導(dǎo)語：干細(xì)胞治療糖尿病研究論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

[關(guān)鍵詞]糖尿病干細(xì)胞胰島健康網(wǎng)訊:

【摘要】本文對本世紀(jì)以來干細(xì)胞治療糖尿病的若干研究，包括胰島的體內(nèi)發(fā)育、分化及其標(biāo)志物，以及應(yīng)用胰導(dǎo)管干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化為胰島對糖尿病進(jìn)行細(xì)胞治療的實驗進(jìn)行了綜述。隨著干細(xì)胞技術(shù)的不斷完善，人類最終能治愈糖尿病。全球糖尿?。╠iabetesmellitus，DM）患者約1.25億（我國也已達(dá)4000萬，預(yù)計2025年將達(dá)3億［1］，已成為嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病之一，特別是久病引發(fā)的多系統(tǒng)損害，及最終的腎功能衰竭。DM發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及遺傳、環(huán)境、免疫調(diào)控和化學(xué)因子。自1922年發(fā)現(xiàn)了胰島素至今，DM的治療以藥物和注射胰島素為主，目前，學(xué)者們開始關(guān)注經(jīng)胰島移植恢復(fù)患者體內(nèi)代謝紊亂的方法，但因組織來源匱缺，制約了胰島移植研究的開展，因此尋找合適的胰島移植物的研究便成為了當(dāng)務(wù)之急。隨著分子、細(xì)胞和發(fā)育生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)展，增加了干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化成胰島的可能性但由于這一技術(shù)還處于實驗室的實驗階段，而且方法也并不統(tǒng)一，因此有必要將近期研究進(jìn)行匯總，希望能對在這方面進(jìn)行研究的同僚們有所幫助。1胰島體內(nèi)的形成、發(fā)育、分化與鑒定

1.1胚胎胰島分化胚胎胰島的分化分4個階段:（1）胚胎9～10周為零散的多激素細(xì)胞階段;（2）胚胎11～15周為未成熟的多激素階段;（3）胚胎16～19周為單激素核心胰島階段;（4）胚胎30周后為多形胰島階段（Bocian，HistochemCellBiol，1999）。在胰島形成過程中，內(nèi)胚層細(xì)胞形成許多小導(dǎo)管網(wǎng)，其末端膨大部分的細(xì)胞團(tuán)發(fā)育為外分泌腺泡，與此同時，一些細(xì)胞群或細(xì)胞索不出現(xiàn)管腔，卷曲成團(tuán)并與其他細(xì)胞索分離開，分散在腺泡之間，內(nèi)含豐富的毛細(xì)血管網(wǎng)，最后發(fā)育成具有內(nèi)分泌功能的胰島。

1.2胰島細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)Ferber［2］認(rèn)為胚胎發(fā)育早期的信號源于脊索，后期的信號源于間質(zhì)，經(jīng)誘導(dǎo)的胰管上皮細(xì)胞增殖分化形成胰島細(xì)胞，但至今為止其誘導(dǎo)因素并無統(tǒng)一認(rèn)識。

