【摘要】目的探討2型重組腺相關(guān)病毒（recombinantadeno-associatedvirus2,rAAV-2）載體能否有效地轉(zhuǎn)染NSCs。方法采用含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP）報告基因的rAAV-2（rAAV-2/EGFP），以感染復(fù)數(shù)（multiplicityofinfection,MOI）分別為1×104、1×105、1×106轉(zhuǎn)染體外分離、培養(yǎng)的大鼠胎鼠NSCs，在熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達(dá)；同時檢測子代細(xì)胞的活力、增殖倍數(shù)、分化情況來評估對其存活、增殖、分化能力的影響；當(dāng)EGFP表達(dá)穩(wěn)定后，流式細(xì)胞儀檢測rAAV-2/EGFP對NSCs的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果轉(zhuǎn)染10天后各轉(zhuǎn)染組便可觀察到NSCs克隆球發(fā)出綠色熒光，起始熒光強(qiáng)度不一，隨MOI值的增大而增強(qiáng)；各轉(zhuǎn)染組熒光強(qiáng)度隨時間的延長而逐漸增強(qiáng)，至轉(zhuǎn)染21天后達(dá)高峰并維持，此時流式細(xì)胞儀檢測rAAV-2對NSCs的轉(zhuǎn)染效率：MOI為1×104、1×105、1×106時轉(zhuǎn)染率分別為25.68%、50.60%、54.72%,熒光指數(shù)（FI）分別為4.08、12.72、14.06；轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)7、14、21天時其細(xì)胞活力、增殖倍數(shù)、分化差異均無顯著性。結(jié)論rAAV-2能有效地轉(zhuǎn)染NSCs，所介導(dǎo)的目的基因能高效表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】神經(jīng)干細(xì)胞；2型腺相關(guān)病毒；轉(zhuǎn)染；感染復(fù)數(shù)；綠色熒光蛋白；熒光指數(shù)；細(xì)胞活力

綠色熒光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）基因是一種新的報告基因，由于其表達(dá)產(chǎn)物GFP可被直接激發(fā)產(chǎn)生熒光，不需要任何底物或輔助因子，較傳統(tǒng)的標(biāo)記基因如β2-半乳糖苷酶基因、熒光素酶基因等更具有明顯的優(yōu)越性；在GFP的基礎(chǔ)上進(jìn)行F64L和S65T的突變從而形成增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP），EGFP增強(qiáng)了GFP的熒光性能，更容易觀察、檢測［1］。2型腺相關(guān)病毒具有與人類疾病無相關(guān)性、宿主范圍廣、可整合入細(xì)胞染色體DNA介導(dǎo)外源基因長期表達(dá)等優(yōu)點,是較理想的基因載體［2］。隨著神經(jīng)干細(xì)胞（neuralstemcells，NSCs）的分離、培養(yǎng)、純化及生物學(xué)功能研究深入［3～5］，尋找NSCs基因修飾載體及標(biāo)記分子，已成為研究NSCs在體內(nèi)、外分化調(diào)控和細(xì)胞工程基因治療中樞系統(tǒng)疾病的研究熱點。運用基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞治療中樞系統(tǒng)疾病具有細(xì)胞修復(fù)和轉(zhuǎn)基因治療的雙重優(yōu)勢。理想的基因轉(zhuǎn)移載體是基因修飾的關(guān)鍵。

1材料與方法

1.1病毒載體rAAV-2/EGFP購于863生物領(lǐng)域病毒基因載體研究開發(fā)基地、北京本元正陽基因技術(shù)股份有限公司，滴度為5×1011v.g/ml。

1.2神經(jīng)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)、鑒定［6］按參考文獻(xiàn)進(jìn)行，體外分離胚胎大鼠大腦額葉皮質(zhì)、懸浮培養(yǎng)，經(jīng)Nestine鑒定為神經(jīng)干細(xì)胞（見圖1），作為實驗細(xì)胞株。

摘要：干細(xì)胞是上世紀(jì)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重大發(fā)現(xiàn)，是當(dāng)前生命科學(xué)的研究熱點，為世人矚目。神經(jīng)干細(xì)胞(NeuralStemCell，NSC)是其中最有發(fā)展前景的重要分支，它具備未分化特性、增殖和自我更新以及分化產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要類型細(xì)胞的能力。Mckay將NSC的概念概括為：能無限增殖，具有分化為神紹元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，能自我更新并提供大量腦組織細(xì)胞的細(xì)胞。

