導(dǎo)語：如何才能寫好一篇細(xì)胞的生物學(xué)特性，這就需要搜集整理更多的資料和文獻(xiàn)，歡迎閱讀由公務(wù)員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

Biological characteristics of placentaderived adherent cells

【Abstract】 AIM: To isolate and culture human placentaderived adherent cells (hPDAC) in vitro and study their biological characteristics involving morphology， phenotype and differentiation. METHODS: Mononuclear cells were harvested after placenta tissue was digested by collagenase IV， seeded and cultured in lowglucose DMEM containing 100 mL/L FBS. Their surface markers were detected by flow cytometry; the growth curve was made; cells of 3 passages were induced to differentiate into osteoblasts with vitamin C， dexamethasone and sodium βglycerophosphate， and the induced cells were observed in the change of matrix mineralization with alizarin red staining; cells of 3 passages were induced to differentiate into lipocytes with dexamethasone and insulin， and the induced cells were observed with oil red O staining. RESULTS: By day 7-14， a few of adherent cells were observed and expanded the same as fibroblasts， and adherent cells were positive for CD29， CD44 and CD105， but negative for CD34， CD45， CD19. After 10day induction， alizarin red staining showed the calcium mineralization and after 7 d， oil red O staining revealed the appearance of fat drops. CONCLUSION: The hPDAC was confirmed to have the osteogenic and adipogenic potentials， indicating that they could be regarded as an alternative source of stem cells.

【Keywords】 placenta; adherent cells; stem cells

【摘要】 目的： 通過體外分離和培養(yǎng)胎盤貼壁細(xì)胞，以研究其形態(tài)、表型和分化特點. 方法： 采用IV型膠原酶消化人胎盤組織，獲得單個核細(xì)胞，接種于100 mL/L FBS 低糖DMEM培養(yǎng)基中，貼壁后常規(guī)換液、傳代，流式細(xì)胞儀檢測其表面標(biāo)志，繪制生長曲線. 采用β甘油磷酸鈉、維生素C、地塞米松聯(lián)合誘導(dǎo)，使胎盤貼壁細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，誘導(dǎo)后10 d行茜素紅染色；采用地塞米松、胰島素誘導(dǎo)，使胎盤貼壁細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞，油紅O染色鑒定. 結(jié)果： 培養(yǎng)7~14 d后有少量貼壁細(xì)胞生長，逐漸呈成纖維細(xì)胞狀，表達(dá)CD29，CD44和CD105，不表達(dá)CD34，CD45，CD19；在成骨誘導(dǎo)10 d后細(xì)胞茜素紅染色可見鈣鹽沉積，成脂肪誘導(dǎo)7 d后油紅O染色見脂肪滴形成. 結(jié)論： 通過不同方式誘導(dǎo)培養(yǎng)，胎盤貼壁細(xì)胞可分化為成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞，提示胎盤貼壁細(xì)胞可能是新的干細(xì)胞來源.

【關(guān)鍵詞】 胎盤；貼壁細(xì)胞；干細(xì)胞

0引言

間充質(zhì)干細(xì)胞（marrow stromal cell， MSC）主要來源于骨髓，可以分化為多種組織細(xì)胞：成骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)細(xì)胞等，但隨著年齡增長或合并感染、腫瘤等疾病時骨髓干細(xì)胞的分化能力明顯下降，因此尋找新的干細(xì)胞成為當(dāng)務(wù)之急. 近幾年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)胎盤組織中存在MSC. 為進(jìn)一步證實這一發(fā)現(xiàn)，我們從胎盤中提取貼壁細(xì)胞，觀察其生物學(xué)特性，以探討其是否具有干細(xì)胞特性.

1材料和方法

1.1材料足月剖宮產(chǎn)的胎盤（產(chǎn)婦同意），低糖DMEM（Gibco公司），新生牛血清（FBS，Gibco公司），IV型膠原酶（Sigma公司），胰蛋白酶（Sigma公司），鼠抗人單克隆抗體CD19，CD44，CD45，CD105，CD34，CD29（晶美公司），茜素紅（Sigma），油紅O（Sigma），倒置顯微鏡（Olympas），CO2培養(yǎng)箱（Jouan）.

1.2方法

1.2.1胎盤貼壁細(xì)胞的分離和培養(yǎng)取足月剖宮產(chǎn)胎盤，剪取胎兒側(cè)胎盤組織，PBS反復(fù)沖洗，剪成碎塊，以1 g/L IV型膠原酶37℃消化30 min，取上清液，以800 r/min離心5 min，沉淀物重復(fù)消化，收集每次離心后的細(xì)胞沉淀，PBS沖洗2遍，以1×107/L的密度接種于100 mL/L FBS DMEM培養(yǎng)基中，貼壁后3~5 d換液1次，取傳3代以上細(xì)胞備用.

1.2.2胎盤貼壁細(xì)胞的表型測定取第3代細(xì)胞，以2.5 g/L胰蛋白酶消化3 min，100 mL/L FBS終止消化，PBS沖洗2遍，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×104/μL，分別加入鼠抗人單克隆抗體CD19， CD44， CD45， CD105， CD34，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型.

1.2.3生長曲線的繪制取第3代細(xì)胞，以2×107/L的密度接種于12孔板中，每日取3復(fù)孔，臺盼藍(lán)染色計數(shù)活細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)計數(shù)7 d，計算平均值，繪制生長曲線.

1.2.4細(xì)胞周期測定取第3代細(xì)胞，以2.5 g/L胰蛋白酶消化3 min，10 mol/L FBS終止消化，PBS沖洗2遍，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/L，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期.

1.2.5細(xì)胞誘導(dǎo)分化及染色取第3代胎盤細(xì)胞，以2.5 g/L胰蛋白酶消化3 min， 10 mol/L FBS終止消化，800 r/min離心5 min，PBS沖洗3遍，分為4組分別以1×105/L細(xì)胞數(shù)接種于6孔板中，1組加入成骨誘導(dǎo)劑（20 mmol/L β甘油磷酸鈉、50 mg/L維生素C，10 mmol/L地塞米松，100 mL/L新生牛血清DMEM培養(yǎng)基），2組加入脂肪誘導(dǎo)劑（10 mmol/L地塞米松、10 mg/L胰島素、100 mL/L新生牛血清DMEM培養(yǎng)基），3，4組為對照組，采用100 mL/L新生牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置37℃，50 mL/L CO2孵箱培養(yǎng)，每3~5日換液1次. 取培養(yǎng)10 d后的1，3組細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)液，多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗3遍，茜素紅染色8 h，顯微鏡下觀察陽性結(jié)果. 取培養(yǎng)7 d后的2，4組細(xì)胞，多聚甲醛固定后油紅O染色.

2結(jié)果

2.1胎盤細(xì)胞的原代培養(yǎng)消化胎盤組織獲得少量的單個核細(xì)胞，約7~14 d后貼壁，從不規(guī)則形，逐漸變?yōu)樗笮危输鰷u狀生長，約4 wk后長滿瓶底，胞體呈細(xì)長，形態(tài)類似成纖維細(xì)胞（圖2），1 wk左右傳代1次，可穩(wěn)定傳至10代. 流式細(xì)胞儀檢測顯示低表達(dá)CD29，高表達(dá)CD44和CD105，不表達(dá)CD34，CD45和CD19. 細(xì)胞的對數(shù)生長期約在第2~4日，其倍增時間為39 h（圖1）. 流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)G0/G1，S，G2/M期的比例分別為20.15%， 72.54%和6.89%.

圖1胎盤貼壁細(xì)胞生長曲線（略）

2.2胎盤細(xì)胞的誘導(dǎo)分化成骨誘導(dǎo)組細(xì)胞在誘導(dǎo)10 d時可見細(xì)胞呈漩渦狀重疊生長，并聚集成團(tuán)，茜素紅染色可見多個散在分布大小、形態(tài)各異的不透明棕紅色鈣化結(jié)節(jié). 對照組少見鈣化結(jié)節(jié)（圖3）. 成脂肪誘導(dǎo)組細(xì)胞在誘導(dǎo)7 d時油紅O染色可見細(xì)胞中出現(xiàn)多個染色深紅的脂肪滴，而對照組中則偶見脂肪滴（圖4）.

A： 培養(yǎng)10 d；B： 培養(yǎng)28 d.

圖2胎盤原代細(xì)胞×100（略）

A：誘導(dǎo)組; B：對照組.

圖3成骨細(xì)胞茜素紅染色 ×100（略）

A：誘導(dǎo)組；B：對照組.

圖4成脂細(xì)胞油紅O染色 ×100（略）

3討論

早在2000年即有學(xué)者從凍存的胎盤組織中分離培養(yǎng)出貼壁細(xì)胞［1］，但胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的研究尚處于起步階段. 我們從形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)及分化能力等方面加以研究進(jìn)一步證實胎盤貼壁細(xì)胞的生物學(xué)特性. 一般認(rèn)為大多數(shù)MSC培養(yǎng)時貼壁，呈成纖維細(xì)胞狀，因而采用貼壁法獲得MSC的研究較多［2］. 胎盤是實體組織，富含血管和間充質(zhì)成分，我們采用酶消化法，獲取細(xì)胞沉淀進(jìn)行培養(yǎng)，與骨髓貼壁細(xì)胞相比較，其貼壁時間較長（1~2 wk），骨髓為72 h［3］，并且胎盤貼壁細(xì)胞需28 d左右才能鋪滿瓶底. 骨髓貼壁細(xì)胞大多最初為梭形，7 d左右形成小集落，其后迅速生長，變?yōu)榫坏拈L梭形［3］，與胎盤貼壁細(xì)胞相似. 另外我們的實驗檢測到的胎盤貼壁細(xì)胞的倍增時間為39 h，文獻(xiàn)中為37 h［4］；我們檢測細(xì)胞周期顯示細(xì)胞大部分處于分裂期，而以往的報道發(fā)現(xiàn)細(xì)胞大部分處于靜息期［4］，因而胎盤貼壁細(xì)胞的特性尚需進(jìn)一步研究.

目前對于胎盤貼壁細(xì)胞的免疫學(xué)特點尚無統(tǒng)一的認(rèn)識，我們的研究發(fā)現(xiàn)胎盤貼壁細(xì)胞的表型與骨髓MSC相似［5-6］，表達(dá)CD29， CD44和CD105，不表達(dá)CD34， CD45， CD19， CD44， CD29均為黏附分子，是纖連蛋白和透明質(zhì)酸鹽的受體，在基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)較多，這樣的結(jié)果使我們推測培養(yǎng)的胎盤貼壁細(xì)胞中可能包含大量的能表達(dá)基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志的細(xì)胞，即MSC，但僅憑細(xì)胞形態(tài)和少量的表面標(biāo)志尚不能完全說明貼壁細(xì)胞即為MSC，MSC的最重要特性應(yīng)該是多向分化潛能.

如果胎盤貼壁細(xì)胞中含有MSC，理論上講MSC來源于中胚層，具有向中胚層組織及神經(jīng)外胚層組織分化的能力［7-8］. 我們的實驗證明β甘油磷酸鈉和低濃度的地塞米松聯(lián)合誘導(dǎo)后細(xì)胞中鈣鹽沉積，茜素紅染色顯示產(chǎn)生大量鈣化結(jié)節(jié)，說明其有成骨能力，只有干細(xì)胞才具有這種能力. 在誘導(dǎo)體系中維生素C可以促進(jìn)體外培養(yǎng)細(xì)胞合成膠原，形成鈣化，能調(diào)節(jié)ATP及ALP活性，并影響其合成，β甘油磷酸鈉可以提供磷離子作為ALP的底物，地塞米松可以增強(qiáng)ALP活性. 而ALP可以破壞鈣化抑制劑，啟動鈣化［8］形成鈣鹽，茜素紅特異性結(jié)合鈣劑，陽性表現(xiàn)為棕紅色，鈣的含量愈高染色愈深，是鑒定成骨細(xì)胞特性的特異性指標(biāo).

我們的實驗由于條件限制，只是初步觀察胎盤貼壁細(xì)胞的特點，證明其具有干細(xì)胞特性，但尚有許多問題如培養(yǎng)的條件、促進(jìn)生長的因子、傳代后是否逐漸衰老、誘導(dǎo)后移植的效果等等，需更深入的研究. 我們的研究提示胎盤貼壁細(xì)胞的分離培養(yǎng)具有潛在的臨床應(yīng)用價值.

