導(dǎo)語：神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)管理論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【摘要】目的探討2型重組腺相關(guān)病毒（recombinantadeno-associatedvirus2,rAAV-2）載體能否有效地轉(zhuǎn)染NSCs。方法采用含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP）報(bào)告基因的rAAV-2（rAAV-2/EGFP），以感染復(fù)數(shù)（multiplicityofinfection,MOI）分別為1×104、1×105、1×106轉(zhuǎn)染體外分離、培養(yǎng)的大鼠胎鼠NSCs，在熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達(dá)；同時(shí)檢測子代細(xì)胞的活力、增殖倍數(shù)、分化情況來評估對其存活、增殖、分化能力的影響；當(dāng)EGFP表達(dá)穩(wěn)定后，流式細(xì)胞儀檢測rAAV-2/EGFP對NSCs的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果轉(zhuǎn)染10天后各轉(zhuǎn)染組便可觀察到NSCs克隆球發(fā)出綠色熒光，起始熒光強(qiáng)度不一，隨MOI值的增大而增強(qiáng)；各轉(zhuǎn)染組熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的延長而逐漸增強(qiáng)，至轉(zhuǎn)染21天后達(dá)高峰并維持，此時(shí)流式細(xì)胞儀檢測rAAV-2對NSCs的轉(zhuǎn)染效率：MOI為1×104、1×105、1×106時(shí)轉(zhuǎn)染率分別為25.68%、50.60%、54.72%,熒光指數(shù)（FI）分別為4.08、12.72、14.06；轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)7、14、21天時(shí)其細(xì)胞活力、增殖倍數(shù)、分化差異均無顯著性。結(jié)論rAAV-2能有效地轉(zhuǎn)染NSCs，所介導(dǎo)的目的基因能高效表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】神經(jīng)干細(xì)胞；2型腺相關(guān)病毒；轉(zhuǎn)染；感染復(fù)數(shù)；綠色熒光蛋白；熒光指數(shù)；細(xì)胞活力

綠色熒光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）基因是一種新的報(bào)告基因，由于其表達(dá)產(chǎn)物GFP可被直接激發(fā)產(chǎn)生熒光，不需要任何底物或輔助因子，較傳統(tǒng)的標(biāo)記基因如β2-半乳糖苷酶基因、熒光素酶基因等更具有明顯的優(yōu)越性；在GFP的基礎(chǔ)上進(jìn)行F64L和S65T的突變從而形成增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP），EGFP增強(qiáng)了GFP的熒光性能，更容易觀察、檢測［1］。2型腺相關(guān)病毒具有與人類疾病無相關(guān)性、宿主范圍廣、可整合入細(xì)胞染色體DNA介導(dǎo)外源基因長期表達(dá)等優(yōu)點(diǎn),是較理想的基因載體［2］。隨著神經(jīng)干細(xì)胞（neuralstemcells，NSCs）的分離、培養(yǎng)、純化及生物學(xué)功能研究深入［3～5］，尋找NSCs基因修飾載體及標(biāo)記分子，已成為研究NSCs在體內(nèi)、外分化調(diào)控和細(xì)胞工程基因治療中樞系統(tǒng)疾病的研究熱點(diǎn)。運(yùn)用基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞治療中樞系統(tǒng)疾病具有細(xì)胞修復(fù)和轉(zhuǎn)基因治療的雙重優(yōu)勢。理想的基因轉(zhuǎn)移載體是基因修飾的關(guān)鍵。

1材料與方法

1.1病毒載體rAAV-2/EGFP購于863生物領(lǐng)域病毒基因載體研究開發(fā)基地、北京本元正陽基因技術(shù)股份有限公司，滴度為5×1011v.g/ml。

1.2神經(jīng)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)、鑒定［6］按參考文獻(xiàn)進(jìn)行，體外分離胚胎大鼠大腦額葉皮質(zhì)、懸浮培養(yǎng)，經(jīng)Nestine鑒定為神經(jīng)干細(xì)胞（見圖1），作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株。

