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篇1

【關(guān)鍵詞】細(xì)胞生物學(xué) 拓展 實(shí)驗(yàn)操作

【中圖分類號(hào)】G642 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1006－9682（2011）07－0057－01

【Abstract】Cell biology is a basic subject of life science, which is very important in the teaching of postgraduate. This paper enhences the higher level in the teaching cell biology for postgraduste by the definite reform measures of teaching with combining the requirement teaching program, and adopt the development and progress of science and technology.

【Key words】Cell biology Expand The exprement operation

目前，隨著科學(xué)和技術(shù)的快速發(fā)展，細(xì)胞生物學(xué)作為生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域的一門專業(yè)基礎(chǔ)課，在當(dāng)前該方向的研究生教學(xué)中十分重要。那么，如何使研究生的細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)跟上時(shí)代的步伐，如何培養(yǎng)和提高研究生的實(shí)踐創(chuàng)新能力，是從事研究生細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)的教師必須認(rèn)真思考的問題。根據(jù)近年來研究生細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)的教學(xué)體會(huì)，作者認(rèn)為應(yīng)從以下幾個(gè)方面著手進(jìn)行教學(xué)改革，旨在為研究生的細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)提供參考：

一、教學(xué)改革實(shí)踐的措施

1．建立一支高水平的教師隊(duì)伍

細(xì)胞生物學(xué)是一門實(shí)踐性比較強(qiáng)的學(xué)科，要建立細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)與實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的機(jī)制，就必須選擇具有扎實(shí)基本功和教學(xué)經(jīng)驗(yàn)豐富的教師作為該課程的主講教師。［1］必須配備一定的實(shí)驗(yàn)技能教師進(jìn)行研究生教學(xué)實(shí)踐的實(shí)驗(yàn)教學(xué)，培養(yǎng)學(xué)生的動(dòng)手和創(chuàng)新能力，同時(shí)要求課題組形成以教師講解與實(shí)驗(yàn)教學(xué)相結(jié)合的教學(xué)機(jī)制，輔以博士研究生和碩士研究生親自動(dòng)手參與實(shí)驗(yàn)和教學(xué)的新的教學(xué)方式。同時(shí)要注意課題組的教師經(jīng)常進(jìn)行教學(xué)經(jīng)驗(yàn)和教學(xué)技能的教改研究，熟悉學(xué)科的前沿發(fā)展趨向和研究動(dòng)態(tài)。［2］教師能夠把最前沿的知識(shí)傳授給學(xué)生，擴(kuò)展視野，激發(fā)研究生進(jìn)行科學(xué)實(shí)驗(yàn)的興趣十分重要。同時(shí)，也為高水平的教師隊(duì)伍的建設(shè)提出了更新、更高的要求。

2．結(jié)合教學(xué)大綱和教學(xué)實(shí)際，調(diào)整教學(xué)內(nèi)容。

（1）力求按照教學(xué)大綱要求進(jìn)行教學(xué)，培養(yǎng)創(chuàng)新能力。細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)大綱是開展教學(xué)的基本框架和內(nèi)容，為了適應(yīng)未來社會(huì)的需求，教師必須讓學(xué)生掌握細(xì)胞生物學(xué)的基本理論和基本內(nèi)容，為將來的實(shí)際應(yīng)用打下良好的基礎(chǔ)。因此，選取教材十分重要，作者認(rèn)為研究生作為高校培養(yǎng)的高級(jí)人才，在本科階段已經(jīng)學(xué)過細(xì)胞生物學(xué)，但是對(duì)分子細(xì)胞生物學(xué)的了解較少，應(yīng)該選取分子細(xì)胞生物學(xué)教材，同時(shí)在課程安排上考慮實(shí)際情況，針對(duì)薄弱環(huán)節(jié)結(jié)合教學(xué)大綱的要求進(jìn)行知識(shí)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，從一定的層次要求他們學(xué)好這門課程。例如，在教學(xué)細(xì)胞生物學(xué)的基本概念和原理時(shí)，應(yīng)該給出一些事實(shí)（例）和問題，讓學(xué)生積極思考回答這些問題，在理解的基礎(chǔ)上掌握概念和原理，而不是進(jìn)行單純的講解，同時(shí)也允許學(xué)生能夠結(jié)合自己在做科研中發(fā)現(xiàn)的問題，進(jìn)行課堂討論，及時(shí)總結(jié)，激發(fā)學(xué)生興趣，充分發(fā)揮學(xué)生的積極性和創(chuàng)造性。［3］

（2）根據(jù)課題組的實(shí)際情況，進(jìn)行教學(xué)內(nèi)容的調(diào)整。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)展十分迅速，原來的細(xì)胞生物學(xué)教科書所涵蓋的內(nèi)容可能正在發(fā)生著新的進(jìn)展，同時(shí)研究生作為學(xué)科發(fā)展的生力軍，在本學(xué)科的教研中起著非常重要的作用，例如針對(duì)植物課題組的研究生教學(xué)就應(yīng)該把重點(diǎn)放在植物細(xì)胞生物學(xué)的研究上，同時(shí)也要照顧到動(dòng)物學(xué)和微生物學(xué)課題組修該課的研究生，不同的學(xué)生要求掌握的重點(diǎn)不一樣，進(jìn)行教學(xué)講解，要做到有的放失。同時(shí)，在現(xiàn)行的教學(xué)研究中應(yīng)該根據(jù)大綱要求的每個(gè)章節(jié)所涵蓋的內(nèi)容結(jié)合課題組的實(shí)際情況作以適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，補(bǔ)充新的研究進(jìn)展，開展專題講座，做到既要顧及全局，又要點(diǎn)面結(jié)合，［4］做到切合實(shí)際的講解，便于研究生更深入的了解和學(xué)習(xí)各個(gè)章節(jié)的內(nèi)容。

（3）補(bǔ)充新的教學(xué)前沿動(dòng)態(tài)研究。傳統(tǒng)的細(xì)胞生物學(xué)研究只是研究細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能等方面，目前細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展逐漸深入到分子領(lǐng)域，且處于快速發(fā)展的領(lǐng)域，例如細(xì)胞功能方面的研究已深入到分子領(lǐng)域，作者認(rèn)為研究生細(xì)胞生物學(xué)的教學(xué)應(yīng)該結(jié)合此領(lǐng)域新的研究進(jìn)展進(jìn)行講解，使學(xué)生能夠了解最新的發(fā)展動(dòng)態(tài)，使其受到啟發(fā)和教育，為今后的科研工作奠定一定的理念和指明方向。［5］應(yīng)該在緊扣教學(xué)大綱的基礎(chǔ)上結(jié)合分子生物學(xué)的發(fā)展進(jìn)行拓展講解，使學(xué)生能夠了解該章節(jié)所涉及的發(fā)展前沿，跟上科技進(jìn)步的步伐，才能在以后的科研中奠定好的基礎(chǔ)，不致于落伍。

（4）結(jié)合教學(xué)實(shí)驗(yàn)課進(jìn)行教學(xué)實(shí)踐總結(jié)。細(xì)胞生物學(xué)是一門實(shí)踐性非常強(qiáng)的學(xué)科，應(yīng)該在進(jìn)行教學(xué)的同時(shí)給學(xué)生一個(gè)實(shí)踐的機(jī)會(huì)，因此應(yīng)該結(jié)合教學(xué)計(jì)劃給予一些階段性的實(shí)驗(yàn)操作，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)是教學(xué)的重要組成部分，二者相結(jié)合更有助于培養(yǎng)研究生的動(dòng)手能力和創(chuàng)新能力，這樣對(duì)教學(xué)的效果也起到一定的補(bǔ)充和檢驗(yàn)過程。［6］

二、教學(xué)改革效果的檢查和驗(yàn)收

現(xiàn)行的研究生教學(xué)必須進(jìn)行改革，但是對(duì)于教學(xué)改革的效果如何？應(yīng)該分階段針對(duì)所進(jìn)行的教學(xué)改革的具體實(shí)踐措施進(jìn)行有針對(duì)性的檢查和驗(yàn)收，促進(jìn)研究生細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)的大膽改革和嘗試，同時(shí)也為高校培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)方面的高級(jí)人才隊(duì)伍打下基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

1 郭培俊、龔洪勝.研討式教學(xué)法探微［J］.浙江工貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005（1）

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篇2

【關(guān)鍵詞】細(xì)胞生物學(xué)；教學(xué)模式；

【前言】細(xì)胞生物學(xué)是生命科學(xué)中既基礎(chǔ)又前沿的一門學(xué)科，它是我國基礎(chǔ)學(xué)科發(fā)展規(guī)劃中的四大基礎(chǔ)學(xué)科之一[1]。細(xì)胞生物學(xué)是生命科學(xué)各個(gè)分支學(xué)科在細(xì)胞層次上的交匯，它從顯微、亞顯微和分子水平對(duì)細(xì)胞的各種生命活動(dòng)開展研究，進(jìn)而探討人體細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能、發(fā)生、發(fā)展、衰老和死亡的生命活動(dòng)規(guī)律及發(fā)病機(jī)理，是高等醫(yī)學(xué)院校的核心主干課程之一。

進(jìn)入21世紀(jì)以來，細(xì)胞生物學(xué)的研究發(fā)展迅猛，新知識(shí)、新方法、新成果層出不窮，傳統(tǒng)的以教師為主的課堂教學(xué)模式已無法滿足新形勢下培養(yǎng)高素質(zhì)人才的要求[2]。如何在有限的課堂教學(xué)學(xué)時(shí)內(nèi)，切實(shí)提高教學(xué)質(zhì)量與效果，讓學(xué)生在完整系統(tǒng)地掌握細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)的同時(shí)，及時(shí)了解細(xì)胞生物學(xué)的最新研究進(jìn)展及其在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，是目前亟待解決的問題。因此，對(duì)現(xiàn)有的教學(xué)手段和方法進(jìn)行優(yōu)化與改革，探索出符合時(shí)代要求的新的細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)模式勢在必行。

1、高等醫(yī)學(xué)院校細(xì)胞生物學(xué)的教學(xué)現(xiàn)況

目前，大多數(shù)醫(yī)學(xué)院校的細(xì)胞生物學(xué)理論教學(xué)存在兩個(gè)主要問題：一是學(xué)時(shí)少，二是內(nèi)容繁雜、抽象、枯燥且知識(shí)點(diǎn)瑣碎。作為醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)的必修課程，我校的細(xì)胞生物學(xué)安排在大學(xué)一年級(jí)的第二學(xué)期，理論授課采用大班（130人左右）傳統(tǒng)的講授式教學(xué)法（LectureBasedLearning，LBL），即以教師為中心，以系統(tǒng)授課為導(dǎo)向的教學(xué)方法，這一方式雖可以系統(tǒng)講解基礎(chǔ)知識(shí)，但不利于學(xué)生自主學(xué)習(xí)能力的培養(yǎng)[3-4]。而病例教學(xué)法（CaseBasedLearning，CBL）是以典型病例為先導(dǎo)，將臨床與相關(guān)基礎(chǔ)問題相結(jié)合，以學(xué)生為主體的啟發(fā)式教學(xué)方法[5-6]。這種教學(xué)方式雖能克服LBL的不足，提高學(xué)生的學(xué)習(xí)主動(dòng)性和積極性，但是否適合在超過百人的大班授課過程中實(shí)施，仍有待商榷。針對(duì)我?，F(xiàn)存的細(xì)胞生物學(xué)的教學(xué)現(xiàn)狀，我們采用CBL與LBL相結(jié)合的教學(xué)方法，以期探索出適合我校的切實(shí)可行的細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)模式。

2、引入臨床案例，提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣

我校臨床醫(yī)療專業(yè)的細(xì)胞生物學(xué)理論教學(xué)只有28學(xué)時(shí)，學(xué)時(shí)相對(duì)緊張，因此我們?cè)谑谡n方式上采用靈活多變的教學(xué)模式。對(duì)于教材中理論性較強(qiáng)，通俗易懂的知識(shí)，仍采用傳統(tǒng)的LBL方式講授，而對(duì)于一些難點(diǎn)、重點(diǎn)且與臨床結(jié)合緊密的知識(shí)點(diǎn)則采用CBL模式。在CBL教學(xué)過程中，案例的選擇與問題的設(shè)計(jì)是關(guān)鍵。教師在備課過程中，搜集與授課章節(jié)密切相關(guān)的常見病例，查閱文獻(xiàn)資料，對(duì)病例進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷暮脱a(bǔ)充，進(jìn)而編寫成教學(xué)病例，并設(shè)計(jì)相關(guān)問題。例如在講授細(xì)胞膜物質(zhì)運(yùn)輸時(shí)，引入“家族性高膽固醇血癥”，引導(dǎo)學(xué)生學(xué)習(xí)受體介導(dǎo)的胞吞作用；利用“矽肺”病例，講解溶酶體膜穩(wěn)定性的重要；通過囊性纖維化（CysticFibrosis，CF）病例分析，引導(dǎo)學(xué)生學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中正確折疊的重要性。CBL改變了傳統(tǒng)的教師講、學(xué)生聽的教學(xué)模式，學(xué)生成為案例分析和課堂討論環(huán)節(jié)中的主體。學(xué)生通過學(xué)習(xí)、研究案例來掌握基礎(chǔ)理論知識(shí)，變抽象為具體，而不再是死記硬背單一的知識(shí)點(diǎn)，這充分調(diào)動(dòng)了學(xué)生學(xué)習(xí)的主觀能動(dòng)性，提高了學(xué)生的邏輯推理能力，同時(shí)也促進(jìn)了其分析問題、解決問題能力的逐步提升，對(duì)學(xué)生綜合素質(zhì)的培養(yǎng)及日后從事臨床工作頗有益處。

3、多媒體教學(xué)和網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)相結(jié)合

醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)的某些理論知識(shí)相對(duì)抽象、晦澀，因此在以LBL為主進(jìn)行授課時(shí)，PPT課件的制作至關(guān)重要。我們力求在每一章節(jié)的授課過程中將圖片、動(dòng)畫與視頻相結(jié)合，圖文并茂，充分調(diào)動(dòng)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，從不同的角度吸引學(xué)生的注意力。在充分利用多媒體這一教學(xué)手段的同時(shí)，我們還利用學(xué)校覆蓋全面的無線網(wǎng)絡(luò)，將教學(xué)過程延展到校園的每一個(gè)角落。目前，我校的細(xì)胞生物學(xué)已成功獲批遼寧省精品資源共享課，課程建設(shè)已順利完成。因此，教師可以將教學(xué)網(wǎng)站提供給學(xué)生，方便學(xué)生及時(shí)查閱PPT課件、課后自測習(xí)題、拓展學(xué)習(xí)等教學(xué)相關(guān)資料。同時(shí)，我們的SPOC網(wǎng)絡(luò)教學(xué)平臺(tái)也于2018年3月建設(shè)完成并投入使用，該平臺(tái)的應(yīng)用進(jìn)一步夯實(shí)了網(wǎng)絡(luò)教學(xué)基礎(chǔ)，也在一定程度上解決了課堂教學(xué)學(xué)時(shí)緊張的問題。另外，我們還建立了細(xì)胞生物學(xué)教研室的教學(xué)公眾號(hào)，定期推送細(xì)胞生物學(xué)研究的最新進(jìn)展，課后教師和學(xué)生還可以利用微信群和QQ群進(jìn)行交流與學(xué)習(xí)的互動(dòng)。