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篇2

[關(guān)鍵詞] CIK細(xì)胞;擴(kuò)增;殺傷活性

[中圖分類號] R392.12 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號]1673-7210（2007）12（c）-019-03

The study of the expansion in vitro and its biological characteristics of cytokine-induced killer cells

WANG Jia-lie, MA Guo-qiang, BAO Li-qing, LIU Yan-ru

(Study Center of Respiratory Disease, Inner Mongolia Hospital, Huhhot010017,China)

[Abstract] Objective: To observe the proliferation ability in vitro and its biological characteristics of cytokine-induced killer cells. Methods: PBMCs were isolated with successive non-adhere method fromvenous blood ,then were induced to be cytokine-induced killer cells by ficoll density gradient centrifugation in the presence of IFN-γ，IL-1β，IL-2 and anti-CD3 antibody. LAK (lymphokine activated killer) cells were prepared as control. The proliferation ability of CIK cells was measured by calculation , the phenotype of CIK cells was analyzed by flow cytometry（FCM）and the killing tumor cell activity of CIK cells was tested with MTT method. Results: After 16 days of induction the proliferation rate of CIK cells reached a high peak, possessing strong proliferate ability with over 100 times expansion after 21 days culture; In comparison with LAK, CIK cells had no difference in early stage, but onday 18,21 the multiplicationability of CIK cells was higher than that of LAK cells markedly (P

[Key words] Cytokine-induced killer cells; Multiplication ability; Killing ability

細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-induced killer，CIK)是將人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)在體外經(jīng)過多種細(xì)胞因子作用后培養(yǎng)獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞。它同時表達(dá)CD3和CD56兩種膜蛋白分子[1，2]，兼具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和NK細(xì)胞的非MHC限制性殺瘤特點，被認(rèn)為是增殖速度最快，殺瘤活性最強(qiáng)，殺瘤譜最廣的效應(yīng)細(xì)胞。過繼性免疫治療是治療惡性腫瘤的一個重要輔助治療方法，用于過繼性免疫治療的免疫活性細(xì)胞必須具有較強(qiáng)的擴(kuò)增力和殺傷性。本實驗通過對CIK細(xì)胞的體外培養(yǎng)及其生物學(xué)特性的研究，以尋求用于過繼免疫治療的高效免疫活性細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1實驗材料

人外周血樣品取自中心血站12例健康成人自愿者的靜脈血50 ml。男6名，女6名，年齡20～50歲。人肺腺癌細(xì)胞株A-549購自南京凱基生物科技發(fā)展公司。

1.2主要試劑和儀器

RPMI1640培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)；特級無支原體無熱源胎牛血清(美國TBD公司)；人淋巴細(xì)胞分離液(密度：1.077 g/cm3 ，TBD生物技術(shù)發(fā)展中心，天津)；二巰基乙醇(美國TBD公司)；臺盼藍(lán)（美國Sigma公司）；二甲亞砜（美國Sigma公司）；青霉素，鏈霉素（華北制藥有限公司）；胰蛋白酶（南京凱基生物科技發(fā)展公司）；乙醇、谷氨酰胺、PBS、EDTA等購自北京化學(xué)試劑公司；MTT試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展公司）；重組人白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)和干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)(PEPROTECH公司)、CD3mAb（美國Stem Cell Technologies公司）；CD3-FITC（異硫氰酸熒光素）、CD4-PE（藻紅阮熒光素）、CD8-PE、CD3-FITC、CD56-PE和鼠抗人IgG熒光抗體（美國eBioscienc公司）；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；550酶標(biāo)儀（美國Biorad公司）。

1.3實驗方法

1.3.1 PBMC的分離(密度梯度離心法)及LAK、CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)將人外周抗凝血用淋巴細(xì)胞分離，吸取白膜層細(xì)胞即PBMC，PBS洗滌3遍，加入含10%無熱源胎牛血清RPMI1640（1 mmol/L丙酮酸鈉、2 mmol/L谷氨酞胺、10 mmol/L Hepes、89 mmol/L NaHC03、50 μmol/L巰基乙醇、0.1 mg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素培養(yǎng)基），調(diào)整細(xì)胞濃度，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，1.0×107個/（10 ml?瓶)，置于37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)靜置2 h，可見分為黏附于瓶壁的細(xì)胞和非黏附細(xì)胞。取非黏附細(xì)胞分成2組。LAK組:加入500 U/ml IL-2，每3天換液1次并補(bǔ)加500 U/ml IL-2。CIK組:第1天加入IFN-γ 1 000 U/ml、IL-1β10 U/ml，24 h后加入IL-2 100 U/ml、CD3mAb 50 ng/ml，此后每隔3 d換液1次，并補(bǔ)加IL-2及CD3mAb。

1.3.2LAK、CIK細(xì)胞表型的檢測在培養(yǎng)1，4，7，10，13，16，19，22 d取培養(yǎng)的細(xì)胞，用PBS洗滌兩遍，調(diào)整細(xì)胞濃度為5.0×106個/ml，取100 μl懸液加入流式專用試管中，加入FITC、PE標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體CD3-FITC、CD4-PE、CD8-FITC、CD3-FITC、CD56-PE，對照為IgG1-FITC、IgG12PE，25℃下避光孵育0.5 h，用PBS液洗滌3遍，洗去多余的抗體。并用同型無關(guān)陰性抗體做對照，在流式細(xì)胞儀（美國BD公司）上檢測分析，至少分析1.0×105個細(xì)胞。

1.3.3 LAK、CIK細(xì)胞殺傷活性的檢測取對數(shù)生長期的肺癌細(xì)胞A-549作為靶細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋成1.0×105個/（100 μl?孔），接種細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板中，然后取出培養(yǎng)兩組效應(yīng)細(xì)胞，把效應(yīng)細(xì)胞加入靶細(xì)胞孔中混合，另設(shè)單獨靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞組，每組設(shè)3個復(fù)孔，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入MTT(5 mg/ml)測儀于570 nm處測OD值，按下面公式計算各組LAK的殺傷活性。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件包處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多個均數(shù)間使用單因素方差分析，兩樣本均數(shù)的比較用t檢驗，P

2 結(jié)果

2.1 CIK細(xì)胞的增殖情況

實驗表明PBMC在細(xì)胞因子作用下均能增殖，鏡下可見細(xì)胞飽滿透亮、聚集成團(tuán)，呈集落樣生長。與LAK比較，在前期無明顯差異，至19、22 d時擴(kuò)增能力顯著高于LAK細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)(P

表1不同培養(yǎng)天數(shù)LAK、CIK細(xì)胞的增殖情況(x±s，倍)

2.2 CIK細(xì)胞的表型分析

用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表型，結(jié)果顯示CIK細(xì)胞培養(yǎng)后，其主要效應(yīng)細(xì)胞CD3+CD56+ 細(xì)胞較培養(yǎng)前顯著增加(P

與培養(yǎng)前比較，*P

2.3 CIK細(xì)胞的殺瘤活性

CIK細(xì)胞在培養(yǎng)至第13天即有較高的殺瘤活性，為61.17%，顯著高于LAK細(xì)胞的41.02%(P

與單純的LAK對照組比較，*P

3 討論

近年來惡性腫瘤的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，隨著細(xì)胞免疫學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞免疫治療成為除化療、放療之外的又一重要輔助治療手段，副作用輕微，安全性較好[3]。過繼免疫治療(ALT)是惡性腫瘤生物治療的一個重要手段，是通過直接向腫瘤患者輸注具有抗腫瘤活性的免疫活性細(xì)胞，在體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤作用，以此來達(dá)到治療腫瘤的目的。淋巴因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（lymphokine activated killer，LAK）是由IL-2激活的殺傷細(xì)胞，具有廣譜殺傷腫瘤的細(xì)胞活性，其較早用于臨床腫瘤免疫治療并取得了一定療效。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine induced killer，CIK)是一種非MHC限制性的高效溶解腫瘤的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，其主要效應(yīng)細(xì)胞表面既有T細(xì)胞表面標(biāo)志CD3，也有NK細(xì)胞表面標(biāo)志CD56[4，5]，因而兼有T淋巴細(xì)胞抗瘤活性和NK細(xì)胞非MHC限制性殺瘤的特點。CIK 細(xì)胞是一類非主要組織相容性復(fù)合物(MHC)和非T細(xì)胞受體(TCR)限制性的免疫活性細(xì)胞，在培養(yǎng)過程中，一些非活性細(xì)胞在多種細(xì)胞因子的共同刺激下，激活為有細(xì)胞毒作用的CIK 細(xì)胞。這些活性細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制很可能是通過黏附分子LFA-1/I、CAM-1相互結(jié)合后，能夠分泌大量的BLT 酯酶的細(xì)胞質(zhì)顆粒，這些顆粒能夠直接穿透封閉的靶細(xì)胞膜進(jìn)行胞吐，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的裂解[6]；同時，CIK細(xì)胞自身還能分泌IL-2、IL-6、TNF-α和GM-CSF等一些細(xì)胞因子，提高細(xì)胞毒作用。是目前最新、殺傷腫瘤效果最佳的生物免疫治療方法。Lanier于1986年首次發(fā)現(xiàn)這種異質(zhì)細(xì)胞群(主要是CD3+CD56+細(xì)胞)，其在外周血淋巴細(xì)胞中的比例為1%～5%[7]。經(jīng)過多年的實踐，科學(xué)家們找到了體外大量擴(kuò)增CIK細(xì)胞的方法，即應(yīng)用細(xì)胞因子IL-1β，IL-2，IFN- γ和CD3單抗共同培養(yǎng)產(chǎn)生CIK。我們在實驗中采取此方法，在分離外周血單個核細(xì)胞中先加IFN-γ，24 h后加入抗CD3單抗、IL-1β與IL-2，培養(yǎng)22 d，每3天換液和補(bǔ)加細(xì)胞因子，培養(yǎng)13 d時即有25%左右的細(xì)胞是CD3+CD56+細(xì)胞，具有典型的CIK細(xì)胞形態(tài)和生物學(xué)性狀。CIK具增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣、毒副作用小等優(yōu)點，目前自體及異體外周血CIK細(xì)胞已被用于一些實體瘤和惡性血液病的治療，并取得了較好的療效。我們的實驗結(jié)果表明，與LAK 細(xì)胞相比，CIK細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力，培養(yǎng)至22 d時體系中總的細(xì)胞數(shù)可增加100多倍。用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表型， 結(jié)果顯示CIK細(xì)胞培養(yǎng)后， 其主要效應(yīng)細(xì)胞CD3+CD56+ 細(xì)胞較培養(yǎng)前顯著增加(P

綜上所述，本研究采用IFN-γ、抗CD3單抗、IL-1β和IL-2等多種細(xì)胞因子成功從健康人非貼壁PBMCs中誘導(dǎo)出大量的具有典型形態(tài)和免疫表型的CIK細(xì)胞，且具有較高的殺傷活性，為下一步臨床治療腫瘤奠定了基礎(chǔ)。

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篇3

【關(guān)鍵詞】干細(xì)胞； NF-κB抑制因子α；細(xì)胞增殖；細(xì)胞分化；細(xì)胞因子

Effect of mutated IκBα gene on the biological characteristics of immortalized neural progenitor cell strain

ZHU Chang， LIU Zhi-heng， ZHANG Chuan-han， et al. Department of Anesthesiology，Tongji Hospital of Tongji Medical College， Huazhong University of Science & Technology， Wuhan 430030， China

【Abstract】 Objective To observe the effect of mutated IκBα gene on the proliferation，differentiation and cytokine secretion of immortalized neural progenitor cell strain(INPCs). Methods After the establishment of mutated IκBα gene transfected INPCs and blank plasmid transfected INPCs， MTT staining and flow cytometry were used to draw the growth curve and measure the cell proliferation index. Western blot was carried out to observe the differentiation of the two cell strains after 5% blood serum induced differentiation. The expression of TNF-α、IL-1β and IL-6 was measured by realtime RT-PCR. Results It was established by growth curve and cell proliferation index that the proliferation was slowed down in mutated IκBα gene transfected INPCs compared with blank plasmid transfected INPCs. After blood serum induced differentiation，glial fibrillary acidic protein was highly expressed in the two cell strains. There was no difference in the expression of TNF-α between mutated IκBα gene transfected INPCs and blank plasmid transfected INPCs. The expression of IL-1β and IL-6 was reduced in mutated IκBα gene transfected INPCs. Conclusion Mutated IκBα gene can slow down the proliferation of INPCs， reduce the expression of some cytokines， but didn’t influence the differentiation of INPCs.

