導(dǎo)語：氟西汀海馬神經(jīng)管理論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【關(guān)鍵詞】氟西汀;細(xì)胞培養(yǎng);海馬神經(jīng)元;大鼠

氟西汀是5-羥色胺（5-HT）再攝取抑制劑之一，是應(yīng)用較廣的抗抑郁藥。氟西汀除有抗抑郁作用外，尚可治療其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。有研究表明，氟西汀對(duì)海馬的神經(jīng)保護(hù)作用是其發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)的機(jī)制之一［1］。關(guān)于氟西汀對(duì)體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)的影響未見報(bào)道，本研究初步探討了氟西汀對(duì)原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)的影響。

1材料與方法

1.1新生大鼠海馬神經(jīng)元的分離和培養(yǎng)

技術(shù)方法在參考文獻(xiàn)［2］基礎(chǔ)上加以改進(jìn)。取出生24h內(nèi)的新生SD大鼠（東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），無菌分離出雙側(cè)海馬，用顯微剪剪碎，D-Hank''''s液清洗2或3次，將剪碎的海馬組織轉(zhuǎn)移至離心管中，加入等量0.25%的胰酶（美國(guó)Sigma公司），37℃消化30min，中間振搖1或2次，加入10%的DMEM/F12（美國(guó)Gibco公司）5ml，輕輕吹打15次，然后1000r·min-1離心5min，制成單細(xì)胞懸液，置于CO2培養(yǎng)箱（德國(guó)Heraeus公司產(chǎn)品）中，差速貼壁30min，去除成纖維細(xì)胞，吸取未貼壁的細(xì)胞，并用200目的不銹鋼濾網(wǎng)過濾，收集過濾后的單細(xì)胞懸液于培養(yǎng)皿中，然后至離心管中，取一滴單細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，并用DMEM/F12將細(xì)胞密度調(diào)到1×106ml-1，然后接種于200μg·ml-1多聚賴氨酸（美國(guó)Sigma公司）包被的6孔培養(yǎng)板中，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，4h后換為無血清培養(yǎng)基，即含2%B27的Neurobasl培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），以后每3天半量換液1次。使用培養(yǎng)6d的神經(jīng)元進(jìn)行染色鑒定。

1.2大鼠海馬神經(jīng)元的鑒定

1.2.1烯醇化酶（NSE）免疫細(xì)胞化學(xué)染色

取培養(yǎng)6d6孔培養(yǎng)板中的蓋玻片進(jìn)行神經(jīng)元特異的NSE免疫組織化學(xué)染色。棄去培養(yǎng)液，4%多聚甲醛室溫固定1h，加入0.3%H2O2甲醇去除內(nèi)源性過氧化氫酶，0.1%TritonX-100破膜，10%綿羊血清封閉，加入一抗1∶200兔抗鼠NSE抗體，4℃濕盒過夜，0.01mmol·L-1PBS清洗，加入二抗1∶200生物素化的山羊抗兔IgG，放入37℃溫箱孵育60min;0.01mmol·L-1PBS清洗，滴加SABC過氧化物酶復(fù)合物，37℃溫箱中孵育60min，0.01mmol·L-1PBS清洗，滴加DAB顯色液作用3～10min，自來水沖洗后，常規(guī)脫水，透明封片。光鏡下觀察NSE表達(dá)陽性細(xì)胞。

1.2.2尼氏染色

6孔培養(yǎng)板的細(xì)胞培養(yǎng)7d時(shí)，取出蓋玻片進(jìn)行尼氏染色。棄去培養(yǎng)液，0.01mmol·L-1PBS清洗，4%多聚甲醛室溫固定1h，0.01mmol·L-1PBS清洗3次，氯仿中1min，95%、70%乙醇各1min，蒸餾水清洗，置于1%甲苯胺藍(lán)染液中染色20min，95%乙醇分化，在顯微鏡下觀察控制，時(shí)間以尼氏體顯示清晰為準(zhǔn)，37℃干燥，二甲苯透明，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3實(shí)驗(yàn)分組

在培養(yǎng)的第3天加入氟西?。ǔＶ莸谒闹扑帍S生產(chǎn)），根據(jù)藥物濃度不同，將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為5組，分別加入1、10、20、40μmol·L-1氟西汀;正常對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)基。

1.4海馬細(xì)胞形態(tài)定量分析

倒置相差顯微鏡（德國(guó)Zeiss公司產(chǎn)品）下觀察加藥48h后的海馬神經(jīng)元形態(tài)，每組各孔隨機(jī)選擇20個(gè)視野（每個(gè)視野0.17mm2），記錄每個(gè)視野內(nèi)細(xì)胞長(zhǎng)出突起的神經(jīng)元數(shù)目，目鏡測(cè)微尺隨機(jī)測(cè)量15個(gè)神經(jīng)元突起的長(zhǎng)度和胞體的長(zhǎng)徑。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果以x-±s表示。多組比較及組間兩兩比較采用方差分析。