1.3主要試劑、儀器DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清（HyClone公司產(chǎn)品）；表皮生長因子（EGF）、堿性成纖維生長因子（bFGF）（SIGMA公司產(chǎn)品）；兔抗巢蛋白Nestin抗體、羅丹明標(biāo)記山羊抗兔二抗（北京中杉金橋公司產(chǎn)品）。相差倒置顯微鏡（Cannon）、倒置熒光顯微鏡（Nikon）、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、CO2培養(yǎng)箱、超凈臺(tái)、流式細(xì)胞儀（BD）。

1.4rAAV-2/EGFP體外轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞

1.4.1分組取生長良好的NSCs，機(jī)械反復(fù)輕柔吹打分散、200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾制備成單細(xì)胞懸液，以1×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于4塊6孔培養(yǎng)板中，分別按感染復(fù)數(shù)（MOI）（v.g/cell）=0、1×104、1×105、1×106轉(zhuǎn)染，設(shè)四組，其中MOI=0作為未轉(zhuǎn)染對照組。

1.4.2轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染時(shí)先按MOI值計(jì)算所需加入rAAV-2/EGFP病毒載體的體積數(shù)，在試管中將所需加入rAAV-2/EGFP病毒載體與DMEM/F12培養(yǎng)液混合形成轉(zhuǎn)染液，將每組對應(yīng)孔中加入相應(yīng)的2ml轉(zhuǎn)染液，MOI=0作為未轉(zhuǎn)染對照組，同樣操作但不轉(zhuǎn)染rAAV-2/EGFP，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h后，1000r/min離心5min，如此DMEM/F12清洗細(xì)胞2次，棄病毒殘液，補(bǔ)充完全細(xì)胞培養(yǎng)液（DMEM/F12加2%B27，20ng/ml的EGF、bFGF）5ml，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，常規(guī)換液、傳代。在倒置熒光顯微鏡下觀察、記錄rAAV-2/EGFP轉(zhuǎn)染NSCs后EGFP的表達(dá)情況。

1.5rAAV-2/EGFP體外轉(zhuǎn)染對神經(jīng)干細(xì)胞存活、增殖、分化的影響rAAV-2/EGFP轉(zhuǎn)染NSCs后，各組分別在7、14、21天細(xì)胞傳代時(shí)臺(tái)盼蘭拒染法檢測細(xì)胞活力、細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)算增殖倍數(shù)。0.2%臺(tái)盼蘭溶液與細(xì)胞懸液混勻，死細(xì)胞著色，而活細(xì)胞不著色，計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)及死細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞活力為活細(xì)胞數(shù)/（活細(xì)胞數(shù)＋死細(xì)胞數(shù)）。EGFP表達(dá)穩(wěn)定時(shí)，10％胎牛血清誘導(dǎo)各組NSCs克隆球分化，觀察分化情況。

1.6流式細(xì)胞儀檢測基因轉(zhuǎn)染率和表達(dá)效率［7］rAAV-2/EGFP轉(zhuǎn)染NSCs后，各組在各相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞機(jī)械反復(fù)輕柔吹打分散、200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾制成單細(xì)胞懸液，上流式細(xì)胞儀（BD），以未轉(zhuǎn)染組為對照，激發(fā)光為488nm、吸收光為530nm，進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取與分析；分析結(jié)果用轉(zhuǎn)染率和熒光指數(shù)（fluorescentindex，F(xiàn)I）表示。轉(zhuǎn)染率即EGFP陽性細(xì)胞的陽性率，熒光指數(shù)主要反映了目的基因的表達(dá)效率。

每一樣品收集1×104個(gè)細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞大小設(shè)定一個(gè)單細(xì)胞區(qū)域，該區(qū)域的細(xì)胞用于熒光分析。以未轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞作為陰性對照，設(shè)定GFP陽性細(xì)胞區(qū)（M1區(qū)）使陰性對照M1區(qū)細(xì)胞數(shù)不超過0.1%，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果用轉(zhuǎn)染率和熒光指數(shù)FI表示。轉(zhuǎn)染率即為GFP陽性細(xì)胞陽性率，F(xiàn)I主要反映了目的基因的表達(dá)效率，分別用下列公式計(jì)算：轉(zhuǎn)染率=樣品M1區(qū)細(xì)胞百分率－陰性對照M1區(qū)細(xì)胞百分率；FI=樣品M1區(qū)細(xì)胞百分率樣品×M1區(qū)平均熒光強(qiáng)度－陰性對照M1區(qū)細(xì)胞百分率×陰性對照M1區(qū)平均熒光強(qiáng)度。在上述兩個(gè)公式中，減數(shù)很小，一般情況下可忽略不計(jì)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理各組數(shù)據(jù)均用x±s表示，組間比較用單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2結(jié)果