關(guān)鍵詞：神經(jīng)干細(xì)胞臨床應(yīng)用

1NSC的來源

據(jù)來源部位的不同，可分為胚胎來源及成體來源，分別稱為胚胎干細(xì)胞(EmbryonicStemCell，ESC)及成體干細(xì)胞(AdultStemCell，ASC)。ESC來源于胚胎胚泡階段，即胚胎發(fā)育過程中植入于宮壁內(nèi)之前階段。ASC來自于成體組織，能在很長一段時間內(nèi)準(zhǔn)確復(fù)制自己，進(jìn)行自我更新，能生長成成體的細(xì)胞類型，具有一定形態(tài)特征和指定的功能。由于ESC研究與應(yīng)用面臨倫理、宗教、法律、免疫排斥和潛在致瘤性等問題，在實際操作上仍有一定困難。而ASC“可塑性”的發(fā)現(xiàn)及相關(guān)研究在不同程度上避免了這些問題，是細(xì)胞替代治療和基因組織工程研究的熱點之一。

2臨床應(yīng)用

對于神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變及嚴(yán)重?fù)p傷，NSC移植有可能替代衰老、變性和死亡的神經(jīng)細(xì)胞，重建神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，恢復(fù)受損的腦功能。這種治療方法具有以下的特點：a.NSC在腦中能根據(jù)周圍環(huán)境的誘導(dǎo)而分化成相應(yīng)的細(xì)胞類型，其形態(tài)功能與附近原有細(xì)胞非常類似。b.免疫源性弱，免疫反應(yīng)小。c.低毒性，致瘤性弱。

摘要：干細(xì)胞是上世紀(jì)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重大發(fā)現(xiàn)，是當(dāng)前生命科學(xué)的研究熱點，為世人矚目。神經(jīng)干細(xì)胞(NeuralStemCell，NSC)是其中最有發(fā)展前景的重要分支，它具備未分化特性、增殖和自我更新以及分化產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要類型細(xì)胞的能力。Mckay將NSC的概念概括為：能無限增殖，具有分化為神紹元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，能自我更新并提供大量腦組織細(xì)胞的細(xì)胞。

關(guān)鍵詞：神經(jīng)干細(xì)胞臨床應(yīng)用

一、NSC的來源

據(jù)來源部位的不同，可分為胚胎來源及成體來源，分別稱為胚胎干細(xì)胞(EmbryonicStemCell，ESC)及成體干細(xì)胞(AdultStemCell，ASC)。ESC來源于胚胎胚泡階段，即胚胎發(fā)育過程中植入于宮壁內(nèi)之前階段。ASC來自于成體組織，能在很長一段時間內(nèi)準(zhǔn)確復(fù)制自己，進(jìn)行自我更新，能生長成成體的細(xì)胞類型，具有一定形態(tài)特征和指定的功能。由于ESC研究與應(yīng)用面臨倫理、宗教、法律、免疫排斥和潛在致瘤性等問題，在實際操作上仍有一定困難。而ASC“可塑性”的發(fā)現(xiàn)及相關(guān)研究在不同程度上避免了這些問題，是細(xì)胞替代治療和基因組織工程研究的熱點之一。

二、臨床應(yīng)用

對于神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變及嚴(yán)重?fù)p傷，NSC移植有可能替代衰老、變性和死亡的神經(jīng)細(xì)胞，重建神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，恢復(fù)受損的腦功能。這種治療方法具有以下的特點：a.NSC在腦中能根據(jù)周圍環(huán)境的誘導(dǎo)而分化成相應(yīng)的細(xì)胞類型，其形態(tài)功能與附近原有細(xì)胞非常類似。b.免疫源性弱，免疫反應(yīng)小。c.低毒性，致瘤性弱。

摘要：干細(xì)胞是上世紀(jì)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重大發(fā)現(xiàn)，是當(dāng)前生命科學(xué)的研究熱點，為世人矚目。神經(jīng)干細(xì)胞(NeuralStemCell，NSC)是其中最有發(fā)展前景的重要分支，它具備未分化特性、增殖和自我更新以及分化產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要類型細(xì)胞的能力。Mckay將NSC的概念概括為：能無限增殖，具有分化為神紹元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，能自我更新并提供大量腦組織細(xì)胞的細(xì)胞。

