導(dǎo)語：多元統(tǒng)計分析紅芪蜜炙前后成分探討一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

摘要：目的比較紅芪蜜炙前后化學(xué)成分差異，分析其差異標(biāo)志物，為紅芪蜜炙炮制機(jī)理及紅芪與炙紅芪質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考。方法采用HPLC建立紅芪與炙紅芪樣品指紋圖譜，并測定香草酸、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素含量；采用SIMCA14.1軟件對紅芪與炙紅芪各10批樣品共有峰峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）。結(jié)果紅芪和炙紅芪指紋圖譜有19個共有峰，20、21號峰為紅芪蜜炙后出現(xiàn)的色譜峰。炙紅芪中毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷和香草酸含量均顯著降低（P＜0.01），分別降低48.00%、21.74%和48.24%；毛蕊異黃酮和芒柄花素含量均顯著上升（P＜0.01），分別上升34.18%和17.49%。多元統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，紅芪蜜炙前后化學(xué)成分存在顯著差異，毛蕊異黃酮苷、芒柄花素、香草酸、毛蕊異黃酮及芒柄花苷為其差異主要指標(biāo)性成分。結(jié)論紅芪與炙紅芪成分差異顯著，紅芪蜜炙后產(chǎn)生了新的成分，毛蕊異黃酮苷、芒柄花素、香草酸、毛蕊異黃酮及芒柄花苷可作為二者的差異標(biāo)志物。

關(guān)鍵詞：紅芪；炙紅芪；多元統(tǒng)計分析；含量測定；差異分析

紅芪始載于《本草經(jīng)集注》，為豆科植物多序巖黃芪HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.的干燥根，具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、利水消腫等功效[1-2]。紅芪為甘肅道地藥材，在甘肅武都、宕昌、岷縣、舟曲、臨潭、漳縣、西和、禮縣、武山等地有較廣分布。炙紅芪為紅芪的蜜炙炮制加工品，主要具有補(bǔ)中益氣功效[1]。2020年版《中華人民共和國藥典》顯示紅芪與炙紅芪主要功效存在差異，且二者質(zhì)量控制均無指標(biāo)性成分含量測定。目前對紅芪成分已有一定研究[3-4]，但紅芪炮制前后成分差異及炮制機(jī)理相關(guān)報道較少。本研究基于多元統(tǒng)計分析方法，深入比較紅芪蜜炙前后化學(xué)成分差異，分析其差異標(biāo)志物，為促進(jìn)紅芪與炙紅芪質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究并揭示其炮制機(jī)理提供依據(jù)。

1儀器與試藥

Agilent1260高效液相色譜儀，美國Agilent公司；101-2A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；AL104萬分之一分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；BT125D十萬分之一分析天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HHS11S電熱恒溫水浴鍋，余姚市上通溫控儀器廠。對照品毛蕊異黃酮（批號150629）、毛蕊異黃酮苷（批號PS000687）、芒柄花素（批號150629）、芒柄花苷（批號PS000672）、香草酸（批號PS010559），HPLC純度≥98%，成都普思生物科技股份有限公司。甲醇（色譜級，批號20160305）、乙腈（色譜級，批號20151201）、磷酸（色譜級，批號20150707），天津大茂化學(xué)試劑廠。蜂蜜，周氏順發(fā)食品有限責(zé)任公司。紅芪藥材樣品采自甘肅省隴南市武都區(qū)米倉山，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室王明偉副教授鑒定為豆科植物多序巖黃芪HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.的干燥根。

2方法與結(jié)果

2.1紅芪飲片制備

將紅芪藥材抖去泥土，快速沖洗干凈，稍晾，趁鮮切成厚片（0.2～0.4）cm，在陰涼通風(fēng)干燥處陰干，備用。

2.2炙紅芪樣品制備

取一定量紅芪飲片，加沸蒸餾水稀釋過的煉蜜悶潤1h，每100g紅芪用煉蜜25g，水為蜜的20%。設(shè)定烘箱溫度70℃，烘制時間2.5h，飲片鋪設(shè)厚度3cm。烘制完成后，取出放涼，備用[5]。