2.1rAAV-2介導(dǎo)的EGFP基因在NSCs中的表達(dá)rAAV-2/EGFP轉(zhuǎn)染NSCs，10天后EGFP開始表達(dá)，倒置熒光顯微鏡下可見各轉(zhuǎn)染組神經(jīng)球受藍(lán)色光激發(fā)產(chǎn)生的呈團(tuán)塊狀的綠色熒光，但較弱且強(qiáng)度不一，總體上感染復(fù)數(shù)越大熒光越強(qiáng)；隨后表達(dá)顯著增加，21天時(shí)達(dá)高峰，這時(shí)熒光較強(qiáng)（見圖2），表明細(xì)胞球中多數(shù)細(xì)胞被轉(zhuǎn)染并成功表達(dá)EGFP，細(xì)胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)，仍可見大量熒光。

2．2rAAV-2對神經(jīng)干細(xì)胞活力、增殖、分化的影響不同MOI的rAAV-2轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染對照組的NSCs在倒置顯微鏡下觀察，均生長良好，細(xì)胞透光性好，形態(tài)完整，細(xì)胞碎片少，NSCs形成克隆球速度相當(dāng)，細(xì)胞穩(wěn)定性好，可連續(xù)傳代，各組細(xì)胞在7、14、21天臺(tái)盼蘭拒染法檢測細(xì)胞活力差異均無顯著性（P＞0.05）（見表1）。同時(shí)各組細(xì)胞在7，14，21天細(xì)胞計(jì)數(shù)從而計(jì)算增殖倍數(shù)，轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染對照組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)差異亦無顯著性（P＞0.05），并在培養(yǎng)過程中呈指數(shù)生長趨勢（見表2）。表1rAAV-2轉(zhuǎn)染對NSCs活力的影響注：均為同一時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組對照比較，組間比較P＞0.05，差異無顯著性表2rAAV-2轉(zhuǎn)染對NSCs增殖倍數(shù)的影響注:均為同一時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染對照組比較，組間比較P＞0.05，差異無顯著性。

EGFP表達(dá)穩(wěn)定時(shí)，10％胎牛血清誘導(dǎo)各組分化后，各組均可見神經(jīng)干細(xì)胞克隆球在含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中6h左右細(xì)胞克隆球貼壁，12h后即發(fā)現(xiàn)有突起從團(tuán)塊邊緣長出，24h后見有少數(shù)細(xì)胞從克隆球的邊緣向外遷移，分化為有突起的細(xì)胞，有的細(xì)胞遷移速度較快，以后分化的細(xì)胞逐漸增多，從克隆球周圍遷移出，呈放射狀排列，隨著時(shí)間的推移，突起不斷增粗與延長并互相連接成網(wǎng)狀，1周以后，各組NSCs克隆球幾乎完全分化，形成大量胞體呈圓形或橢圓形、具有1～2細(xì)長突起的神經(jīng)元樣細(xì)胞和胞體較大、形態(tài)不規(guī)則、具有多個(gè)粗突起的星形膠質(zhì)樣細(xì)胞。MAP-2、GFAP免疫熒光分別鑒定分化細(xì)胞，熒光顯微鏡下各組均可見MAP-2陽性的神經(jīng)元和GFAP陽性的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。rAAV-2轉(zhuǎn)染的神經(jīng)干細(xì)胞不僅可以分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)保持正常，且轉(zhuǎn)染不影響神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的分化比例。各組MAP-2、GFAP陽性細(xì)胞比例見表3，差異均無顯著性（P值均＞0.05）。表3不同MOI轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染對照組MAP-2、GFAP陽性細(xì)胞的比較注：組間比較P>0.05，差異無顯著性