【Key words】Stem cells；NF-kappaB inhibitor alpha；Cell proliferation ；Cell differentiation； Cytokines

本實驗室成功構(gòu)建了SV40Tag永生化的大鼠神經(jīng)前體細(xì)胞株（INPCs）[1]，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了轉(zhuǎn)IκBα突變型基因永生化神經(jīng)前體細(xì)胞株。作為細(xì)胞移植治療的細(xì)胞來源和外源基因的載體，INPCs的生物學(xué)特性在轉(zhuǎn)入外源基因后有何改變，是進(jìn)一步研究首先應(yīng)關(guān)注的問題。本研究擬通過比較轉(zhuǎn)IκBα突變型基因及空白對照載體的INPCs在增殖、分化以及細(xì)胞因子分泌功能上的差異，為進(jìn)一步將該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞用于細(xì)胞移植治療腦缺血等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

材料 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs由本實驗室構(gòu)建，DMEM/F12培養(yǎng)基、B27無血清培養(yǎng)添加劑（Gibco公司，美國）；堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)（Pepro Tech公司，英國）； MTT、碘化丙啶（PI）（Sigma公司，美國）；抗β-actin抗體、抗膠原纖維酸性蛋白（GFAP）抗體、抗微管相關(guān)蛋白2（MAP2）抗體（Neomarkers公司，美國）； Trizol試劑（上海華舜公司），SYBR ExScriptTM RT-PCR Kit (Takara，日本)。

細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1或pcDNA3.1/IκBαM的INPCs在含2%B27、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、0.3μg/ml嘌呤霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，0.25％胰酶消化傳代。

細(xì)胞生長曲線的繪制 將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs以每孔5×103的密度接種于96孔板，共種8板，每板每株細(xì)胞接種12孔，每24h取出一板，每孔加入0.2％MTT 50μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸去上清液，每孔加入DMSO 150μl，震蕩10 min，在酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司，美國）上測定570nm吸光度值，并繪制生長曲線。

細(xì)胞增殖指數(shù)的測定 將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs分別制成單細(xì)胞懸液，PBS 洗一次后，加入-20 ℃預(yù)冷的80 %乙醇固定， 冰浴30min，固定后的細(xì)胞用PBS 洗滌2 次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×106 / ml，加入PI (終濃度為50μg/mL)和RNA酶（終濃度為1μg/ml）， 室溫避光孵育1h后上機(jī)檢測，細(xì)胞增殖指數(shù)= ( S + G2 /M) / ( G0 /G1 + S +G2 /M) ×100%。

Western blot檢測細(xì)胞分化 分別提取轉(zhuǎn)pcDNA3.1 INPCs及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IκBαM INPCs的細(xì)胞總蛋白，兩株細(xì)胞以5％血清誘導(dǎo)分化一周后分別提取總蛋白，以β-actin為內(nèi)參照，取等量的蛋白質(zhì)經(jīng)10%聚丙稀酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上， 用5%脫脂奶粉封閉1h，加10μg/ml抗GFAP單抗、抗MAP2單抗或抗β-actin單抗，室溫孵育1h，漂洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，漂洗后二氨基聯(lián)苯胺顯色2～3 min，水洗后照相。

Realtime RT-PCR 檢測細(xì)胞因子的表達(dá) 用Trizol試劑提取轉(zhuǎn)pcDNA3.1 INPCs及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IκBαM INPCs的總mRNA，8453E型紫外分光光度儀（Agilent公司，美國）測定RNA濃度，參照SYBR ExScriptTM RT-PCR試劑盒說明操作，用等量的總mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板在LightCycler real-time PCR儀（羅氏公司，美國）上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性10 s，94℃變性5 s，60℃退火及延伸20s，共反應(yīng)40個循環(huán)后，分析融解曲線，參照Livak等人的方法，以2－σσCT法分析細(xì)胞因子的的相對表達(dá)量[2]，引物列表見表1。

統(tǒng)計學(xué)處理　采用SPSS 12. 0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ ±s）表示，不同細(xì)胞株間比較采用成組t檢驗，P < 0. 05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

生長曲線的繪制 采用MTT法繪制的轉(zhuǎn)pcDNA3.1INPCs及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IκBαM INPCs的生長曲線，見圖1。除接種后第一天外，各時點轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IκBαM INPCs加入MTT后，其570nm吸光度值均較相同時點轉(zhuǎn)pcDNA3.1 INPCs低，同時點兩株細(xì)胞間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖指數(shù) 轉(zhuǎn)pcDNA3.1INPCs 及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IκBαM INPCs的細(xì)胞增殖指數(shù)依次為61.64％±4.25％和46.19％±0.86％，兩者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

Western blot檢測細(xì)胞分化 血清誘導(dǎo)分化后，兩株細(xì)胞MAP2的蛋白條帶極其微弱，GFAP條帶明顯，誘導(dǎo)分化前，轉(zhuǎn)pcDNA3.1INPCs 及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IκBαM INPCs均有明顯的MAP2條帶，而無明顯的GFAP條帶，兩株細(xì)胞間比較，MAP2和GFAP條帶的明暗程度在分化前及分化后無明顯差異。（見圖2）

細(xì)胞因子的表達(dá) 用Realtime RT-PCR的方法檢測轉(zhuǎn)pcDNA3.1 INPCs及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IκBαM INPCs細(xì)胞因子mRNA的相對表達(dá)量，如表2所示。將轉(zhuǎn)pcDNA3.1INPCs相應(yīng)細(xì)胞因子的表達(dá)量定義為1，兩株細(xì)胞TNF-α的mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IκBαM INPCs中IL-6 及IL-1β mRNA的表達(dá)較轉(zhuǎn)pcDNA3.1的INPCs低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

討 論

神經(jīng)前體細(xì)胞具有不斷分裂增殖、自我更新以及多分化潛能[3]。轉(zhuǎn)pcDNA3.1INPCs 及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IκBαM INPCs的培養(yǎng)和傳代證實，轉(zhuǎn)入IκBα突變型基因后，INPCs仍能不斷分裂增殖，保持了自我更新的特性。而western blot通過半定量的方式證實，轉(zhuǎn)入的外源基因并未影響INPCs的分化特性，即血清誘導(dǎo)分化后大部分細(xì)胞表達(dá)作為星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志的GFAP，分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞，僅有少量細(xì)胞表達(dá)作為神經(jīng)元標(biāo)志的MAP2，分化為神經(jīng)元。增殖和分化潛能的保持即證實了轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IκBαM INPCs保持了神經(jīng)前體細(xì)胞的特性，同時也是該細(xì)胞株用于細(xì)胞移植治療的基本保證。

篇4

【摘要】 目的 觀察RNA 干擾技術(shù)沉默Annexin1基因表達(dá)對膀胱癌T24細(xì)胞增殖能力的影響。方法 針對Annexin1基因不同部位設(shè)計并化學(xué)合成3對不同的靶向小干擾RNA(siRNA)，脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時轉(zhuǎn)染膀胱癌T24細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后應(yīng)用半定量RTPCR和Western印跡法檢測Annexin1 mRNA和蛋白的改變，透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡情況，用MTT法檢測沉默Annexin1表達(dá)對膀胱癌T24細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果 轉(zhuǎn)染siRNA后膀胱癌T24細(xì)胞Annexin1 mRNA和蛋白水平顯著下降(P

【關(guān)鍵詞】 膀胱癌;Annexin1;siRNA

【Abstract】 Objective To explore the effects of Annexin1 gene silencing by small interfering RNA(siRNA) on bladder cancer cells T24 in vitro. Methods Three siRNA targeting three different domains of Annexin1 gene were designed， synthesized， and transfected into bladder cancer T24 cells by lipofectamineTM2000. After transfection， expression of Annexin1 was detected by RTPCR and Western blotting. Transmission electronic microscope(TEM) was applied to observe the apoptosis cellular morphology. The cellular proliferation inhibitory ratio was evaluated by MTT assay. Results Compared with the negative control (siRNANC) groups， transfection of three targeting siRNA in T24 cells decreased the expression of Annexin1 mRNA and protein. Annexin1 gene silencing reduced the proliferative capacity of T24 cells and leaded to tumor cells apoptosis after transfection. Conclusions The chemically synthesized specific siRNA targeting Annexin1 could effectively reduce the expression of Annexin1 gene， reduce the proliferative capacity of T24 cells and induce tumor cells apoptosis.

【Key words】 Bladder cancer; Annexin1; siRNA

膜聯(lián)蛋白1(Annexin1)增強(qiáng)感染局部的凋亡表明它對腫瘤的診斷和治療有重要意義，因此該蛋白質(zhì)與腫瘤細(xì)胞的活性調(diào)節(jié)相關(guān)〔1，2〕。目前，Annexin1的表達(dá)缺失是否與膀胱癌細(xì)胞的異常增殖潛力相關(guān)以及對化療藥物的敏感性尚未明了，本研究利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)通過沉默Annexin1基因直接觀察Annexin1表達(dá)缺失對膀胱癌細(xì)胞體外增殖能力的影響，為進(jìn)一步揭示該基因促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 膀胱癌T24細(xì)胞株(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院中心實驗室提供)，RNA干擾試劑盒(SilencerTM siRNA Construction Kit)購自美國Ambion公司。陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒LipofectamineTM2000、Trizol、MMLV購自Invitrogen 生命技術(shù)公司。RPMI1640、IMDM、胰蛋白酶購自GIBCO公司。

1.2 小干擾RNA(siRNA)的設(shè)計及合成 根據(jù)GenBank 中Annexin1基因序列(GenBank Accession No.NM000700)和siRNA設(shè)計原則，應(yīng)用Ambion生物公司的設(shè)計軟件(siRNA Target Finder and Design Tools)，自Annexin1 mRNA的起始密碼子開始，尋找“AA”二連序列，記下其3′端的19個堿基序列作為候選的siRNA靶序列。將候選序列在GenBank中用Blast軟件進(jìn)行同源序列搜索，排除那些和其他基因編碼序列或EST同源的候選序列。最終選擇了3段21個堿基的siRNA序列(TI、TⅡ、TⅢ)，分別靶向Annexin1基因的240260 (SI) ，435455 (SⅡ)和 506526 (SⅢ)區(qū)域(見表1)。另外，根據(jù)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，設(shè)計與TI(240siRNA)序列含有同樣核苷酸比例的隨機(jī)對照siRNA(240c1，240c2)做為陰性對照，用Blast驗證隨機(jī)序列與GenBank中其他已知人類基因序列沒有同源性。利用針對三磷酸甘油醛脫氫酶(βactin)基因的正、反義寡核苷酸模板作為RNA干擾實驗的陽性對照。設(shè)計的正反義寡核苷酸模板3′端均加上T7啟動子引物5′CCTGTCTC3′，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 引物的設(shè)計與合成 設(shè)計1對Annexin1的引物，上游：5′GACCACCTCAACTCAAGGAC3′，下游：5′AGGAAGCTGGATGAAGAGAC3′，長度 546 bp，同時設(shè)計1對管家基因βactin引物，上游：5′ACCACAGCTGAGAGGGAAATCG3′，下游：5′AGAGGTCCTTACGGATGTCAACG3′，長度290 bp，由上海生工合成。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)RPMI1640培養(yǎng)，至轉(zhuǎn)染前夜，細(xì)胞培養(yǎng)液更換為用無血清和無抗生素的IMDM，置于37℃、 5% CO2孵箱，轉(zhuǎn)染后用20%FBS IMDM培養(yǎng)液，按常規(guī)方法培養(yǎng)，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。用OptiMEMⅠ轉(zhuǎn)染液及脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑，按試劑盒說明優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，分別將3對siRNA和陽性對照篩選出的干擾序列的scramble siRNA(siRNAneg)以400 nmol/L的終濃度加入細(xì)胞培養(yǎng)液，孵育24、48、72 h后收獲細(xì)胞進(jìn)行檢測。實驗重復(fù)3次。表1 靶向Annexin1的siRNA核苷酸序列

1.5 半定量RTPCR檢測轉(zhuǎn)染前后膀胱癌T24 細(xì)胞Annexin1 mRNA 的表達(dá)水平 Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，用2 μg總RNA進(jìn)行cDNA的合成，半定量RTPCR方法檢測siRNA轉(zhuǎn)染后不同時間點24、48、72 h細(xì)胞中Annexin1 mRNA表達(dá)水平，βactin作內(nèi)對照。PCR 擴(kuò)增條件Annexin1：95℃預(yù)變性5 min;94℃變性40 s，58℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，共33個循環(huán);72℃延伸10 min。βactin：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，63℃退火1 min，72℃延伸2 min，共30個循環(huán);72℃延伸10 min。取適量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在2%瓊脂糖凝膠電泳(80 V，25 min)，EB染色，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照。

1.6 Western印跡法檢測轉(zhuǎn)染前后膀胱癌T24細(xì)胞Annexin1蛋白的表達(dá) 取狀態(tài)良好對數(shù)生長期細(xì)胞5×106個，用PBS洗2遍，于冰上加冷的細(xì)胞裂解液，制備細(xì)胞總蛋白，Lowry法蛋白定量。將樣品置于5×SDS凝膠加樣緩沖液中，100℃加熱10 min使蛋白質(zhì)變性，丙烯酰胺凝膠電泳，Western印跡法，按0.1 ml/cm2的量加入封閉液和適量稀釋的抗體，于搖床上室溫2 h，PBS漂洗濾膜3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，將漂洗過的硝酸纖維素膜移至上述底物溶液中，輕輕搖動，蛋白條帶的顏色達(dá)到要求，即用水沖洗，濾紙吸干，拍照，保存。內(nèi)參對照使用小鼠抗人βactin(稀釋度為1∶10 000)。