4、優(yōu)化理論教學(xué)內(nèi)容，拓展研究型課堂

作為醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)課程，細(xì)胞生物學(xué)與生物化學(xué)、生理學(xué)等其他課程的內(nèi)容有部分的重疊和交叉，為了避免不必要的重復(fù)，保證細(xì)胞生物學(xué)與其他課程知識(shí)的緊密銜接，教研室與相關(guān)課程的授課教師進(jìn)行溝通，刪減醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)與其他學(xué)科的部分重復(fù)內(nèi)容，合理安排教學(xué)章節(jié)。同時(shí)，在教學(xué)過程中有選擇地補(bǔ)充了與本課程密切相關(guān)的科研進(jìn)展，引導(dǎo)學(xué)生利用課外時(shí)間查閱相關(guān)文獻(xiàn)，了解本學(xué)科最新的相關(guān)研究進(jìn)展，逐步深化、拓展研究型教學(xué)，提高他們自主學(xué)習(xí)的積極性和主動(dòng)性。

5、反饋與評(píng)價(jià)

在2017年、2018年學(xué)期末課程結(jié)束后，我們連續(xù)兩年分別在2016級(jí)和2017級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)的260名學(xué)生中發(fā)放調(diào)查問卷，對(duì)教學(xué)過程和教學(xué)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。問卷發(fā)放260份，收回有效問卷254份，有效回收率為97.7%。通過對(duì)問卷進(jìn)行整理分析，得出以下調(diào)查結(jié)果：95.8%的學(xué)生認(rèn)為開設(shè)細(xì)胞生物學(xué)課程非常必要或有必要；95.5%的學(xué)生認(rèn)為非常必要或有必要建立網(wǎng)絡(luò)教學(xué)平臺(tái)；98%的學(xué)生認(rèn)為在教學(xué)中介紹臨床相關(guān)知識(shí)非常必要或有必要；97.4%的學(xué)生認(rèn)為非常必要或有必要在教學(xué)中介紹相關(guān)的研究進(jìn)展和熱點(diǎn)問題；87.7%的學(xué)生喜歡并接受CBL與LBL相結(jié)合的教學(xué)模式，其中有92%的學(xué)生認(rèn)為這種教學(xué)模式可以充分激發(fā)自己的學(xué)習(xí)興趣，但有21.4%的學(xué)生認(rèn)為這種教學(xué)模式在對(duì)基礎(chǔ)知識(shí)的系統(tǒng)掌握和理解方面無顯著促進(jìn)作用；87%的學(xué)生認(rèn)為CBL與LBL相結(jié)合的教學(xué)模式可以明顯提高或提高自學(xué)能力在調(diào)查中，學(xué)生還結(jié)合自己的體驗(yàn)對(duì)細(xì)胞生物學(xué)的教學(xué)提出了一些建議和意見，也在一定程度上反映了我們?cè)诮虒W(xué)方面存在的不足和問題。

綜合分析調(diào)查結(jié)果和學(xué)生提出的合理化建議、意見，我們將采取下列改進(jìn)措施：由于授課對(duì)象是大一學(xué)生，學(xué)生相關(guān)的專業(yè)知識(shí)儲(chǔ)備不足，因此在選擇課堂教學(xué)案例時(shí)，應(yīng)盡量選擇典型而淺顯的病例，并請(qǐng)教臨床的醫(yī)生，進(jìn)行更為準(zhǔn)確的描述，重新撰寫案例分析，結(jié)合實(shí)際教學(xué)情況完善教學(xué)案例素材；課堂教學(xué)及時(shí)補(bǔ)充與案例相關(guān)的知識(shí)點(diǎn)，逐步提升學(xué)生自主學(xué)習(xí)的主動(dòng)性和積極性；進(jìn)一步完善網(wǎng)絡(luò)教學(xué)平臺(tái)建設(shè)，并配備專業(yè)人員進(jìn)行平臺(tái)監(jiān)管，真正實(shí)現(xiàn)師生時(shí)時(shí)互動(dòng)，充分發(fā)揮網(wǎng)絡(luò)資源的空間延展性。

總之，教無定法，因材施教。教學(xué)工作就是一個(gè)不斷優(yōu)化的過程。在與學(xué)生的交流和互動(dòng)過程中，我們將不斷總結(jié)反思，探索前行，選擇真正適合學(xué)生的教學(xué)模式，不斷完善教學(xué)過程，切實(shí)提高教學(xué)質(zhì)量，培養(yǎng)學(xué)生成為符合時(shí)展需要的新型醫(yī)學(xué)人才。

【生物博士論文參考文獻(xiàn)】

[1]付燕燕，陳彥，吳健，等.醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的幾點(diǎn)思考[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教育，2015，17（2）：135-136.

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篇3

[關(guān)鍵詞]腭裂；瘢痕；成纖維細(xì)胞；rhIFNα-2b；rhIFN-γ

[中圖分類號(hào)]R619+.6R782.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2011）06-0926-03

Empirical study of interferon affecting on the fibroblasts of the exposed bone surface from cleft palate scar

TAO Ming1,2,HU Chao3,DING Ding1,ZHAO Li-li1,ZHAN Jia1,SUN Hui1,SUN Hui1,WANG Yuan-yin1,ZHOU Jian1

(1.Stomatological Hospital,Anhui Medical University,Hefei 230032,Anhui,China;2.Department of Stomatology,Yijishan Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 24100,Anhui,China;3.Department of Stomatology,The Third Military Medical University,Chongqing 400037)

Abstract:ObjectiveTo study the effects of interferon to the biological activities of fibroblasts origined from the exposed bone surface from cleft palate scar in vitro cultural. MethodsMaking rabbit cleft palate scar models, in vitro culture,observed by MTT assay and flow cytometry, analysis the effects of interferon to the biological activities of fibroblasts origined from the exposed bone surface of cleft palate scar. Data using analysis of variance and q test treatment. ResultsCompared with the control group,after added interferon, cleft palate fibroblast's growth trends and value-added activity of experimental group was inhibited significantly. Percentage of cells decreased during the S-G2-M stage.ConclusionsInterferon on the growth trends and value-added activity of the cleft palate fibroblast has significant inhibitory effect, indicating that cleft palate in the prevention of scar formation of the exposed bone surface has some value.

Key words:cleft palate；scar；fibroblast；rhIFNα-2b;rhIFN-r

先天性腭裂發(fā)病率約占人口出生率的1/700左右，嚴(yán)重影響患者的口腔頜面部器官的形態(tài)與功能及心理健康。雖然目前的外科技術(shù)已能實(shí)現(xiàn)對(duì)腭部裂隙的良好修復(fù)，有助于語音及吞咽功能的恢復(fù)，但大量的臨床與基礎(chǔ)研究證實(shí)，術(shù)后患者上頜骨的生長發(fā)育繼發(fā)畸形會(huì)變得更為嚴(yán)重，對(duì)患者的頜面形態(tài)與功能構(gòu)成嚴(yán)重危害。腭裂術(shù)后上頜骨繼發(fā)生長畸形的病理解剖學(xué)基礎(chǔ)已經(jīng)探明是腭裂術(shù)后遺留在上頜骨硬腭的骨面瘢痕攣縮所致[1-2]。因此，如何防治腭裂術(shù)后骨面瘢痕形成是目前口腔頜面外科領(lǐng)域亟待解決的難題之一。在瘢痕的形成與增生過程中，成纖維細(xì)胞是主要的效應(yīng)細(xì)胞，其功能狀態(tài)是影響瘢痕發(fā)生、發(fā)展、以及轉(zhuǎn)歸的主要因素。干擾素（IFN）具有抗病毒、抗腫瘤、影響細(xì)胞增殖分化等多種生物學(xué)效應(yīng)。臨床上已經(jīng)有將干擾素用于防治瘢痕形成的報(bào)道,但用干擾素觀察腭裂術(shù)后骨面瘢痕成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的影響尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過體外觀察和研究干擾素對(duì)腭裂術(shù)后骨面瘢痕成纖維細(xì)胞的生物學(xué)作用，可為尋求應(yīng)用干擾素治療腭裂術(shù)后骨面瘢痕提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑：DMEM培養(yǎng)基（低糖 美國Sigma公司），新生小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），胰蛋白酶（美國Sigma公司），PBS(pH7.2～7.4)液，Hank's(pH7.2～7.4)液（自配），rhIFNα-2b和rhIFN-γ（安徽安科生物工程股份有限公司），MTT溶液（5mg/ml）(美國Amresco公司)，二甲亞砜（DMSO，分析純）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1兔腭裂術(shù)后骨面瘢痕動(dòng)物模型的制備：成年大耳白兔6只（合肥工業(yè)大學(xué)控釋藥物研究中心動(dòng)物室提供），體重2千克，3%戊巴比妥鈉溶液按30mg/kg進(jìn)行耳緣靜脈注射麻醉，仰臥位固定四肢，張口，沿腭中縫做縱行切口，逐層切開腭部軟組織，骨膜分離器左右分離軟組織，顯露出上腭骨面，徹底止血后沿切口縫合。麻醉效應(yīng)過后，兔肢體可自由活動(dòng)，術(shù)后連續(xù)5天每日肌注80萬單位青霉素，術(shù)后4周在全麻下沿原切口切開，取腭部骨面上的瘢痕組織以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2腭裂術(shù)后骨面瘢痕成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及傳代：采用組織塊法進(jìn)行成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)(見照片2)，用含15%新生小牛血清DMEM培養(yǎng)液于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，2～4天更換培養(yǎng)液，待原代培養(yǎng)長出的成纖維細(xì)胞接近或達(dá)到融合時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代。

1.2.3細(xì)胞生長增殖情況（MTT測定法）：取第3～5代生長狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，消化后用15%新生小牛血清DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)位1×106/ml，接種于96孔培養(yǎng)板中，共2板，每孔加入200μl，并留下不含細(xì)胞和培養(yǎng)液的調(diào)零孔，將96孔板移入37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24h。取出96孔板，棄上清液，每孔加入200μl無血清DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h。取出96孔板，換新培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)1組分別加入濃度為2 000、4 000、6 000、8 000、10 000U/ml的rhIFNα-2bDMEM培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)2組分別加入濃度為2 000、4 000、6 000、8 000、10 000U/ml的rhIFN-γDMEM培養(yǎng)液每孔液體總量為200μl；對(duì)照組加相同容積的DMEM培養(yǎng)液；每一濃度藥物設(shè)6個(gè)平行孔。將96孔板置入37℃、5%CO2孵箱中分別培養(yǎng)24、48h。

MTT測定法：取出96孔板，每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后取出，小心吸去孔內(nèi)上清液，每孔加入150μlDMSO,振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解；選擇570nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收（OD）值。

1.2.4細(xì)胞周期分析(流式細(xì)胞術(shù))：取第6～8代生長狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/ml，接種于25cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)24h。棄原培養(yǎng)液，加入無血清DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，進(jìn)行細(xì)胞同步化處理。實(shí)驗(yàn)1組分別加入終濃度為2 000、4 000、6 000、8 000、10 000U/ml的rhIFNα-2bDMEM培養(yǎng)液；實(shí)驗(yàn)2組分別加入終濃度為2 000、4 000、6 000、8 000、10 000U/ml的rhIFN-γDMEM培養(yǎng)液；對(duì)照組加入相同容積的DMEM培養(yǎng)液，每組3瓶。將培養(yǎng)液置入37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)48h；0.25%胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，1 000r/min離心5min，棄上清，收集細(xì)胞，70%冰乙醇固定18h，4℃保存；PI綜合染液室溫下避光染色30min，300目尼龍網(wǎng)膜過濾，流式細(xì)胞儀測細(xì)胞周期。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)結(jié)果用x±s表示，采用方差分析及q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 干擾素抑制腭裂術(shù)后瘢痕成纖維細(xì)胞生長增殖：MTT比色實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果顯示，加入rhIFNα-2b和rhIFN-γ培養(yǎng)24h后實(shí)驗(yàn)組于對(duì)照組OD值之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），培養(yǎng)48h后，與對(duì)照組比較，2 000U/ml濃度組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），4 000、6 000、8 000、10 000U/ml濃度組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），提示rhIFNα-2b和rhIFN-γ對(duì)腭裂術(shù)后骨面成纖維細(xì)胞的增殖有抑制作用（見表1、表2）。

2.2干擾素對(duì)腭裂術(shù)后瘢痕成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響：流式細(xì)胞術(shù)測定結(jié)果顯示：對(duì)照組成纖維細(xì)胞培養(yǎng)48h處于S-G2-M期的百分比為（44.54±3.21）%，加入rhIFNα-2b和rhIFN-γ作用48h，與對(duì)照組比較，2 000U/ml濃度組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而4 000、6 000、8 000、10 000U/ml濃度組處于S-G2-M期的百分比均明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）（見表3）。

3討論

國內(nèi)外研究已表明，腭裂術(shù)后硬腭部骨面的形成及瘢痕修復(fù)將抑制患者上頜骨的生長，引起患者顏面部凹陷，反牙合等畸形和功能障礙。有研究表明骨面的瘢痕組織，由于缺少大血管和彈力纖維，膠原纖維呈橫向走行并通過纖維附著于硬腭骨上，而且粘骨膜與牙周韌帶相延續(xù)，因此在收縮時(shí)，對(duì)牙弓產(chǎn)生向內(nèi)的牽張力，從而導(dǎo)致了面中份骨的發(fā)育不足[3]。創(chuàng)傷愈合是人體組織修復(fù)的一種過程，而瘢痕形成則是過度愈合或愈合紊亂。瘢痕中的成纖維細(xì)胞是創(chuàng)面愈合、瘢痕形成、增生和攣縮的功能性細(xì)胞，其增殖、活化、分化的異常直接導(dǎo)致病理性瘢痕的形成。干擾素是一類具有抗病毒、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性的細(xì)胞因子。它是目前比較明確的瘢痕增生負(fù)性調(diào)節(jié)因子[4-5]。近年來,許多體外研究表明干擾素具有抑制成膠原的合成，促進(jìn)膠原降解以及激活膠原酶的活性,起到對(duì)病理性瘢痕中成纖維細(xì)胞的抑制作用[5-6]。臨床上也有局部注射干擾素來治療病理性瘢痕的報(bào)道[7-8]。然而，干擾素是否對(duì)腭裂術(shù)后骨面瘢痕來源的成纖維細(xì)胞有抑制作用，之前未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將干擾素作用于體外培養(yǎng)的兔腭裂術(shù)后骨面瘢痕成纖維細(xì)胞中，結(jié)果表明對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生明顯的抑制作用。

我們?yōu)榱四軌驅(qū)⒏蓴_素應(yīng)用到預(yù)防腭裂術(shù)后的繼發(fā)畸形中，于是在此首先觀察了rhIFNα-2b和rhIFN-γ對(duì)體外培養(yǎng)的腭裂術(shù)后骨面瘢痕來源的成纖維細(xì)胞的作用，以便為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)顯示，IFN在較高濃度時(shí)對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞的生長增殖具有明顯的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)中采用MTT法檢測IFN對(duì)成纖維細(xì)胞生長增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入IFN48h后，4 000～10 000U/ml濃度組OD值明顯低于對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01），說明實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞比對(duì)照組細(xì)胞生長要慢，活細(xì)胞數(shù)相對(duì)較少，提示IFN對(duì)細(xì)胞增殖活性產(chǎn)生了抑制作用。但實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞48h的OD值與24h相比仍然有所增加，說明rhIFNα-2b不能絕對(duì)抑制細(xì)胞增殖，而是抑制了細(xì)胞的增長趨勢。由于MTT比色法測定反映的是細(xì)胞總數(shù)，于是我們又應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定了細(xì)胞總數(shù)中各細(xì)胞周期的百分比，反映細(xì)胞中處于分裂期的總體比例，能準(zhǔn)確地揭示群體細(xì)胞中具有分裂能力的細(xì)胞量。結(jié)果顯示加入IFN后在短時(shí)間內(nèi)（24 h）與對(duì)照組無明顯差別，而延長觀察時(shí)間（48h） 則整體瘢痕成纖維細(xì)胞中處于S-G2-M期的比例降低（2 000 U/ml濃度組除外）。說明加入的IFN的抑制活性與細(xì)胞數(shù)量改變之間有一定的時(shí)間濃度依賴關(guān)系。我們預(yù)測：高濃度的IFN在促使瘢痕組織軟化、預(yù)防和治療瘢痕攣縮方面可以發(fā)揮作用。

