)的培養(yǎng)，重視學(xué)生的創(chuàng)新精神以及在實踐中解決問題的能力。在教學(xué)中注重內(nèi)容的基礎(chǔ)性與先進性的有機結(jié)合，把該領(lǐng)域的最新成果和亟待解決的現(xiàn)實問題融化到教學(xué)內(nèi)容中，充分體現(xiàn)學(xué)科教學(xué)內(nèi)容的先進性，緊跟學(xué)科發(fā)展的步伐，增強學(xué)生對課程的學(xué)習(xí)興趣。

二 調(diào)整課程結(jié)構(gòu)，優(yōu)化教學(xué)內(nèi)容

第一，糧食深加工專業(yè)有生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)等多門重要的專業(yè)基礎(chǔ)課，內(nèi)容互有交叉、重復(fù)。如何處理好它們之間的邏輯關(guān)系，搞好教學(xué)銜接是教學(xué)實踐中的一個難題。為了更好地體現(xiàn)相關(guān)課程核心內(nèi)容，我院進行大膽取舍，使課程內(nèi)容更加精簡、重點更加突出。如蛋白質(zhì)合成，細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)都有涉及；再如對有關(guān)淀粉知識，生化教材和淀粉工藝教材等都做了審慎合理的處理。根據(jù)學(xué)生和學(xué)校的實際，堅持基礎(chǔ)實、起點高、內(nèi)容新、知識活的原則，注意處理好基礎(chǔ)、前沿和能力三方面的關(guān)系。

第二，圍繞課程的教學(xué)理念，將基礎(chǔ)理論知識與學(xué)科前沿發(fā)展相結(jié)合。在理論課中適當(dāng)?shù)匾胍恍┛萍记把刂R，重視相關(guān)的科學(xué)發(fā)展史的介紹，包括學(xué)科的研究歷史、科學(xué)家的成長經(jīng)歷，相關(guān)的最新科研成果，如生化課程中在講授糖化學(xué)時，補充介紹相關(guān)的諾貝爾獎內(nèi)容、科學(xué)家生平及所做的貢獻，從中學(xué)習(xí)前輩的科學(xué)態(tài)度、思維方式，拓展學(xué)生視野，提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和積極性， 改善教學(xué)效果。

三 尊重教育規(guī)律，重視教學(xué)法研究

好的教學(xué)方法是生物教學(xué)的有力保障。在教學(xué)過程中可以采取啟發(fā)式、互動式、研討式的教學(xué)方法，充分調(diào)動學(xué)生的學(xué)習(xí)主動性，引導(dǎo)學(xué)生積極思考，主動參與教學(xué)活動。過去許多教師的教學(xué)只是單純以傳授學(xué)科知識為主，把教材上的全部內(nèi)容“兜給”學(xué)生，學(xué)生們疲于被動地接受一大堆結(jié)論，而不知道這些結(jié)論是如何獲取的，這種教學(xué)模式不利于學(xué)生科學(xué)思維能力的提升，因而在重視傳授基礎(chǔ)知識的同時更要重視教給學(xué)生獲得科學(xué)結(jié)論的思路和方法。

在教學(xué)中可以組織課堂討論，安排學(xué)生選擇某個專題制作PPT，進行課堂小講座，促進了學(xué)生之間及學(xué)生與教師之間的專業(yè)交流，培養(yǎng)了學(xué)生查閱文獻、閱讀文獻的能力，學(xué)生自學(xué)能力、演講交流能力明顯提高。教學(xué)中積累的這些素材和經(jīng)驗，還促進了整個專業(yè)基礎(chǔ)課程的教學(xué)，使更多的學(xué)生從中受益。