1.7 siRNA和脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性檢測 細(xì)胞用無血清和無抗生素的培養(yǎng)液洗滌重懸，每孔2×104加入96孔板。分別加入用OptiMEMⅠ稀釋的siRNA(終濃度為100 nmol/L)或Lipofectamine2000(終濃度為2 ml/L)，6 h后加入含20%血清的培養(yǎng)液補(bǔ)足血清，72 h后分別加入5 mg/ml的MTT，每孔20 μl，37℃置4 h，棄上清，每孔加入100 μl二甲基亞砜，待甲瓚完全溶解后，測定其在570 nm的吸光度，并計算細(xì)胞存活率。對照孔細(xì)胞中加入等量的OptiMEMⅠ代替脂質(zhì)體或siRNA，其余培養(yǎng)條件與處理組相同。存活率(%)=(處理孔OD570-空白孔OD570)/(對照孔OD570-空白孔OD570)×100%。

1.8 透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡形態(tài) 取細(xì)胞1×107個，冷PBS洗3遍，預(yù)冷2%戊二醛于4℃固定細(xì)胞2 h，冷PBS洗3遍，1%四氧化鋨酸4℃再固定30 min，常規(guī)電鏡脫水、包埋并超薄切片，用醋酸雙氧鈾和鉛染液雙重染色，觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.9 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力的改變 對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種1×105個細(xì)胞，在37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后換用無血清的培養(yǎng)基。實驗組設(shè)7個不同藥物濃度，按相同倍數(shù)遞增。每組藥物濃度設(shè)6個復(fù)孔，對照組不加藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24～96 h后，每孔加入MTT溶液(5 g/L)孵育4 h后吸棄培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 100 μl，振蕩溶解10 min，酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm波長測吸光度值(A)，細(xì)胞增殖抑制率計算公式為：抑制率(%)=(1-實驗組A均數(shù)/對照組A均數(shù))×100%，繪制生長曲線，重復(fù)3次。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以x±s表示，兩組均數(shù)間比較采用雙尾Student′s t檢驗，多組均數(shù)間比較采用方差分析(ANOVA)。

2 結(jié) 果

2.1 siRNA對膀胱癌T24細(xì)胞Annexin1 mRNA表達(dá)的影響 經(jīng)AlphaEaseFCTM(Alpha Innotech)軟件分析，以40 nmol/L濃度轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞24 h后siRNAⅠ、Ⅱ、Ⅲ組mRNA表達(dá)水平明顯降低(圖1)，在24 h下調(diào)(80.63±0.24)%(t=474.3，P=0.001);在48 h下調(diào)(38.9±0.85)%(t=64.833，P=0.01)，72 h恢復(fù)正常。

2.2 siRNA對膀胱癌T24細(xì)胞Annexin1蛋白表達(dá)的影響 與隨機(jī)對照相比，靶向Annexin1的siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)Annexin1蛋白表達(dá)明顯下降，與RTPCR結(jié)果一致。見圖2。

1：Marker DL200，2：siRNA 轉(zhuǎn)染24 h，3：siRNA轉(zhuǎn)染48 h，4：siRNA 轉(zhuǎn)染72 h，5：siRNA陰性對照，6：未轉(zhuǎn)染組

圖1 siRNA對膀胱癌T24細(xì)胞

Annexin1 mRNA表達(dá)的影響

2.3 沉默Annexin1基因?qū)24細(xì)胞增殖能力的影響 轉(zhuǎn)染siRNA Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ序列靶向降低Annexin1基因表達(dá)后T24細(xì)胞的體外增殖能力明顯降低(圖3)，以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞做對照，轉(zhuǎn)染siRNA Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ后24、48、72 h細(xì)胞增殖抑制率分別是siRNA I：0.98/0.73/0.49倍，siRNA Ⅱ：0.97/0.65/0.41倍，siRNA Ⅲ：0.91/0.55/0.39倍，其中48、72 h組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 siRNA對膀胱癌T24細(xì)胞Annexin1蛋白表達(dá)的影響圖3 沉默Annexin1基因?qū)24細(xì)胞增殖能力的影響

2.4 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察 對照組腫瘤細(xì)胞未發(fā)生凋亡，細(xì)胞核形態(tài)正常，核內(nèi)異染色質(zhì)未發(fā)生固縮現(xiàn)象，核仁清楚;細(xì)胞質(zhì)中原生質(zhì)著色均勻;線粒體結(jié)構(gòu)完整;嵴無斷裂(圖4a)。經(jīng)過siRNA作用48 h后的T24細(xì)胞出現(xiàn)典型凋亡細(xì)胞特征(圖4b)，凋亡小體形成;異染色質(zhì)已發(fā)生固縮，核仁消失;細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡;原生質(zhì)著色不均勻;線粒體擴(kuò)張;嵴腫脹、斷裂。

圖4 siRNA作用前后的T24細(xì)胞

2.5 siRNA和脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性檢測結(jié)果 T24細(xì)胞經(jīng)靶向Annexin1基因的siRNA或oligo Lipofectamine處理后計算細(xì)胞存活率，與未處理的T24細(xì)胞相比，沒有顯著統(tǒng)計學(xué)差異，顯示siRNA及脂質(zhì)體本身在實驗條件下對細(xì)胞基本沒有毒性作用。

3 討 論

RNAi是由雙鏈RNA分子在mRNA水平關(guān)閉相應(yīng)序列基因表達(dá)使其沉默的過程，是一種典型的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控方法，此時啟動子是活躍的，靶基因能夠被轉(zhuǎn)錄，但不能正常累積mRNA。其優(yōu)點首先表現(xiàn)在siRNA只引起與其同源的mRNA降解，而其他基因的表達(dá)不受影響，因此具有高度的序列專一性。許多實驗證實，導(dǎo)入細(xì)胞的siRNA只能引起同源基因表達(dá)的抑制，而無關(guān)基因不受影響〔3〕。在siRNA序列中配對的19～21nt中如果只改變一個核苷酸，就可以使該siRNA序列不對靶mRNA起作用，證明RNAi有明顯的特異性。其次RNAi是通過自身放大機(jī)制來發(fā)揮作用，極少量的dsRNA就能有效地抑制靶基因的表達(dá)，因此與反義寡核苷酸等基因封閉技術(shù)相比，具有高效性〔4〕。另外RNAi操作簡便快捷，利用RNA干擾技術(shù)，甚至可以在一周之內(nèi)可以關(guān)閉10個基因。

2001年，Elbashir等首次報道siRNA在哺乳動物體外培養(yǎng)細(xì)胞中能夠成功的誘導(dǎo)特異基因受阻〔5〕。作為一種有效抑制基因表達(dá)的方法，RNA干擾技術(shù)在近幾年被廣泛用于基因的功能研究。雙鏈siRNA的合成是進(jìn)行RNAi研究的關(guān)鍵〔6〕，本研究采取體外轉(zhuǎn)錄法，即在噬菌體RNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶等作用下，以連有噬菌體啟動子的線性DNA為模板，直接合成出特異雙鏈siRNA。RNA聚合酶是體外轉(zhuǎn)錄合成siRNA的關(guān)鍵酶，除了本實驗中用到的T7 RNA聚合酶，其他通用的RNA聚合酶還有T3、SP6 RNA聚合酶，它們均是以DNA為模板的RNA聚合酶。DNA模板必須連有特異的啟動子序列，啟動子區(qū)域是噬菌體RNA聚合酶結(jié)合和RNA開始合成的部位，因此本實驗在設(shè)計寡核苷酸模板的時候，3′端均加上T7啟動子引物5′CCTGTCTC3′。在RNA聚合酶結(jié)合到雙鏈DNA啟動子后，聚合酶分開雙鏈DNA模板，并以3′5′鏈作為模板合成出互補(bǔ)的5′3′RNA鏈，合成出的正反義RNA鏈經(jīng)雜交即可得雙鏈RNA。在本研究中，以AA開頭針對597 bp的Annexin1 cds區(qū)的靶序列共有26個，其中GC堿基含量在50%以下的有25個，對其進(jìn)行Blast分析，最終選擇了240260 (SI)，435455 (SⅡ)和 506526 (SⅢ)的3段序列，其中SI SiRNA靶序列的GC含量為43.9%，SⅡ SiRNA靶序列的GC含量為39.2%，SⅢ SiRNA靶序列的GC含量為41.2%。結(jié)果表明3段siRNA序列都有抑制Annexin1基因表達(dá)的作用，但是SⅡ siRNA抑制作用要更強(qiáng)一些。通過研究3對不同的靶向干擾序列和1對陰性對照序列，發(fā)現(xiàn)在mRNA水平3對靶向序列均可抑制Annexin1的表達(dá)，在蛋白水平也獲得較高的抑制效果。MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞或轉(zhuǎn)染陰性對照細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染siRNA可顯著抑制T24細(xì)胞的生長，增加G0/G1期比例，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，與Mariotti〔7〕報道一致?？傊?，本研究通過siRNA下調(diào)Annexin1基因表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期發(fā)生改變使細(xì)胞增殖緩慢和凋亡，為Annexin1與膀胱癌臨床相關(guān)性和治療新途徑提供了實驗依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

1 SilistinoSouza R，RodriguesLisoni FC，Cury PM，et al.Annexin 1：differential expression in tumor and mast cells in human larynx cancer〔J〕. Int J Cancer，2007;120(12):25829.

2 Ang EZ，Nguyen HT，Sim HL，et al.Annexin1 regulates growth arrest induced by high levels of estrogen in MCF7 breast cancer cells〔J〕.Mol Cancer Res，2009;7(2):26674.

3 Dalzell JJ，McMaster S，F(xiàn)leming CC，et al.Short interfering RNAmediated gene silencing in Globodera pallida and Meloidogyne incognita infective stage juveniles〔J〕.Int J Parasitol，2010;40(1):91100.

4 PalBhadra M，Bhadra U，Birchler JA.RNAi related mechanisms affect both transcriptional and posttranscriptional transgene silencing in Drosophila〔J〕.Mol Cell，2002;9(2):31527.

5 Elbashir SM，Harborth J，Lendeckel W，et al.Duplexes of 21nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells〔J〕.Nature，2001;411(6836)：4948.

篇5

關(guān)鍵詞：生物科學(xué)；核心課程；邏輯關(guān)系

中圖分類號：G633.91

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1674-9944（2016）21-0130-03

1 引言

生物化學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程學(xué)是生物科學(xué)專業(yè)的核心課程，由于它們相互聯(lián)系，交叉滲透，因此存在邏輯關(guān)系不清，課程內(nèi)容重疊較多等問題，例如原核生物和真核生物基因表達(dá)調(diào)控在生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)都有介紹，基因工程原理在分子生物學(xué)、基因工程學(xué)中都有介紹，導(dǎo)致教師教學(xué)內(nèi)容難以起舍，課程順序難以安排。要理順生物化學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程學(xué)的邏輯關(guān)系，確定各課程教學(xué)內(nèi)容和教學(xué)順序，必須把其定義，研究內(nèi)容，發(fā)展歷史動態(tài)結(jié)合起來。

2 生物科學(xué)專業(yè)核心課程概述

2.1 生物化學(xué)

生物化學(xué)是運用化學(xué)的理論和方法研究生物分子結(jié)構(gòu)與功能、物質(zhì)代謝及遺傳信息傳遞與調(diào)控規(guī)律的科學(xué)。

生物化學(xué)是生命科學(xué)中最古老的學(xué)科之一。 隨著生命科學(xué)的發(fā)展，各學(xué)科相互滲透。18世紀(jì)，一些從事化學(xué)研究的科學(xué)家轉(zhuǎn)向生物領(lǐng)域，為生物化學(xué)的誕生播下了種子。19世紀(jì)末，生物化學(xué)從生理化學(xué)中獨立。20世紀(jì)中后期又從生物化學(xué)分離出部分內(nèi)容與遺傳學(xué)部分內(nèi)容結(jié)合為分子生物學(xué)，然后，分子生物學(xué)基因操作部分獨立出來，形成基因工程學(xué)。

1920年以前，生物化學(xué)研究內(nèi)容以分析生物體的化學(xué)組成、性質(zhì)和含量為主，稱為靜態(tài)生物化學(xué)時期。

1920年-1950年，隨著同位素示蹤技術(shù)、色譜技術(shù)等物理學(xué)手段的廣泛應(yīng)用，生物化學(xué)從單純的組成分析深入到物質(zhì)代謝、能量轉(zhuǎn)化，如：光合作用、生物氧化、糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝等領(lǐng)域。這是生物化學(xué)飛速發(fā)展的時期，稱為動態(tài)生物化學(xué)時期。