本研究分析測定了IFN對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。體外實(shí)驗(yàn)肯定了IFN對(duì)腭裂術(shù)后骨面瘢痕的成纖維細(xì)胞的生長趨勢及增殖具有顯著的抑制作用。雖然其具體的作用機(jī)制目前尚未完全清楚，但為進(jìn)一步進(jìn)行活體實(shí)驗(yàn)提供了依據(jù)，也為臨床上預(yù)防和治療腭裂術(shù)后骨面瘢痕形成及術(shù)后上頜骨繼發(fā)畸形提供了重要的參考信息。

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篇4

1細(xì)胞壁的層次與化學(xué)組成

細(xì)胞壁是原生質(zhì)生命活動(dòng)中所形成的多種壁物質(zhì)加在質(zhì)膜外方所構(gòu)成的。由于這些壁物質(zhì)種類、數(shù)量和比例組成上的差異，使細(xì)胞壁具有成層現(xiàn)象〔3〕。細(xì)胞壁由內(nèi)到外一般分為胞間層、初生壁和次生壁三個(gè)層次，也有一些細(xì)胞僅具胞間層和初生壁。

1.1胞間層

胞間層亦稱中層，是細(xì)胞分裂產(chǎn)生新細(xì)胞時(shí)形成的，主要成分是果膠質(zhì)。胞間層的存在使相鄰的細(xì)胞粘連在一起，并可緩沖細(xì)胞間的擠壓。

1.2初生壁

初生壁是在細(xì)胞生長過程中形成的細(xì)胞壁層次，主要成分是纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)。初生壁具有較大的可塑性，既可使細(xì)胞保持一定形狀，又能隨細(xì)胞生長而延展。

1.3次生壁

次生壁是細(xì)胞體積停止增大后加在初生璧內(nèi)表面繼續(xù)積累形成的細(xì)胞壁層，其主要成分為纖維素和半纖維素。

2細(xì)胞壁的特化及常見類型

2.1細(xì)胞壁的特化

在細(xì)胞壁停止生長后，由原生質(zhì)體產(chǎn)生一些特殊的次生代謝物質(zhì)，并填充到細(xì)胞壁纖維素分子束交錯(cuò)的網(wǎng)狀空間里，從而引起細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)產(chǎn)生明顯的變化，即細(xì)胞壁的特化。細(xì)胞壁的特化是植物在長期進(jìn)化過程中，植恤細(xì)胞在對(duì)環(huán)境和生理功能的適應(yīng)的結(jié)果。

2.2細(xì)胞壁特化的類型根據(jù)細(xì)胞壁中滲人的化學(xué)成分不同，細(xì)胞壁的特化類型主要有木質(zhì)化細(xì)胞壁、角質(zhì)化細(xì)胞壁、栓質(zhì)化細(xì)胞壁、礦質(zhì)化細(xì)胞壁和私液化細(xì)胞壁等[4]。

2.2.1木質(zhì)化

細(xì)胞壁木質(zhì)化細(xì)胞壁指細(xì)胞壁內(nèi)填充和附加了木質(zhì)素。木質(zhì)素是一種分子量相當(dāng)高的有機(jī)化合物，是苯基丙烷衍生物的聚合產(chǎn)物。它比纖維素彈性小，但硬度大。經(jīng)過木質(zhì)化后，細(xì)胞壁的硬度提高，增加了細(xì)胞壁的機(jī)械支撐能力。

2.2.2角質(zhì)化

細(xì)胞壁角質(zhì)化細(xì)胞壁指細(xì)胞壁為角質(zhì)所浸透，并常在細(xì)胞壁的表面形成一層無色透明的角質(zhì)層。角質(zhì)的主要單體成分是單、雙及三經(jīng)基脂肪酸，這些經(jīng)基脂肪酸主要通過醋鍵相互連接。細(xì)胞壁的角質(zhì)化使細(xì)胞表面形成堅(jiān)固的疏水層。

2.2.3栓質(zhì)化

細(xì)胞壁栓質(zhì)化細(xì)胞壁指細(xì)胞壁內(nèi)填充和附加了栓質(zhì)。栓質(zhì)是脂肪酸組成的高度聚合的化合物。細(xì)胞壁經(jīng)過栓質(zhì)化后，失去了對(duì)水和空氣的通透性。

2.2.4礦化細(xì)胞壁

礦化細(xì)胞壁指細(xì)胞壁滲人鈣鹽或硅質(zhì)。鈣化合物主要有果膠酸鈣、碳酸鈣、草酸鈣等。硅質(zhì)主要是二氧化硅、氧化硅等。細(xì)胞壁經(jīng)過礦化后，變得粗糙堅(jiān)硬，增加了支持力。

2.2.5私液化細(xì)胞壁

私液化細(xì)胞壁指細(xì)胞壁中果膠質(zhì)和纖維素豁液化或樹膠狀。此類細(xì)胞細(xì)胞壁僅具果膠層和初生壁。貓液化細(xì)胞壁使細(xì)胞表面由于水分條件不同而呈現(xiàn)固體狀態(tài)或粘液狀態(tài)，有利于種子的吸水萌發(fā)。例如，車錢、亞麻的種子表皮細(xì)胞。此外，細(xì)胞壁的特化還包括蠟質(zhì)化細(xì)胞壁和揉質(zhì)化細(xì)胞壁等類型。細(xì)胞壁中滲人蠟質(zhì)，稱為蠟質(zhì)化，此類細(xì)胞常在細(xì)胞壁外具蠟被，?？梢詼p少細(xì)胞水分損失和機(jī)械損傷或抵御病原體的侵人，例如甘蔗莖的表皮細(xì)胞。還有一些植物細(xì)胞壁滲人揉質(zhì)，稱為靴質(zhì)化，常見于多年生木本植物的根、莖中，如鍛樹、松柏類，是細(xì)胞腔內(nèi)的揉質(zhì)后含物向次生壁滲人的結(jié)果。

3植物組織細(xì)胞盛的特化與功能的適應(yīng)

3.1保護(hù)組織

保護(hù)組織具有減少水分蒸發(fā)和機(jī)械損傷或抵御病原體的侵人等功能。保護(hù)組織的細(xì)胞排列緊密，沒有胞間隙，細(xì)胞壁高度特化。

3.1.1表皮

表皮是植物體的初生保護(hù)組織，由表皮細(xì)胞組成。不同種類的植物體莖、葉的表皮細(xì)胞細(xì)胞壁的外切向壁常角質(zhì)化或蠟質(zhì)化或硅質(zhì)化。表皮細(xì)胞是幼嫩植物最外面的保護(hù)層，直接與外界環(huán)境相接觸。角質(zhì)化的細(xì)胞壁及角質(zhì)層是陸生植物表皮細(xì)胞壁特化的常見類型，這些結(jié)構(gòu)的存在使植物體整個(gè)表面形成堅(jiān)固的疏水層，有效減少了水分散失，體現(xiàn)了對(duì)陸生環(huán)境的適應(yīng)。而水生植物、濕生植物的表皮細(xì)胞一般沒有角質(zhì)層或角質(zhì)化不明顯。另外，在一些單子葉植物葉的表皮細(xì)胞中，如小麥、玉米的葉一部分表皮細(xì)胞的細(xì)胞壁發(fā)生礦質(zhì)化，常為具有棘突的硅質(zhì)化細(xì)胞。細(xì)胞壁經(jīng)礦質(zhì)化后變得更加堅(jiān)硬，葉片用手觸摸有些粗糙，有時(shí)甚至?xí)澠破つw。表皮細(xì)胞礦質(zhì)化是此類植物抵御動(dòng)物取食或損傷的有效手段。

3.1.2周皮

周皮是植物體的次生保護(hù)組織。隨著植物體的次生生長，植物根、莖不斷加粗，出現(xiàn)周皮，它取代表皮在植物體表面起保護(hù)作用。周皮由木栓層、木栓形成層、栓內(nèi)層組成。木栓層在周皮的最外層，一般由幾層扁平細(xì)胞疊落狀排列。木栓層細(xì)胞是典型的栓質(zhì)化細(xì)胞，成熟的木栓層細(xì)胞是死細(xì)胞，原生質(zhì)解體，僅存木栓質(zhì)的壁。栓質(zhì)化的細(xì)胞壁不能透過水分和空氣，而且隔熱、絕緣。細(xì)胞壁的這些特點(diǎn)使木栓層成為覆蓋在植物體表的一層堅(jiān)固屏障，是植物體完善的次生保護(hù)組織。

3.2機(jī)械組織

機(jī)械組織是對(duì)植物起主要支持作用的組織，它有很強(qiáng)的抗壓、抗張、抗曲繞的能力。植物能有一定的硬度，枝干能挺立，樹葉能平展，能經(jīng)受狂風(fēng)暴雨以及其他外力的侵襲都與機(jī)械組織的存在有關(guān)。機(jī)械組織的細(xì)胞常成束或成層分布，細(xì)胞壁強(qiáng)烈木質(zhì)化。機(jī)械組織在植物體內(nèi)可以分為厚角組織和厚壁組織。厚壁組織是植物體內(nèi)主要的機(jī)械組織，主要由纖維和石細(xì)胞組成。

3.2.1纖維

纖維是在植物體內(nèi)分布最為廣泛的厚壁組織。纖維細(xì)胞長梭型，成束存在。成熟的纖維細(xì)胞為死細(xì)胞，原生質(zhì)解體，細(xì)胞腔狹小，次生壁強(qiáng)烈加厚且高度木質(zhì)化。由于經(jīng)過木質(zhì)化后，細(xì)胞壁的硬度提高，增加了細(xì)胞群的機(jī)械力和支撐能力，使纖維構(gòu)成植物體內(nèi)最主要的支持骨架。一些植物的韌皮部富含纖維，例如竺麻、棉花、大麻等，是人類紡織和造紙的重要原料。

3.2.2石細(xì)胞

石細(xì)胞主要分布在植物的果皮與種皮中。石細(xì)胞常呈不規(guī)則穎粒狀并成層存在，成熟的石細(xì)胞為死細(xì)胞，細(xì)胞腔很小，中空，次生壁強(qiáng)烈加厚且高度木質(zhì)化。成層存在的石細(xì)胞提高了果皮和種皮的硬度，對(duì)果實(shí)和種子起到保護(hù)作用，例如板栗堅(jiān)硬的果皮、椰子堅(jiān)硬的內(nèi)果皮和豆類的堅(jiān)固種皮等。

3.3輸導(dǎo)組織

輸導(dǎo)組織是植物體中擔(dān)負(fù)物質(zhì)長途運(yùn)輸?shù)闹饕M織。輸導(dǎo)組織細(xì)胞長管狀，管腔大，細(xì)胞壁次生木質(zhì)加厚，端壁特化，這些特點(diǎn)都與其功能完美適應(yīng)。輸導(dǎo)組織的主要細(xì)胞有導(dǎo)管分子、篩管分子及伴胞。

3.3.1導(dǎo)管

導(dǎo)管分子為長管狀大型細(xì)胞，多個(gè)導(dǎo)管分子彼此縱向相連構(gòu)成導(dǎo)管，是植物運(yùn)輸水分和無機(jī)鹽的主要結(jié)構(gòu)。成熟的導(dǎo)管分子為死細(xì)胞，細(xì)胞腔中空，具加厚的木質(zhì)化次生壁。導(dǎo)管分子兩端壁特化為穿孔，提高了運(yùn)輸效率。

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《組成細(xì)胞的分子》是人教版高中六冊(cè)課本中必修第一冊(cè)《普通高中課程標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)教科書生物1（必修）分子與細(xì)胞》第二章的課程內(nèi)容，這一章節(jié)在高中生物課程的學(xué)習(xí)中有著及其重要的作用，該章是學(xué)習(xí)第一冊(cè)教材其它章節(jié)、其它必修模塊以及選修模塊的知識(shí)基礎(chǔ)，是培養(yǎng)學(xué)生探究、繪圖、實(shí)驗(yàn)等技能的基礎(chǔ)。所以研究如何上好這一章的內(nèi)容對(duì)整個(gè)高中生物課程教學(xué)都有著極其重要的作用。

一、教學(xué)課時(shí)安排策略

《組成細(xì)胞的分子》這一章的內(nèi)容主要分為細(xì)胞中的元素和化合物、生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者─蛋白質(zhì)、遺傳信息的攜帶者─核酸、細(xì)胞中的糖類和脂質(zhì)、細(xì)胞中的無機(jī)物這五個(gè)小節(jié)。建議教師每一節(jié)課對(duì)應(yīng)一課時(shí)來進(jìn)行講解，再加上其中兩節(jié)有實(shí)驗(yàn)課，每節(jié)實(shí)驗(yàn)課一課時(shí)，則這章的內(nèi)容至少要七課時(shí)來完成教學(xué)計(jì)劃。為了循序?qū)W生由易到難的認(rèn)知規(guī)律，建議把第一節(jié)《細(xì)胞中的元素和化合物》和最后一節(jié)《細(xì)胞中的無機(jī)物》放在一起學(xué)習(xí)[1]。這樣的課時(shí)劃分，有利于讓學(xué)生有針對(duì)性的掌握本章每一節(jié)的具體內(nèi)容，并且能夠突出本章教材的重點(diǎn)和難點(diǎn)，能夠讓教師有側(cè)重點(diǎn)地去教學(xué)，讓學(xué)生能夠有側(cè)重點(diǎn)的學(xué)習(xí)和記憶教材內(nèi)容，從而能夠提高生物課堂教學(xué)的有效率和學(xué)生學(xué)習(xí)的有效率。

二、聯(lián)系生活，創(chuàng)設(shè)學(xué)習(xí)情境

在教學(xué)過程中，教師要盡可能地創(chuàng)造條件，讓學(xué)生通過自主的活動(dòng)，主動(dòng)去觀察、去探究、去學(xué)習(xí)。生物是一門與實(shí)際生活聯(lián)系緊密的學(xué)科，教師可以通過聯(lián)系生活創(chuàng)設(shè)學(xué)習(xí)情境，讓學(xué)生在輕松、愉悅的學(xué)習(xí)氛圍中去學(xué)習(xí)知識(shí)、基本技能以及真正領(lǐng)悟科學(xué)的思想和精神[2]?！督M成細(xì)胞的分子》這一章的內(nèi)容與實(shí)際生活聯(lián)系尤為緊密，教師可以根據(jù)生活中的實(shí)際例子，來創(chuàng)設(shè)問題情境，讓學(xué)生既能夠激發(fā)學(xué)習(xí)興趣，又能夠加強(qiáng)學(xué)生對(duì)所學(xué)知識(shí)的理解，還能不斷提高學(xué)生的實(shí)際應(yīng)用能力。例如教師可以通過“大頭嬰兒”的示例作為導(dǎo)入來引起學(xué)生對(duì)《生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者─蛋白質(zhì)》這一節(jié)課的學(xué)習(xí)興趣，然后教師可以讓學(xué)生舉含蛋白質(zhì)食品的例子等，讓學(xué)生在接下來的學(xué)習(xí)中集中注意力。在學(xué)習(xí)第3節(jié)《遺傳信息的攜帶者─核酸》時(shí)，教師可以從學(xué)生比較感興趣的DNA技術(shù)在案件偵破中的應(yīng)用作為導(dǎo)入，并讓學(xué)生自主地圍繞DNA討論幾個(gè)問題，把學(xué)生從思維熱身中引入核酸內(nèi)容的學(xué)習(xí)中?！都?xì)胞中的糖類和脂質(zhì)》這一節(jié)內(nèi)容更是與學(xué)生的生活和身體健康密切相關(guān)，教師要善于利用這一特點(diǎn)，結(jié)合學(xué)生的實(shí)際創(chuàng)設(shè)情境。一提到吃，學(xué)生肯定很感興趣，教師就可以利用“吃”來引入教學(xué)內(nèi)容，可以通過“運(yùn)動(dòng)會(huì)時(shí)，可以為運(yùn)動(dòng)員們準(zhǔn)備哪些能夠快速補(bǔ)充能量的食物”來讓學(xué)生認(rèn)識(shí)到糖能為人提供能量，從而過渡到糖類的學(xué)習(xí)中。通過這樣的方式能夠緊緊抓住學(xué)生的注意力，激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。

