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摘要:目前天然藥物化學實驗課程中缺少對天然產(chǎn)物立體構(gòu)型確定的內(nèi)容。在多年教學科研工作基礎(chǔ)上，提出以青蒿素構(gòu)型和構(gòu)象為主題，將實物球棍HGS分子模型和ChemOffice軟件中模擬分子模型應(yīng)用到天然藥物化學實驗中，同時整合TopSpin核磁共振圖譜處理軟件和CCDC晶體數(shù)據(jù)庫網(wǎng)絡(luò)資源，構(gòu)建“天然產(chǎn)物立體結(jié)構(gòu)分析”互動實驗教學平臺。旨在幫助學生更好地理解相對構(gòu)型、絕對構(gòu)型、構(gòu)象等概念，提高學生對復雜天然產(chǎn)物進行結(jié)構(gòu)解析的能力。

關(guān)鍵詞:天然藥物化學實驗;立體化學;分子模型;青蒿素

天然藥物化學作為國內(nèi)藥學和中藥學相關(guān)專業(yè)的必修專業(yè)課程，從天然產(chǎn)物的提取分離、理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)鑒定等方面，為未來創(chuàng)新天然藥物研發(fā)人才提供了重要的知識儲備。隨著2015年中國科學家屠呦呦因?qū)η噍锼匮芯康呢暙I獲得諾貝爾生理學或醫(yī)學獎，以及2016年國家實施《中醫(yī)藥發(fā)展戰(zhàn)略規(guī)劃綱要(2016－2030年)》，方興未艾的天然藥物研究也給該課程的理論和實驗教學提出了更高的要求。作為理論教學的重要輔助課程，天然藥物化學實驗給學生提供了對理論知識點加以驗證的機會，同時還可以培養(yǎng)學生的觀察、思考和操作能力。國內(nèi)相關(guān)院校也以提高學生興趣、參與度和創(chuàng)新能力為目標，在教學方法上進行了大膽的改革嘗試。例如，引入慕課輔助教學模式［1］、開展自主設(shè)計性實驗［2］和發(fā)現(xiàn)式實驗教學［3］等。然而，目前國內(nèi)天然藥物化學實驗仍局限于特定結(jié)構(gòu)類型化合物的提取分離和理化鑒別反應(yīng)，而缺失通過波譜學方法對復雜天然產(chǎn)物化學結(jié)構(gòu)，尤其是立體結(jié)構(gòu)確證的教學內(nèi)容。眾所周知，利用波譜學方法確定化合物平面結(jié)構(gòu)及立體構(gòu)型一直以來是傳統(tǒng)天然藥物研究中必不可少的一個環(huán)節(jié)，而目前通過計算機軟件預(yù)測化合物生物學靶標之前也需要明確化合物的立體構(gòu)型和構(gòu)象。因此，天然產(chǎn)物立體化學及其相關(guān)波譜學方法和其他確定手段(包括單晶X-射線衍射、分子模型分析等)，應(yīng)該成為天然藥物化學理論和實驗教學中學生必須掌握的基礎(chǔ)知識，并且應(yīng)該通過教學改革，學校提供給學生更多可視化、可操作、可記錄的實踐機會。分子模型是天然產(chǎn)物立體結(jié)構(gòu)確證中應(yīng)用最廣泛的手段，其可以獲得最直觀的分子空間結(jié)構(gòu)，并幫助學生更好地解讀核磁共振波譜數(shù)據(jù)。目前主要有兩種構(gòu)建分子空間模型的方法:一種是傳統(tǒng)的球棍模型。例如，日本Maruzen公司的HGS分子構(gòu)造模型，其可以使學生在手動搭建模型的過程中獲得更多的體驗感和直觀認識，因此這種模型在日本藥學高等院校的化學相關(guān)課程教學中得到很好的應(yīng)用;另外一種為ChemOffice等化學結(jié)構(gòu)繪圖軟件中包含的Chem3D組件，其可以將ChemDraw繪制的二維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為三維空間結(jié)構(gòu)，并通過能量優(yōu)化獲取化合物最穩(wěn)定的空間構(gòu)象，在目前天然產(chǎn)物構(gòu)象的確定中應(yīng)用廣泛?；谝陨戏治?，圍繞天然產(chǎn)物立體結(jié)構(gòu)確證這一重要知識點，筆者提出將HGS分子模型引入天然藥物化學實驗教學內(nèi)容，同時激活整合ChemOffice軟件包、TopSpin核磁共振圖譜處理軟件、劍橋晶體學數(shù)據(jù)中心［TheCambridgeCrystallographicDataCentre(CCDC)］網(wǎng)絡(luò)資源、互動教學系統(tǒng)等教學資源，構(gòu)建“天然產(chǎn)物立體結(jié)構(gòu)分析”的互動實驗教學平臺。在鞏固天然藥物化學理論教學效果的基礎(chǔ)上，提升天然藥物化學實驗課程的教學水平，進而全面促進學生對天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定相關(guān)知識的學習，為他們未來就業(yè)或研究生學習提供更強的競爭力。