1950年以后，蛋白質(zhì)化學(xué)和和核酸化學(xué)進(jìn)展迅速，生物化學(xué)進(jìn)入了分子生物學(xué)時期。分子生物學(xué)的發(fā)展揭示了生命本質(zhì)的高度有序性和一致性，是人類在認(rèn)識的巨大飛躍。根據(jù)生物化學(xué)的定義和歷史，生物化學(xué)研究的內(nèi)容包括以下幾個方面。

2.1.1 生物的物質(zhì)組成

生物是由一定的物質(zhì)按特定的方式組成的，直到今天，新物質(zhì)仍不斷被發(fā)現(xiàn)。如陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的干擾素、環(huán)核苷一磷酸、鈣調(diào)蛋白、粘連蛋白、外源凝集素等都具有重要的生物學(xué)功能。另一方面，早已熟知的化合物也發(fā)現(xiàn)了新的功能，如20世紀(jì)50年代才知道肉堿是一種生長因子，而到60年代又發(fā)現(xiàn)其是生物氧化的載體。

2.1.2 物質(zhì)代謝

生物體內(nèi)絕大部分物質(zhì)代謝是在酶催化下進(jìn)行的，具有高度自動調(diào)節(jié)能力。一個小小的細(xì)胞內(nèi)，有近2000種酶，在同一時間內(nèi)，催化各種不同的化學(xué)反應(yīng)。這些化學(xué)反應(yīng)互不干擾，有條不紊地進(jìn)行。表明生物體內(nèi)的物質(zhì)代謝有精確的調(diào)節(jié)控制系統(tǒng)。

2.1.3 結(jié)構(gòu)與功能

生物大分子的功能與其特定的結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系。如酶的活性中心的結(jié)構(gòu)決定其催化活性及其特異性；變構(gòu)酶的活性還與其催化的代謝終末產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)有關(guān)。

核酸中核苷酸排列順序的不同，其結(jié)構(gòu)就不同，所含遺傳信息不同。這些不同的構(gòu)象對基因的表達(dá)具有調(diào)控作用。

生物體的糖包括多糖、寡糖和單糖。由于多糖鏈結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有很大的信息容量，對于細(xì)胞專一地識別、相互作用具有重要作用。糖類將與蛋白質(zhì)、核酸并列成為生物化學(xué)的主要研究對象。

在生物化學(xué)中，有關(guān)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究才僅僅開始，尚待大力研究的問題很多，其中重大的有：亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中生物大分子間的結(jié)合，細(xì)胞的相互識別、細(xì)胞的接觸抑制、細(xì)胞間的粘合、抗原與抗體的作用、激素、神經(jīng)介質(zhì)與其受體的相互作用等。

2.1.4 繁殖與遺傳

生物典型特點是具有繁殖與遺傳特性?；蚴荄NA分子中的一段核苷酸序列，現(xiàn)在DNA分子的核苷酸序列已不難測得，不但能在分子水平上研究遺傳，而且還可能改變遺傳，從而派生出基因工程學(xué)。

2.2 細(xì)胞生物學(xué)

細(xì)胞生物學(xué)是從顯微水平、亞顯微水平和分子水平研究細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及其生命活動規(guī)律的科學(xué)。

過去，細(xì)胞生物學(xué)主要是在光學(xué)顯微鏡下對細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生活史進(jìn)行研究，稱為細(xì)胞學(xué)。20 世紀(jì) 50 年代以來，由于電子顯微鏡、放射性同位素、細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分分離技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù)的廣泛應(yīng)用，特別是分子生物學(xué)的興起，使細(xì)胞生物學(xué)研究的廣度和深度都有迅猛發(fā)展，從宏觀到微觀、從平面到立體、從定性到定量、從分析到綜合；從細(xì)胞、亞細(xì)胞、分子三個水平研究細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能、分裂與分化、衰老與死亡等生命活動規(guī)律及其調(diào)控機(jī)制，細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與環(huán)境之間的相互關(guān)系。使原來以形態(tài)結(jié)構(gòu)研究為主的細(xì)胞學(xué)轉(zhuǎn)變成以生理功能研究為主、將結(jié)構(gòu)與功能緊密結(jié)合起來的細(xì)胞生物學(xué)。由于細(xì)胞生物學(xué)在分子水平上的研究工作取得了深入的進(jìn)展，因此細(xì)胞生物學(xué)又稱為細(xì)胞分子生物學(xué)。細(xì)胞生物學(xué)研究內(nèi)容如下。

2.2.1 細(xì)胞社會學(xué)

細(xì)胞社會學(xué)是細(xì)胞生物學(xué)中的一個新的領(lǐng)域。它是以系統(tǒng)論的觀點研究細(xì)胞群體中細(xì)胞間的相互關(guān)系、細(xì)胞群體的社會行為；細(xì)胞識別、通訊、相互作用；整體和細(xì)胞群對細(xì)胞的生長、分化、形態(tài)發(fā)生和器官形成等活動的調(diào)控；細(xì)胞外環(huán)境對細(xì)胞的影響。

2.2.2 細(xì)胞的增殖、生長、分化與調(diào)控

研究細(xì)胞增殖、生長、分化及其調(diào)控機(jī)制，不僅是控制生物生長和發(fā)育的基礎(chǔ)，而且是研究細(xì)胞癌變和逆轉(zhuǎn)的重要途徑。

2.2.3 細(xì)胞遺傳學(xué)

細(xì)胞遺傳學(xué)從細(xì)胞學(xué)角度來研究染色體的結(jié)構(gòu)和行為以及染色體與細(xì)胞器的關(guān)系，從而探討遺傳與變異的機(jī)制等。

2.2.4 細(xì)胞化學(xué)

細(xì)胞化學(xué)：用切片或分離細(xì)胞成分，對單個細(xì)胞或細(xì)胞各個部分進(jìn)行定性和定量的化學(xué)分析，研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分的定位、分布及其生理功能。

2.2.5 分子細(xì)胞學(xué)

分子細(xì)胞學(xué)：從分子水平研究細(xì)胞與細(xì)胞器中蛋白質(zhì)、核酸等大分子的組成、結(jié)構(gòu)與功能及其遺傳性狀的表現(xiàn)和調(diào)控等，探討細(xì)胞生命活動的分子機(jī)理。

2.3 遺傳學(xué)

遺傳學(xué)是研究生物遺傳和變異規(guī)律的科學(xué)。孟德爾認(rèn)為生物性狀的遺傳是受遺傳因子控制的，并提出了遺傳因子分離和自由組合的基本遺傳規(guī)律。1900年，孟德爾的成果得到廣泛重視，成為遺傳學(xué)的基石。

20世紀(jì)初，利用光學(xué)顯微鏡發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞有絲分裂和減數(shù)分裂過程中染色體及其行為，奠定了遺傳的染色體理論基礎(chǔ)。1910年左右，美國遺傳學(xué)家摩爾根及其同事根據(jù)對普通果蠅的研究，提出了基因的連鎖交換規(guī)律，并結(jié)合當(dāng)時的細(xì)胞學(xué)成就，創(chuàng)立了以染色體遺傳為核心的細(xì)胞遺傳學(xué)。

遺傳信息在分子水平上研究始于20世紀(jì)40年代。隨著電子顯微鏡的發(fā)明，人們已能夠直接觀察遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)及其在基因表達(dá)過程中的特征，使細(xì)胞遺傳學(xué)的研究進(jìn)入分子水平。

1953年，沃森和克里克提出了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，為進(jìn)一步闡明DNA的結(jié)構(gòu)、復(fù)制和遺傳物質(zhì)如何保持世代連續(xù)的問題奠定了基礎(chǔ)，開創(chuàng)了分子遺傳學(xué)這一新的學(xué)科領(lǐng)域。

遺傳學(xué)研究的領(lǐng)域非常廣泛，可劃分成經(jīng)典遺傳學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子遺傳學(xué)和生統(tǒng)遺傳學(xué)4個分支，各個分支領(lǐng)域相互聯(lián)系、相互重疊、相互印證，組成了一個不可分割的整體。

經(jīng)典遺傳學(xué)研究從親代到子代的遺傳特性，包括遺傳的分離規(guī)律；獨立分配規(guī)律；連鎖和交換遺傳規(guī)律及機(jī)理；基因互作及其與環(huán)境的相互關(guān)系；性別決定與伴性遺傳；基因及染色體變異；數(shù)量性狀的特征及其多基因假說，近親繁殖和雜種優(yōu)勢；細(xì)胞質(zhì)遺傳等。

細(xì)胞遺傳學(xué)是通過細(xì)胞學(xué)手段對遺傳物質(zhì)進(jìn)行研究。其內(nèi)容包括細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能；染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)；細(xì)胞的有絲分裂，減數(shù)分裂；配子的形成和受精。

分子遺傳學(xué)是從分子的水平上研究遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)及遺傳信息的傳遞。內(nèi)容包括DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯，基因突變及修復(fù)，原核生物和真核基因表達(dá)與調(diào)控；基因、基因組及作圖，遺傳重組。

生統(tǒng)遺傳學(xué)是用數(shù)理統(tǒng)計學(xué)方法來研究生物遺傳變異規(guī)律的學(xué)科。根據(jù)研究的對象不同，又可分為數(shù)量遺傳學(xué)和群體遺傳學(xué)。前者研究生物體數(shù)量性狀即由多基因控制的性狀遺傳規(guī)律，后者是研究基因頻率在群體中的變化、群體的遺傳結(jié)構(gòu)和物種進(jìn)化。

2.4 分子生物學(xué)

分子生物學(xué)是從分子水平研究核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能、遺傳信息傳遞和調(diào)控，闡明生命本質(zhì)的科學(xué)。

從19世紀(jì)后期到20世紀(jì)50年代初，確定了蛋白質(zhì)是生命的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，DNA是生物遺傳的物質(zhì)的載體，是現(xiàn)代分子生物學(xué)誕生的準(zhǔn)備和醞釀階段。

從20世紀(jì)50年代初到70年代初，是現(xiàn)代分子生物學(xué)的建立和發(fā)展階段，1953年Watson和Crick提出的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型為現(xiàn)代分子生物學(xué)誕生的里程碑，確立了核酸作為遺傳信息分子的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，提出了鹼基配對是核酸復(fù)制、遺傳信息傳遞的基本方式，為核酸與蛋白質(zhì)的關(guān)系及其在生命中的作用打下了最重要的基礎(chǔ)。

70年代后，基因工程技術(shù)出現(xiàn)，人類進(jìn)入認(rèn)識生命本質(zhì)并開始改造生命的發(fā)展階段。

分子生物學(xué)原來是生物化學(xué)的一部分，因其太重要了，20世紀(jì)中后期從生物化學(xué)中分離出來并與遺傳學(xué)結(jié)合，獨立出來成為單獨的學(xué)科，是生物化學(xué)的發(fā)展和延續(xù)。涉及的部分內(nèi)容比生物化學(xué)更細(xì)致深入，并從整體上考慮。

分子生物學(xué)從蛋白質(zhì)、核酸、基因及基因組結(jié)構(gòu)開始，以中心法則為主線，闡述生物大分子在信息傳導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控中的相互作用和機(jī)理。主要內(nèi)容包括蛋白質(zhì)、核酸、基因和基因組的結(jié)構(gòu)、DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、基因突變與修復(fù)、蛋白質(zhì)生物合成和翻譯后加工、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控、真核生物基因表達(dá)的調(diào)控?；蚬こ碳夹g(shù)的原理和應(yīng)用等。

2.5 基因工程學(xué)

20世紀(jì)70年代，隨著 DNA的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和遺傳機(jī)制逐漸呈現(xiàn)在人們眼前，生物學(xué)家不再僅僅滿足于探索、揭示生物遺傳的秘密，而是開始設(shè)想在分子的水平上去干預(yù)生物的遺傳特性。這就像工程設(shè)計，按照人類的需要（設(shè)計）把這種生物的某個“基因”與那種生物的某個“基因”進(jìn)行“施工”，“組裝”成新的基因組合，創(chuàng)造出新的生物的工程技術(shù)被稱為“基因工程”。

基因工程包括如下幾個主要的內(nèi)容：①目的基因的合成或提起分離。②載體的構(gòu)建。③將載體轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞并增殖。④重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆篩選。⑤將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。