四 理論與實驗并重，提高學(xué)生動手能力

生物學(xué)是實驗性很強的學(xué)科，實驗課對學(xué)習(xí)生物基礎(chǔ)十分重要。我們十分注重理論教學(xué)與實驗教學(xué)有機結(jié)合。教學(xué)中既有傳統(tǒng)的驗證性實驗，用于幫助學(xué)生理解、鞏固所學(xué)的生物知識，更多的是探究性實驗，即只給出課題研究的要求，在教師指導(dǎo)下，由學(xué)生自己思考實驗原理、選擇實驗儀器、制訂實驗方案，其目的重在培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)態(tài)度、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)淖黠L(fēng)和團結(jié)協(xié)作的精神，促進學(xué)生創(chuàng)新能力的提升。我們還通過開放實驗室，創(chuàng)造條件讓學(xué)生多動手，培養(yǎng)學(xué)生的實踐能力。今年，生化實驗教師指導(dǎo)的學(xué)生在吉林省高校生化技能競賽中榮獲一等獎。

五 搞好教學(xué)評價，促進教學(xué)質(zhì)量提高

教學(xué)評價作為教學(xué)系統(tǒng)的重要組成部分，它的內(nèi)容和形式對教學(xué)活動的開展起著重要的促進作用。通過學(xué)校、學(xué)院、教研室和授課班級的教學(xué)管理體系，開展教學(xué)質(zhì)量監(jiān)控，對任課教師的教學(xué)質(zhì)量做出相應(yīng)的評價，建立健全教學(xué)質(zhì)量監(jiān)控體系。一是教師評學(xué)，教師通過考勤、課堂討論、作業(yè)等對學(xué)生學(xué)習(xí)過程進行評價，通過期中、期末考試進行終結(jié)性評價；二是學(xué)生評學(xué)，學(xué)生通過網(wǎng)絡(luò)評教對教學(xué)過程提供反饋意見，了解教師教學(xué)活動的效果；三是督導(dǎo)評學(xué)，通過學(xué)院各級督導(dǎo)對教師的課堂教學(xué)和學(xué)生的課堂學(xué)習(xí)情況進行檢查指導(dǎo)，以此評價教師和學(xué)生的表現(xiàn)；四是實踐評學(xué)，注重將理論知識和實踐相結(jié)合，通過實驗參與和操作過程，對教師和學(xué)生能力進行評價。

專業(yè)基礎(chǔ)課教學(xué)是一項系統(tǒng)工程，需要持續(xù)不斷的探索，努力開拓創(chuàng)新，以培養(yǎng)更多基礎(chǔ)扎實、素質(zhì)高、能力強、能為我國的經(jīng)濟建設(shè)和社會發(fā)展做出貢獻的人才。

參考文獻

[1]張晶、華子春.細(xì)胞生物學(xué)課程體系優(yōu)化的實踐與思考[J].中國細(xì)胞生物學(xué)報，2011（6）：71

[2]康潔、馬麗.細(xì)胞生物學(xué)課程體系和教學(xué)模式的改革與探討[J].讀與寫，2011（11）

篇9

關(guān)鍵詞 組織工程骨；力學(xué)刺激；動態(tài)載荷

中圖分類號R31 文獻標(biāo)識碼A 文章編號 1674-6708（2013）83-0102-02

1 概述

大段骨缺損的修復(fù)重建一直是骨科領(lǐng)域中亟待解決的難題，隨著研究的深入，其治療方法逐步從傳統(tǒng)的自體骨和異體骨移植等治療手段深入到組織工程、人工骨材料、基因工程領(lǐng)域。在體外構(gòu)建組織工程化活性骨有望成為解決上述難題的一種有效方法[1]。組織工程骨的傳統(tǒng)構(gòu)建方法是在體外將具有成骨分化能力的種子細(xì)胞與三維骨支架材料靜態(tài)復(fù)合培養(yǎng)一定時間后，植入體內(nèi)修復(fù)骨缺損。在靜態(tài)培養(yǎng)環(huán)境下，由于重力作用造成三維支架內(nèi)部細(xì)胞數(shù)量不足，分布不均勻；而且在人體內(nèi)，細(xì)胞是生長在機體提供的微動力學(xué)環(huán)境中，因此靜態(tài)培養(yǎng)無法滿足組織工程骨構(gòu)建的要求[2]。研究表明力學(xué)刺激能促進成骨和骨再生，是調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能的重要因素。因而組織工程骨的培養(yǎng)需要提供適宜的壓應(yīng)力刺激，適當(dāng)?shù)牧W(xué)刺激能誘導(dǎo)和促進種子細(xì)胞增殖、增加生長因子分泌和細(xì)胞外基質(zhì)合成。因此采用三維動態(tài)培養(yǎng)取代傳統(tǒng)的靜態(tài)培養(yǎng)方法己經(jīng)成為組織工程骨體外構(gòu)建的一種新趨勢[3]。