1基于分子模型互動教學的“天然產(chǎn)物立體結(jié)構(gòu)分析”實驗平臺的構(gòu)建

為了提高學生對該實驗教學內(nèi)容的興趣，筆者以青蒿素立體結(jié)構(gòu)的確定為例，以數(shù)碼互動教學系統(tǒng)為載體，在引入HGS分子構(gòu)造模型動手操作環(huán)節(jié)的基礎(chǔ)上，結(jié)合計算機操作，構(gòu)建起“化學結(jié)構(gòu)繪制”“NMR信號分析”“分子模型搭建”和“晶體結(jié)構(gòu)驗證”等相關(guān)模塊(圖1)。1.1“化學結(jié)構(gòu)繪制”模塊。筆者應(yīng)用ChemOffice2004軟件［4-7］中的Chem-DrawUltra8.0組件完成青蒿素結(jié)構(gòu)的繪制。該模塊旨在提高學生繪制天然產(chǎn)物化學結(jié)構(gòu)的規(guī)范性。例如，繪圖模板的選擇、鍵長鍵角的選擇、雜原子的字體大小，尤其是涉及立體構(gòu)型方面手性碳的標識和楔形鍵的擺放角度等問題。結(jié)合青蒿素的結(jié)構(gòu)，學生在繪制的過程中還需要注意:同一手性碳上僅標識1個基團的朝向即可。例如，C-10和C-11位上無需標識氫原子的朝向，而C-4位上無需標識甲基的朝向;所有手性碳均應(yīng)明確構(gòu)型。例如，C-1、C-5和C-7位等兩個環(huán)狀結(jié)構(gòu)駢合的位置上應(yīng)標識氫原子的朝向;應(yīng)在綜合相關(guān)文獻的基礎(chǔ)上對結(jié)構(gòu)中所有碳原子進行編號，以方便后續(xù)模塊操作中NMR信號的歸屬，以及結(jié)合分子模型和NOESY圖譜進行構(gòu)象和構(gòu)型的分析。1.2“NMR信號分析”模塊。應(yīng)用Bruker公司面向?qū)W校和科研院免費提供的TopSpin軟件，學生在掌握軟件常規(guī)操作(例如定標、積分、標識位移等)的基礎(chǔ)上，對青蒿素對照品在氘代氯仿中測試得到的1HNMR、13CNMR、HSQC和HMBC圖譜進行分析，歸屬所有的1H和13CNMR信號，并整理成規(guī)范的NMR信號列表。進一步對NOESY圖譜分析，準確尋找到所有可以用于“分子模型搭建”模塊使用的相關(guān)信號。1.3“分子模型搭建”模塊此模塊操作中，學生應(yīng)在NOESY相關(guān)數(shù)據(jù)的指導下，開展實物球棍模型的搭建和計算機模擬分子模型的構(gòu)象優(yōu)化兩方面內(nèi)容。1.3.1實物球棍模型的搭建。結(jié)合國內(nèi)其他院校將分子模型應(yīng)用在理論教學中的工作基礎(chǔ)［8-10］，筆者選擇Maruzen公司的C型套裝(有機化學實驗用)HGS分子構(gòu)造模型(其含有30個sp3雜化的碳原子、14個苯環(huán)碳原子以及相配套的氫原子，可以滿足絕大多數(shù)天然產(chǎn)物球棍模型的搭建)。