PDX1:一種同源框轉(zhuǎn)錄因子（homeoboxtranˉscriptionfactor），即胰十二指腸同源異型盒基因（pa-ncreaticandduodenalhomeobox1），編碼胰腺十二指腸同源框蛋白1，又稱IPF-1、IDX-1、IUF-1。Lu（Lu，Endocrinology，1996）認(rèn)為PDX1是胰腺發(fā)育及胰島素基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，即決定于胰腺前體細(xì)胞向B、A、D細(xì)胞的分化。Mckinnon［3］認(rèn)為PDX1對于腸內(nèi)胚層背胰芽和腹胰芽的生長、分化起重要作用。Dutta［4］認(rèn)為早期胰腺表達(dá)的PDX-1對胰腺上皮的形成和分化是必需的。Gu［5］認(rèn)為所有胰腺細(xì)胞均來源于PDX1表達(dá)的前體細(xì)胞，是最先發(fā)現(xiàn)的胰腺發(fā)育決定基因，隨著胰腺發(fā)育PDX1的表達(dá)逐漸減弱，如缺失將導(dǎo)致胰腺無法形成。Docherty［6］的研究證實小鼠PDX1基因的純合子缺失、突變會導(dǎo)致胰腺無法形成。ngn3:ngn3即神經(jīng)元素3（neurogenin3），是胰腺發(fā)育過程中短暫表達(dá)的蛋白，可能是胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞系的定向因子，且在成熟胰島中不存在。用PDX1啟動子促進(jìn)轉(zhuǎn)基因小鼠中早期胰腺前體細(xì)胞中ngn3表達(dá)，會導(dǎo)致內(nèi)分泌細(xì)胞數(shù)增加，外分泌胞數(shù)減少。ngn3缺失的純合子小鼠中胰島細(xì)胞和nestin胰島前體細(xì)胞在發(fā)育各階段都缺失［6］。Lee［7］認(rèn)為ngn3基因與胰島分化有密切關(guān)系，因為ngn3基因缺陷小鼠不能表達(dá)胰島其他特異性轉(zhuǎn)錄因子，包括islet1、PAX4、PAX6，而缺乏PAX6、NeuˉroD1、NKN6.1或NKX2.2的動物胰腺中表達(dá)ngn3，表明ngn3位于這些因子的上游，且對啟動內(nèi)分泌細(xì)胞分化必不可少，而分化后期關(guān)閉。Gasa［8］通過表達(dá)的腺病毒感染胰腺導(dǎo)管細(xì)胞，建立了體外調(diào)控分化模型，發(fā)現(xiàn)ngn3和N

euroD1活化胰島分化的基因并不重疊，表明這兩個bHLH蛋白在胰島發(fā)育活動中具有不同的功能。Mellitzer［9］通過將cDNA插入到前體細(xì)胞的3′端非翻譯區(qū)，通過EYFP定位NGN-3表達(dá)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)分泌前體細(xì)胞在缺乏間充質(zhì)信號刺激情況下，可在體外擴(kuò)增，向內(nèi)分泌細(xì)胞分化為其默認(rèn)的途徑。Leon［10］用抗新霉素基因篩選用含Nkx6.1前體基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼠胚胎干細(xì)胞。培養(yǎng)后用篩選Nkx6.1陽性細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞分泌胰島素，注入糖尿病鼠體內(nèi)可使其血糖恢復(fù)正常。

Foxα2:內(nèi)分泌的關(guān)鍵調(diào)控基因是forkhead基因Foxα2。Guo［11］誘導(dǎo)內(nèi)胚層分化的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxα2可被Foxd3激活，而被Oct4抑制。內(nèi)胚層分化可通過抑制Oct4表達(dá)實現(xiàn)。Foxα2基因關(guān)鍵參與肺、肝、胰發(fā)育。缺乏Foxα2基因，鼠不能產(chǎn)生前、中腸內(nèi)胚層（Ang，Cell，1994）。HNF:HNF4參與肝、腸、胰分化，缺失可致年輕人成熟期發(fā)病的糖尿病（Maturityonsetdiabetesmelliˉtusinyoung，MODY1）。HNF1α（TCF1）HNF4或Foα2及Pdx-1雙雜合缺失，導(dǎo)致β細(xì)胞功能缺陷，提示這些基因構(gòu)成β細(xì)胞發(fā)育的基因網(wǎng)絡(luò)（Yamagata，Nature，1996）。HNF6-/-鼠，腹胰發(fā)育缺陷及膽管發(fā)育異常，該基因需ngn3激活（Yamagata，Nature，1996）。HNF6還激活Foxα2a基因。

Pax:Pax-4和Pax-6同屬Pax基因家族，其在胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用。Sosa（Sosa，Nature，1997）將Lac-Z插入到Pax基因中作標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)Pax-4失活的新生鼠經(jīng)免疫組織化學(xué)法顯示缺少β細(xì)胞和δ細(xì)胞，α細(xì)胞排列不規(guī)整。Pax-6缺失，α細(xì)胞缺如，而胰島素和生長抑素分泌細(xì)胞卻可出現(xiàn)（St-Onge，Nature，997）。由此推斷出Pax-6是α細(xì)胞發(fā)育所必需，而非β、δ細(xì)胞發(fā)育所必需。