為了更好地進行組織工程骨的培養(yǎng)與骨生物力學(xué)的研究，我們對前期已研制出的組織工程骨動態(tài)載荷培養(yǎng)裝置進行改進，設(shè)計建立了一套新型的動態(tài)載荷培養(yǎng)裝置。新裝置不僅能提供良好的三維培養(yǎng)條件，而且能在培養(yǎng)過程中進行精確的力學(xué)刺激和檢測工作，為下一步在體外進行組織工程骨的動態(tài)培養(yǎng)和探討力學(xué)刺激對細(xì)胞生物學(xué)特性的影響提供一種可靠的培養(yǎng)裝置與研究平臺。

2 系統(tǒng)設(shè)計

2.1 設(shè)計原理

新、舊裝置的設(shè)計原理基本相同：通過電機驅(qū)動加載壓頭對種子細(xì)胞—三維骨支架復(fù)合材料進行壓應(yīng)力刺激，使之作用于附著在支架上的細(xì)胞。整個裝置由驅(qū)動系統(tǒng)、控制系統(tǒng)和細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)組成。

2.2 驅(qū)動系統(tǒng)

新裝置驅(qū)動系統(tǒng)主要由上橫梁、中橫梁、下橫梁、滾珠絲桿、減速機構(gòu)、伺服電機及驅(qū)動器組成。伺服電機通過連軸器與滾珠絲杠連接，電機旋轉(zhuǎn)動作通過滾珠絲杠和絲杠螺母轉(zhuǎn)換為直線運動，產(chǎn)生周期性的垂直位移運動。通過計算機軟件編程設(shè)定所需的頻率、位移、波形（方波、正弦波、三角波）和工作時間，伺服電機接收到控制指令后產(chǎn)生響應(yīng)頻率、波形和位移的電信號，并轉(zhuǎn)化為加載壓頭端的垂直位移，最后作用到三維骨支架上產(chǎn)生應(yīng)力刺激。實際工作信號通過位移傳感器采集反饋，在操作界面實時顯示所采集到的頻率、波形、位移和工作時間等。驅(qū)動系統(tǒng)的輸出頻率為0Hz~10Hz，加載壓頭端產(chǎn)生的壓縮位移為0mm~5mm，精確度達到0.01mm。與舊儀器相比，新裝置的位移可控精度更高，采集數(shù)據(jù)量大、準(zhǔn)確。

2.3 控制系統(tǒng)

控制系統(tǒng)分為測試控制單元和微機控制單元。測試控制單元主要有傳感器、數(shù)字控制器及功率放大器等組成。由負(fù)荷傳感器、位移傳感器和變形傳感器將其相應(yīng)的力學(xué)信號轉(zhuǎn)變?yōu)槲⑷醯碾娦盘?，?jīng)放大、A/D轉(zhuǎn)換、接口器將載荷、位移和變形等量轉(zhuǎn)換為數(shù)字量。微機控制單元通過編制的軟件，采集數(shù)據(jù)、繪制曲線，按操作界面設(shè)定的頻率、位移、波形以及工作時間等指令執(zhí)行，并將產(chǎn)生的動態(tài)壓縮載荷傳遞到三維骨支架表面上，及時記錄實時數(shù)據(jù)、實際工作頻率和時間。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)