關(guān)鍵詞：神經(jīng)干細(xì)胞臨床應(yīng)用

1NSC的來源

據(jù)來源部位的不同，可分為胚胎來源及成體來源，分別稱為胚胎干細(xì)胞(EmbryonicStemCell，ESC)及成體干細(xì)胞(AdultStemCell，ASC)。ESC來源于胚胎胚泡階段，即胚胎發(fā)育過程中植入于宮壁內(nèi)之前階段。ASC來自于成體組織，能在很長一段時間內(nèi)準(zhǔn)確復(fù)制自己，進(jìn)行自我更新，能生長成成體的細(xì)胞類型，具有一定形態(tài)特征和指定的功能。由于ESC研究與應(yīng)用面臨倫理、宗教、法律、免疫排斥和潛在致瘤性等問題，在實際操作上仍有一定困難。而ASC“可塑性”的發(fā)現(xiàn)及相關(guān)研究在不同程度上避免了這些問題，是細(xì)胞替代治療和基因組織工程研究的熱點之一。

2臨床應(yīng)用

對于神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變及嚴(yán)重?fù)p傷，NSC移植有可能替代衰老、變性和死亡的神經(jīng)細(xì)胞，重建神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，恢復(fù)受損的腦功能。這種治療方法具有以下的特點：a.NSC在腦中能根據(jù)周圍環(huán)境的誘導(dǎo)而分化成相應(yīng)的細(xì)胞類型，其形態(tài)功能與附近原有細(xì)胞非常類似。b.免疫源性弱，免疫反應(yīng)小。c.低毒性，致瘤性弱。

1診斷

對于該病的診斷，由病史、癥狀、體征等臨床特點，提供了第一手重要的診斷依據(jù)。目前更為突出的是影像學(xué)檢查手段的完善、發(fā)展，使早期、超早期診斷成為可能。

1.1CT目前，急性腦卒中患者的頭顱CT平掃檢查是常規(guī)影像檢查，因其能迅速而敏感地發(fā)現(xiàn)腦出血的存在，進(jìn)行第一步最重要的鑒別診斷。先進(jìn)的CT設(shè)備可在卒中發(fā)生數(shù)小時內(nèi)提供診斷信息，最常見的CT改變?yōu)榇竽X中動脈閉塞時的大腦中動脈高密度征，其他的早期缺血改變包括豆?fàn)詈嗣芏认陆?、島帶消失、半側(cè)腦溝消失和半側(cè)腦實質(zhì)密度下降，后兩種CT異常提示了梗死面積大、預(yù)后不良及進(jìn)行溶栓治療的危險性增加［1～3］。近年，隨著螺旋CT的發(fā)展，CT血管成像及灌注成像為腦梗死的早期診斷提供了更多的幫助。

1.1.1CT血管成像（CTA）CTA為通過靜注碘化造影劑后，經(jīng)螺旋CT掃描進(jìn)行血管重建成像，其成像質(zhì)量正在接近常規(guī)血管造影。這項技術(shù)可以檢測顱外頸動脈狹窄程度和斑塊形態(tài)，還可以可靠地檢測顱內(nèi)血管狹窄、栓子和中等大小或一些更大的動脈瘤。因可較直觀地看到腦的血液循環(huán)情況，故對腦梗死的早期診斷有重要意義。

1.1.2CT灌注成像CT灌注成像技術(shù)，主要通過團(tuán)注碘對比劑顯示毛細(xì)血管內(nèi)對比劑通過時引起的腦組織密度變化狀態(tài)。在急性腦缺血早期，特別是發(fā)病2～4h的超早期，常規(guī)CT平掃改變輕微或無異常改變，一旦出現(xiàn)低密度病灶，就被認(rèn)為是缺血性梗死形成，代表形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞。而灌注成像能早期發(fā)現(xiàn)灌注異常區(qū)，對估計側(cè)支循環(huán)和患者的預(yù)后極為重要［4，5］。近年來，多層CT灌注成像的時間和空間分辨率高，可快速、準(zhǔn)確、無創(chuàng)和三維地評價腦循環(huán)內(nèi)血流動力學(xué)變化［4］。