Chiang［12］為分析單個胰腺細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄模式，改進(jìn)了基于PCR的cDNA擴(kuò)增方法，即將單個胰腺細(xì)胞中的cDNA與含有95個常見胰腺細(xì)胞表達(dá)基因的DNA芯片進(jìn)行雜交，芯片上的基因包括轉(zhuǎn)錄因子，信號傳導(dǎo)分子以及對照基因。研究者觀察了胚胎10.5d小鼠的胰腺分離出的單個細(xì)胞中的基因表達(dá)模式。在這個時期上皮細(xì)胞的形態(tài)均一，而基因表達(dá)模式分析可分為6個不同的亞型。I型只表達(dá)Pdx1，Nkx2.2和Nkx6.1，II型還表達(dá)P48，III型還表達(dá)ngn3。因為Pdx1是最早表達(dá)的胰腺臟細(xì)胞標(biāo)記蛋白，因此研究者認(rèn)為I型細(xì)胞是最好的胰腺干細(xì)胞候選者。II型細(xì)胞表達(dá)的P48是外分泌胰腺細(xì)胞的標(biāo)記，而Nkx2.2和Nkx6.1是內(nèi)分泌細(xì)胞分化所必須的。研究者根據(jù)這些研究結(jié)果推測出一個胰腺細(xì)胞分化的模型，每一個階段都對應(yīng)相應(yīng)的基因表達(dá)模式。此外，成體的胰島內(nèi)分泌細(xì)胞40～50d更新一次，其過程包括細(xì)胞凋亡和胰導(dǎo)管干細(xì)胞增殖分化成新的胰島細(xì)胞。給予葡萄糖或高血糖素樣肽（Glucagon-likepeptied，GLP1）等促胰島因子48h后，胰島細(xì)胞數(shù)量可增加一倍，說明機(jī)體胰島在一定的條件與需求下進(jìn)行著不斷更新與增殖的（Rosenberg，CellTransplant，1995）。

1.3胰島前體細(xì)胞的標(biāo)記Jindal（Jindal，TransplanˉtationProceeding，1997）認(rèn)為胰臟的外分泌細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞都來源于具有導(dǎo)管細(xì)胞特征的未分化上皮細(xì)胞，提示胰導(dǎo)管細(xì)胞可能是胰島的前體細(xì)胞。Berger［13］也發(fā)現(xiàn)胰腺中存在干細(xì)胞，認(rèn)為胰腺干細(xì)胞是胚胎發(fā)生中沒有進(jìn)行終末分化的胰腺細(xì)胞，具有自我更新和分裂能力。應(yīng)用HE染色顯示該細(xì)胞是一種嗜堿性的單核細(xì)胞，直徑約8μm，呈圓形，細(xì)胞核為圓形或腎形，較大，多含2個核仁，染色質(zhì)細(xì)膩而分散，胞質(zhì)中不含顆粒，在形態(tài)上與小淋巴細(xì)胞極為相似。近年來的研究揭示了胰島前體細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，這對胰島前體細(xì)胞的提取將有很大的幫助，目前較為公認(rèn)的特異性標(biāo)記物有以下幾種，還有很多標(biāo)記物有待于發(fā)現(xiàn)。酪氨酸羥化酶（tyroxinehydroxyˉlase，TH）:在大鼠胰腺發(fā)生中表現(xiàn)出發(fā)育依賴性變化。第16天胚胎的導(dǎo)管細(xì)胞可見TH的表達(dá)，但成熟的內(nèi)分泌細(xì)胞中卻難以檢測到TH，胎兒和剛出生幼兒的胰島細(xì)胞和一些導(dǎo)管細(xì)胞TH呈陽性。成年大