2.3rAAV-2對神經(jīng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率EGFPEGFP開始表達(dá)后，于14、21、28天流式細(xì)胞儀檢測各MOI的rAAV-2/EGFP轉(zhuǎn)染NSCs的效率（見表4）：可見21天為其表達(dá)高峰，此時(shí)MOI為1×104、1×105、1×106時(shí)轉(zhuǎn)染率分別為25.68%、50.60%、54.72%（見圖3），熒光指數(shù)（FI）分別為4.08、12.72、14.06。表4不同MOI的rAAV-2/EGFP轉(zhuǎn)染NSCs的效率

3討論

近年來，神經(jīng)干細(xì)胞的研究發(fā)展迅速，但仍存在許多問題，如細(xì)胞移植時(shí)常常不能區(qū)別供體細(xì)胞與宿主細(xì)胞，不能較精確地觀察植入細(xì)胞的存活及生長分化情況，也就難以對腦內(nèi)移植的功效作出一個(gè)客觀評價(jià)。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們可根據(jù)不同的科研及治療目的，對神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行不同的遺傳學(xué)修飾，以期制成基因工程細(xì)胞，這些細(xì)胞極具科研和應(yīng)用價(jià)值，受到廣泛關(guān)注。病毒載體和非病毒載體是目前基因修飾中常用的兩大類載體。非病毒載體有脂質(zhì)體、質(zhì)粒、分子偶聯(lián)載體等，基因轉(zhuǎn)移效率低。病毒載體應(yīng)用最廣泛，約占85%，其中腺相關(guān)病毒、逆（反）轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、單純皰疹病毒是基因治療中最常用的4種病毒載體，病毒載體安全性問題至關(guān)重要［8］。各種病毒載體都有自己的優(yōu)點(diǎn)和不足，但是逆（反）轉(zhuǎn)錄病毒是隨機(jī)整合入宿主DNA、可能會(huì)引起“插入誘變”、也有可能產(chǎn)生具有復(fù)制能力的病毒［9］；腺病毒不能整合到宿主染色體DNA上，表達(dá)時(shí)間短暫，所以不能持續(xù)表達(dá)所需產(chǎn)物，且可能刺激免疫反應(yīng)［10］；單純皰疹病毒對人類具有明顯的致病性，能夠從潛伏狀態(tài)激活［11］。而AAV-2是一種單鏈的微小DNA病毒，需要輔助病毒才能有效地復(fù)制，具有與人類疾病無相關(guān)、宿主范圍廣，并能整合入宿主細(xì)胞DNA，去除其復(fù)制蛋白R(shí)ep和包裝蛋白Cap基因,僅具有感染宿主的功能,安全性較高,成為較理想的基因修飾載體,倍受矚目。其具有下列優(yōu)點(diǎn):目前尚未發(fā)現(xiàn)該病毒在人體中致病,所以比較安全；感染宿主細(xì)胞廣泛,包括非分裂細(xì)胞和分裂細(xì)胞,特別是神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)感染性較強(qiáng)；能特異整合于人的第19號染色體長臂末端，減小了插入突變激活原癌基因的可能性，rAAV雖然失去了整合特異性，但反向末端重復(fù)序列中沒有轉(zhuǎn)錄調(diào)控組件，因而減少了插入突變的可能性；外源基因表達(dá)穩(wěn)定，可長達(dá)2年［2，12］。NSCs具有自我復(fù)制、增殖分化的能力，是基因修飾、基因治療的靶細(xì)胞。