舊裝置中細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)是開放式的培養(yǎng)環(huán)境，力學(xué)加載裝置和培養(yǎng)系統(tǒng)是放置在一個超凈工作臺內(nèi)，以特制的紅外線石英加熱燈泡作為熱源，通過直接輻射加熱達到細(xì)胞培養(yǎng)所需的溫度環(huán)境。但這種方法無法保證溫度的恒定、增加了光照對細(xì)胞的影響因素，而且無法提供細(xì)胞培養(yǎng)所需的濕度和CO2濃度的要求。新裝置改進后，縮小了力學(xué)加載裝置，將其和培養(yǎng)系統(tǒng)一起可直接放入37℃、5% CO2的恒溫箱內(nèi)。舊裝置中的細(xì)胞培養(yǎng)器是用聚乙烯材料制成的。由于聚乙烯彈性模量較低，當(dāng)機械載荷作用于三維支架時，聚乙烯培養(yǎng)器會隨著三維支架一起產(chǎn)生形變，造成較大試驗誤差。新裝置采用聚四氟乙烯材料，彈性模量高，減少了實驗誤差，而且耐腐蝕，耐高低溫，易清洗，適于細(xì)胞培養(yǎng)。放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)部分均可以通過75%酒精擦拭以及紫外燈照射消毒，避免污染。

2.5 裝置配套工具

由于對三維骨支架材料施加的力學(xué)刺激屬于微小應(yīng)變，如果骨組織支架形狀不規(guī)則即使通過預(yù)加載也無法確保加載壓頭與支架完全緊密接觸，這將影響到應(yīng)變加載在骨組織支架上的力分布，同時各組材料也缺乏可比性。因此必須對支架材料進行標(biāo)準(zhǔn)化的切割。我們首先采用直徑10mm的取芯電鉆，將骨組織材料制成10mm直徑大小的圓柱體，然后用線鋸將骨組織材料切割成表面平整的樣本[4]。通過這套工具制作的支架形態(tài)大小一致而且表面光滑平整。

3 討論

骨組織工程化培養(yǎng)必須有合適的力學(xué)環(huán)境，采用動態(tài)培養(yǎng)取代傳統(tǒng)的靜態(tài)培養(yǎng)方法已經(jīng)成為一種新趨勢。目前代表性的組織工程骨生物反應(yīng)器主要有旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器、攪拌式生物反應(yīng)器、灌流式生物反應(yīng)器和應(yīng)力加載式生物反應(yīng)器等。如何控制好反應(yīng)器內(nèi)產(chǎn)生的仿生力學(xué)環(huán)境是生物反應(yīng)器研發(fā)過程中的技術(shù)難點之一[4]。本研究介紹的加載裝置在原有基礎(chǔ)上做了進一步的改進，本裝置操作簡便可靠、控制精度高、壓應(yīng)變均一、滿足生物力學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)試驗要求，不易發(fā)生污染，可望用于研究三維培養(yǎng)條件下力學(xué)載荷對成骨細(xì)胞的生物行為的影響和在動態(tài)培養(yǎng)條件下構(gòu)建具有臨床應(yīng)用價值的組織工程骨。

參考文獻

[1]祝聯(lián)，鄒成，朱敏，等.組織工程化骨修復(fù)四肢骨缺損的初步臨床研究.組織工程與重建外科雜志，2009，5：121-124.

[2]張玉龍，秦廷武，楊志明.一種改進型動態(tài)應(yīng)變?nèi)S細(xì)胞培養(yǎng)裝置的研制.生物醫(yī)學(xué)工程研究，2008，27(4)：248-250.