三、不斷完善教學(xué)方式

受傳統(tǒng)教育的影響，我國高中教學(xué)的教學(xué)方式一般都是教師講、學(xué)生聽的模式，這樣的教學(xué)模式嚴(yán)重忽視了學(xué)生的主體地位，并且隨著新課改的不斷推進(jìn)，傳統(tǒng)教學(xué)模式的弊端已逐漸顯露出來，這就要求教師從傳統(tǒng)教學(xué)模式的框架下走出來，不斷研究并采用國內(nèi)外有效的教學(xué)方式，不斷完善生物課堂教學(xué)方式。例如小組合作模式，生物教學(xué)內(nèi)容中的實(shí)驗(yàn)部分是最適合運(yùn)用小組合作學(xué)習(xí)模式的教學(xué)內(nèi)容。例如“觀察DNA和RNA在細(xì)胞中的分布”的實(shí)驗(yàn)，這個(gè)實(shí)驗(yàn)是本節(jié)教學(xué)內(nèi)容的關(guān)鍵，是本章兩個(gè)重要實(shí)驗(yàn)之一。教師可以根據(jù)學(xué)生的性別、學(xué)習(xí)能力、實(shí)驗(yàn)技能、興趣愛好等情況遵循“組內(nèi)異質(zhì)、組間同質(zhì)”的原則進(jìn)行合理分配劃分小組，分小組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探究并討論。這樣既能夠讓學(xué)生自己動(dòng)手實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)知識(shí)，又能夠讓學(xué)生在小組合作中相互學(xué)習(xí)、相互促進(jìn)，不斷提高生物學(xué)習(xí)水平。

四、運(yùn)用多媒體技術(shù)

生物教學(xué)內(nèi)容中有很多復(fù)雜的生命現(xiàn)象或者生化反應(yīng)，代謝途徑等等，如果教師只是用語言去描述，學(xué)生接受起來就有所困難[3]。但是多媒體技術(shù)能夠把聲音、文字、視頻等進(jìn)行有機(jī)結(jié)合，既形象生動(dòng)、又直觀，讓學(xué)生能夠在視聽享受中加深學(xué)生對(duì)教學(xué)內(nèi)容的理解，讓學(xué)生能夠自主的在頭腦中構(gòu)建相應(yīng)的理論模型和知識(shí)結(jié)構(gòu)，這樣學(xué)生也容易掌握教學(xué)中的難點(diǎn)和重點(diǎn)。例如在學(xué)習(xí)《生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者─蛋白質(zhì)》這一節(jié)的內(nèi)容時(shí)，教師可以用多媒體技術(shù)展示氨基酸組成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次，通過多媒體來展示幾種氨基酸的結(jié)構(gòu)，讓學(xué)生自己推導(dǎo)氨基酸的結(jié)構(gòu)簡式，使抽象的內(nèi)容變得形象生動(dòng)，既能夠讓學(xué)生印象深刻，又能夠構(gòu)建活潑開放的課堂氛圍。

結(jié)束語：

隨著新課改的不斷推進(jìn)，很多新的教學(xué)模式和教學(xué)理念正在被廣大教師理解并且運(yùn)用，已經(jīng)在慢慢影響課堂教學(xué)實(shí)踐，并取得了一定的成果。但是我們也能發(fā)現(xiàn)，新理念、新教學(xué)模式、新教學(xué)策略在課堂教學(xué)的落實(shí)方面還存在著不足。本文上述提到的《組成細(xì)胞的分子》這一章的教學(xué)策略并不是唯一的、固定的，這就需要教師在教學(xué)過程中不斷總結(jié)分析并不斷完善，在教學(xué)實(shí)踐中不斷探索適合自身學(xué)科特點(diǎn)的教學(xué)策略。

參考文獻(xiàn)：

[1]胡冬英.高中生物新教材（人教版）《組成細(xì)胞的分子》的教學(xué)研究[D].廣西師范大學(xué).2012，25（12）：21-22

篇6

【摘要】 目的:研究131I標(biāo)記的Rituximab對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)以及對(duì)荷人Raji細(xì)胞移植瘤裸鼠的放射免疫治療效果，為放射免疫導(dǎo)向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：體外培養(yǎng)人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Raji細(xì)胞，裸鼠皮下接種Raji細(xì)胞成瘤，IODO- GEN法將131I標(biāo)記于Rituximab，將細(xì)胞分為131I- Rituximab組、單純抗體組、單純核素組及空白對(duì)照組4組，流式細(xì)胞儀檢測各組Raji細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期；取30只成瘤裸鼠隨機(jī)分成高、中、低劑量治療組及單純抗體組、單純核素組、空白對(duì)照組6組，進(jìn)行裸鼠的放射免疫治療研究。每周測量裸鼠荷瘤大小1次，4周后處死裸鼠，取瘤稱重，常規(guī)病理分析。結(jié)果：131I- Rituximab組凋亡率高于其他各組；131I- Rituximab組細(xì)胞周期發(fā)生變化，大部分被阻滯在G2期。裸鼠各治療組與對(duì)照組比較，腫瘤生長減慢，腫瘤生長抑制率具有劑量時(shí)間依賴性，組織病理學(xué)檢測顯示治療有效。結(jié)論：131I- Rituximab能夠誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡并調(diào)控細(xì)胞周期，而且可特異性地定位于腫瘤組織，發(fā)揮放射免疫導(dǎo)向治療作用，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】 放射免疫治療； B細(xì)胞淋巴瘤； 抗CD20單克隆抗體； 131I-Rituximab

非霍奇金淋巴瘤（NHL）是最常見的淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其絕大多數(shù)是B細(xì)胞來源，放射免疫治療（RIT）屬于內(nèi)照射治療，已成為目前B細(xì)胞NHL治療的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)將Rituximab-人鼠嵌合型抗CD20單克隆抗體偶聯(lián)放射性核素131I，從體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)兩方面研究其對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤的生物學(xué)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

人B淋巴瘤細(xì)胞系Raji細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所；BALB/c裸鼠（4～6周齡）購于中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，于東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院SPF動(dòng)物房飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑及器材

Rituximab購于羅氏制藥公司，Na131I購于南京森科公司，Iodogen(四氯二苯基甘脲)由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院核醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，流式細(xì)胞儀為FACS Vantage SE型，SPECT顯像儀為德國西門子公司E.CAM9358型。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清、100 U·ml-1青霉素、100 U·ml-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用流式細(xì)胞儀測定CD20表達(dá)率。

1.4 131I- Rituximab的制備

應(yīng)用IODO- GEN法［1］標(biāo)記，標(biāo)記產(chǎn)物經(jīng)Sephadex G- 25分離純化，檢測標(biāo)記產(chǎn)物的標(biāo)記率及放射化學(xué)純度。

1.5 體外實(shí)驗(yàn)

1.5.1 分組 細(xì)胞換液后24 h，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106 ml-1，分為4組。A組（131I- Rituximab組）：將131I- Rituximab加入Raji 細(xì)胞中，使131I- Rituximab的最終比放射性活度為3 μCi·ml-1（1 Ci=37 GBq），Rituximab的最終濃度為50 μg·ml-1；B組（單純核素組）：將Na131I加入Raji細(xì)胞中，使Na131I的最終比放射性活度為3 μCi·ml-1；C組（單純抗體組）：將Rituximab加入Raji細(xì)胞中，使Rituximab的最終濃度為50 μg·ml-1；D組（空白對(duì)照組）：加入等量培養(yǎng)液。上述各組劑量參照文獻(xiàn)［2］確定。

1.5.2 觀察指標(biāo) 加藥24 h后顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期：以Annexin Ⅴ- FIFC/PI雙染法測定藥物對(duì)細(xì)胞的早期誘導(dǎo)凋亡作用，采用DNA倍體分析法檢測細(xì)胞周期，重復(fù)測定3次。

1.6 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1.6.1 B細(xì)胞淋巴瘤動(dòng)物模型的建立 將處于對(duì)數(shù)生長期的Raji細(xì)胞，用不含血清的RPMI 1640調(diào)整細(xì)胞密度為1×107 ml-1，每只裸鼠皮下接種0.2 ml，30 d后部分裸鼠成瘤，挑選腫瘤直徑約為0.8 cm的30只成瘤裸鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組。

1.6.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 成瘤裸鼠模型隨機(jī)分為6組（每組5只）。a組（高劑量組）：尾靜脈注射131I- Rituximab 400 μCi；b組（中劑量組）：尾靜脈注射131I- Rituximab 150 μCi；c組（低劑量組）：尾靜脈注射131I- Rituximab 50 μCi；d組（單純抗體組）：尾靜脈注射Rituximab 0.8 mg；e組（單純核素組）：尾靜脈注射Na131I 150 μCi；f組（空白對(duì)照組）：尾靜脈注射生理鹽水0.2 ml。上述各組劑量參照文獻(xiàn)［3］確定。

1.6.3 治療效果觀察 （1）觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般狀況包括精神狀況、皮膚光澤、活動(dòng)度、飲食、飲水情況，并稱體重；（2）每隔3～4 d測量腫瘤的長徑和短徑，根據(jù)公式計(jì)算腫瘤體積和腫瘤生長抑制率（IR）：V=ab2/2（a為長徑，b為短徑），IR=(V0-Vn)/V0×100%(V0代表非治療組的腫瘤體積，Vn為治療組的腫瘤體積)；（3）SPECT顯像：分別于注射后4、24、48、72、96、168 h顯像；（4）組織病理學(xué)檢測：治療4周后處死裸鼠分離腫瘤，稱重后用10%福爾馬林固定，HE染色，作常規(guī)病理檢查。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件處理，進(jìn)行方差分析，兩兩比較采用LSD法。

2 結(jié)

果

2.1 Raji細(xì)胞形態(tài)改變及CD20表達(dá)率

倒置顯微鏡下可見細(xì)胞為圓形，生長旺盛，聚集成團(tuán)，透明度高，折光性強(qiáng)。流式細(xì)胞儀測定CD20表達(dá)率為98.03％。

2.2 131I- Rituximab的標(biāo)記率及放化純度

131I- Rituximab采用紙層析法測其標(biāo)記率為90％，其穩(wěn)定性好，4 ℃貯存24 h，其放化純度為91％。

2.3 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 A、B、C組細(xì)胞生長受到抑制，數(shù)量減少，細(xì)胞收縮，胞核變小。

2.3.2 細(xì)胞凋亡情況 細(xì)胞凋亡率 A組為59.94％，B、C、D組依次為48.21％、40.40％、1.06％，各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

2.3.3 細(xì)胞周期分析 （1）A組有17.13%的細(xì)胞截止于S期，B、C、D組依次有24.31%、25.73%、33.32%，除B組和C組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義以外，余各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

2.4 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般情況 b組裸鼠精神狀況、活動(dòng)度、皮膚狀況、飲食飲水量及體重均未發(fā)現(xiàn)明顯異常變化；a、c和d組裸鼠精神情況尚可，活動(dòng)度較b組略差，飲食飲水量輕度減少；e組和f組在實(shí)驗(yàn)后期裸鼠精神萎靡，皮膚暗淡，體重減輕，飲食飲水量明顯減少。a組分別在注射后第2、3天各有一裸鼠死亡，說明劑量過高，射線對(duì)裸鼠本身有一定傷害作用。

2.4.2 131I- Rituximab對(duì)腫瘤的抑制情況 如圖1所示：a、b組隨時(shí)間的延長腫瘤體積無明顯增大甚至有所縮小，c、d組隨時(shí)間的延長腫瘤體積稍增大，e、f組隨時(shí)間的延長腫瘤體積有明顯增大。各組裸鼠經(jīng)治療后第4周計(jì)算腫瘤生長抑制率，結(jié)果，a、b、c、d、e組依次為48.69％、47.60%、29.60％、17.27％、6.81％，各治療組與對(duì)照組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

2.4.3 SPECT顯像 給藥后4、24、48、72、96及168 h利用SPECT顯像。于注射后4 h腫瘤未見明顯顯影，周圍組織及血本底較高；24、48 h后a、b、c組可見腫瘤部位放射性濃聚（圖2），e組未見明顯腫瘤部位濃聚；72、96及168 h a、b、c 3組可見腫瘤圖像逐漸變淺；24 h b組可見腫瘤部位放射性濃聚。

2.4.4 病理觀察結(jié)果 e、f組腫瘤細(xì)胞增生活躍，可見較多的病理性核分裂相，偶見小灶性壞死；c、d組瘤細(xì)胞體積縮小，病理性核分裂相可見，腫瘤細(xì)胞核固縮、結(jié)構(gòu)不清、破裂，腫瘤組織見小片壞死，部分區(qū)域腫瘤細(xì)胞全部壞死、消失；a、b組瘤細(xì)胞體積明顯縮小，病理性核分裂相可見，腫瘤組織見大片壞死（圖3）。

3 討

論

放射免疫治療（RIT）是近幾年在分子靶向治療基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新的治療方法，即利用特異性抗體作載體，與能釋放射線的放射性核素偶合，注入體內(nèi)與腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)瘤體的內(nèi)照射治療，它不僅能殺傷與抗體結(jié)合的腫瘤細(xì)胞，還能殺傷鄰近的不表達(dá)抗原及無法與抗體結(jié)合的細(xì)胞。

RIT淋巴瘤具有許多優(yōu)勢［4- 6］：（1）淋巴瘤細(xì)胞對(duì)射線具有高度敏感性；（2）RIT通過射線殺傷腫瘤，不必完全依賴補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用（CDC）和抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC），因此即使機(jī)體免疫缺陷、抗原表達(dá)陰性或腫瘤免疫逃避等導(dǎo)致抗體及免疫毒素?zé)o效時(shí)，內(nèi)照射仍可發(fā)揮作用；（3）標(biāo)記抗體本身固有強(qiáng)大的抗腫瘤效應(yīng)；（4）放射性核素釋放的β射線能穿透多個(gè)細(xì)胞直徑的距離，因此對(duì)于周圍抗原表達(dá)陰性而沒有結(jié)合核素的腫瘤細(xì)胞同樣也有殺傷作用，這種作用稱為“交叉火力作用”（cross fire）；（5）與傳統(tǒng)的分次、短時(shí)、高劑量外照射治療相比，RIT為持續(xù)性低劑量內(nèi)照射治療，避免腫瘤細(xì)胞在放療間隔期DNA的修復(fù)，且持續(xù)低劑量輻射使腫瘤細(xì)胞被阻止在對(duì)射線敏感的細(xì)胞周期G2期，從而增加放射性細(xì)胞毒作用。國外對(duì)該方面研究成果顯著：90Y- ibritumomab和131I- tositumomab已被FDA批準(zhǔn)用于難治、復(fù)發(fā)性NHL及CD20陽性的轉(zhuǎn)型NHL的治療［7］。