3 課程間的邏輯關(guān)系，教學(xué)內(nèi)容選擇及課程順序安排

從生物化學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程學(xué)的定義，研究內(nèi)容，發(fā)展歷史動態(tài)可知，各學(xué)科的邏輯關(guān)系是：理解細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能需要一定的生物化學(xué)基礎(chǔ)，理解遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能需要一定的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)，而分子生物學(xué)是生物化學(xué)、遺傳學(xué)交叉融合的產(chǎn)物，研究核酸和蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)和功能以及相互關(guān)系，而各個分子不能孤立發(fā)揮作用，必須依賴于一定的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，因此，生物化學(xué)是細(xì)胞生物學(xué)的基礎(chǔ)；細(xì)胞生物學(xué)是遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的基礎(chǔ)?；蚬こ淌抢梅肿由飳W(xué)的理論和實驗技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作的部分獨立出來的，因此分子生物學(xué)是基因工程學(xué)的基礎(chǔ)。所以，高校應(yīng)按生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程的順序安排課程教學(xué)最為合適。

由以上可知，由于歷史的原因，生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程學(xué)相互聯(lián)系，交叉滲透，研究內(nèi)容重復(fù)較多。因此，本研究根據(jù)其定義、邏輯關(guān)系及發(fā)展歷史，同時為編寫教材和教學(xué)的方便，建議生物化學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程學(xué)教學(xué)內(nèi)容如下。

（1）生物化學(xué)主要教學(xué)內(nèi)容主要有：蛋白質(zhì)化學(xué)、核酸化學(xué)；酶學(xué)基礎(chǔ)；糖代謝與生物氧化；脂類代謝；蛋白質(zhì)的分解代謝等內(nèi)容。而將DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、突變、修復(fù)及原核生物和真核生物基因表達(dá)調(diào)控留在分子生物學(xué)講授。

（2）細(xì)胞生物學(xué)的教學(xué)內(nèi)容主要有：細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)；細(xì)胞生物學(xué)研究方法；細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能及物質(zhì)跨膜運輸；細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)與細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)；細(xì)胞通訊與信號傳遞；線粒體和葉綠體；細(xì)胞核與染色體；細(xì)胞骨架；細(xì)胞增殖及其調(diào)控；細(xì)胞分化、衰老與凋亡。

（3）遺傳學(xué)的教學(xué)內(nèi)容主要有：遺傳的分離規(guī)律；獨立分配規(guī)律；連鎖和交換遺傳規(guī)律；基因互作及其與環(huán)境的關(guān)系；基因定位與連鎖遺傳圖；性別決定與伴性遺傳；基因及染色體變異；染色體畸變；數(shù)量性狀的特征及其多基因假說；近親繁殖和雜種優(yōu)勢；細(xì)胞質(zhì)遺傳；遺傳重組。

（4）分子生物學(xué)的教學(xué)內(nèi)容主要有：DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、基因突變與修復(fù)、蛋白質(zhì)生物合成和翻譯后加工、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控、真核生物基因表達(dá)的調(diào)控。

（5）基因工程學(xué)的主要教學(xué)內(nèi)容有：基因工程技術(shù)的原理和應(yīng)用等。

以上各門課的教學(xué)內(nèi)容相對前述和我國現(xiàn)行教材的教學(xué)內(nèi)容作了較大調(diào)整，例如；核酸和蛋白質(zhì)的組成及結(jié)構(gòu)只在生物化學(xué)中講授，細(xì)胞信號傳遞只在細(xì)胞生物學(xué)中講授，基因工程原理只在基因工程學(xué)中講授，避免了課程內(nèi)容的重復(fù)。

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篇6

河北大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院河北省保定市071000【摘　要】關(guān)于腫瘤發(fā)生機(jī)制的研究雖然已有百年的歷史，但時至今日依然沒有完全解開。隨著越來越多的實驗結(jié)果不能用傳統(tǒng)的體細(xì)胞突變學(xué)說解釋，一些新的學(xué)說如腫瘤干細(xì)胞學(xué)說應(yīng)運而生。本文就腫瘤干細(xì)胞的起源、特性與應(yīng)用作一簡要分析。

關(guān)鍵詞 腫瘤干細(xì)胞；研究；分析

1959年，Makino提出腫瘤干細(xì)胞（tumorstemcells，TSC）假說并認(rèn)為腫瘤細(xì)胞是由與正常干細(xì)胞相似的一小部分細(xì)胞分化而成的，但很長時間此假說并未得到重視。直到1997年Bonnet[1]etal成功分離出并證實了表型為CD34+/CD38-的白血病干細(xì)胞，加上人們對體細(xì)胞突變理論正確性的逐漸質(zhì)疑，TSC假說在當(dāng)時得到了廣泛關(guān)注，直到今天，TSC的相關(guān)研究依然是主流熱點之一。

1腫瘤干細(xì)胞的起源

關(guān)于腫瘤干細(xì)胞的起源目前尚無定論。Clark[2]etal認(rèn)為TSC來自正常干細(xì)胞，因為其在生物學(xué)特性等方面與正常干細(xì)胞相似；國內(nèi)學(xué)者王瑞安[3]提出“干細(xì)胞錯位學(xué)說”并認(rèn)為浸潤癌的產(chǎn)生是由于上皮性干細(xì)胞誤入結(jié)締組織間質(zhì)而形成。另有學(xué)者認(rèn)為其起源于分化成熟的細(xì)胞去分化所得。但不論如何，腫瘤干細(xì)胞與正常干細(xì)胞生物學(xué)行為的相似性這點毋庸置疑，因此大部分學(xué)者認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞是通過某種方式由正常干細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來。

2腫瘤干細(xì)胞的特性

TSC與正常組織干細(xì)胞在生物學(xué)特性上具有較多相似性，比如具有較強(qiáng)增殖的能力，并且能自我克隆出子代TSC和分化出其他腫瘤細(xì)胞；TSC也存在正常組織干細(xì)胞不具備的生物學(xué)特性。一般認(rèn)為，干細(xì)胞對化放療敏感，而TSC對化放療具有較強(qiáng)耐受力，且此能力會隨著化放療的進(jìn)程而加強(qiáng)。Woodward[3]etal研究表明，在對乳腺癌放療后TSC比例并未下降反而增高；Lagadec[4]etal進(jìn)行動物實驗時發(fā)現(xiàn)，放射線照射后的乳腺癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為乳腺癌細(xì)胞的能力是原先的30倍，傳統(tǒng)的化放療治療并未對TSC產(chǎn)生有效作用，反而促進(jìn)了腫瘤的復(fù)發(fā)，可能這就是目前積極治療腫瘤后復(fù)發(fā)率仍然較高的原因之一。

3腫瘤干細(xì)胞的應(yīng)用

TSC假說的提出使人們逐漸轉(zhuǎn)變了傳統(tǒng)治療惡性腫瘤的思維，并在惡性腫瘤的治療中把注意力從殺滅腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到積極殺滅TSC中去，目前已經(jīng)有了一些成果：Li[5]etal通過實驗研究得出DCLK1是存在于結(jié)腸癌干細(xì)胞上的表面標(biāo)識，并為TSC的靶向治療提供了基礎(chǔ)；Liu[6]etal發(fā)現(xiàn)Gd@C82(OH)22能夠調(diào)控腫瘤微環(huán)境，有效抑制乳腺癌干細(xì)胞自我更新，實現(xiàn)殺滅腫瘤干細(xì)胞，并能終止腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移。越來越多的研究表明，只有真正殺滅腫瘤干細(xì)胞，惡性腫瘤才能得到控制，其相關(guān)治療具有較好的應(yīng)用前景。

4結(jié)語

腫瘤干細(xì)胞假說可以看做為體細(xì)胞突變學(xué)說的一個很好的發(fā)展或者糾正，雖然目前尚未能從普遍上證明TSC學(xué)說的正確性，但越來越多的實驗?zāi)軌蜃C明TSC確實存在并影響腫瘤的發(fā)生。相信隨著研究的深入，腫瘤干細(xì)胞的研究將會取得更多進(jìn)展并早日應(yīng)用于臨床，從而為腫瘤的治療提供新的思路。

參考文獻(xiàn)

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篇7

【關(guān)鍵詞】 耐萬古霉素；金黃色葡萄球菌；生物學(xué)特征；細(xì)菌檢測

金黃色葡萄球菌是社區(qū)獲得性肺炎的常見病菌，2002年首次報道耐萬古霉素葡萄球菌，2004年JAMA在職報道毅力患者體內(nèi)分離出該病菌，臨床常用的檢測及藥敏試驗未能檢測出耐萬古霉素金黃色葡萄球菌[1]，我院采用萬古霉素體外誘導(dǎo)方法將1株，異質(zhì)性萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌（h-VRSA）誘導(dǎo)為耐萬古霉素金黃色葡萄球菌（VRSA），觀察其生物學(xué)特點，現(xiàn)報告如下：

1資料和方法

1.1一般資料 標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌（ATCC 29216）和異質(zhì)性萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌分離菌株10833來源于我院檢驗科，血漿凝固酶（+），觸媒（+），GPI編碼：76134056712。

1.2方法卵磷脂吐溫80瓊脂，微量生化反應(yīng)管，萬古霉素紙片，鹽酸萬古霉素、MH瓊脂、肉湯、GPI鑒定卡，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試劑、PCR擴(kuò)增儀、ZF紫外分析儀。按照10827篩選方法操作，確認(rèn)為h-VRSA，將該菌株接種于萬古霉素選擇性培養(yǎng)基內(nèi)，誘導(dǎo)出VRSA，并接種于血瓊脂平板、兔血漿、MH肉湯，觀察菌落形態(tài)、溶血環(huán)及色素，應(yīng)用手工法、儀器法、PCR法測定金黃色葡萄球菌基因序列[2]，采用菌譜分析法，檢測對萬古霉素的敏感性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計數(shù)資料以％表示，計量資料以(x±s)表示，組內(nèi)和組間比較分別采用t檢驗和x2檢驗。P

2結(jié)果

2.1 VRSA菌群特點與標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌比較見表1

表1 VRSA菌群特點與標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌比較

生物學(xué)形態(tài) 標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌 VRSA

菌落形態(tài)及大小 均勻 大小不均

溶血環(huán) 清晰、寬大 窄小、無

色素 淡黃 灰白

凝固酶 陽性 陰性

金黃色葡萄球菌耐藥后色素、溶血環(huán)消失，菌落變小，凝固酶陰性。

2.2VRSA實驗室檢測分析見表2

表2VRSA實驗室檢測分析

鑒定方法 標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌 VRSA

手工法 金葡菌 溶血葡萄球菌

儀器法 金葡菌 溶血葡萄球菌

PCR 金葡菌 金葡菌

實驗室常用細(xì)菌鑒定方法將其鑒定為溶血葡萄球菌或者模仿葡萄球菌，PCR檢測方法能正確鑒定VRSA誘導(dǎo)菌。

2.3 VRSA藥敏試驗結(jié)果紙片法和儀器法對于h-VRSA和VRSA均能檢測到，微量肉湯對VRSA能檢測到，對h-VRSA容易漏診。

3討論

萬古霉素通過與肽聚糖前體D-D丙氨酸-丙氨酸結(jié)合，組織轉(zhuǎn)糖基和轉(zhuǎn)肽作用，抑制細(xì)胞壁的合成，發(fā)揮殺菌作用，其耐藥機(jī)制尚未明了，有資料報名，金黃色葡萄球菌對萬古霉素的耐藥機(jī)制不是單一的。細(xì)胞壁增厚是其主要耐藥機(jī)制，增厚的細(xì)胞壁通過阻塞、親密誘捕引起耐藥，萬古霉素與丙氨酸殘基結(jié)合，阻塞其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[3]，阻止萬古霉素向細(xì)胞質(zhì)膜滲透，同時細(xì)胞壁上增多的肽聚糖單體與萬古霉素結(jié)合，大部分藥物結(jié)合在細(xì)胞壁上，不能到達(dá)細(xì)胞質(zhì)膜。金葡菌分泌一種肽，可以通過信息傳導(dǎo)途徑把耐藥質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到金葡菌體內(nèi)。本次實驗表明，VRSA生物學(xué)特性改變主要是細(xì)菌菌落變小，色素消失，溶血環(huán)消失，凝固酶轉(zhuǎn)陰，細(xì)菌菌落變小，提示耐藥菌培養(yǎng)時間延長。VRSA生物學(xué)特征改變，對細(xì)菌鑒定結(jié)果也產(chǎn)生影響，手工法和儀器法錯誤鑒定為溶血葡萄球菌和模仿葡萄球菌，在采用PCR技術(shù)檢測VRSA的nuc基因[4]，特異性表達(dá)于金黃色葡萄球菌，可應(yīng)用于VRSA和h-VRSA的鑒定，這說明耐藥菌生物學(xué)特征改變導(dǎo)致儀器法和手工法檢測錯誤，金黃色葡萄球菌對萬古霉素耐藥后，生物學(xué)發(fā)生變化，容易導(dǎo)致細(xì)菌鑒定結(jié)果錯誤，應(yīng)引起臨床重視。