篇10

關(guān)鍵詞：草履蟲；水體監(jiān)測；重金屬離子；農(nóng)藥

中圖分類號： Q959.117 文獻標(biāo)識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20150940002

引言

20世紀(jì)中葉以來，世界工廠化的生產(chǎn)模式不斷擴大，人口總量迅速增加，人們對于自然資源的索取超過了自然界的再生能力，同時過度排放污染物，造成了世界性的資源短缺和嚴(yán)重的環(huán)境問題。水污染就是其中之一。水污染可分為兩類：一類是自然污染；另一類是人為污染。其中人為污染較為常見，每年排入江河湖海的污水約有4.2×1012m3，污染了數(shù)億立方米的淡水，相當(dāng)于世界江流總量的14%以上[1]。特別是近年來，隨著農(nóng)藥的大量使用以及工廠排放廢水的增加，水污染問題變得愈發(fā)嚴(yán)重。而水是生命的源泉，是人類賴以生存和發(fā)展的不可或缺的最重要的物質(zhì)之一，所以有效的進行水體污染監(jiān)測刻不容緩。

草履蟲（Paramecium）是原生動物門纖毛綱的代表物種，除了具有靈敏的應(yīng)激系統(tǒng)外，還具有分布廣泛，結(jié)構(gòu)典型，繁殖速度快，便于觀察，容易采集培養(yǎng)等特點，因此被廣泛應(yīng)用于水體監(jiān)測[2]。目前，國內(nèi)研究人員從重金屬離子、農(nóng)藥等污染物質(zhì)對草履蟲應(yīng)激性及其生殖能力的影響等方面做了大量的研究，研究表明重金屬離子、農(nóng)藥等因素對草履蟲均會產(chǎn)生相應(yīng)程度的影響[3]。

1 草履蟲簡介

1.1 草履蟲種類

草履蟲是原生動物門纖毛綱的單細(xì)胞動物，其形狀類似于倒置草鞋底，主要生活在有機質(zhì)充足、細(xì)菌豐富、光線充足的河流池塘或水溝中。目前，世界已知草履蟲種類有22種[4]，常見的有大草履蟲、雙小核草履蟲、多小核草履蟲、綠草履蟲。其中大草履蟲最為常見，體長180～300μm；雙小核草履蟲，體長80～170μm，伸縮泡2個，有2個很小的小核；多小核草履蟲，體長180～310μm，有時有3個伸縮泡，小核泡型，有3～12個；綠草履蟲，體長80～150μm，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有綠藻共生，經(jīng)見光處培養(yǎng)后通體呈綠色，小核2個。

1.2 草履蟲的結(jié)構(gòu)

草履蟲一般呈長橢圓形，前端較圓，后端寬而略尖，因形狀與草鞋相似而得名。其表膜由三層膜組成，具有緩沖和保護作用。膜下機體中生長有近萬根纖毛，其排列成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，更有助于控制草履蟲活動[5]。與表膜垂直排列分布在外質(zhì)中的一排小桿狀的囊泡結(jié)構(gòu)，叫做刺絲泡，從而起到防衛(wèi)和捕食作用。刺絲泡在表膜上開口，蟲體在受到外界的刺激時會射出刺絲泡中的內(nèi)容物，當(dāng)內(nèi)容物接觸到水就會形成細(xì)絲[6]。

1.3 草履蟲的生活環(huán)境

草履蟲生活在水流緩慢、帶有腐草的水溝、池塘和稻田中，在有機質(zhì)豐富、光線充足的水面附近較常見，尤其是在細(xì)菌豐富的水中，草履蟲種群密度最大[7]。草履蟲在水溫0～30℃情況下均能正常生活，24～27℃是草履蟲生活的最佳水溫，當(dāng)水溫低于10℃或高于35 ℃不利于草履蟲的繁殖[8]。