本實(shí)驗(yàn)從體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)兩方面研究131I標(biāo)記的Rituximab對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤的生物學(xué)效應(yīng)：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察131I- Rituximab對(duì)Raji細(xì)胞的早期凋亡及細(xì)胞周期的影響，體外實(shí)驗(yàn)觀察131I- Rituximab對(duì)荷B細(xì)胞淋巴瘤裸鼠的治療效果。選用IODO- GEN法把131I標(biāo)記到Rituximab上標(biāo)記方法簡單，標(biāo)記率及放化純度均在90％以上，標(biāo)記物穩(wěn)定，證明IODO- GEN法有很強(qiáng)的實(shí)用性。Raji細(xì)胞的CD20表達(dá)率達(dá)98.03%，證明CD20是放免治療B細(xì)胞淋巴瘤的良好靶點(diǎn)［8］，131I- Rituximab可與Raji細(xì)胞表面抗原CD20特異性結(jié)合，將131I固定到腫瘤細(xì)胞，131I所發(fā)射的β射線對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生輻射生物效應(yīng)［9］，Rituximab在行使載體功能［8］的同時(shí)，其所產(chǎn)生的補(bǔ)體依賴的CDC和ADCC［10］共同作用抑制腫瘤生長。

體外實(shí)驗(yàn)中，由于131I- Rituximab中131I所發(fā)射的射線對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的輻射生物效應(yīng)，使細(xì)胞內(nèi)DNA斷裂、交聯(lián)，影響了DNA的復(fù)制和細(xì)胞的有絲分裂。本研究顯示，131I- Rituximab作用于Raji細(xì)胞后其凋亡率為59.94％，而單純抗體組僅為40.40％。131I- Rituximab組有17.13%截止于S期，單純核素組、單純抗體組、對(duì)照組依次為24.31%、25.73%、33.32%，提示治療組腫瘤細(xì)胞增殖狀態(tài)不佳；131I- Rituximab組有69.01%截止于G2期，單純核素組、單純抗體組、對(duì)照組依次為65.10%、51.83%、50.13%，提示射線將腫瘤細(xì)胞阻滯于G2期，阻止細(xì)胞進(jìn)一步分裂。以上說明131I- Rituximab具有生物導(dǎo)向的治療作用，通過持續(xù)低劑量輻射，使細(xì)胞被阻止在對(duì)射線最敏感的有絲分裂期，增強(qiáng)放射性細(xì)胞毒作用。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，從6組裸鼠腫瘤的增生情況及治療后第4周對(duì)腫瘤生長的IR來看，單獨(dú)使用Rituximab已經(jīng)有一定的抑瘤效果，其抑瘤率達(dá)到17.27％；使用低劑量131I- Rituximab的抑瘤效果要好于單獨(dú)使用Rituximab的效果，這說明核素在其中起了增強(qiáng)作用；中劑量131I- Rituximab組的抑瘤效果最明顯，甚至使腫瘤略縮小；高劑量131I- Rituximab組由于劑量太高，雖然也有明顯的抑瘤效果，但是造成了正常組織的損傷，治療效果不理想。

總之，131I- Rituximab在體內(nèi)和體外均顯示了較強(qiáng)的特異性殺腫瘤作用，適合以后作為免疫導(dǎo)向治療的藥物，針對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤高表達(dá)的CD20抗原作為治療靶點(diǎn)的免疫導(dǎo)向治療前景樂觀。腫瘤放射免疫治療的發(fā)展為難治性復(fù)發(fā)性B細(xì)胞NHL治療開辟了新的天地。通過131I- Rituximab對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤生物學(xué)效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究，希望能夠?yàn)槠溥M(jìn)一步臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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篇7

【關(guān)鍵詞】 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；生物學(xué)特性；細(xì)胞培養(yǎng)

The Biological Characteristics and Culture in Vitro of Rabbit Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells

〔Abstract〕 ObjectiveTo further study the isolation and cultivation procedures of mesenchymal stem cells from rabbit in vitro， and explore their biological properties. To build an experimental basis on applying MSCs as seed cells to treat many diseases. Methods

MSCs were obtained from tibias by density gradient centrifugation and were tested the rate of adhesion. The configuration was observed under phase-contrast microscope consecutively and the cell growth was measured by MTT method. Cell cycle and surface antigens were detected through flow cytometer. Results The subcultured cells showed active proliferative ability. More than 95% of subceltured MSCs were adhesive in 12 h. MSCs were positive for CD29， CD44， CD105 and negative for CD34.

Conclusion

In present culture condion， MSCs showed stable and rapid

growth in vitro . The characteristics make it possible to MSCs to be the seed cells for tissue engineering.

〔Key Words〕

Mesenchymal stem cells; Biological characteristics; Cell culture

干細(xì)胞是具有自我更新能力，且在適宜微環(huán)境下具有多系分化潛能的原始細(xì)胞[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體內(nèi)除胚胎干細(xì)胞外還存在具有自我更新和分化能力的成體干細(xì)胞。其中骨髓中的干/粒細(xì)胞包括間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells， MSCs），造血干細(xì)胞及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)。 MSCs 可在體外擴(kuò)增并有多向分化潛能[2-4]， 且取材方便，免疫耐受性、遺傳背景穩(wěn)定及易于轉(zhuǎn)染外源基因等，因而作為組織工程“種子細(xì)胞”有“廣泛的應(yīng)用前景”[5-8]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)兔 MSCs 體外培養(yǎng)法及其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，以建立一套穩(wěn)定、成熟的兔 MSCs 培養(yǎng)方法，從而為細(xì)胞移植等組織工程提供種子細(xì)胞來源提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1

材料及方法

1.1

主要試劑與儀器

低糖 DMEM 培養(yǎng)基（GIBICO 公司）、10% 胎牛血清（Hyclone 公司）、0.125% 胰蛋白酶（Sigma 公司）、Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液（上海華精生物高科技有限公司，比重 1.077 g/mL）、CD29、CD34、CD44、CD105 單克隆抗體和 FITC 標(biāo)記的二抗（Lab vision）、MTT（沃宏公司）、倒置相差顯微鏡（OLYMPUS）、細(xì)胞培養(yǎng)箱（Forma）、流式細(xì)胞儀（FACSCalibur， BECTON DICKINSON 公司，美國）及超凈工作臺(tái)（ESCO）等。

1.2

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)健康新西蘭大耳白兔，雌性，兔齡約 3 個(gè)月（南京市第一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK [蘇] 2002-2007）。

1.3

方法

1.3.1

骨髓 MSCs 的分離純化與培養(yǎng)

兔仰臥固定于兔臺(tái)上，予 2% 利多卡因局麻后，持 16 號(hào)骨穿針，沿脛骨平臺(tái)垂直刺入骨髓腔，外接肝素（3 000 U，0.2 mL）潤洗過的 10 mL 無菌注射器，抽取骨髓 4 mL，緩慢疊于等量 Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液（密度 1.077 g/mL）上，以 2 000 r/min 的速度離心 20 min，分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，收集界面上的細(xì)胞，移入另一離心管，PBS 洗滌，2 000 r/min 離心 5 min，反復(fù) 2 次，棄上清，懸浮于含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基（青霉素 100 U/mL，鏈霉素 100 U/mL），輕輕吹打均勻，接種到 25 cm2 培養(yǎng)瓶，置 37℃，5% CO2 及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4~6 d 首次換液，以后每 3 d 或 4 d 換液 1 次，14~21 d 細(xì)胞生長融合達(dá) 80% 以上，以 0.125% 胰蛋白酶消化，按 1:2 比例傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.2

骨髓 MSC 貼壁率檢測

取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，0.125% 胰蛋白酶消化制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×105/mL，接種于 24 孔培養(yǎng)板，每次孔 1 mL，每 2 h 取出培養(yǎng)板，吸去 4 孔培養(yǎng)液，0.1 mol/L PBS 漂洗除去未貼壁細(xì)胞，0.125% 胰蛋白酶消化后離心收集細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，共觀察 12 h，按以下公式逐個(gè)計(jì)算每個(gè)時(shí)相點(diǎn)的貼壁率：貼壁率=（貼壁細(xì)胞總數(shù)/接種細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.3.3

骨髓 MSCs 生長曲線的測定

取第 3 代生長良好的細(xì)胞，用 0.125% 胰蛋白酶消化后用含 10% FBS 的 DMEM 制備細(xì)胞懸液，以每孔 103~104 個(gè)細(xì)胞于不同時(shí)相分別接種于 8 塊 96 孔板中的 8 孔，每孔體積 200 L，置于 37℃、5% CO2 及飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育。于第 2 天起行 MTT 比色法，每孔加入 MTT 溶液（5 mg/mL）20 L，37℃ 繼續(xù)孵育 4 h 后，每孔加入 150 L 二甲基亞砜，振蕩 10 min 后選擇 490 nm 波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，以時(shí)間為橫軸，光吸收值 A（OD）為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。

1.3.4

骨髓 MSCs 表面標(biāo)記測定

取第 3 代MSCs，用 0.125% 胰蛋白酶消化，2 000 r/min 離心 5 min，PBS 洗滌 2 次，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為 1×106/mL，分為 4 份，分別滴加人抗兔 CD29、CD34、CD44、CD105 一抗（以 PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照），室溫反應(yīng) 30 min 后，PBS 洗滌 2 次，滴加 FITC 標(biāo)記的抗兔 IgG，避光反應(yīng) 15 min 后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面 CD29、CD34、CD44、CD105 陽性細(xì)胞的表達(dá)。

2

結(jié)

果

2.1

MSCs 的形態(tài)學(xué)變化

原代培養(yǎng)中，可見細(xì)胞以分散、克隆集落方式增殖；第 1~3 天細(xì)胞大部分呈圓形、橢圓形生長；第 3~7 天貼壁細(xì)胞增多，并逐漸延展生長為多角形、星形或梭形； 7~21 d 貼壁細(xì)胞明顯增多，并有集落形成，相鄰集落融合成片達(dá) 80% 以上，細(xì)胞排列呈漩渦狀，細(xì)胞間界限不清，細(xì)胞呈長梭形；14~21 d 后，細(xì)胞傳代，傳代后的細(xì)胞不以集落方式生長，而是均勻分布長梭形細(xì)胞。

2.2

MSCs 各時(shí)相點(diǎn)細(xì)胞帖壁率

見表 1。

2.3

MSCs 生長曲線分析

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞傳代培養(yǎng) 1~2 d，吸光度變化不大，甚至有輕微下降，細(xì)胞處于潛伏期，第 3 天起呈對(duì)數(shù)生長，至第 7 天到達(dá)高峰，之后進(jìn)入平臺(tái)期，見圖 2。

根據(jù)計(jì)算細(xì)胞的倍增時(shí)間公式可得：

DT = t ×〔lg2/（lgNt-lgNo）〕= 96 ×〔0.301/ （-0.060+1）〕= 30.8 h

2.4

MSCs 表面標(biāo)記

流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示：CD34、CD45 陽性細(xì)胞均為 0.8%；CD29 和 Cd105 陽性細(xì)胞數(shù)為 99.8%。說明分享獲得的細(xì)胞符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特點(diǎn)（見圖 3）。

3

討

論

MSCs 體外培養(yǎng)的生長特點(diǎn)和生物學(xué)特性已有較多相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。MSCs 在骨髓中的含量極少，約占有核細(xì)胞的 0.001%~0.01%[9]，如何獲得高純度、足量的 MSCs，成為 MSCs 應(yīng)用研究的關(guān)鍵。

目前常用于 MSCs 分離方法有密度梯度離心法[10-11]、貼壁篩選法[12]、免疫磁珠法[13]、流式細(xì)胞儀分離法[14]及 Hung 等[15]研究的特制微孔培養(yǎng)板篩選法。采用全骨髓貼壁篩選法，將抽取的骨髓直接置于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長的特性分離細(xì)胞，幾天后換液觀察細(xì)胞貼壁情況，這種保留造血干細(xì)胞和各種細(xì)胞混合培養(yǎng)的方法，由于維持了 MSCs 原始的生活環(huán)境，有利于 MSCs 分化，但所得細(xì)胞成分復(fù)雜， MSCs 純度不足。單克隆抗體磁珠分離系統(tǒng)或流式細(xì)胞儀技術(shù)對(duì)細(xì)胞活性影響較大，甚至導(dǎo)致細(xì)胞完全失去活性，而且實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，需要骨髓量大，不易重復(fù)，造價(jià)較高，一般僅限于在大實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用[16]。特制微孔培養(yǎng)板篩選法，可以快速有效分離得到相對(duì)同質(zhì)的 MSCs，利用這種方法可以不用 Percoll 液去除紅細(xì)胞[17]，但是結(jié)果不穩(wěn)定，特定原料不易大量獲取。密度梯度離心法即根據(jù)骨髓中細(xì)胞成分比重的不同，利用Percoll 或淋巴細(xì)胞分離液提取單核細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。操作上較貼壁細(xì)胞分離法煩瑣，得到的細(xì)胞數(shù)不如后者多，但細(xì)胞純度較后者高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合密度梯度離心法和貼壁篩選法，利用密度為 1.077 g/L 的 Ficoll 分離液，能有效去除絕大部分紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和血小板，獲得純度較高的單個(gè)核細(xì)胞。然后利用 MSCs 的貼壁性，逐漸棄掉未貼壁細(xì)胞，從而獲得足量的 MSCs。

在培養(yǎng)過程中，我們還注意到以下幾個(gè)環(huán)節(jié)：①與蔣雯等[18]不同，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，兔 MSCs 原代培養(yǎng)首次換液的時(shí)間宜在 4~6 d，過早換液將丟失過多尚未貼壁細(xì)胞，因在實(shí)驗(yàn)過程中，第 3 天首次換液后，收集舊培養(yǎng)液離心洗滌，再接種仍有細(xì)胞大量生長；且原代細(xì)胞在培養(yǎng) 14 d~21 d 左右才能達(dá)到80% 以上的融合，才能進(jìn)行傳代培養(yǎng)，這可能與我們用的培養(yǎng)基加的胎牛血清濃度不同，蔣雯等用的是 20% 的血清，而我們用的是 10% 的胎牛血清；②培養(yǎng)基中胎牛血清濃度保持在 10% 左右為宜，過低由于缺乏生長因子的刺激，細(xì)胞增殖減慢，而過高又因含大量促進(jìn)細(xì)胞生長增殖分化的因子，易引起細(xì)胞過早出現(xiàn)老化；③兔 MSCs 原代接種貼壁不良時(shí)，可予膠原[19]包被培養(yǎng)瓶，增加細(xì)胞的貼壁率；④胰蛋白酶消化細(xì)胞時(shí)，可先將 PBS 潤洗培養(yǎng)瓶 2 次，去除殘留血清，更易將貼壁細(xì)胞消化下來，且消化時(shí)間縮短，不會(huì)造成消化時(shí)間過長對(duì)細(xì)胞的損傷；⑤細(xì)胞傳代時(shí)，應(yīng)注意接種密度，宜按 1:2 比例傳代接種，如此細(xì)胞才能保持良好的增長趨勢，不會(huì)因接種密度過稀致增長緩慢且易老化。