1.2核磁共振（MR）磁共振成像（MRI）是目前最重要的輔助檢查之一，在采用T1加權(quán)和T2加權(quán)成像上，早期在6h后就可出現(xiàn)異常，表現(xiàn)為長T1和長T2信號，T1為低信號，T2為高信號。更為早期的診斷方法為彌散加權(quán)像（DWI）和灌注成像（PWI），可以自癥狀出現(xiàn)數(shù)分鐘發(fā)現(xiàn)異常，最多在發(fā)病后1h左右即可出現(xiàn)。

【關(guān)鍵詞】Wnt

ExpressionandbiologicalactivityofmouseWnt3ageneinNIH3T3cells

【Abstract】AIM:ToexpressrecombinantmouseWnt3asignalproteinwithbiologicalactivity.METHODS:Therecombinanteukaryoticexpressionplasmid,pSecTag2/HygroBWnt3a,wastransfectedintoNIH3T3cellsbyliposome,thentheexpressedproteinwasdetectedbyWesternBlot.ThesaturationdensityandthecapabilityofsuppressingapoptosisinWnt3a/NIH3T3cellswereevaluated.RESULTS:TheWnt3asignalproteinwasstablyexpressedinWnt3a/NIH3T3cells.ThesaturationdensityandthecapabilityofsuppressingapoptosisinWnt3a/NIH3T3cellsweremarkedlyincreased.CONCLOUSION:WesuccessfullyconstructtherecombinantWnt3asignalproteinwithbiologicalactivity.

【Keywords】Wnt3a;eukaryoticexpression;contactinhibition;apoptosis

【摘要】目的：表達(dá)具備生物活性的重組小鼠Wnt3a信號蛋白.方法：應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將重組真核表達(dá)載體pSecTag2/HygroBWnt3a轉(zhuǎn)染并篩選穩(wěn)定表達(dá)的NIH3T3細(xì)胞，WesternBlot鑒定重組Wnt3a蛋白的表達(dá)，并對Wnt3a/NIH3T3細(xì)胞的融合密度及抗凋亡能力給予檢測.結(jié)果：Wnt3a信號蛋白在Wnt3a/NIH3T3細(xì)胞中獲得穩(wěn)定表達(dá)，Wnt3a信號蛋白能夠明顯提高NIH3T3細(xì)胞的融合密度及抗凋亡能力.結(jié)論：在NIH3T3細(xì)胞中表達(dá)的重組Wnt3a信號蛋白具備生物活性.

【關(guān)鍵詞】Wnt3a；真核表達(dá)；接觸抑制；細(xì)胞凋亡

干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力和一定分化潛能的細(xì)胞，在一定條件下，它可以分化成多種具有不同功能的細(xì)胞。根據(jù)干細(xì)胞所處的發(fā)育階段及其功能學(xué)特性，可將其進(jìn)一步分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。因此，干細(xì)胞在組織工程、再生醫(yī)學(xué)中有著重要的應(yīng)用價值。目前，牙齒缺損等牙源性疾病在中老年人中發(fā)病率較高。牙髓干細(xì)胞(dentalpulpstemcell，DPSC)是牙髓組織中的一類成體干細(xì)胞，具有一定的分化潛能和增殖能力，在牙齒再生、牙髓修復(fù)方面有著重要的應(yīng)用價值，特別是隨著相關(guān)組織工程技術(shù)的發(fā)展，DPSC具備了成為一種新型種子細(xì)胞的潛能〔1〕。

1DPSC的定義和基本生物學(xué)性質(zhì)

成牙本質(zhì)細(xì)胞是一種終末細(xì)胞，不具備進(jìn)一步分化的能力，因此，一般認(rèn)為成牙本質(zhì)細(xì)胞在遭受損傷后，牙髓內(nèi)的某些具有分化功能的前體細(xì)胞可進(jìn)一步分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，并分泌相關(guān)細(xì)胞基質(zhì)，修復(fù)受損組織，這種前體細(xì)胞即為DPSC。DPSC具有較強(qiáng)的增殖能力和較高的分化潛能，正是這兩種生物學(xué)性質(zhì)，決定了DPSC在牙源組織修復(fù)和骨性修復(fù)方面具有重要的作用〔2〕。Gronthos等〔3〕在2000年首次正式提出了DPSC的概念，把牙髓內(nèi)可以快速增殖并且具有一定克隆形成能力的牙髓細(xì)胞命名為DPSC，研究人員應(yīng)用酶消化法對成人第三磨牙的牙髓細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行比較，結(jié)果顯示:這兩種細(xì)胞具有極為相似的免疫學(xué)特性，并且，該研究進(jìn)一步證實DP-SC經(jīng)體外誘導(dǎo)后，可形成高密度的鈣化小結(jié)，將DPSC與羥基磷灰石/磷酸三鈣(HA/TCP)支架復(fù)合后移植到小鼠背側(cè)皮下，經(jīng)過一段時間后，能觀察到類似于牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體樣的結(jié)構(gòu)。