2結(jié)果

2.1海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察

倒置相差顯微鏡下觀察，培養(yǎng)1d，細(xì)胞絕大部分貼壁，細(xì)胞形態(tài)大小不一，以單突起的小細(xì)胞為主。培養(yǎng)6d，神經(jīng)元胞體較大，突起進(jìn)一步增多、延長(zhǎng)，并形成稀疏的網(wǎng)絡(luò)（圖1）。培養(yǎng)12d，神經(jīng)元胞體進(jìn)一步增大，突起形成比較稠密的網(wǎng)絡(luò)。培養(yǎng)24d，神經(jīng)元胞體出現(xiàn)空泡，部分神經(jīng)元死亡，胞體崩解，突觸斷裂。

2.2海馬神經(jīng)元鑒定

NSE免疫細(xì)胞化學(xué)染色:染色后光鏡下觀察第6天的神經(jīng)細(xì)胞，胞漿和突起被染成棕黃色為NSE抗體表達(dá)陽性細(xì)胞，以3個(gè)視野中陽性神經(jīng)元的數(shù)目占總細(xì)胞的比例為神經(jīng)元純度，經(jīng)鑒定神經(jīng)元的純度為90%。見圖2A。

2.3氟西汀對(duì)海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響

結(jié)果見表1和圖3。不同濃度的氟西汀對(duì)海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響是不同的，10μmol·L-1氟西汀組海馬神經(jīng)元與正常對(duì)照組相比，有突起的神經(jīng)元數(shù)目增加、最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度增長(zhǎng)（P<0.05）;40μmol·L-1氟西汀組海馬神經(jīng)元與正常對(duì)照組相比，有突起神經(jīng)元數(shù)目減少（P<0.05），最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度及胞體長(zhǎng)徑無顯著性差異（P>0.05）;1、20μmol·L-1氟西汀組海馬神經(jīng)元與正常對(duì)照組相比，有突起神經(jīng)元數(shù)目、最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度及胞體長(zhǎng)徑無顯著性差異（P>0.05）。表1氟西汀對(duì)加藥48h海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響（略）

3討論

本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格控制胰酶的量和消化時(shí)間，采用了0.25%胰蛋白酶低濃度溶液、30min長(zhǎng)時(shí)間消化的方法，盡可能減少分離過程中的化學(xué)損傷。為了避免操作過程中的機(jī)械損傷，分離時(shí)動(dòng)作輕柔，規(guī)律換藥，每72h半量換液1次，換液時(shí)速度快，以減少對(duì)神經(jīng)元生長(zhǎng)的影響。本實(shí)驗(yàn)采用了差速貼壁生長(zhǎng)，去除了成纖維細(xì)胞，并采用B27無血清培養(yǎng)基，可以選擇性地促使神經(jīng)元生長(zhǎng)，抑制非神經(jīng)元的生長(zhǎng)和繁殖［3］，從而可以純化海馬神經(jīng)元。NSE是神經(jīng)元分化成熟的特異性標(biāo)志酶之一，它主要表達(dá)于神經(jīng)元的胞體、軸突、樹突部分［4］，通過NSE免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法，可以鑒定體外培養(yǎng)的新生大鼠海馬神經(jīng)元及其純度。本實(shí)驗(yàn)通過NSE免疫化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞胞漿和突起被染成棕黃色，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞百分率為90%。尼氏體是神經(jīng)元的特征性結(jié)構(gòu)之一，存在于神經(jīng)元胞體和樹突內(nèi)，可被堿性染料染成深色的顆粒和斑塊，它是細(xì)胞內(nèi)的一種蛋白質(zhì)合成裝置，可作為觀察神經(jīng)細(xì)胞功能狀態(tài)的靈敏指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)觀察到培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)尼氏體數(shù)量較多，說明培養(yǎng)的海馬神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)良好。NSE免疫細(xì)胞化學(xué)染色和尼氏染色結(jié)果提示，本實(shí)驗(yàn)?zāi)芘囵B(yǎng)出純度較高、生長(zhǎng)良好的海馬神經(jīng)元。氟西汀不僅是廣泛應(yīng)用的抗抑郁藥，而且可以用于治療癲癇、偏頭痛、認(rèn)知障礙、焦慮障礙、兒童孤獨(dú)癥等諸多神經(jīng)精神疾病。目前研究認(rèn)為，氟西汀抗抑郁效應(yīng)與它對(duì)海馬的神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)，這種作用可能是通過促進(jìn)海馬細(xì)胞增殖來抵抗神經(jīng)元的萎縮和丟失來實(shí)現(xiàn)的。李鸝等［1］研究發(fā)現(xiàn)，氟西汀在顯著改善抑郁大鼠抑郁行為的同時(shí)，增加了海馬齒狀回神經(jīng)前體細(xì)胞的數(shù)目，其增殖也增強(qiáng)，推測(cè)促進(jìn)海馬神經(jīng)元再生可能是氟西汀治療抑郁癥的機(jī)制之一。李云峰等［5］通過慢性應(yīng)激建立小鼠抑郁模型，認(rèn)為氟西汀促進(jìn)海馬齒狀回神經(jīng)元再生可能是抗抑郁劑共同作用機(jī)制之一，并且可能與提高海馬BDNF水平密切相關(guān)。一些臨床研究的結(jié)果也提示抗抑郁藥具有神經(jīng)保護(hù)作用。Santarelli等［6］