目前 MSCs 在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，然而 MSCs 表面標(biāo)志由于細(xì)胞分離、培養(yǎng)方法和培養(yǎng)時(shí)間等的不同而有差異。Pittenger 等[20]認(rèn)為人MSCs 陽性表面標(biāo)志是 SH2（CD105）、SH3、SH4、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD124，陰性表面標(biāo)志是 CD45、CD34 和 CD14 等造血細(xì)胞標(biāo)志。Hung 等[21]采用帶 3 m 孔培養(yǎng)板的裝置培養(yǎng)分離得到人 MSC，培養(yǎng)至第 2 代末時(shí)陽性表面標(biāo)志是 CD90、CD44、CD29、CD51，陰性表面標(biāo)志是 CD45、CD34、CD7、AC133 等。研究者們應(yīng)用不同的分離擴(kuò)增方法及不同的方式表達(dá)細(xì)胞特性，使得對(duì)一些研究結(jié)果的比較變得困難，阻礙了其在這些領(lǐng)域的應(yīng)用[22]。因此在 2005 年，ISCT（the International Society for Cellular Therapy）定義了 MSCs 的最低標(biāo)準(zhǔn)： 首先，MSCs 在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下必須具備貼壁生長的特點(diǎn)；其次，MSCs 表達(dá) CD105、CD73 和 CD90，而 CD45、CD34、CD14 或 CD11b、CD79a、或 CD19 及 HLA-DR 表面分子表達(dá)陰性；第三，MSC 在體外能分化為格根包爾氏細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞[23]。本實(shí)驗(yàn)選擇第 3 代細(xì)胞行流式細(xì)胞儀檢測表面抗原顯示，陽性表達(dá)黏附分子、整合素家族成員等如細(xì)胞表面抗原 CD29、CD44、CD105 陽性細(xì)胞數(shù)占 99.8%，而造血細(xì)胞表面標(biāo)志陰性或極少表達(dá)即 CD34 陽性率只有 0.8%，上述結(jié)果表明：獲得的細(xì)胞為非造血類的、符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特點(diǎn)，與文獻(xiàn)資料吻合[12，24]。

通過對(duì)兔MSCs 培養(yǎng)方法和表面標(biāo)識(shí)物的進(jìn)一步研究，本研究建立了一套穩(wěn)定分離、培養(yǎng)擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，獲得足量純化的 MSCs 并進(jìn)而研究其作為種子細(xì)胞治療多種疾病提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。隨著基因工程和組織工程的發(fā)展，骨髓 MSCs 也將在細(xì)胞治療、基因治療等方面得到廣泛應(yīng)用。本研究設(shè)計(jì)的缺陷在于，這只是細(xì)胞培養(yǎng)的一個(gè)初步研究，下一步若對(duì)細(xì)胞周期及細(xì)胞活力進(jìn)行檢測，將對(duì)選擇最合適代數(shù)細(xì)胞作為種子細(xì)胞的應(yīng)用提供更有價(jià)值的信息。

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篇8

【關(guān)鍵詞】 異體移植

摘 要：［目的］研究神經(jīng)長度是否影響化學(xué)去細(xì)胞神經(jīng)的質(zhì)量及化學(xué)去細(xì)胞異體神經(jīng)修復(fù)犬神經(jīng)缺損的適當(dāng)長度范圍。［方法］切取犬的坐骨神經(jīng)全長，截取直徑近似段長度12 cm，去除神經(jīng)外膜的脂肪組織及血管，在50％Triton X100和50％脫氧膽酸鈉中重復(fù)消化得到化學(xué)去細(xì)胞神經(jīng)；部分神經(jīng)用于組織學(xué)評(píng)價(jià)，將12 cm神經(jīng)按順序切割為6段，石蠟包埋制備切片，厚度5 μm。HE染色和Fastblue染色，觀察去細(xì)胞程度、神經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性、髓鞘染色強(qiáng)度，觀察每段神經(jīng)的差異。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，用化學(xué)去細(xì)胞異體神經(jīng)橋接犬的坐骨神經(jīng)缺損，缺損長度分別為8、10 cm組，每組各有6條成年犬，隨訪時(shí)間12個(gè)月。觀察動(dòng)物肢體功能恢復(fù)、肌電圖變化及再生神經(jīng)組織學(xué)表現(xiàn)，包括HE染色、S100免疫組織化學(xué)染色、乙酰膽堿酯酶染色。［結(jié)果］去細(xì)胞神經(jīng)全長各段在去細(xì)胞程度、結(jié)構(gòu)完整性及殘余髓鞘染色綜合評(píng)價(jià)中無差異。體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示8 cm去細(xì)胞異體神經(jīng)移植組的犬在術(shù)后12個(gè)月踝關(guān)節(jié)可直立行走，而10 cm去細(xì)胞異體神經(jīng)移植組犬12個(gè)月時(shí)踝關(guān)節(jié)不能直立行走。肌電圖檢查結(jié)果顯示，兩組動(dòng)物的手術(shù)肢體均可記錄到誘發(fā)的運(yùn)動(dòng)和感覺電位。肌電圖波幅、時(shí)限及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度結(jié)果顯示，8 cm移植組明顯高于10 cm移植組(P

關(guān)鍵詞：去細(xì)胞神經(jīng)； 異體移植； 再生

Abstract：［Objective］The purpose of this paper is to demonstrate whether the nerve length could affect the quality of acellular nerve and investigate the properly repairable distance of nerve defects with acellular nerve allografts. ［Method］Fresh sciatic nerves were obtained from adult dogs and pided into 12 cm long segments. The nerve segments were decellularized via an improved chemical decelluarization treatment as following: Nerve segments were rinsed with cold sterile Ringer's solution and submergedin 5% Triton100 solution 12h ，and then soaked the nerve segments into 5% sodium deoxycholate for 12h. The treated nerve segments were washed in distilled water for 3h. This procedures were repeated once again. In vitro， the degrees of decellularization ， demyelination and integrity of nerve fiber tubal of chemically extracted acellular nerves were observed with microscope and assessed by a score system. In vivo，the sciatic nerve of dogs on the right was exposed.In 8 cm grafted group (n=6)，a 7 cm segment of sciatic nerve was removed from the midthigh level. In 10 cm grafted group (n=6) ， a 9 cm segment of sciatic nerve was removed at the same level. The gaps were bridged with acellular nerve allografts by 8 cm and 10　cm long segments respectively. The followup period was 12 month postoperatively. Motor functional recovery of the right hind following allografting was examined by neurobehavioral， electrophysiological， histological and immunohistochemical assessment. ［Result］There was no difference on the degrees of decellularization， demyelination and integrity of nerve fiber tubal among every fraction of the acellular nerve from the two ends to the central portion. In 8 cm grafted group ， all survival dogs(n=5) were held upright with the affected hindlimb extended so that the body's weight was supported by the distal metatarsus and toes. In 10 cm grafted group， animals were failed to held upright with the affected hindlimb. Electrophysiological studies showed that elctromyographic activity was observed in both groups.After 12 month the conduction velocity was 321+51 m/s in 8 cm grafted animals and 183+6.0m/s in 10 cm grafted group. In normal animals， the conduction velocity was 1066+164 m/s. The conduction velocity in 10 cm grafted group was lower than 8 cm grafted(P

Key words: Acellular nerve; Allograft; Regeneration

創(chuàng)傷、理化因素及腫瘤等原因可導(dǎo)致周圍神經(jīng)的損傷，造成長距離的神經(jīng)缺損。為恢復(fù)肢體的神經(jīng)支配通常需要應(yīng)用移植物橋接神經(jīng)缺損。該類移植物的功能是引導(dǎo)神經(jīng)纖維通過缺損區(qū)并長入支配的器官和組織。由于新鮮異體神經(jīng)移植的免疫學(xué)反應(yīng)，在臨床實(shí)踐中自體神經(jīng)移植一直被認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)”。但是由于切取自體神經(jīng)帶來的諸多并發(fā)癥及供區(qū)所限，自體神經(jīng)替代物修復(fù)神經(jīng)缺損成為研究的重點(diǎn)。人工合成的替代物主要是由具有良好生物相容性和生物可降解材料制備，如PLA(polylacticacid)［1，2］，PLGA［poly(lacticcoglycolic)］［3］等。合成材料雖然可避免切取自體神經(jīng)的并發(fā)癥及異體神經(jīng)的免疫反應(yīng)，但在內(nèi)部結(jié)構(gòu)上不具備天然神經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)，而這種結(jié)構(gòu)對(duì)引導(dǎo)神經(jīng)軸突的生長至關(guān)重要。異體神經(jīng)的MHC(major histocompatibility complex)主要存在于神經(jīng)的雪旺細(xì)胞和髓鞘成份中，近期研究顯示經(jīng)化學(xué)處理的去細(xì)胞異體神經(jīng)可有效降低移植后的免疫反應(yīng)并促進(jìn)神經(jīng)軸突向遠(yuǎn)端生長［4，5］，從而修復(fù)周圍神經(jīng)的節(jié)段性缺損。因此，化學(xué)去細(xì)胞異體神經(jīng)已成為一種具有應(yīng)用前景的自體神經(jīng)替代物，并對(duì)其神經(jīng)移植物的保存方法進(jìn)行了研究［6］。然而，在實(shí)驗(yàn)研究中，對(duì)下述兩個(gè)問題尚未進(jìn)行深入研究：(1)較長節(jié)段神經(jīng)的化學(xué)去細(xì)胞處理是否會(huì)造成神經(jīng)斷端與神經(jīng)中段質(zhì)量的差異；(2)在大型動(dòng)物神經(jīng)缺損修復(fù)中有效的長度范圍為多少。上述問題的研究對(duì)制備較長的去細(xì)胞神經(jīng)移植物和選擇修復(fù)神經(jīng)缺損的長度具有重要意義。

1 材料與方法

11 儀器及試劑

Medtronic Keypoint肌電圖儀(丹麥)，恒溫振蕩器(回旋式，上海)，Triton X100(Sigma，美國)，脫氧膽酸鈉(Sigma，美國) 。

12 犬化學(xué)去細(xì)胞神經(jīng)的制備

已行鈷―鉻―鉬人工假體體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)并準(zhǔn)備取材的實(shí)驗(yàn)犬6條，體重在24～26 kg，用速眠新100 mg肌注后全麻安樂死，取雙側(cè)全長的坐骨神經(jīng)干，每條坐骨神經(jīng)長約12 cm。將切取的全長犬坐骨神經(jīng)標(biāo)記遠(yuǎn)近端后，按下述順序進(jìn)行化學(xué)處理：(1)蒸餾水浸浴12 h；(2)50％Triton X100消化12 h;(3)蒸餾水浸浴3h；(4)50％脫氧膽酸鈉消化12 h；(5)重復(fù)前述步驟；(6)蒸餾水浸浴3 h；(7)萃取神經(jīng)在4℃、 pH 72無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)暫時(shí)保存；(8)將處理好的去細(xì)胞神經(jīng)組織和Hank’s液一起用雙層無毒塑料袋進(jìn)行分裝，在250 KGy的γ射線下進(jìn)行輻照滅菌，放置在4℃冰箱中備用。

13 去細(xì)胞神經(jīng)的組織學(xué)評(píng)價(jià)

去細(xì)胞處理后的神經(jīng)組織，將每一神經(jīng)段按等比例分為6小段，每小段長為20 mm，石蠟包埋，做5 μm厚橫向和縱向組織學(xué)切片，進(jìn)行HE染色觀察去細(xì)胞程度及纖維管道結(jié)構(gòu)完整性、Fast blue染色觀察髓鞘成分。按照表1的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行去細(xì)胞神經(jīng)的質(zhì)量評(píng)價(jià)。每段隨機(jī)取3張切片進(jìn)行觀察，取其均值單項(xiàng)計(jì)分。

14 去細(xì)胞異體神經(jīng)移植試驗(yàn)

健康雜種犬12只，雌雄不分，體重243～266 kg，隨機(jī)分成2組，8 cm移植組和10 cm移植組，每組 6只。用25％戊巴比妥鈉(10 mg／kg體重)靜脈注射進(jìn)行麻醉。在無菌條件下右股后切口顯露坐骨神經(jīng)干。在坐骨神經(jīng)干中段分別銳性切除7、9 cm長的神經(jīng)節(jié)段，自然回縮造成8、10 cm長的神經(jīng)缺損。分別用8、10 cm長的化學(xué)去細(xì)胞同種異體神經(jīng)進(jìn)行移植橋接神經(jīng)缺損，用8-0無創(chuàng)尼龍線行神經(jīng)外膜縫合，環(huán)形縫合6針。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，觀察期12個(gè)月。

15 體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)觀察

151 一般觀察 觀察移植后切口愈合及肢體功能恢復(fù)。

152 神經(jīng)電生理觀察 用丹麥產(chǎn)Medtronic Keypoint便攜式肌電圖儀進(jìn)行運(yùn)動(dòng)和感覺誘發(fā)電位的檢測。隨機(jī)選取左側(cè)非手術(shù)側(cè)肢體5例作為正常值對(duì)照。在全麻下手術(shù)切開顯露待測神經(jīng)。

在進(jìn)行運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位檢查時(shí)，將刺激電極放置在移植段神經(jīng)近側(cè)2 cm的正常神經(jīng)上，記錄電極放置在小腿三頭肌上，通過給予相同劑量的方波刺激比較兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位波幅和時(shí)限上的區(qū)別。左側(cè)肢體電極放置在相應(yīng)位置，刺激參數(shù)為：10～20 mA，01 ms，10 Hz。

在進(jìn)行感覺誘發(fā)電位觀察時(shí)，刺激電極放置在踝關(guān)節(jié)部的脛神經(jīng)上，記錄電極放置在移植段近側(cè)的正常神經(jīng)上。刺激參數(shù)為50～100 mA，02 ms，19 Hz。

運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度檢查時(shí)，在移植側(cè)，近端刺激電極位于移植段近端吻合口近側(cè)2 cm處，遠(yuǎn)端記錄電極位于移植段遠(yuǎn)端吻合口遠(yuǎn)側(cè)2 cm處，兩實(shí)驗(yàn)組距離分別為12、14 cm。在對(duì)照側(cè)，兩點(diǎn)位于與右側(cè)相應(yīng)部位的坐骨神經(jīng)干上，間距10 cm。刺激參數(shù)為10～20 mA，02 ms，10 Hz，肌電圖儀自動(dòng)記錄并計(jì)算運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)速度。

153 再生神經(jīng)的組織學(xué)觀察 在過量麻醉藥物的作用下處死實(shí)驗(yàn)犬并即刻觀察取材。對(duì)實(shí)驗(yàn)組全部動(dòng)物的移植段神經(jīng)的近側(cè)吻接口、移植段中央、遠(yuǎn)側(cè)吻接口、移植段遠(yuǎn)側(cè)神經(jīng)和神經(jīng)支配區(qū)域的靶肌肉進(jìn)行神經(jīng)再生的組織學(xué)觀察。

1531 HE染色 將切取的移植神經(jīng)及兩端各1 cm正常神經(jīng)取出后浸于4％多聚甲醛水溶液中固定24 h，經(jīng)脫水處理后分段用石蠟進(jìn)行包埋，連續(xù)組織學(xué)切片，切片厚度為5 μm，蘇木素-伊紅染色后觀察組織結(jié)構(gòu)形態(tài)，再生神經(jīng)纖維和細(xì)胞浸潤情況。

1532 S-100免疫組化染色 標(biāo)本為石蠟包埋，切片厚度5 μm。Ⅰ抗為兔抗S-100蛋白抗體，Ⅱ抗為生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體。用于觀察再生神經(jīng)中的許旺細(xì)胞的分布情況，特別是移植段神經(jīng)中許旺細(xì)胞的分布。

1533 美藍(lán)復(fù)紅染色 在移植段中央和移植段遠(yuǎn)側(cè)的神經(jīng)中各取2 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊用05％戊二醛固定24 h，樹脂包埋后用于半薄切片美藍(lán)復(fù)紅染色，切片厚度2 μm，染色后觀察有髓神經(jīng)纖維。

1534 透射電鏡觀察 將經(jīng)05％戊二醛固定后樹脂包埋的神經(jīng)組織行超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色。在SEM透射電鏡下觀察再生神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)。

1535 靶肌肉運(yùn)動(dòng)終板染色 在脛神經(jīng)進(jìn)入小腿三頭肌肌腹部位切取3 mm厚的肌肉塊，在含1％氯化鈣的 10％福爾馬林水溶液中固定24 h，取出后放置在蔗糖-凝膠溶液中，行冰凍切片，切片厚度為30 μm。用膽堿酯酶法進(jìn)行運(yùn)動(dòng)終板染色，觀察靶肌肉中再生的運(yùn)動(dòng)終板的形態(tài)。每張切片隨意選3個(gè)視野計(jì)數(shù)運(yùn)動(dòng)終板數(shù)量，取其平均數(shù)。