1.4 草履蟲的應(yīng)激性

草履蟲細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部的水分約占細(xì)胞質(zhì)的75%～85% [9]，采取自旋回波測量的方式對草履蟲細(xì)胞進行研究，其研究結(jié)果表明，細(xì)胞內(nèi)的水呈“結(jié)構(gòu)化”，即草履蟲細(xì)胞內(nèi)的水是以液晶態(tài)形式存在。液晶態(tài)物質(zhì)具有對熱、磁、光、電、聲、輻射、應(yīng)力等變化反應(yīng)較靈敏的特性。所有包括膜電位在內(nèi)的應(yīng)激信息，都會通過其在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)傳導(dǎo)，構(gòu)成草履蟲身體內(nèi)的原始應(yīng)激系統(tǒng)。由于草履蟲應(yīng)激系統(tǒng)靈敏的特性，使得草履蟲無論是在監(jiān)測農(nóng)藥使用的安全性方面還是重金屬離子的監(jiān)測方面都有著十分重要的意義。

2 草履蟲在水體監(jiān)測中的作用

隨著經(jīng)濟的發(fā)展，工業(yè)化的迅速擴張，人們在面對這一時代到來的同時，還面對著重金屬排放和農(nóng)藥過度使用所導(dǎo)致的水污染問題。而草履蟲的應(yīng)激性能夠直觀的反應(yīng)水體污染程度，是水體監(jiān)測中的一種重要的原生動物。

2.1 重金屬對草履蟲的影響

2.1.1 Cd2+對草履蟲的影響

重金屬鎘對生物和人體均有毒害作用，同時它也是一種水體污染物。由于草履蟲等原生動物對鎘的毒性作用反應(yīng)同后生動物相比更加敏感，因此草履蟲在監(jiān)測Cd2+毒性方面具有重要的意義。方衛(wèi)飛等[10]利用CdSO4、CdCl2、Cd（NO3）2這三種鎘化合物對草履蟲的生物毒性進行了研究，結(jié)果表明對草履蟲毒性作用最大的是CdSO4。胡好遠(yuǎn)等[11]通過對Cd2+24h半致死濃度（LC50）進行了實驗，結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，Cd2+的濃度增加，草履蟲的種群數(shù)量也會隨之增長，但Cd2+濃度過高也會降低草履蟲的種群增長率。

2.1.2 Pb、Cu對草履蟲的影響

近些年來，隨著冶金工業(yè)的快速發(fā)展，部分水體中的沉積物中Pb2+、Cu2+的含量不斷積累，Pb、Cu等元素會對生態(tài)環(huán)境造成破壞，尤其是隨著雨水的沖淋，Pb、Cu等元素進入水體環(huán)境，造成嚴(yán)重的水體污染。周玉[12]通過在20℃培養(yǎng)條件下Pb、Cu等單一元素對草履蟲種群毒性的影響的研究，結(jié)果表明，Cu2+、Pb2+24h對草履蟲的LC50分別為0.0826mg/L、3.9907mg/L；Pb、Cu等單一元素對草履蟲都具有毒害作用，且相同條件下Cu2+對草履蟲的毒害作用大于Pb2+。

2.2 農(nóng)藥對草履蟲的影響

2.2.1 除草劑對草履蟲的影響

2，4-D丁酯是除草劑中的一種，2，4-D丁酯對草履蟲的種群增長具有抑制作用，但對草履蟲的細(xì)胞脅迫變化并不顯著。谷艷芳等[13]發(fā)現(xiàn)，在水環(huán)境中，草履蟲對2， 4-D丁酯有明顯的驅(qū)避作用。捕食行為受到影響會造成生物機體獲得資源減少，引起生產(chǎn)量下降或發(fā)育繁殖遲緩。所以受到2，4-D丁酯的脅迫會引起草履蟲在自然界的自然增長率下降和分布格局的變化。但目前關(guān)于2， 4-D丁酯對草履蟲影響的生態(tài)毒理學(xué)機制仍不完善，需要進一步提高。