2.3含量測定

2.3.1供試品溶液制備采用四分法分別取紅芪和炙紅芪飲片適量，粉碎（過20目篩），粉末60℃干燥至恒重。精密稱取紅芪和炙紅芪樣品粉末各3.0000g，置150mL錐形瓶中，加入甲醇30mL，于75℃水浴加熱回流提取1h，過濾，濾液減壓濃縮后，定容至10mL容量瓶，備用[6]。2.3.2對照品溶液制備分別精密稱取毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、芒柄花素、芒柄花苷、香草酸對照品5.16、5.13、4.71、5.47、4.93mg，加甲醇超聲溶解，定容于5mL容量瓶中，分別制成各對照品貯備液。分別取上述對照品貯備液各1mL，定容至10mL容量瓶中，制成混合對照品溶液，備用。2.3.3色譜條件采用AgilentHC-C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），流動相為乙腈-0.01%磷酸水溶液，梯度洗脫（0～5min，乙腈2%～5%；5～20min，乙腈5%～16%；20～35min，乙腈16%～18%；35～36min，乙腈18%～30%；36～66min，乙腈30%～60%；66～80min，乙腈60%～90%），流速1.0mL/min，檢測波長280nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10μL。在此色譜條件下，色譜峰分離度良好。2.3.4線性關(guān)系考察分別精密移取“2.3.2”項下毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、芒柄花素、芒柄花苷、香草酸對照品貯備液，加甲醇逐級稀釋成不同濃度對照品溶液，按“2.3.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。結(jié)果表明，各對照品在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表1.2.3.5精密度試驗精密吸取“2.3.2”項下混合對照品溶液1mL，按“2.3.3”項下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定各成分峰面積并計算RSD。結(jié)果香草酸、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素色譜峰峰面積RSD分別為0.46%、0.82%、1.02%、0.68%、1.42%，表明精密度良好。2.3.6穩(wěn)定性試驗取紅芪同一供試品溶液，于4℃放置保存，分別于0、6、14、20、32h進(jìn)樣，測定各成分峰面積并計算RSD。結(jié)果香草酸、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素色譜峰峰面積RSD分別為0.79%、1.15%、1.07%、1.24%、1.76%，表明供試品溶液于4℃放置32h內(nèi)基本穩(wěn)定。2.3.7重復(fù)性試驗精密稱取炙紅芪樣品6份，按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算各成分含量。結(jié)果香草酸、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素的平均含量分別為20.40、52.21、90.05、79.20、144.96μg/g，RSD分別為1.67%、2.05%、2.48%、2.33%、1.27%，表明方法重復(fù)性較好。2.3.8加樣回收率試驗精密稱取已知待測成分含量的同一炙紅芪樣品6份，每份約1.0000g，按待測成分含量1∶1比例分別精密加入香草酸、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素對照品，按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算各成分加樣回收率，結(jié)果香草酸、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素平均加樣回收率分別為98.02%、96.58%、97.44%、97.24%、96.37%，RSD分別為1.96%、2.13%、2.26%、1.66%、2.05%，見表2。2.3.9樣品測定精密稱取紅芪和炙紅芪樣品各10批，按“2.3.1項下方法分別制備供試品溶液，按“2.3.3”項下方法進(jìn)樣，測定各共有峰峰面積，計算香草酸、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素的含量，結(jié)果見表3。對照品色譜圖見圖1，紅芪和炙紅芪供試品指紋圖譜見圖2。紅芪蜜炙后，毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷和香草酸含量均顯著降低（P＜0.01），分別降低48.00%、21.74%和48.24%；毛蕊異黃酮和芒柄花素含量均顯著上升（P＜0.01），分別上升34.18%和17.49%。

2.4多元統(tǒng)計分析

采用SIMCA14.1軟件對紅芪與炙紅芪各10批樣品中共有峰峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行多維變量統(tǒng)計分析。2.4.1主成分分析主成分分析（PCA）主要反映組內(nèi)聚集和組間分離趨勢[7]。紅芪和炙紅芪的PCA得分圖（見圖3）顯示，炙紅芪與紅芪明顯分為兩類，組內(nèi)出現(xiàn)明顯聚集。圖3紅芪和炙紅芪PCA得分圖2.4.2正交偏最小二乘判別分析采用正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）進(jìn)一步分析紅芪與炙紅芪差異。紅芪和炙紅芪OPLS-DA得分圖（見圖4）顯示，紅芪和炙紅芪均表現(xiàn)出明顯的聚類，且組間分離更加明顯，表明紅芪與炙紅芪化學(xué)成分有顯著差異。對所建立的OPLS-DA模型進(jìn)行驗證，通過置換測試以檢查其過度擬合。R2和Q2分別表示累積的自變量X對Y的解釋能力和模型的預(yù)測能力，理論上兩者數(shù)值越接近1表明模型擬合越好。本研究建立的OPLS-DA模型R2和Q2分別為0.9935和0.9911。由圖5可見，Q2截距＜0，且R2和Q2與橫坐標(biāo)的交點均小于0.5，兩者與縱坐標(biāo)的交點均小于1，表明該模型未過度擬合，且預(yù)測能力較好。進(jìn)一步以VIP＞1為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出紅芪與炙紅芪主要差異色譜峰。圖6所示，21、20、13（毛蕊異黃酮苷）、14、7、17（芒柄花素）、12（香草酸）、16（毛蕊異黃酮）、5、11、2、15（芒柄花苷）、10、8號峰為二者差異的主要指標(biāo)性成分。其中，21、20號峰為紅芪蜜炙后新生成的色譜峰。

3討論

紅芪與炙紅芪主要功效存在差異，而化學(xué)成分是藥物產(chǎn)生藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究結(jié)果顯示，紅芪與炙紅芪成分差異顯著。多元統(tǒng)計分析結(jié)果表明，21、20、13（毛蕊異黃酮苷）、14、7、17（芒柄花素）、12（香草酸）、16（毛蕊異黃酮）、5、11、2、15（芒柄花苷）、10、8號峰為其差異主要指標(biāo)性成分。含量測定結(jié)果顯示，與紅芪相比，炙紅芪中毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷及香草酸含量均顯著降低，而毛蕊異黃酮和芒柄花素含量均顯著上升。毛蕊異黃酮苷和芒柄花苷均為黃酮苷類，其苷鍵易受熱斷裂而生成游離黃酮和糖基。紅芪中毛蕊異黃酮苷和芒柄花苷在蜜炙過程中可能部分受熱分解成毛蕊異黃酮和芒柄花素，從而使炙紅芪中這2種游離黃酮含量升高。毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、芒柄花素和芒柄花苷均具有抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、抗菌、抗癌等作用[8-12]。香草酸是一種酚酸類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗血栓、抗細(xì)胞凋亡及抑制感染性結(jié)石形成等多種藥理作用[13-17]。紅芪和炙紅芪中上述5種成分均具有廣泛的藥理活性，是其主要活性成分，也是紅芪與炙紅芪的差異標(biāo)志物。2020年版《中華人民共和國藥典》未明確紅芪與炙紅芪質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分，因此，可以考慮選取上述5種成分作為紅芪與炙紅芪質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。

作者：牛江濤 曹瑞 司昕蕾 張育貴 張淑娟 李越峰 單位：甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 甘肅省中藥質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)研究重點實驗室