16 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 115統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間對(duì)比用成對(duì)資料的t檢驗(yàn)，P

2 結(jié) 果

21 去細(xì)胞神經(jīng)各段間組織學(xué)觀察結(jié)果

神經(jīng)全長從近端到遠(yuǎn)端去細(xì)胞完全，評(píng)分均為0分；在結(jié)構(gòu)觀察中，除第2段為0分外，其余5段均為1分，存在輕度的結(jié)構(gòu)破壞：觀察髓鞘染色強(qiáng)度，神經(jīng)全長均為1分，仍殘留少部分髓鞘成分。綜合評(píng)分第1段為2分，第2段1分，第3段到第6段均為2分，神經(jīng)全長各段經(jīng)去細(xì)胞處理后綜合評(píng)分相似（見表1）。 表1 化學(xué)去細(xì)胞神經(jīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

22 移植動(dòng)物一般情況和功能觀察

8 cm組有1犬在移植后3個(gè)月并發(fā)肺部感染死亡。10 cm組有1犬在4個(gè)半月腹瀉死亡。其余動(dòng)物均存活至觀察期滿。 在8 cm組實(shí)驗(yàn)犬在移植術(shù)后3個(gè)月時(shí)均有不同程度運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，至6個(gè)月時(shí)恢復(fù)了較好的行走功能，但是外觀上仍有輕微的跛行，12個(gè)月時(shí)在行走過程中踝關(guān)節(jié)可以完全直立和有較好的背屈。10 cm組在6個(gè)月時(shí)也有不同程度的下肢功能恢復(fù)，但是進(jìn)展較慢，移植后12個(gè)月踝關(guān)節(jié)仍不能直立或爪背著地。

23 神經(jīng)電生理觀察

在移植段近側(cè)的正常神經(jīng)上給予電刺激時(shí)，8 cm組和10 cm組均在小腿三頭肌上記錄到誘發(fā)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)電位。如表2所示移植術(shù)后12個(gè)月記錄到的運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位時(shí)限和波幅的區(qū)別，8 cm組的波幅高于10 cm組(t=3286，P

24 再生神經(jīng)組織學(xué)觀察

大體上觀察，8 cm組在局部切開檢查時(shí)，移植段神經(jīng)與周圍組織有輕微的短縮，可見移植段神經(jīng)有良好的連續(xù)性，無明顯變細(xì)變硬。神經(jīng)與周圍組織有少量的粘連，再血管化良好。近側(cè)和遠(yuǎn)側(cè)吻接口無神經(jīng)瘤形成。神經(jīng)支配區(qū)的肌肉組織有輕度萎縮。10 cm組在切開檢查時(shí)，可見移植段神經(jīng)的遠(yuǎn)側(cè)段明顯變細(xì)變硬，但是仍然保持連續(xù)性，神經(jīng)與周圍組織有粘連，神經(jīng)支配區(qū)肌肉萎縮明顯。 表2 去細(xì)胞異體神經(jīng)移植術(shù)后12個(gè)月肌電圖結(jié)果光鏡下，在兩組移植段神經(jīng)內(nèi)均有S-100表達(dá)陽性的雪旺細(xì)胞，沿神經(jīng)纖維方向呈帶狀排列(圖1)，8 cm組的數(shù)量多于10 cm組。移植段以遠(yuǎn)的神經(jīng)內(nèi)亦可見到雪旺細(xì)胞增殖成帶，神經(jīng)橫切面顯示有再生的神經(jīng)纖維，8 cm組優(yōu)于10 cm組，在10 cm組可見較多神經(jīng)束呈脫髓鞘改變。

運(yùn)動(dòng)終板染色顯示在神經(jīng)支配區(qū)的小腿三頭肌中可以見到重新形成的運(yùn)動(dòng)終板結(jié)構(gòu)，兩組實(shí)驗(yàn)犬在運(yùn)動(dòng)終板數(shù)量上有較明顯的差別，8 cm組再生的運(yùn)動(dòng)終板數(shù)量多于10 cm組，終板的形態(tài)也優(yōu)于10 cm組(圖2)。每個(gè)高倍視野下的運(yùn)動(dòng)終板的數(shù)量在8 cm組明顯多于10 cm組，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P10 cm組。但是兩組終板和正常的終板結(jié)構(gòu)相比不管是在終板的數(shù)量還是在終板的縱橫徑上均有差別(P

電鏡下8 cm組移植段神經(jīng)內(nèi)可見由雪旺細(xì)胞形成的髓鞘和有髓神經(jīng)纖維，同時(shí)可見大量的無髓神經(jīng)纖維呈束狀分布(圖3)；10 cm組移植段神經(jīng)內(nèi)也有少量有髓神經(jīng)纖維形成。表3 去細(xì)胞異體神經(jīng)移植術(shù)后小腿三頭肌運(yùn)動(dòng)終板測量

3 討 論

在異體神經(jīng)移植的研究中，雖然經(jīng)凍融處理、放射處理和化學(xué)處理后的異體神經(jīng)均具有促進(jìn)神經(jīng)再生的功能，但由于凍融處理及放射處理的神經(jīng)細(xì)胞碎片仍殘存在神經(jīng)的基底板層管內(nèi)，妨礙神經(jīng)軸突向遠(yuǎn)端的延伸，因此修復(fù)神經(jīng)缺損的距離一般較短。而化學(xué)處理后的異體神經(jīng)在降低免疫原性的同時(shí)，保留了神經(jīng)纖維管道的結(jié)構(gòu)完整性，其內(nèi)部細(xì)胞碎片已被清除，去除了軸突生長的障礙，因此可用于修復(fù)較長距離的神經(jīng)缺損。但在化學(xué)去細(xì)胞處理過程中，當(dāng)為修復(fù)較長距離的神經(jīng)缺損而處理較長神經(jīng)段時(shí)，神經(jīng)的兩端與中央部位是否存在質(zhì)量差異，對(duì)修復(fù)神經(jīng)缺損有較大的影響?；瘜W(xué)浸提液是從神經(jīng)的兩端還是透過神經(jīng)外膜對(duì)神經(jīng)進(jìn)行去細(xì)胞處理存在爭議。實(shí)驗(yàn)中從去細(xì)胞程度、髓鞘提取的程度及神經(jīng)纖維管道的完整程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示在長12 cm的神經(jīng)段中，經(jīng)化學(xué)去細(xì)胞處理后，神經(jīng)的中央部分與兩端的各段間在上述三個(gè)方面的綜合評(píng)價(jià)中無差異，說明對(duì)同等粗細(xì)的神經(jīng)其長度并不影響其神經(jīng)移植物的質(zhì)量，由此可以推斷化學(xué)浸提液并非從神經(jīng)的兩端而是從神經(jīng)的外膜開始進(jìn)行去細(xì)胞處理。故在用相同的浸提液及處理程序進(jìn)行去細(xì)胞處理時(shí)，神經(jīng)的長度對(duì)神經(jīng)移植物質(zhì)量無影響。

雖然在理論上可以應(yīng)用化學(xué)去細(xì)胞的方法處理任意長度的神經(jīng)，但在實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用中移植長度仍然影響肢體功能康復(fù)的結(jié)果。在早期的研究中應(yīng)用化學(xué)去細(xì)胞異體神經(jīng)較滿意修復(fù)了犬5 cm長的坐骨神經(jīng)缺損［7］。在應(yīng)用相同方法處理的犬的化學(xué)去細(xì)胞異體神經(jīng)移植實(shí)驗(yàn)中，對(duì)犬的8、10 cm 長的坐骨神經(jīng)缺損用化學(xué)去細(xì)胞同種異體神經(jīng)進(jìn)行移植修復(fù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在8 cm長的坐骨神經(jīng)缺損修復(fù)組，無論是肢體功能的大體觀察還是電生理的觀察，均恢復(fù)較好。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的波幅已達(dá)正常神經(jīng)的50％，神經(jīng)傳導(dǎo)速度達(dá)到正常神經(jīng)的30％；而在10 cm長的神經(jīng)移植組，功能恢復(fù)較差，肌電圖波幅及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度均未達(dá)到正常神經(jīng)的20％。再生神經(jīng)的組織學(xué)觀察顯示8 cm長的去細(xì)胞神經(jīng)移植組在雪旺細(xì)胞、有髓神經(jīng)纖維的分布及運(yùn)動(dòng)終板的數(shù)量和形態(tài)方面均明顯優(yōu)于10 cm移植組。

在8、10 cm神經(jīng)移植組，其移植物本身的質(zhì)量無差異，但最終結(jié)果具有明顯的差異。產(chǎn)生這種差異的原因不在移植物本身，而與神經(jīng)缺損的距離有關(guān)。Haase等［8］用去細(xì)胞異體神經(jīng)橋接大鼠腓神經(jīng)缺損，研究顯示去細(xì)胞異體神經(jīng)可以修復(fù)2 cm的周圍神經(jīng)缺損，當(dāng)缺損>4 cm時(shí)未出現(xiàn)功能恢復(fù)，并認(rèn)為生長因子可能有助于修復(fù)較長的神經(jīng)缺損。但在隨后的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用血管內(nèi)皮生長因子與去細(xì)胞異體神經(jīng)復(fù)合后移植修復(fù)神經(jīng)缺損，僅表現(xiàn)出促進(jìn)近端吻合口軸突的生長，并未顯出促使神經(jīng)軸突延長的作用［9］。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是生長因子雖有促神經(jīng)再生的作用，但在修復(fù)區(qū)內(nèi)未能呈現(xiàn)生理環(huán)境下的濃度梯度變化，故軸突的生長方向受到干擾。在周圍神經(jīng)損傷后，靶器官通過神經(jīng)遠(yuǎn)端釋放不同的生物因子，發(fā)揮化學(xué)趨化作用，促使神經(jīng)軸突向遠(yuǎn)端生長。生物因子的濃度呈現(xiàn)明顯的梯度改變趨勢，隨距離的增加，生物因子的濃度發(fā)生明顯的變化，從而影響神經(jīng)的再生速度及肢體功能康復(fù)。因此，在使用生長因子促使神經(jīng)向遠(yuǎn)端生長時(shí)應(yīng)考慮其作用環(huán)節(jié)及濃度梯度變化。

本研究證實(shí)神經(jīng)的長度并不影響化學(xué)去細(xì)胞神經(jīng)制備的質(zhì)量，在應(yīng)用去細(xì)胞異體神經(jīng)修復(fù)周圍神經(jīng)缺損中，8 cm或許是目前單獨(dú)使用化學(xué)去細(xì)胞異體神經(jīng)移植取得較好結(jié)果的最大范圍。為修復(fù)更大范圍的神經(jīng)缺損，應(yīng)探討神經(jīng)遠(yuǎn)端的生物因子表達(dá)分布規(guī)律，利用化學(xué)趨化原理促進(jìn)神經(jīng)的快速生長。

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篇9

【關(guān)鍵詞】醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué) 教學(xué)改革

【中圖分類號(hào)】G642 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1674-4810（2015）23-0067-02

隨著細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的相關(guān)知識(shí)和理論在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用的不斷深入，細(xì)胞生物學(xué)已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的重要基礎(chǔ)，在醫(yī)學(xué)教育中占有重要的地位。對(duì)于現(xiàn)代醫(yī)科學(xué)生來說，具備細(xì)胞生物學(xué)的相關(guān)基礎(chǔ)知識(shí)和基本技能，是進(jìn)一步學(xué)習(xí)其他醫(yī)學(xué)課程必不可少的條件。2011年以來，我校執(zhí)行新版教學(xué)計(jì)劃，其中對(duì)蒙醫(yī)專業(yè)、臨床和護(hù)理專業(yè)的醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)課時(shí)改革，學(xué)校教研室對(duì)其教學(xué)內(nèi)容的安排和教學(xué)方法的施用也進(jìn)行了相應(yīng)的改革，旨在進(jìn)一步提高和完善教學(xué)質(zhì)量和效果。

一 我校醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)發(fā)展歷程

1978年，哲里木醫(yī)學(xué)院生物教研室成立，在臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)開設(shè)了醫(yī)學(xué)生物學(xué)課程，本、?？品謩e為72、54學(xué)時(shí)，先后由校內(nèi)一些教師任教。在當(dāng)時(shí)的醫(yī)學(xué)生物學(xué)課程中，已用相當(dāng)?shù)钠驅(qū)W生介紹了醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)知識(shí)。1992年，蒙醫(yī)學(xué)院將臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)的醫(yī)用生物學(xué)課程一分為二，南×老師開設(shè)醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)，理論課30學(xué)時(shí)，實(shí)驗(yàn)課18學(xué)時(shí)。2000年，內(nèi)蒙古民族師范學(xué)院、內(nèi)蒙古蒙醫(yī)學(xué)院和哲里木盟畜牧學(xué)院三校合并成立內(nèi)蒙古民族大學(xué)后，教學(xué)條件得到了顯著改善。2011年，學(xué)校各學(xué)院執(zhí)行新版本科生培養(yǎng)計(jì)劃，蒙醫(yī)藥學(xué)院蒙醫(yī)專業(yè)、醫(yī)學(xué)院臨床和護(hù)理專業(yè)醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)課時(shí)壓縮（僅24學(xué)時(shí)）。

二 優(yōu)化醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)大綱

教學(xué)大綱作為重要的指導(dǎo)性文件，是課程教學(xué)的基本依據(jù)和教學(xué)質(zhì)量的基本保證。大綱中的教學(xué)內(nèi)容與學(xué)時(shí)分配是對(duì)一門課程教學(xué)的基本內(nèi)容所做的基本規(guī)定，是教學(xué)大綱的核心部分。在教學(xué)大綱的制定過程中，我們既要注重醫(yī)學(xué)專業(yè)目標(biāo)培養(yǎng)的需要，還要考慮與其他醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)課程的前后鏈接，對(duì)于已學(xué)課程、將開課程和正在進(jìn)行中的課程的教學(xué)內(nèi)容，要深入了解分析，注意知識(shí)之間的銜接，避免遺漏與重復(fù)，最大程度地保證教學(xué)質(zhì)量的不斷提高。

蒙醫(yī)學(xué)專業(yè)，過去曾開設(shè)“醫(yī)學(xué)生物學(xué)”，該課程中涵蓋了部分細(xì)胞生物學(xué)知識(shí)，后來取消了這門課程，這樣在醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)內(nèi)容安排時(shí)增加了相應(yīng)內(nèi)容，并作深入講解。如在醫(yī)學(xué)生物學(xué)中第二章《細(xì)胞膜及其表面》的教學(xué)內(nèi)容擬定過程中，細(xì)胞膜的化學(xué)組成、細(xì)胞膜的分子結(jié)構(gòu)和細(xì)胞膜的特性三部分內(nèi)容加到醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)中。2011年，執(zhí)行新版教學(xué)計(jì)劃，蒙醫(yī)、臨床醫(yī)學(xué)和護(hù)理學(xué)專業(yè)，學(xué)時(shí)由原來的30減為24學(xué)時(shí)，由于課程壓縮，醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)總課時(shí)數(shù)減少。我們知道每個(gè)專業(yè)培養(yǎng)計(jì)劃中所開設(shè)的每門課程相互之間聯(lián)系密切，醫(yī)學(xué)專業(yè)也不例外。如今醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)面臨著學(xué)時(shí)嚴(yán)重不足的現(xiàn)狀，所以，我們重新審視了這門課的教學(xué)大綱。甄別在醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)大綱中與其他課程重復(fù)的部分予以刪除，盡量使學(xué)生在有限時(shí)間內(nèi)學(xué)習(xí)掌握醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)的精髓內(nèi)容。近幾年，學(xué)校教研室通過類似的教學(xué)改革研究，更加合理地組織醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)內(nèi)容，不但解決了課時(shí)少、內(nèi)容多的矛盾，同時(shí)也使我們的教學(xué)活動(dòng)有的放矢，學(xué)生也學(xué)有所獲。