研究發(fā)現(xiàn)5-HT再攝取抑制劑能部分逆轉(zhuǎn)認(rèn)知功能障礙大鼠海馬齒狀回神經(jīng)元增殖減少及樹突萎縮，并能促進(jìn)海馬神經(jīng)元的再生和存活。Yatte等［7］通過高分辨率的MRI和立體定位方法測(cè)定海馬容量，發(fā)現(xiàn)持續(xù)性接受抗抑郁藥物治療與只在發(fā)作時(shí)接受治療的患者相比，海馬容量無顯著性降低。

本研究首次以體外培養(yǎng)的新生SD大鼠海馬神經(jīng)元為模型，通過細(xì)胞形態(tài)定量分析，探討氟西汀對(duì)海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)的影響。Chiou等［8］通過MTT方法，發(fā)現(xiàn)濃度在55μmol·L-1以下的氟西汀可明顯促進(jìn)海馬神經(jīng)干細(xì)胞存活，在20μmol·L-1時(shí)達(dá)到高峰。根據(jù)Chiou等［8］的研究結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選擇了濃度分別為1、10、20、40μmol·L-1的氟西汀來干預(yù)海馬神經(jīng)元。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度的氟西汀對(duì)海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響是不同的，10μmol·L-1氟西汀組海馬神經(jīng)元與正常對(duì)照組相比，有突起的神經(jīng)元數(shù)目增加、最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度增長(zhǎng)（P<0.05）;40μmol·L-1氟西汀組海馬神經(jīng)元與正常對(duì)照組相比，有突起神經(jīng)元數(shù)目減少（P<0.05），最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度及胞體長(zhǎng)徑無顯著性差異（P>0.05）;1、20μmol·L-1氟西汀組海馬神經(jīng)元與正常對(duì)照組相比，有突起神經(jīng)元數(shù)目、最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度及胞體長(zhǎng)徑無顯著性差異（P>0.05）。結(jié)果表明氟西汀對(duì)海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)的影響有濃度依賴性，濃度過低（1μmol·L-1）對(duì)海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)的作用不明顯，適當(dāng)濃度（10μmol·L-1）可以促進(jìn)海馬神經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育，濃度過高（40μmol·L-1）則抑制海馬神經(jīng)元的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)中氟西汀濃度為40μmol·L-1即出現(xiàn)對(duì)海馬神經(jīng)元的抑制作用，與Chiou等［8］研究結(jié)果不完全一致，表明氟西汀對(duì)海馬神經(jīng)元和神經(jīng)干細(xì)胞的影響存在差異。氟西汀促海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)的機(jī)制尚不明了，有研究［9］表明，長(zhǎng)期給予氟西汀后，大鼠海馬神經(jīng)元的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組，而BDNF具有很強(qiáng)的刺激和促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，維持神經(jīng)細(xì)胞存活和正常功能的作用，Dwivedi等［10］發(fā)現(xiàn)氟西汀不僅能夠增加海馬BDNFmRNA的表達(dá)，還可以逆轉(zhuǎn)皮質(zhì)酮導(dǎo)致的海馬BDNFmRNA表達(dá)的降低。據(jù)此可以推測(cè)，氟西汀促海馬BDNF表達(dá)可能是促海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)的機(jī)制之一。非營(yíng)養(yǎng)因子家族，包括睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，都能促進(jìn)海馬神經(jīng)元的生長(zhǎng)，氟西汀是否也可能通過上調(diào)這些因子的表達(dá)而促進(jìn)海馬神經(jīng)元的生長(zhǎng)有待研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，氟西汀可以促進(jìn)新生大鼠海馬神經(jīng)元的生長(zhǎng)，這為氟西汀治療與海馬損害有關(guān)的神經(jīng)精神疾病提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。氟西汀促海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)的確切機(jī)制尚待進(jìn)一步探討。

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