2DPSC的多向分化潛能

作為一種成體干細(xì)胞，DPSC具備多向分化的潛能，這種潛能不僅僅局限在骨性分化方面，研究人員在成脂分化、神經(jīng)分化等方面均取得了一定的研究成果，在再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域有著重要的指導(dǎo)意義。

2.1DPSC的骨性分化DPSC的骨性分化是關(guān)于DPSC定向分化研究較早的一項內(nèi)容，近些年來，又有了進(jìn)一步的發(fā)展。Mori等〔4〕采用成骨分化培養(yǎng)基進(jìn)行對DPSC的骨性誘導(dǎo)分化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，某些典型成骨細(xì)胞基因，如:堿性磷酸酶、I型膠原、骨橋蛋白等均大量表達(dá);應(yīng)用微陣列及RT-PCR技術(shù)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在成骨分化過程中，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5基因(IGFBP-5)、JunB原癌基因(JUNB)和核受體相關(guān)基因(NURR1)均發(fā)生表達(dá)上調(diào)現(xiàn)象，這一機(jī)制在成骨分化過程中有著重要的意義。D''''Alimonte等〔5〕在人源DPSC正常成骨誘導(dǎo)過程中，加入血管內(nèi)皮生長因子，結(jié)果顯示:這種方法可以刺激DPSC的增殖分裂的速度加快，而且促進(jìn)了成骨分化的進(jìn)程。

[論文關(guān)鍵詞]牙齒組織工程

[論文摘要]牙齒組織工程學(xué)是指利用體外和體內(nèi)培養(yǎng)的手段從單細(xì)胞獲得整個牙齒的組織工程手段。其關(guān)鍵之處是獲得具有較強(qiáng)生長和分化能力的種子細(xì)胞、優(yōu)選較為適宜的支架材料，以及構(gòu)建有較強(qiáng)再生能力的細(xì)胞-支架復(fù)合體。

近年來，隨著發(fā)育生物學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、干細(xì)胞以及生物材料學(xué)等領(lǐng)域的新進(jìn)展組織工程學(xué)也取得了長足的發(fā)展。所謂的牙齒組織工程學(xué)是運用生命科學(xué)和工程學(xué)的方法、原理和技術(shù)，在體外構(gòu)建有生物活性的組織，植入體內(nèi)，修復(fù)缺損組織，重建功能的一門新興學(xué)科。眾所周知，牙齒的發(fā)生發(fā)育經(jīng)歷有初始發(fā)生期、蕾狀期、帽狀期、鐘狀期、分化期、分泌期以及牙根的形成等階段，由上皮和間充質(zhì)的相互作用完成。即便使用單細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，牙齒結(jié)構(gòu)的發(fā)生和發(fā)育也要經(jīng)歷這些必然階段。這為牙齒組織工程學(xué)的研究奠定了基礎(chǔ)。然而組織工程學(xué)并不是一項簡單的工程，需要各個方面的工作相互協(xié)調(diào)，相互配合。

一、牙齒組織工程與干細(xì)胞

干細(xì)胞是一類具有自我更新能力的細(xì)胞，能夠產(chǎn)生至少一種類型的、高度分化的子代細(xì)胞。其可在體外分離、擴(kuò)增和冷凍保存，在一定的條件下可被誘導(dǎo)分化為不同的細(xì)胞或組織。根據(jù)發(fā)生學(xué)來源的不同可將干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。