每個學生使用一套模型，完成下列實驗內(nèi)容:熟悉模型的基本使用方法(包括不飽和鍵，例如羰基的裝配方法)，并搭建青蒿素分子模型;根據(jù)NMR信號歸屬情況及NOESY相關(guān)信號，對化合物的相對構(gòu)型進行確證，歸屬C-2、C-3、C-8和C-9位亞甲基上兩個不同朝向的質(zhì)子，對結(jié)構(gòu)中所有雜環(huán)的構(gòu)象進行判斷。1.3.2模擬分子模型的優(yōu)化。學生將在ChemDrawUltra8.0組件中繪制的青蒿素結(jié)構(gòu)導入到Chem3DUltra8.0組件中，然后利用“MM2”工具欄下的“MinimizeEnergy”選項對其空間結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化，獲取能量最低的構(gòu)象;通過視圖放大及構(gòu)象旋轉(zhuǎn)按鈕對構(gòu)象進行調(diào)整，結(jié)合NOESY圖譜相關(guān)信號及實物分子模型，核對各雜環(huán)的構(gòu)象，并掌握對分子構(gòu)象進行調(diào)整的方法;選擇能夠看到絕大多數(shù)關(guān)鍵質(zhì)子的觀察角度，調(diào)整構(gòu)象大小和清晰度后，將其導入ChemDraw組件中，標識各個質(zhì)子的化學位移及關(guān)鍵的NOESY相關(guān)信號后，以圖片形式進行保存。1.4“晶體結(jié)構(gòu)驗證”模塊。以青蒿素的英文名“artemisinin”為關(guān)鍵詞，在AccessStructures界面檢索到存儲號為1243346的晶體結(jié)構(gòu)，學生在3DViewer中通過構(gòu)象旋轉(zhuǎn)選擇合適角度，與搭建的實物模型及模擬分子模型三者進行比對，驗證分子模型構(gòu)建的準確性。1.5實驗平臺各操作模塊間的協(xié)調(diào)和運行。整個實驗平臺包含動手操作部分(“分子模型搭建”模塊中實物球棍模型的搭建)和上機操作部分，后者又包含四個模塊中絕大部分的操作。因此，該平臺應(yīng)以數(shù)碼互動教學系統(tǒng)為載體來運行，從而可以使學生和教師間的信息反饋更加及時準確。四個模塊間的順序安排，一般應(yīng)以“化學結(jié)構(gòu)繪制”模塊起始，繪制的青蒿素結(jié)構(gòu)用于Chem3D構(gòu)象分析;然后，通過“NMR信號分析”模塊歸屬青蒿素的碳氫信號，并在此基礎(chǔ)上尋找到關(guān)鍵NOESY相關(guān)信號用于對“分子模型搭建”模塊中兩種模型構(gòu)象和相對構(gòu)型的校正;最后，通過“晶體結(jié)構(gòu)驗證”模塊對在NOESY圖譜指導下搭建的實物和模擬分子模型進行進一步驗證。