鼠胰腺中，TH僅在β細(xì)胞中表達(dá)。TH的這種表達(dá)模式可用于鑒別內(nèi)分泌前體細(xì)胞［14］。葡萄糖轉(zhuǎn)運子2（glucosetransporter，GluT-2）:可在大鼠胚胎的背胰芽和腹胰芽細(xì)胞中檢出，并在胰芽發(fā)育中持續(xù)表達(dá)。孕17d，可檢測到細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GluT-2和胰島素，以后，這些細(xì)胞聚集形成胰島的β細(xì)胞群，而那些將轉(zhuǎn)變成腺泡細(xì)胞的細(xì)胞不再表達(dá)GluT-2［15］。細(xì)胞角蛋白20（cytokeratin，CK20）:CK20是成熟胰腺導(dǎo)管細(xì)胞的一個特異標(biāo)志。在胎鼠和幼鼠的導(dǎo)管細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞中表達(dá)，而在成年動物的導(dǎo)管細(xì)胞中有CK20表達(dá)則提示能定向分化成內(nèi)外分泌細(xì)胞的胰腺未分化細(xì)胞。誘導(dǎo)與導(dǎo)管連接的β細(xì)胞再生時，CK20也可在內(nèi)分泌細(xì)胞中表達(dá)，顯示了未分化細(xì)胞分化為內(nèi)分泌細(xì)胞的過程［15］。PDX-1:是β細(xì)胞成熟的標(biāo)志。在哺乳動物中，這種同源域蛋白（homeodomainprotein）是一種調(diào)節(jié)胰島素和抑生長素表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，也作為胰島素啟動因子-1（IPF-1）、抑生長素活化因子-1（STF-1）和胰島十二指腸同源域蛋白（IDX-1）而存在。PDX-1也可在尚未形成胎兒胰腺上皮細(xì)胞的所有胰島素分泌細(xì)胞中短暫表達(dá)（Bouwens，Micros.Res.Tech，1998）。Kit:Kit在胰島素細(xì)胞系中表達(dá)，認(rèn)為在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面起作用。胎鼠和成鼠的胰島中均可檢測到Kit，經(jīng)Kit基因表達(dá)的標(biāo)記物gal證實，Kit在胰島素細(xì)胞中特異表達(dá)，在其他內(nèi)分泌細(xì)胞和外分泌細(xì)胞中不表達(dá)［16］。ngn3:ngn3陽性細(xì)胞散在于胎鼠胰腺的導(dǎo)管細(xì)胞，胚胎15.5d達(dá)高峰，成熟胰島細(xì)胞則轉(zhuǎn)為陰性［17］。由于胰島激素或成熟內(nèi)分泌細(xì)胞不表達(dá)ngn3，因此ngn3陽性細(xì)胞可作為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的前體細(xì)胞的標(biāo)記物［18］。波形蛋白（vimentin）:Schmied［19］將長期培養(yǎng)的胰島細(xì)胞去分化得到未分化的導(dǎo)管樣上皮細(xì)胞，這些細(xì)胞可分化成胰腺內(nèi)外分泌細(xì)胞，并限制性表達(dá)波形蛋白，所以波形蛋白可作為胰島祖細(xì)胞的分子標(biāo)志。

但在此需說明的是，最近研究人員用小鼠做了詳細(xì)的追蹤研究，Matthews［20］通過孕鼠及乳鼠喂養(yǎng)不同劑量的維生素A，發(fā)現(xiàn)缺乏維生素A，β細(xì)胞數(shù)量和體積明顯下降。ChenY［21］等發(fā)現(xiàn)SOCS-1（-/-）鼠感染后外分泌部細(xì)胞死亡高于內(nèi)分泌部，可能γ干擾素或腫瘤壞死因子促進(jìn)內(nèi)分泌部增生分化。Gesina［22］通過糖皮質(zhì)激素治療通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使激素受體缺陷的鼠，發(fā)現(xiàn)胰島素分泌細(xì)胞減少是外分泌細(xì)胞的2倍，提示糖皮質(zhì)激素有利于向外分泌分化。表達(dá)Pax-1，Pax-6，Nkx6.1處下游調(diào)控序列，而paf-1-p48和Hes-1的mRNA增高。選擇非活化激素受體基因，在鼠β細(xì)胞無明顯效果。而對于缺乏糖皮質(zhì)激素受體，且表達(dá)Pdx-1則β細(xì)胞群增長加倍。胰島細(xì)胞數(shù)量和體積均增大而α細(xì)胞除外。提示糖皮質(zhì)激素在胰腺β細(xì)胞分化中具有重要作用。

2誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為胰島的研究近況

應(yīng)用生物工程技術(shù)獲取胰島素分泌細(xì)胞可從以下幾個途徑:（1）胰導(dǎo)管干細(xì)胞（2）胚胎干細(xì)胞;（3）利用基因工程技術(shù)。但將這些細(xì)胞誘導(dǎo)成胰島，僅是實驗室研究的初級階段，并不是最終的成果。

2.1胰導(dǎo)管干細(xì)胞應(yīng)用（1）Peck［23］和Ramiya［24］分離、提取出了存在于胰腺導(dǎo)管中的胰島干細(xì)胞，經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)形成了胰島樣細(xì)胞。（2）Bonner［25］發(fā)現(xiàn)角質(zhì)化細(xì)胞生長因子（keratinocytegrowthfactor，KGF）和煙堿（nicotine）對導(dǎo)管干細(xì)胞分化為胰島產(chǎn)生作用。（3）Ramiya［26］從胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化得到“產(chǎn)生胰島的干細(xì)胞（isletproducingstemcells，IPSCs）”，這些IPSCs呈較典型的胰島樣結(jié)構(gòu)，并對高濃度葡萄糖有胰島素釋放應(yīng)答反應(yīng)，免疫組織化學(xué)染色證實有胰島素和胰高糖素的表達(dá)，RT-PCR顯示這些

細(xì)胞能表達(dá)許多胰島細(xì)胞的標(biāo)志性基因，如胰島素基因，胰高糖素，生長抑素，GLUT2及谷氨酸脫羧酶等。將分化成熟的胰島細(xì)胞移植到NOD鼠體內(nèi)，可完全逆轉(zhuǎn)其DM狀態(tài)［25］。由IPSCs可誘導(dǎo)分化得到“產(chǎn)生胰島的細(xì)胞”（isletproducingcells，IPCs），IPCs可分化成有組織結(jié)構(gòu)的胰島細(xì)胞團(tuán)，包括A、B、D細(xì)胞，表達(dá)一系列胰島標(biāo)志，分泌胰島素并受葡萄糖誘導(dǎo)。將這些細(xì)胞移植到NOD鼠體內(nèi)，可穩(wěn)定其血糖水平。

2.2胚胎干細(xì)胞應(yīng)用（1）Lumelsky［27］采用胚胎干細(xì)胞體外擴(kuò)增后，篩選巢蛋白（nestin）陽性細(xì)胞，加入堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basicfibroblastgrowthfactor，bFGF）及B27和尼可酰胺，誘導(dǎo)成為能分泌胰島素的胰島樣結(jié)構(gòu)，將其植入糖尿病鼠體內(nèi)，可使血糖降低且有血管形成，只是胰島素分泌量較低。（2）Assady［28］從ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化得到可分泌胰島素的細(xì)胞，他們的方法是先將ES細(xì)胞在有白血病抑制因子（leukaemiainbibitoryfactor，LIF）存在，但無滋養(yǎng)層的條件下培養(yǎng)，此時有PDX1（pancreaticandduodenalhomeobox1）

表達(dá)，然后在無LIF的條件下促進(jìn)ES細(xì)胞增殖分化為擬胚體（EmbryoBodys，EBs），再在無血清環(huán)境下培養(yǎng)，提高nestin細(xì)胞的比例，加入bFGF繼續(xù)培養(yǎng)，得到類胰島組織細(xì)胞。這些細(xì)胞表達(dá)145pgμg的鼠胰島素Ⅰ和Ⅱ，而且其表達(dá)受葡萄糖誘導(dǎo)，還表達(dá)胰島淀粉多肽（isletamyloidpolypepˉtide），GLUT2等胰島細(xì)胞標(biāo)志。但將這些細(xì)胞移植入糖尿病小鼠后，未能使其血糖正?；＃?）Soriˉa［29］通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將基因插件插入到小鼠胚胎干細(xì)胞中，經(jīng)潮霉素（hygromycin）篩選，獲得含上述基因插件的干細(xì)胞，擴(kuò)增后用G418篩選，從而獲得純化的胰島。

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