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篇8

關(guān)鍵詞：犬細(xì)小病毒；分離；鑒定

中圖分類號：S852.65+9.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）20-4576-03

犬細(xì)小病毒（Canine parvovirus，CPV）屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬，為單股、負(fù)義、線形無囊膜的DNA病毒[1]。CPV可引起犬的出血性腸胃炎和心肌炎，并使白細(xì)胞大量減少，在幼犬中的發(fā)病率和死亡率都很高[2]。CPV對多種理化因素和常用消毒劑具有較強(qiáng)的抵抗力，在4～10 ℃存活6個月，37 ℃存活2周，56 ℃存活24 h，80 ℃存活15 min，在糞便中可存活數(shù)月至數(shù)年[3]；該病毒對乙醚，氯仿和醇類有抵抗力[4]。CPV一年四季均可發(fā)病，以冬、春多發(fā)[5]，飼養(yǎng)管理條件驟變、長途運輸、寒冷、擁擠均可促使該病發(fā)生[6]。病犬是主要傳染源，其嘔吐物、唾液、糞便中均有大量病毒[7]。根據(jù)臨床癥狀和血清學(xué)反應(yīng)，可做出準(zhǔn)確診斷[8-13]。本研究通過對山東毒株分離，并對其部分生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為該病的防治和后續(xù)研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基為Gibco產(chǎn)品；小牛血清、谷氨酸胺、雙抗、胰蛋白酶等購自大連寶生物TaKaRa有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純試劑。

1.1.2 病料 病料為2009～2011年聊城大學(xué)獸醫(yī)院收集或其他養(yǎng)犬場送檢的可疑CPV病料，包括20份糞便樣品和10份臟器。

1.1.3 試驗動物和細(xì)胞 8只40～50日齡的山東細(xì)犬幼犬（抗CPV HI抗體效價小于1∶4），健康狀況良好；貓腎傳代細(xì)胞系（F81）和犬腎傳代細(xì)胞系（MDCK）等由聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 試劑的配制

1）1%豬紅細(xì)胞懸液的制備。用20 mL注射器內(nèi)吸入阿氏液3～5 mL，于健康豬前腔靜脈采血10～15 mL，立即混勻，4 ℃保存?zhèn)溆?。使用時用PBS洗滌保存的豬紅細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，洗滌3次，取紅細(xì)胞泥1 mL加稀釋液100 mL，再加入小牛血清白蛋白0.1 g，即為1%豬紅細(xì)胞懸液。

2）HA抗原配制。用移液器向V型血凝板每孔加稀釋液25 μL，然后吸取25 μL經(jīng)福爾馬林滅活的CPV細(xì)胞培養(yǎng)物，在血凝板上倍比稀釋，最后1孔不稀釋，作為陰性對照；接著每孔加稀釋液25 μL和1%豬紅細(xì)胞懸液50 μL，于振蕩器上振蕩1 min混勻，于4 ℃冰箱靜置1～2 h，待紅細(xì)胞完全沉淀后判定。判定的方法是以50%紅細(xì)胞凝集為終點，在對照孔紅細(xì)胞完全不凝集，呈圓形小點沉于孔底時，凝集終點的稀釋倍數(shù)即為該抗原的HA效價，將此效價除以8，即是8單位血凝抗原的稀釋倍數(shù)。

1.2.2 病料的處理

1）糞便樣品的處理：將病犬糞便用DMEM培養(yǎng)液稀釋（m∶m=1∶9），再加等量的氯仿混勻，4 000 r/min離心10 min，取上清，加入雙抗200 μL，4 ℃過夜，再經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2）臟器樣品的處理。將臟器樣品用滅菌后的研磨器進(jìn)行研磨，并反復(fù)凍融3次，同時加入9倍體積的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，5 000 r/min離心25 min，取上清液，經(jīng)過濾除菌。將處理好的樣品置-20 ℃保存，待分離鑒定。

1.2.3 血清樣品HI抗體效價的測定 取待檢血清0.2 mL，加入豬紅細(xì)胞懸液1滴，混勻于室溫吸收1 h，離心取上清液待檢。先用移液器向血凝板每孔加稀釋液25 μL，然后吸取待檢血清25 μL，在血凝板上倍比稀釋，最后2孔不稀釋作為對照，每孔加8單位HA抗原25 μL，最后1孔不加，作為血清對照。加完后振蕩混勻，于4 ℃冰箱靜置1～2 h判定。判定的方法是以完全不凝集為終點，在抗原對照孔完全凝集，血清對照孔完全不凝集的情況下，血清出現(xiàn)終點抑制的稀釋倍數(shù)，即為該血清的HI效價。

1.2.4 病毒的分離 采用同步接毒法，在F81細(xì)胞消化傳代后，按培養(yǎng)液量體積的1/10接入處理過的樣品，37 ℃靜置培養(yǎng)3～5 d，每天觀察有無細(xì)胞病變。如無細(xì)胞病變，則于培養(yǎng)的第4～5 d收取上清，繼續(xù)按常規(guī)傳代培養(yǎng)，至第5代仍無病變判為分離結(jié)果陰性；若出現(xiàn)細(xì)胞病變則分離結(jié)果為陽性，反復(fù)凍融3次，收毒，-20 ℃保存。

1.2.5 生物學(xué)特性鑒定

1）理化特性。按《動物病毒學(xué)》[3]規(guī)定進(jìn)行，取分離病毒的F81細(xì)胞培養(yǎng)物，分別做以下處理：50 ℃水浴作用60 min；加20%乙醚振蕩10 min，放4 ℃過夜，并無菌揮發(fā)除去全部乙醚；將病毒液調(diào)節(jié)pH為3時于4 ℃作用處理1 h，再用0.1 mol/L NaOH調(diào)至pH 7.2，進(jìn)行耐酸性試驗，然后分別用F81細(xì)胞測定其TCID50變化。

2）紅細(xì)胞血凝試驗。采用微量血凝（HA）試驗，分別用0.5%的雞、豬、大鼠、兔和人（O型）的紅細(xì)胞懸液測定病毒培養(yǎng)液的HA效價。

3）細(xì)胞敏感譜。選用貓腎傳代細(xì)胞系（F81）、犬腎傳代細(xì)胞系（MDCK）作為接種對象，分別分離得到HA效價≥1∶128的細(xì)胞培養(yǎng)液。按常規(guī)方法進(jìn)行同步接毒，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，換液，每天觀察細(xì)胞病變（CPE），4～5 d收獲凍融，再以同樣方法連傳5代，以出現(xiàn)CPE作為感染指標(biāo)。

1.2.6 動物回歸試驗

用所分離的CPV分離株1，2和3（HA效價均為1∶512～1∶2 048）對試驗犬進(jìn)行人工感染試驗。接種途徑為口服，劑量為5 mL，設(shè)空白對照組和試驗組。將幼犬隨機(jī)分為4組，每組2只。試驗Ⅰ組幼犬接種分離株1；試驗Ⅱ組幼犬接種分離株2；試驗Ⅲ組幼犬接種分離株3；將第4組設(shè)為空白對照，接種生理鹽水。對4組試驗犬進(jìn)行隔離飼養(yǎng)。接種后，每天觀察試驗犬的臨床變化并進(jìn)行體溫的測量，每3 d進(jìn)行一次白細(xì)胞計數(shù)，自接種后5 d開始收集糞便，并進(jìn)行CPV的HA/HI檢測。攻毒后觀察15 d，如無眼觀臨床癥狀、白細(xì)胞總數(shù)正常，則視為試驗犬健康。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離結(jié)果

將處理后的病料接種F81細(xì)胞后，采用同步接毒進(jìn)行病毒分離。在第一代細(xì)胞病變不明顯，但盲傳至第3～5代時，部分接毒細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞圓縮、拉網(wǎng)和脫落等細(xì)胞病變，而對照細(xì)胞排列緊密，生長旺盛，呈不規(guī)則形（見圖1～2）。試驗共從3份病料中分離出病毒，分別命名為CPV分離株1、分離株2和分離株3。

2.2 生物學(xué)特性

1）理化特性。經(jīng)50 ℃、20%乙醚和酸（pH 3.0）處理后，通過比較處理前后TCID50的變化發(fā)現(xiàn)TCID50效價相差都小于2個數(shù)量級，變化不大。說明分離毒株能抵抗乙醚、酸（pH 3.0）和熱（50 ℃），這與細(xì)小病毒理化特性一致。

2）紅細(xì)胞血凝結(jié)果。采用微量血凝試驗測定各病毒分離株對雞、豬、大鼠、兔和人紅細(xì)胞的HA效價。分離株對豬紅細(xì)胞的凝集效價達(dá)到1∶27～1∶210；而對其他紅細(xì)胞的血凝效價為20，沒有血凝性。與文獻(xiàn)記載的CPV血凝譜相符。

3）細(xì)胞感染譜。將CPV分離株在多種細(xì)胞上同步接毒培養(yǎng)5代，并每天觀察CPE。結(jié)果表明，有3株CPV分離株連續(xù)傳代后出現(xiàn)細(xì)胞病變現(xiàn)象，分別命名為分離株1、2、3。

2.3 動物回歸試驗結(jié)果

用病毒分離株感染幼犬后第5～6天，試驗組均發(fā)病。其中試驗Ⅲ組即接種CPV分離株3的2只幼犬在接種后第5天開始出現(xiàn)臨床癥狀，精神沉郁，嘔吐，排稀糞。隨后轉(zhuǎn)為拉血、脫水、食欲廢絕，最后死亡。

對病死幼犬病理剖檢發(fā)現(xiàn)空腸和回腸局部充血、粘膜脫落，腸系膜淋巴結(jié)腫脹，腸腔內(nèi)有血樣糞便。其他2組試驗組犬接種后第6天表現(xiàn)出精神沉郁，體溫增高，食欲下降，拉稀便，但后來自行康復(fù)。所有接毒試驗犬的白細(xì)胞總數(shù)均出現(xiàn)不同程度的下降。但對照犬的白細(xì)胞總數(shù)沒有明顯變化。

試驗組犬在攻毒后5～8 d，幼犬糞便的HA效價為1∶128～1∶512，對照犬的糞便HA檢測結(jié)果均為陰性。

3 討論

3.1 病毒分離

本試驗通過采集疑似CPV感染犬的糞便和內(nèi)臟，經(jīng)處理后接種于貓腎細(xì)胞分離病毒，然后通過對分離病毒的生物學(xué)特性、血凝抑制試驗和動物回歸試驗等方法對病毒株進(jìn)行了鑒定。

CPV無囊膜，用氯仿處理糞便可使有囊膜的病毒失活，有利于該病毒的分離和純化。部分出血很明顯的細(xì)小病毒樣本，反而沒有分離出病毒?？赡芤驗樵诩膊≈泻笃?，由于腸道出血，血液中的犬細(xì)小病毒抗體和細(xì)小病毒形成抗原抗體復(fù)合物，造成樣品中的病毒量減少，細(xì)胞分離呈陰性。糞便中毒素和組織分解代謝產(chǎn)物會對培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生一定的影響。因此，如何處理糞便，盡量減少對細(xì)胞的毒性，成為能否成功分離病毒的關(guān)鍵?？梢詼p少接種樣本數(shù)量（1/20～1/30），或接種后及時換液，可有效降低糞便中毒素對細(xì)胞的毒害作用，提高病毒分離率。CPV的復(fù)制須完全依賴宿主細(xì)胞DNA的復(fù)制機(jī)制，復(fù)制主要發(fā)生在細(xì)胞周期的S期晚期和G2早期，病毒的接種最好采用同步接種方式。所以，在試驗中采用了同步接毒的辦法。但由于樣本的毒性，可以在傳代后6～8 h再接種，能減少樣本對細(xì)胞的影響。

3.2 病毒鑒定

通過對分離的病毒進(jìn)行理化鑒定，發(fā)現(xiàn)所分離的病毒具有抗酸、抗脂溶劑和耐熱的特性，與文獻(xiàn)報道的細(xì)小病毒的理化性質(zhì)一致。通過對不同動物紅細(xì)胞的血凝譜測定，所分離病毒能夠凝集豬的紅細(xì)胞，不能凝集雞、兔和人的紅細(xì)胞，與報道的CPV的血凝譜一致。病毒除了能在F81細(xì)胞增殖外，病毒株2還可以在MDCK細(xì)胞增殖。病毒血凝抑制試驗進(jìn)一步確認(rèn)所分離的病毒血凝特性能夠被犬特異性細(xì)小病毒血清抑制，證明試驗中分離到的病毒為犬細(xì)小病毒。

3.3 動物回歸試驗

為了檢驗所分離犬細(xì)小病毒的致病性，進(jìn)行了動物回歸試驗，分別將3株病毒人工接種試驗犬。動物試驗結(jié)果顯示，試驗組均發(fā)病，表現(xiàn)為拉稀、脫水、精神沉郁、食欲廢絕，對照組健康。