2分子模型互動教學平臺教學內(nèi)容的拓展

在上述“青蒿素立體結(jié)構(gòu)確證”的實驗教學內(nèi)容以外，基于分子模型互動教學平臺，筆者選擇了幾個典型的天然產(chǎn)物立體構(gòu)型和波譜學特征相互聯(lián)系的案例，供學生選擇學習。2.1青蒿素類似物結(jié)構(gòu)中的船式構(gòu)象和烯丙偶合的探究?；衔颒HHY-D-16(圖2)是從黃花蒿中分離得到的青蒿素類似物，學生通過測試1HNMR、13CNMR、HSQC和HMBC圖譜可確定其平面結(jié)構(gòu)，進一步對NOESY圖譜進行分析確定其相對構(gòu)型，同時證實了C-1/C-2/C-3/C-4/O/C-6和C-1/C-6/C-7/C-8/C-9/C-10兩個六元環(huán)均為椅式構(gòu)象。根據(jù)雙氫青蒿素的晶體結(jié)構(gòu)，學生可推測C-5/C-6/C-7/C-11/C-12/O所在的六元環(huán)也應(yīng)為扭椅式構(gòu)象。然而，在NOESY圖譜中卻沒有觀察到C-12位連氧亞甲基上任何一個質(zhì)子同H-5或H-8存在相關(guān)信號，反而觀察到亞甲基上其中一個質(zhì)子4.58(1H，dt，J=14.5，2.0Hz)同CH3-15(1.51，3H，s)的NOESY相關(guān)。根據(jù)上述異?，F(xiàn)象推測C-5/C-6/C-7/C-11/C-12/O六元環(huán)應(yīng)為扭船式構(gòu)象。通過搭建實物分子模型和Chem3D構(gòu)象優(yōu)化，證實了上述推斷，并且發(fā)現(xiàn)扭船式構(gòu)象的能量(40.9463Kcal/mol)要略低于扭椅式構(gòu)象(42.5864Kcal/mol)。上述構(gòu)象同時也解釋了4.58處質(zhì)子信號(朝向)的偶合裂分情況，即第二級的三重峰是由于其與C-13位兩個烯氫質(zhì)子二面角均為90°，從而受到明顯的烯丙偶合影響而產(chǎn)生的。圖2青蒿素類似物HHHY-D-16分子模型及其構(gòu)象和烯丙位偶合這項實驗內(nèi)容可以讓學生結(jié)合NOESY數(shù)據(jù)，動手搭建實物分子模型，從而比較生動地理解這一特殊構(gòu)象，糾正固有的“椅式構(gòu)象能量一定低于船式構(gòu)象”的錯誤觀念，并使學生對烯丙位偶合的強弱與二面角之間的關(guān)系建立起直觀的認識。2.2含半縮酮結(jié)構(gòu)片段三萜中的質(zhì)子W型偶合的探究。HJSJ-D-1(圖3)是從火炬樹中分離得到的含有六元半縮酮結(jié)構(gòu)的羽扇豆烷型五環(huán)三萜類化合物。在其1HNMR中給出4.25(1H，dd，J=8.7，2.7Hz)和3.73(1H，dd，J=8.7，1.6Hz)兩個連氧亞甲基上質(zhì)子信號，歸屬為結(jié)構(gòu)中CH2-25。其中兩個質(zhì)子的第一級偶合(偶合常數(shù)為8.7Hz)為同碳偕偶，但考慮到CH2-25鄰位的C-10為季碳，研究者對其各自第二級偶合是無法解釋的，推測可能存在質(zhì)子間遠程偶合。圖3含半縮酮結(jié)構(gòu)三萜HJSJ-D-1分子模型及質(zhì)子間W型偶合通過Chem3D模擬和搭建實物分子模型，學生可以很容易地觀察到CH2-25兩個質(zhì)子分別和處于直立鍵且為朝下的H-5和H-1間表現(xiàn)出非常典型的W型偶合，從而可以解釋各自第二級偶合的產(chǎn)生。同時，學生通過HJSJ-D-1實物分子模型，可以很好地掌握天然藥物化學第七章(三萜及其苷類)和第八章(甾體及其苷類)教學內(nèi)容中環(huán)系駢合方式的判斷。2.3二氫黃酮H-2/H-3偶合裂分情況分析。天然藥物化學第五章中二氫黃酮和二氫黃酮醇的1HNMR特征和立體化學一直以來都是教學中的難點。學生通過平面結(jié)構(gòu)或者教材中給出的構(gòu)象很難準確地理解其H-2/H-3之間特征的質(zhì)子偶合關(guān)系。在二氫黃酮類化合物圣草酚(eriodictyol，圖4)的1HNMR(CD3OD)圖譜中，給出了H-2特征的信號5.28(1H，dd，J=12.7，3.0Hz)，以及兩個H-3質(zhì)子信號:3.07(1H，dd，J=17.1，12.7Hz)和2.70(1H，dd，J=17.1，3.0Hz)。學生通過分析可以發(fā)現(xiàn)，H-3兩個質(zhì)子和H-2分別表現(xiàn)出偶合常數(shù)為12.7Hz和3.0Hz的鄰位偶合。通過ECD圖譜中331nm處正的Cotton效應(yīng)，判斷C-2為S構(gòu)型。學生通過搭建其分子模型，可以很清楚地觀察到在B環(huán)這一大基團位于平伏鍵的情況下，處于朝向直立鍵上的H-2與處于直立鍵的H-3和平伏鍵的H-3之間的二面角分別約為180°和60°，從而分別呈現(xiàn)出12.7和3.0Hz的鄰位偶合。