2.2.2 殺蟲劑對草履蟲的影響

氯氰菊酯是一種廣譜、生物活性較高的擬除蟲菊酯類殺蟲劑，擁有8個光學(xué)異構(gòu)體，其中有4個生物活性較高的異構(gòu)體組成的外消旋混合物稱為高效氯氰菊酯，在十字花科蔬菜、棉花、果樹、茶樹等作物害蟲的防治中應(yīng)用廣泛[14]。目前，關(guān)于擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對草履蟲的毒性研究已有報道。對于氰戊菊酯對原生動物群落48h急性毒性的檢測，王莉霞等[15]研究得出LC50為15.830mg/L。李霖等[16]通過三氟氯氰菊酯對草履蟲的毒性進行研究，研究表明：三氟氯氰菊酯對草履蟲1h的LC50為1.650mg/L。而高效氯氰菊酯對草履蟲1h 的LC50為27.536mg/L，可見草履蟲對高效氯氰菊酯的反應(yīng)靈敏度遠(yuǎn)低于三氟氯氰菊酯。

2.2.3 殺菌劑對草履蟲的影響

多菌靈是一種廣譜性的苯并咪唑類殺菌劑，學(xué)名2-苯并咪唑基氨基甲酸甲酯（MBC），又稱作棉萎靈、苯井咪唑44號。對由半知菌、多子囊菌引起的多種作物病害有防治效果[17]。在葉面噴霧、種子處理和土壤處理中有很多應(yīng)用。李霖等[18]在進行殺菌劑多菌靈對草履蟲的急慢性毒性作用研究，結(jié)果表明，草履蟲的生長與多菌靈溶液的濃度有關(guān)，多菌靈濃度越高，毒性作用越大。

2.2.4 草履用于水體監(jiān)測的優(yōu)勢

草履蟲對毒性的應(yīng)激反應(yīng)與多細(xì)胞動物相比更為敏銳，并且對于反映環(huán)境化學(xué)毒性物質(zhì)的毒理效應(yīng)相比單純的化學(xué)手段也更為生動、直觀。因此，草履蟲在毒性監(jiān)測方面具有著重要的研究價值。同時草履蟲更是一種良好的水體監(jiān)測材料，是水體質(zhì)量監(jiān)測的重要指示生物之一。近些年來，國內(nèi)外研究人員以草履蟲為實驗材料進行毒性實驗，研究水體環(huán)境中的重金屬污染和農(nóng)藥污染等問題，為農(nóng)藥的使用安全、重金屬污染的監(jiān)測以及生態(tài)環(huán)境保護等方面提供了更多有價值的參考。

3 問題與展望

目前關(guān)于草履蟲的毒理研究很多，并且對于草履蟲在環(huán)境方面的監(jiān)測實驗也取得了長足的進展。而在實驗室和水體污染監(jiān)測中采用的草履蟲基本是從野外采集回來，進行簡單純化培養(yǎng)，完全達不到模式生物的要求標(biāo)準(zhǔn)。對于從不同水體中采集的草履蟲，因為自身的生長環(huán)境影響對某些污染物具有一定的適應(yīng)性，如果不能妥善解決，將會嚴(yán)重影響監(jiān)測的準(zhǔn)確性。而且處于不同生長階段的草履蟲對外界的刺激所產(chǎn)生的反應(yīng)也是有所差異的，這些都將會影響實驗的平行性和可信度。

目前，草履蟲的培養(yǎng)方法簡單，而且培養(yǎng)出的草履蟲生長階段、生長速度不一致。因此，為了能夠在實際應(yīng)用中勝任精確的監(jiān)測工作，培養(yǎng)無背景處于同一生長階段的模式生物草履蟲是現(xiàn)在迫切需要解決的問題。對于無背景草履蟲的培養(yǎng)，可以在最適溫度和pH條件下使用單一營養(yǎng)物質(zhì)進行培養(yǎng)，保證草履蟲在生長過程中不受外界污染源的影響。而對于單一營養(yǎng)物質(zhì)的選擇，根據(jù)草履蟲的食物攝取情況，可以選擇某一種純培養(yǎng)的細(xì)菌，也可以選用一種或多種氨基酸配制無菌培養(yǎng)液。

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