三 結(jié)合多媒體教學(xué)手段，改進(jìn)教學(xué)方法

當(dāng)今很多課程都使用了多媒體輔助教學(xué)，在醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)當(dāng)中，我們也將比較枯燥的純理論知識(shí)放在圖文聲像并茂的多媒體課件中，將微小的、看不見的細(xì)胞變?yōu)榭梢暤?，并營造了一種科學(xué)性、知識(shí)性、形象性融為一體的富有強(qiáng)烈感染力的教學(xué)情境，確實(shí)激起了醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)生學(xué)習(xí)細(xì)胞生物學(xué)的興趣，調(diào)動(dòng)了學(xué)生多種感官參與到細(xì)胞生物學(xué)的學(xué)習(xí)中，激發(fā)了學(xué)生學(xué)習(xí)細(xì)胞生物學(xué)的積極性。

多媒體課件的另一大特點(diǎn)（優(yōu)點(diǎn)）是極大壓縮了傳統(tǒng)教學(xué)中教師板書及學(xué)生記筆記的時(shí)間。同時(shí)由于屏幕的快速投放，在短時(shí)間內(nèi)播放大量的信息，提高了教學(xué)效率，并且解決了學(xué)時(shí)矛盾。這個(gè)優(yōu)點(diǎn)也在其他很多課程中得到了驗(yàn)證，我們也利用多媒體的這個(gè)優(yōu)點(diǎn)，在教學(xué)中增加了細(xì)胞生物學(xué)的一些新知識(shí)、新進(jìn)展、新技術(shù)，這樣既開闊了學(xué)生視野又?jǐn)U展了知識(shí)面，這在應(yīng)用多媒體手段之前是不可能實(shí)現(xiàn)的。因此，可以制作內(nèi)容豐富的多媒體課件，改進(jìn)教學(xué)手段，提高教學(xué)質(zhì)量。

醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)這門課側(cè)重于從形態(tài)學(xué)的角度研究。在整個(gè)授課過程中，細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能機(jī)制的講授是細(xì)胞生物學(xué)中的重點(diǎn)及難點(diǎn)內(nèi)容。多媒體輔助教學(xué)的第三個(gè)特點(diǎn)是可以進(jìn)行大量相關(guān)圖片的演示。由于該課程的研究對(duì)象是細(xì)胞，一般肉眼是看不見的，更不用提細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。在課堂中無論一個(gè)教師是多么善于語言、肢體表達(dá)或是精致的繪畫，都難以表現(xiàn)或畫出一些抽象的細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖畫，而這些結(jié)構(gòu)知識(shí)內(nèi)容又恰恰是細(xì)胞生物的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

多媒體教學(xué)的第四個(gè)優(yōu)點(diǎn)就是過程再現(xiàn)等操作，不但可以演示細(xì)胞功能機(jī)制，還能重現(xiàn)，即一遍沒理解，能再播放一遍。例如，講授“細(xì)胞質(zhì)膜的物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)”這一知識(shí)要點(diǎn)時(shí)，將細(xì)胞質(zhì)膜上的鈉鉀泵轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞內(nèi)外的鈉離子和鉀離子，可以把這個(gè)過程做成動(dòng)畫，并配以相應(yīng)的講解，使書面理論變成看得見的動(dòng)態(tài)圖像，能幫助學(xué)生更好更快地理解掌握這個(gè)知識(shí)內(nèi)容。

傳統(tǒng)的課堂教學(xué)模式是以老師板書為中心進(jìn)行的教學(xué)活動(dòng)。如今多媒體輔助教學(xué)作為一種新的教學(xué)手段，具有一些傳統(tǒng)手段無可比擬的優(yōu)越性。如圖文并茂的課件帶動(dòng)學(xué)生興趣；有限的課堂時(shí)間匯聚大量知識(shí)；易突破重點(diǎn)并分散難點(diǎn)，而且在眾多其他課程中已得到了充分應(yīng)用與認(rèn)可。眾所周知，醫(yī)學(xué)是一門應(yīng)用科學(xué)，作為21世紀(jì)的醫(yī)學(xué)人才必須具備醫(yī)術(shù)精、能力強(qiáng)等較高的素質(zhì)，而創(chuàng)新能力就是高素質(zhì)的人才所必需的，因此我們?cè)诮虒W(xué)活動(dòng)中就必須更新教育觀念，改進(jìn)教學(xué)方法。

四 建設(shè)具有民族特色的醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教材

1.課程教材建設(shè)目標(biāo)

教學(xué)內(nèi)容的改革是提高課程教學(xué)質(zhì)量的關(guān)鍵，教材建設(shè)是教學(xué)改革與課程建設(shè)的體現(xiàn)。發(fā)揚(yáng)內(nèi)蒙古民族大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)的優(yōu)良傳統(tǒng)，在保持原有體系的基礎(chǔ)上，充分利用校內(nèi)民族特色資源，建設(shè)符合我校醫(yī)學(xué)專業(yè)的課程教材，使學(xué)生既能扎實(shí)掌握細(xì)胞生物學(xué)的基礎(chǔ)知識(shí)和基本理論，又具有較強(qiáng)應(yīng)用知識(shí)的能力和探究創(chuàng)新意識(shí)，為后續(xù)的生物學(xué)課程的學(xué)習(xí)和高素質(zhì)的生物、醫(yī)學(xué)科學(xué)人才的培養(yǎng)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

本課程在老一輩細(xì)胞生物學(xué)家的帶領(lǐng)下，曾編寫了《細(xì)胞與遺傳實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》教科書，在使用過程中，收到了良好的評(píng)價(jià)。目前我校的醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)課程已構(gòu)建了完整的教學(xué)建設(shè)體系，教材建設(shè)提上日程。

2.教材建設(shè)步驟

第一，整理分析已有的醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)教案，積極編寫適合我校不同學(xué)院專業(yè)的新的細(xì)胞生物學(xué)教材和細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。第二，結(jié)合我校的民族特色，如蒙醫(yī)蒙藥研究，增設(shè)民族研究特色內(nèi)容，對(duì)學(xué)生更具針對(duì)性，有的放矢。比如在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中開設(shè)綜合性實(shí)驗(yàn)蒙藥對(duì)肝臟的保護(hù)作用等。第三，聘請(qǐng)校內(nèi)外的知名專家作教材編寫顧問，對(duì)教材編寫進(jìn)行指導(dǎo)，進(jìn)一步提高教材質(zhì)量。加強(qiáng)與國內(nèi)其他先進(jìn)學(xué)校的細(xì)胞生物學(xué)精品課的教師（如北京大學(xué)、清華大學(xué)、內(nèi)蒙古民族大學(xué)、四川大學(xué)、東北師范大學(xué)等知名大學(xué)）的聯(lián)系與交流，學(xué)習(xí)他們的經(jīng)驗(yàn)，進(jìn)一步提高我們教學(xué)的水平。第四，結(jié)合多媒體授課手段，在教材編寫中，注重圖片與文字相結(jié)合，特別是重點(diǎn)難點(diǎn)內(nèi)容，要多插入圖片，便于學(xué)生理解。

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篇10

【關(guān)鍵詞】　細(xì)胞生物學(xué)　實(shí)驗(yàn)教學(xué)　科研素質(zhì)

細(xì)胞生物學(xué)是生命科學(xué)中重要的組成部分，它能夠反映生命科學(xué)的形成進(jìn)程，同時(shí)也體現(xiàn)生命科學(xué)的最新進(jìn)展。該學(xué)科是由實(shí)驗(yàn)研究產(chǎn)生和發(fā)展起來的。因此，細(xì)胞生物學(xué)研究技術(shù)和方法的作用及地位顯得尤為突出，細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課教學(xué)是培養(yǎng)本科生科研素養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)。是研究性學(xué)習(xí)的重要內(nèi)容，也是最必要的形式和過程。

1.開設(shè)實(shí)驗(yàn)課，是生命世紀(jì)所需。細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展經(jīng)歷了經(jīng)典細(xì)胞學(xué)、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞學(xué)及細(xì)胞生理學(xué)、現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)等階段，推動(dòng)學(xué)科理論內(nèi)容的產(chǎn)生、發(fā)展及豐富的動(dòng)力是實(shí)驗(yàn)研究。例如：顯微鏡觀察方法導(dǎo)致了細(xì)胞學(xué)的產(chǎn)生，而電子顯微鏡及其它更精細(xì)觀察顯像技術(shù)的應(yīng)用，可以觀察細(xì)胞內(nèi)部的亞顯微結(jié)構(gòu)、甚至單一生物分子的位置，更加準(zhǔn)確描述細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能。

在大三開設(shè)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課是適時(shí)的。大三本科生經(jīng)過動(dòng)植物學(xué)的學(xué)習(xí)初步了解動(dòng)植物細(xì)胞的一般特性：通過微生物學(xué)的學(xué)習(xí)，則了解微生物在細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)及功能等方面的特殊性；生理學(xué)與生物化學(xué)的學(xué)習(xí)，掌握了細(xì)胞生命活動(dòng)的動(dòng)態(tài)性，并且有了相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)技能。在此基礎(chǔ)上，本科生能夠適應(yīng)較為復(fù)雜的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課的學(xué)習(xí)和操作。

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)直接與當(dāng)今生命科學(xué)的前沿技術(shù)接軌，在高年級(jí)開設(shè)這樣的課程，有助于本科生迅速進(jìn)入畢業(yè)論文研究的狀態(tài)，有助于考研進(jìn)入更深層次的研究工作。

2.選擇實(shí)驗(yàn)課內(nèi)容，注重基本能力和創(chuàng)新能力的培養(yǎng)。參考國內(nèi)主要細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教材，自編實(shí)驗(yàn)教材，編寫過程中，注重介紹與某一個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目相關(guān)的背景知識(shí)和實(shí)驗(yàn)原理。例如：光學(xué)顯微鏡的使用是最基本的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，是從事生物學(xué)教學(xué)和科研必備的基本技能，在實(shí)驗(yàn)教材中，作詳細(xì)介紹，列出不同放大倍數(shù)物鏡的鏡口率、工作距離、景深和視野直徑等參數(shù)，使學(xué)生明確“放大倍數(shù)小的物鏡工作距離大，放大倍數(shù)大的物鏡工作距離小，物鏡是顯微鏡中關(guān)鍵部件”等基本規(guī)律，有助于使用和選擇顯微鏡。

設(shè)計(jì)了染色體制備和分帶的內(nèi)容，可以允許每個(gè)人動(dòng)手操作，完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)程序，得到預(yù)處理、樣品制備、離心、顯微鏡使用等綜合技術(shù)的訓(xùn)練。事實(shí)反映出操作認(rèn)真、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐瑢W(xué)能獲得較理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

選編了細(xì)胞培養(yǎng)、熒光顯微鏡技術(shù)等較高要求的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，并附編了相應(yīng)的前沿技術(shù)，如激光共聚焦顯微鏡原理。這些都是從事細(xì)胞生物學(xué)科研工作所需的研究技術(shù)，該類實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的開設(shè)，使學(xué)生初步了解細(xì)胞生物學(xué)研究的基本技術(shù)路線和實(shí)驗(yàn)方法，使學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)課的認(rèn)識(shí)從完成操作、獲得學(xué)分過渡到科研綜合性、探索性，乃至創(chuàng)新性的高度。

詳盡描述實(shí)驗(yàn)操作步驟，特別是不可忽視的、影響實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵細(xì)節(jié)，以及實(shí)驗(yàn)試劑、藥品的配制和儀器實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)等內(nèi)容。注意操作過程與實(shí)驗(yàn)原理的結(jié)合，增加圖解。例如小鼠骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本制備和C帶分析實(shí)驗(yàn)，操作步驟多，影響因素多，相對(duì)成功率較低，學(xué)生興趣濃。操作程序的清晰、嚴(yán)格要求是完成實(shí)驗(yàn)的重要保障。

設(shè)計(jì)具有啟發(fā)性的創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)后思考題，以激發(fā)學(xué)生利用所學(xué)理論知識(shí)和實(shí)際動(dòng)手經(jīng)驗(yàn)，熟悉怎樣設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、組建哪些實(shí)驗(yàn)技術(shù)達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒛男┎襟E是控制實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵及其影響因素，甚至可提出修改的方案。

3.注重課前準(zhǔn)備，確保實(shí)驗(yàn)質(zhì)量。教師持之以恒動(dòng)手從事科研實(shí)驗(yàn)工作，掌握或了解本學(xué)科研究技術(shù)的過去、現(xiàn)在及將來。堅(jiān)持與實(shí)驗(yàn)員設(shè)計(jì)、商討、準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)，要有預(yù)瞻性，掌握實(shí)驗(yàn)中可能出現(xiàn)的問題，以便在課堂及時(shí)準(zhǔn)確回答學(xué)生問題。

作為實(shí)驗(yàn)教學(xué)的主體，學(xué)生的臨陣狀態(tài)也很重要。不少學(xué)生習(xí)慣于課前不預(yù)習(xí)，課堂上一邊對(duì)照實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，一邊操作，經(jīng)常導(dǎo)致操作混亂、時(shí)間延長甚至實(shí)驗(yàn)失敗。目前，此類現(xiàn)象仍然較普遍，教師需注意檢查督促，進(jìn)行關(guān)鍵性問題提問、請(qǐng)個(gè)別學(xué)生上臺(tái)操作示范，教師再對(duì)其中的注意事項(xiàng)、操作錯(cuò)誤重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)。另外，可將預(yù)習(xí)作為實(shí)驗(yàn)成績的一部分，學(xué)生有備而來，提高實(shí)驗(yàn)質(zhì)量。

4.細(xì)致指導(dǎo)，重視基本技能訓(xùn)練。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)包括形態(tài)、結(jié)構(gòu)觀察性實(shí)驗(yàn)，也包括操作復(fù)雜、技術(shù)綜合的實(shí)驗(yàn)，要求學(xué)生牢固地掌握基本實(shí)驗(yàn)技能，如顯微鏡及特殊顯微鏡的熟練操作，微觀世界的確認(rèn)，臨時(shí)與永久玻片制作，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物解剖，生物繪圖方法，離心機(jī)的使用，細(xì)胞生物學(xué)染色體方法，細(xì)胞培養(yǎng)過程的無菌要求，這些基本技能都是每個(gè)學(xué)生必需的。教師必修逐個(gè)指導(dǎo)、示范和糾正，培養(yǎng)學(xué)生正確的規(guī)范的操作習(xí)慣。嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度、創(chuàng)新的精神和嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣，是科研最基本的素養(yǎng)，而本科細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是訓(xùn)練的最好平臺(tái)。

5.誘導(dǎo)啟發(fā)，培養(yǎng)創(chuàng)造性思維。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目廣泛，材料具有多樣性和普遍性，教師給學(xué)生安排的實(shí)驗(yàn)是挑選了典型的材料和經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)方法。教師應(yīng)鼓勵(lì)學(xué)生在完成實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)指定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，提出衍生性的實(shí)驗(yàn)題目，讓學(xué)生書面自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)(包括實(shí)驗(yàn)材料、方法、目的)，有條件情況下，少部分同學(xué)進(jìn)行創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)。強(qiáng)調(diào)科研協(xié)作的重要性，鼓勵(lì)同學(xué)之間互相學(xué)習(xí)，有利于同學(xué)們開闊視野、培養(yǎng)敏捷的思維，激發(fā)對(duì)科學(xué)的求知欲和對(duì)本課程的興趣。