隨著生物技術(shù)及組織工程學(xué)的發(fā)展，可通過干細(xì)胞定向分化技術(shù)，培育出特定的組織或器官。其原理是人為干預(yù)干細(xì)胞的分化方向，使這些細(xì)胞按照我們的需要分化成單一的組織或器官。組織工程牙齒的研究常以干細(xì)胞、信號分子及生物支架為基礎(chǔ)[1-2]，在體外通過組織重組技術(shù)及器官培養(yǎng)等方法研究牙齒的再生。Sharpe等[3]利用小鼠胚胎牙上皮和不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞）及成人骨髓干細(xì)胞重組后再植入小鼠體內(nèi)可獲得牙齒結(jié)構(gòu)，Young等[4]也通過組織工程的方法制備了齒/骨雜交體，即用豬第三磨牙的牙蕾細(xì)胞種植到生物可降解的支架PGA或PLGA上，在成年大鼠的視網(wǎng)膜上生長4周后即得牙移植塊；同樣從豬的骨髓中分離誘導(dǎo)成骨細(xì)胞，并種植到PLGA支架上，在透氧的生物反應(yīng)器系統(tǒng)中培養(yǎng)10天后即得骨移植塊；將以上的牙移植塊和骨移植塊組合在一起重新植入大鼠的視網(wǎng)膜上生長8周后，經(jīng)過組織學(xué)和免疫組化的方法分析發(fā)現(xiàn)齒/骨雜交體不僅能產(chǎn)生牙本質(zhì)、修復(fù)牙本質(zhì)及釉質(zhì)組織，還能表達(dá)骨鈣蛋白、骨涎蛋白以及Ⅲ型膠原。Kramer等[5]將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與牙周韌帶細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨鈣蛋白和骨橋蛋白的表達(dá)量明顯增加，而骨涎蛋白的表達(dá)量明顯降低，體現(xiàn)了共培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠獲得牙周韌帶細(xì)胞的特性，可用于進(jìn)行牙周組織的修復(fù)。這在一定程度上說明了，利用組織工程的方法在體外再生牙齒是可能的[6-7]。且在一定條件下不僅牙髓干細(xì)胞能夠再生牙齒結(jié)構(gòu)，其他來源的間充質(zhì)干細(xì)胞也能夠產(chǎn)生類似牙齒硬組織的結(jié)構(gòu)。

[論文關(guān)鍵詞]牙齒組織工程

[論文摘要]牙齒組織工程學(xué)是指利用體外和體內(nèi)培養(yǎng)的手段從單細(xì)胞獲得整個牙齒的組織工程手段。其關(guān)鍵之處是獲得具有較強(qiáng)生長和分化能力的種子細(xì)胞、優(yōu)選較為適宜的支架材料，以及構(gòu)建有較強(qiáng)再生能力的細(xì)胞-支架復(fù)合體。

近年來，隨著發(fā)育生物學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、干細(xì)胞以及生物材料學(xué)等領(lǐng)域的新進(jìn)展組織工程學(xué)也取得了長足的發(fā)展。所謂的牙齒組織工程學(xué)是運用生命科學(xué)和工程學(xué)的方法、原理和技術(shù)，在體外構(gòu)建有生物活性的組織，植入體內(nèi)，修復(fù)缺損組織，重建功能的一門新興學(xué)科。眾所周知，牙齒的發(fā)生發(fā)育經(jīng)歷有初始發(fā)生期、蕾狀期、帽狀期、鐘狀期、分化期、分泌期以及牙根的形成等階段，由上皮和間充質(zhì)的相互作用完成。即便使用單細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，牙齒結(jié)構(gòu)的發(fā)生和發(fā)育也要經(jīng)歷這些必然階段。這為牙齒組織工程學(xué)的研究奠定了基礎(chǔ)。然而組織工程學(xué)并不是一項簡單的工程，需要各個方面的工作相互協(xié)調(diào)，相互配合。

一、牙齒組織工程與干細(xì)胞

干細(xì)胞是一類具有自我更新能力的細(xì)胞，能夠產(chǎn)生至少一種類型的、高度分化的子代細(xì)胞。其可在體外分離、擴(kuò)增和冷凍保存，在一定的條件下可被誘導(dǎo)分化為不同的細(xì)胞或組織。根據(jù)發(fā)生學(xué)來源的不同可將干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。