3分子模型互動教學平臺的初步應(yīng)用

雖然目前互動教學系統(tǒng)尚未投入使用，但筆者已經(jīng)將“化學結(jié)構(gòu)繪制”“NMR信號分析”“分子模型搭建”和“晶體結(jié)構(gòu)驗證”四個模塊的教學在兩個專業(yè)的天然藥物化學實驗中加以應(yīng)用。初步探索式的運行采取自愿報名的方式從學生中選擇參與人，以興趣小組的形式組織教學活動:筆者首先進行ChemOffice2004和Topspin軟件(含青蒿素的1D及2DNMR圖譜)的安裝和操作講解;學生課前查閱相關(guān)文獻，通過ChemDraw組件進行青蒿素結(jié)構(gòu)的繪制，并整理NMR信號列表;學生課上搭建實物球棍分子模型，并通過Chem3D組件獲取模擬分子模型，結(jié)合NOESY數(shù)據(jù)對兩種模型進行校正;在CCDC數(shù)據(jù)庫檢索獲取青蒿素晶體結(jié)構(gòu)，與實物和模擬分子模型進行比對，熟悉青蒿素各個雜環(huán)的構(gòu)象，并在此基礎(chǔ)上學生進一步檢索學習雙氫青蒿素的晶體結(jié)構(gòu)。參與此項教學活動的學生普遍反映:通過“分子模型搭建”和“晶體結(jié)構(gòu)驗證”兩個模塊的學習，真正理解了天然產(chǎn)物立體化學涉及的相對構(gòu)型、絕對構(gòu)型、構(gòu)象等概念，并掌握了其確定方法;掌握了NMR圖譜處理軟件的使用方法，并且對復雜質(zhì)子峰形的解析方面積累了豐富的經(jīng)驗;掌握了復雜天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的規(guī)范畫法。

4結(jié)語

由于教學手段和教學條件的局限，傳統(tǒng)的天然藥物化學實驗課程主要圍繞提取分離和理化鑒別開設(shè)不同的教學內(nèi)容，而未能給理論教學中非常突出的難點———結(jié)構(gòu)鑒定提供一個通過具體操作來加深理解的機會。而筆者通過實物和虛擬分子模型的引入，激活了NMR處理軟件和結(jié)構(gòu)繪制分析軟件在實驗教學中的應(yīng)用，并構(gòu)建起了完整的“天然產(chǎn)物平面結(jié)構(gòu)———立體結(jié)構(gòu)解析”的教學平臺。在今后的教學活動中，筆者將逐步完善該平臺在數(shù)碼互動教學系統(tǒng)中的運行，同時也會在科研工作中尋找更多適合應(yīng)用到該平臺的化合物立體化學解析實例，以不斷提高學生對天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)解析和立體化學的學習效果，并在此過程中全面提升學生自主學習的積極性和能力。

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作者:李占林 朱玲娟 張雪 高慧媛 單位:沈陽藥科大學中藥學院