AAV-2能否有效地轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞，且轉(zhuǎn)染rAAV-2對神經(jīng)干細(xì)胞存活、增殖、分化能力等有無影響，值得探討。因?yàn)槿绻D(zhuǎn)染rAAV-2對神經(jīng)干細(xì)胞存活、增殖、分化能力等天然性能產(chǎn)生影響，都會(huì)對細(xì)胞、機(jī)體造成嚴(yán)重后果，那么將會(huì)極大地限制其在基因修飾、基因治療方面的應(yīng)用。許多學(xué)者采用AAV轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞，得到的結(jié)果各不相同。Hughes等［13］研究認(rèn)為rAAV-2對神經(jīng)干細(xì)胞球略有效率低下的轉(zhuǎn)染能力，其僅觀察5天轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)情況，而腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后基因表達(dá)的高峰期為1個(gè)月左右，轉(zhuǎn)入基因5天時(shí)可能沒有表達(dá)或者表達(dá)量很少。本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)了大鼠胚胎源性神經(jīng)干細(xì)胞，用rAAV-2/EGFP轉(zhuǎn)染NSCs，對其進(jìn)行基因修飾，我們的結(jié)果提示：轉(zhuǎn)染rAAV-2對神經(jīng)干細(xì)胞存活、增殖、分化能力等未產(chǎn)生影響，rAAV-2對神經(jīng)干細(xì)胞沒有毒性作用，不影響神經(jīng)干細(xì)胞的生物學(xué)特性，是神經(jīng)干細(xì)胞間接體外法基因治療的理想載體；MOI=1×104、1×105、1×106轉(zhuǎn)染10天后，EGFP開始表達(dá)，熒光顯微鏡下可見彌漫于整個(gè)NSCs克隆球中的綠色熒光，起始表達(dá)強(qiáng)度不一，隨MOI值的增大而增強(qiáng)，而且EGFP的表達(dá)強(qiáng)度隨著時(shí)間的延長而逐漸增強(qiáng)，至轉(zhuǎn)染后第21天達(dá)到高峰并維持,此后熒光指數(shù)不再增大；此時(shí)行流式細(xì)胞儀檢測：MOI為1×104、1×105、1×106時(shí)轉(zhuǎn)染率分別為25.68%、50.60%、54.72%,熒光指數(shù)（FI）分別為4.08、12.72、14.06。僅以轉(zhuǎn)染率不能夠全面衡量一個(gè)基因載體的轉(zhuǎn)移效率，無法反映多拷貝基因轉(zhuǎn)移，也不能反映目的基因的表達(dá)效率。熒光指數(shù)能更為全面地反映基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)效率；以GFP基因?yàn)閳?bào)告基因，用流式細(xì)胞儀分析基因轉(zhuǎn)移效率（轉(zhuǎn)染率和熒光指數(shù)）優(yōu)于傳統(tǒng)人工計(jì)數(shù)法，并且還可用流式細(xì)胞儀進(jìn)一步篩選表達(dá)EGFP陽性的細(xì)胞。AAV是通過靶細(xì)胞膜上的表面肝素聚糖蛋白（surfaceheparinproteinofglycans,SHPG）為受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的［14］，而受體的數(shù)目和功能是有限的，當(dāng)AAV與受體結(jié)合達(dá)平衡時(shí)，發(fā)揮最大生物效應(yīng)，再增大MOI也不會(huì)提高轉(zhuǎn)染效率。因此我們可以解釋rAAV-2/EGFP轉(zhuǎn)染NSCs的效率隨MOI值的增大而增強(qiáng)，但MOI為1×105、1×106轉(zhuǎn)染效率相差不大，可能是AAV與受體結(jié)合達(dá)到了平衡，轉(zhuǎn)染達(dá)到了穩(wěn)定，結(jié)合實(shí)驗(yàn)經(jīng)濟(jì)因素，因而MOI=1×105為最佳MOI。另外，還有可能是由于神經(jīng)干細(xì)胞AAV受體表達(dá)強(qiáng)弱、培養(yǎng)方法、轉(zhuǎn)染時(shí)間、檢測方法的不同等因素，引起不同學(xué)者實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果上的差異。

GFP相對分子質(zhì)量小，這也是它作為報(bào)告基因的一大優(yōu)點(diǎn)；GFP與目的基因融合后對目的基因的結(jié)構(gòu)功能沒有影響，大量表達(dá)對細(xì)胞也無毒性作用。在我們的研究基礎(chǔ)上，將rAAV-2/EGFP與一些促進(jìn)NSCs存活和定向分化的營養(yǎng)因子，如GDNF、VEGF等目的基因構(gòu)建成融合基因，以GFP基因?yàn)閳?bào)告基因，rAAV-2為載體，一起轉(zhuǎn)染移植的NSCs，不需用其他檢測方法，只需熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況，便可針對另一基因作相關(guān)研究，將對中樞系統(tǒng)的研究手段有更好的應(yīng)用價(jià)值。

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