隨著生物技術(shù)及組織工程學(xué)的發(fā)展，可通過干細(xì)胞定向分化技術(shù)，培育出特定的組織或器官。其原理是人為干預(yù)干細(xì)胞的分化方向，使這些細(xì)胞按照我們的需要分化成單一的組織或器官。組織工程牙齒的研究常以干細(xì)胞、信號分子及生物支架為基礎(chǔ)[1-2]，在體外通過組織重組技術(shù)及器官培養(yǎng)等方法研究牙齒的再生。Sharpe等[3]利用小鼠胚胎牙上皮和不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞）及成人骨髓干細(xì)胞重組后再植入小鼠體內(nèi)可獲得牙齒結(jié)構(gòu)，Young等[4]也通過組織工程的方法制備了齒/骨雜交體，即用豬第三磨牙的牙蕾細(xì)胞種植到生物可降解的支架PGA或PLGA上，在成年大鼠的視網(wǎng)膜上生長4周后即得牙移植塊；同樣從豬的骨髓中分離誘導(dǎo)成骨細(xì)胞，并種植到PLGA支架上，在透氧的生物反應(yīng)器系統(tǒng)中培養(yǎng)10天后即得骨移植塊；將以上的牙移植塊和骨移植塊組合在一起重新植入大鼠的視網(wǎng)膜上生長8周后，經(jīng)過組織學(xué)和免疫組化的方法分析發(fā)現(xiàn)齒/骨雜交體不僅能產(chǎn)生牙本質(zhì)、修復(fù)牙本質(zhì)及釉質(zhì)組織，還能表達(dá)骨鈣蛋白、骨涎蛋白以及Ⅲ型膠原。Kramer等[5]將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與牙周韌帶細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨鈣蛋白和骨橋蛋白的表達(dá)量明顯增加，而骨涎蛋白的表達(dá)量明顯降低，體現(xiàn)了共培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠獲得牙周韌帶細(xì)胞的特性，可用于進(jìn)行牙周組織的修復(fù)。這在一定程度上說明了，利用組織工程的方法在體外再生牙齒是可能的[6-7]。且在一定條件下不僅牙髓干細(xì)胞能夠再生牙齒結(jié)構(gòu)，其他來源的間充質(zhì)干細(xì)胞也能夠產(chǎn)生類似牙齒硬組織的結(jié)構(gòu)。

【關(guān)鍵詞】氟西汀;細(xì)胞培養(yǎng);海馬神經(jīng)元;大鼠

氟西汀是5-羥色胺（5-HT）再攝取抑制劑之一，是應(yīng)用較廣的抗抑郁藥。氟西汀除有抗抑郁作用外，尚可治療其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。有研究表明，氟西汀對海馬的神經(jīng)保護(hù)作用是其發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)的機(jī)制之一［1］。關(guān)于氟西汀對體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元生長的影響未見報道，本研究初步探討了氟西汀對原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元生長的影響。

1材料與方法

1.1新生大鼠海馬神經(jīng)元的分離和培養(yǎng)

技術(shù)方法在參考文獻(xiàn)［2］基礎(chǔ)上加以改進(jìn)。取出生24h內(nèi)的新生SD大鼠（東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供），無菌分離出雙側(cè)海馬，用顯微剪剪碎，D-Hank''''s液清洗2或3次，將剪碎的海馬組織轉(zhuǎn)移至離心管中，加入等量0.25%的胰酶（美國Sigma公司），37℃消化30min，中間振搖1或2次，加入10%的DMEM/F12（美國Gibco公司）5ml，輕輕吹打15次，然后1000r·min-1離心5min，制成單細(xì)胞懸液，置于CO2培養(yǎng)箱（德國Heraeus公司產(chǎn)品）中，差速貼壁30min，去除成纖維細(xì)胞，吸取未貼壁的細(xì)胞，并用200目的不銹鋼濾網(wǎng)過濾，收集過濾后的單細(xì)胞懸液于培養(yǎng)皿中，然后至離心管中，取一滴單細(xì)胞懸液進(jìn)行計數(shù)，并用DMEM/F12將細(xì)胞密度調(diào)到1×106ml-1，然后接種于200μg·ml-1多聚賴氨酸（美國Sigma公司）包被的6孔培養(yǎng)板中，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，4h后換為無血清培養(yǎng)基，即含2%B27的Neurobasl培養(yǎng)基（美國Gibco公司），以后每3天半量換液1次。使用培養(yǎng)6d的神經(jīng)元進(jìn)行染色鑒定。

1.2大鼠海馬神經(jīng)元的鑒定