本試驗采用F81細(xì)胞同步接毒的方式從送檢的疑似CPV感染的30份樣品中分離出3份CPV陽性樣品。并對分離病毒進(jìn)行了生物學(xué)和動物接種試驗，檢驗了分離病毒的致病性。其中分離株3可以引起接種幼犬死亡，表明是一株犬細(xì)小病毒的強(qiáng)毒株。本研究為犬細(xì)小病毒病的預(yù)防和控制提供了理論依據(jù)，同時為深入研究該病毒的致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

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篇9

1制造

1．1總體要求

重組DNA技術(shù)產(chǎn)品安全有效的保障，不僅需要對目標(biāo)產(chǎn)品的原液和成品進(jìn)行質(zhì)量控制，而且還需要對起始原材料和工藝過程進(jìn)行充分控制。即應(yīng)對包括細(xì)胞株的來源、鑒別和檢測、發(fā)酵或細(xì)胞培養(yǎng)、生產(chǎn)中使用的其它原材料、驗證純化工藝去除不需要物質(zhì)的能力(特別是可能存在的病毒污染物、來自連續(xù)培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的殘余DNA、宿主細(xì)胞蛋白等)、生產(chǎn)工藝中的過程控制、因生產(chǎn)工藝的變化對產(chǎn)品質(zhì)量安全和有效性的潛在影響，以及原液和成品全面的質(zhì)量分析均給予必須和足夠的重視。

1．2起始原材料的控制

重組DNA技術(shù)產(chǎn)品須采用經(jīng)過驗證的細(xì)胞庫系統(tǒng)進(jìn)行生產(chǎn)，首先應(yīng)將宿主與載體結(jié)合制備主細(xì)胞庫，再由主細(xì)胞庫制備工作細(xì)胞庫。并需建立相關(guān)文件，詳細(xì)描述培養(yǎng)、提取、純化的步驟以及對細(xì)胞庫批次的定義。如生產(chǎn)中使用人或動物來源的材料，則應(yīng)符合病毒安全的有關(guān)要求。

1．1．1表達(dá)載體和宿主細(xì)胞應(yīng)提供宿主細(xì)胞和表達(dá)載體起源、來源、遺傳背景和歷史的描述，包括克隆基因的來源和特性、該基因的構(gòu)建和鑒別情況，以及表達(dá)載體遺傳特性和結(jié)構(gòu)等詳細(xì)信息。同時應(yīng)提供表達(dá)載體來源和各部分功能的說明，如:復(fù)制起始位點，啟動子，抗性標(biāo)記，限制性內(nèi)切酶圖譜等。詳細(xì)描述表達(dá)載體擴(kuò)增、對宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法，以及生產(chǎn)用細(xì)胞克隆的篩選判定標(biāo)準(zhǔn)。提供表達(dá)載體在宿主細(xì)胞中的位置和物理狀態(tài)、如是否整合到染色體上，以及拷貝數(shù)和遺傳穩(wěn)定性資料。明確插入克隆基因、表達(dá)載體控制區(qū)及其兩側(cè)的核苷酸序列，與表達(dá)有關(guān)或與產(chǎn)

品質(zhì)量相關(guān)的核苷酸序列均應(yīng)詳細(xì)敘述。同時也應(yīng)詳細(xì)描述在生產(chǎn)過程中控制、提高克隆基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)水平的各種措施。1．1．2細(xì)胞庫系統(tǒng)重組DNA技術(shù)產(chǎn)品的生產(chǎn)中，其細(xì)胞庫系統(tǒng)通常包括主細(xì)胞庫和生產(chǎn)工作細(xì)胞庫。主細(xì)胞庫(maincellbank，MCB)由含目的基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的原始細(xì)胞經(jīng)傳代擴(kuò)增制成的均一懸液，并以等體積分裝于單獨容器中用于儲存(如，在液氮中)。在某些情況下，可能需要分別建立表達(dá)載體和宿主細(xì)胞的主細(xì)胞庫。工作細(xì)胞庫(workingcellbank，WCB)是從主細(xì)胞庫經(jīng)有限傳代而來的細(xì)胞材料的均一懸液，并以等體積分裝于單獨容器中用于儲存(如，在液氮中)。以上兩種細(xì)胞庫，所有的儲藏容器應(yīng)在相同條件下妥善保管，一旦取出使用，不得再返回庫內(nèi)儲藏。細(xì)胞庫類型、容量、在預(yù)期使用頻率下細(xì)胞庫的壽命、保存使用的容器和封閉系統(tǒng)、包括凍存劑、培養(yǎng)基、冷凍保存步驟和存儲條件等細(xì)胞庫制備的方法均應(yīng)詳細(xì)記錄在案，并提供在已優(yōu)化儲存條件下，庫存細(xì)胞穩(wěn)定性的證據(jù)。

1．1．3細(xì)胞庫的控制應(yīng)對主細(xì)胞庫包括重組蛋白表達(dá)和/或表達(dá)載體在內(nèi)的相應(yīng)表型和基因型標(biāo)記進(jìn)行鑒定。對特定主庫細(xì)胞基質(zhì)的檢測，可根據(jù)細(xì)胞的生物學(xué)特性和培養(yǎng)的歷史背景進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整，并且該鑒定的范圍和程度，可能會影響到后期生產(chǎn)階段細(xì)胞基質(zhì)所需常規(guī)檢查的類型和級別。應(yīng)采用分子生物學(xué)或其他適合的技術(shù)對表達(dá)載體基因拷貝數(shù)、基因插入或缺失、整合位點數(shù)量等情況進(jìn)行分析。核酸酸序列應(yīng)與表達(dá)載體一致，并與所預(yù)期表達(dá)的蛋白序列吻合。由于支原體、病毒等外源因子污染動物來源的細(xì)胞基質(zhì)后，可以進(jìn)行擴(kuò)增，同時逆轉(zhuǎn)錄病毒等內(nèi)源因子也會引發(fā)安全問題，因此對細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)、外源病毒因子的檢測十分重要。應(yīng)制定和建立細(xì)胞庫微生物有機(jī)體檢測的策略和方法，并考慮采用適當(dāng)?shù)臋z測技術(shù)以確認(rèn)某些特定病毒是否存在。通常受到內(nèi)、外源因子污染的細(xì)胞基質(zhì)是不適合用于生產(chǎn)的。但也存在例外，例如CHO和其他攜帶內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒的嚙齒類細(xì)胞株，已廣泛用于重組DNA技術(shù)產(chǎn)品的生產(chǎn)。在這種情況下，應(yīng)納入風(fēng)險降低與控制的策略，如在工藝中采用物理、化學(xué)或酶解等手段對其進(jìn)行去除或滅活。應(yīng)提供建立工作細(xì)胞庫的規(guī)程，每批WCB均應(yīng)按規(guī)定進(jìn)行一次全面的鑒別和純度測定，并制定包括分析方法、判定標(biāo)準(zhǔn)的在內(nèi)的WCB質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，新建WCB也應(yīng)符合該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求。

1．1．4細(xì)胞基質(zhì)遺傳穩(wěn)定性應(yīng)評估培養(yǎng)階段細(xì)胞基質(zhì)的穩(wěn)定性，檢測項目包括但不僅限于如:形態(tài)學(xué)特征，生長特征，生化標(biāo)記，免疫標(biāo)記，目的產(chǎn)物的表達(dá)量，或其他相關(guān)的基因型和核型標(biāo)記。插入的核苷酸序列應(yīng)至少在每一個主細(xì)胞庫培養(yǎng)期末進(jìn)行一次確認(rèn)。長期發(fā)酵的多次收獲物會導(dǎo)致一些質(zhì)量屬性的飄移，例如糖基化等。出現(xiàn)的“新”的變體可能會影響產(chǎn)品的質(zhì)量、安全和有效性。這類飄移的管理應(yīng)該在工藝驗證研究中妥善地處理，明確宿主細(xì)胞在長時間培養(yǎng)后，表達(dá)產(chǎn)物分子的完整性，并且明確細(xì)胞基質(zhì)的表型和基因型的特征，并綜合上述特征提出生產(chǎn)用細(xì)胞最高限定代次。

1．3生產(chǎn)過程控制

生物技術(shù)藥物的生產(chǎn)工藝基礎(chǔ)是采用活體表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行目標(biāo)產(chǎn)品的制備，主要包括細(xì)菌、酵母和哺乳動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)等。建議應(yīng)采用適當(dāng)?shù)姆绞?、檢測頻率，證實細(xì)胞培養(yǎng)過程中無細(xì)菌、酵母和霉菌污染。由于某些生產(chǎn)細(xì)胞株可能或含有內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒，因此應(yīng)建立相應(yīng)的工藝和可靠的分析技術(shù)，證明在培養(yǎng)過程中有效的將所有病毒清除或滅活。對目標(biāo)產(chǎn)品質(zhì)量屬性、生產(chǎn)工藝的深入理解和全面的設(shè)計，是建立可重復(fù)的、可控的工藝，保證穩(wěn)定地生產(chǎn)出符合原液和成品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的策略的一部分。因此，生產(chǎn)工藝可接受標(biāo)準(zhǔn)的限度，應(yīng)根據(jù)從研發(fā)早期到規(guī)?；a(chǎn)的整個工藝生命周期范疇中所獲得信息進(jìn)行調(diào)整。在原液和成品的生產(chǎn)中，需在關(guān)鍵決策步驟(criticaldecisionmakingsteps)實施工藝過程控制，其他工藝環(huán)節(jié)的支持?jǐn)?shù)據(jù)可確保工藝的一致性。對那些影響原液質(zhì)量的工藝參數(shù)應(yīng)制定可接受標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行控制。適當(dāng)?shù)墓に囘^程控制能夠減少對原液和/或成品常規(guī)檢測的需求。

1．3．1細(xì)胞培養(yǎng)在生產(chǎn)過程中使用的每種材料(如:溶劑，試劑，酶)都應(yīng)進(jìn)行鑒定。應(yīng)提供對這些原材料來源、質(zhì)量和控制的資料。應(yīng)適當(dāng)提供證明這些原材料(包括生物來源的原料，如:培養(yǎng)基組成物，單克隆抗體，酶)符合既定用途質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(包括外來試劑的清除和控制)及物料供應(yīng)商變更情況的資料。(1)有限傳代水平的生產(chǎn)應(yīng)限定生產(chǎn)過程中的傳代或群體倍增的最高傳代次數(shù)(將從細(xì)胞凍融到生產(chǎn)結(jié)束的最大允許天數(shù)定義為細(xì)胞壽命的限度是可接受的)。應(yīng)提供生產(chǎn)過程中培養(yǎng)、增殖和表達(dá)量一致性的數(shù)據(jù)。確立終止培養(yǎng)、廢棄培養(yǎng)物以及摒棄收獲物的標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)提供經(jīng)過長時間的培養(yǎng)后宿主細(xì)胞的表型、基因型特性以及所表達(dá)基因的分子完整性、一致性信息。證明上述特征的試驗所涉及的傳代范圍應(yīng)超過規(guī)定的細(xì)胞最高限定代次。還應(yīng)建立生產(chǎn)末期宿主細(xì)胞/載體的一致性監(jiān)測手段，如質(zhì)?？截悢?shù)及其在宿主細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)等。(2)連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn)除上述要求外，細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn)應(yīng)根據(jù)系統(tǒng)穩(wěn)定性和培養(yǎng)期間產(chǎn)品一致性的信息，明確連續(xù)培養(yǎng)的最長周期，并進(jìn)行培養(yǎng)周期全過程的監(jiān)測，監(jiān)測類型及頻率取決于產(chǎn)品和生產(chǎn)系統(tǒng)特點。應(yīng)提供生產(chǎn)中產(chǎn)品變異體或其它培養(yǎng)參數(shù)未超過標(biāo)準(zhǔn)限度的數(shù)據(jù)。建立適合于收獲階段的微生物污染常規(guī)檢測，明確收獲物后續(xù)加工中對“批次”的定義。根據(jù)宿主載體系統(tǒng)的穩(wěn)定性和產(chǎn)品特性等確定對細(xì)胞、產(chǎn)品進(jìn)行再評估的時間間隔。常規(guī)生產(chǎn)過程中，無論采用上述哪種培養(yǎng)方法，還均應(yīng)符合現(xiàn)行版《中華人民共和國藥典》“生物制品生產(chǎn)檢定用動物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程”的有關(guān)規(guī)定。

1．3．2純化(提取回收和純化extraction，recovery＆purificaiton)從發(fā)酵液或細(xì)胞培養(yǎng)液中提取、純化蛋白主要依賴于各種蛋白分離技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)或者酵母等真核發(fā)酵的優(yōu)點是其蛋白產(chǎn)物大多都會分泌到培養(yǎng)液中，因此只要去除細(xì)胞或酵母就可以初步獲得較高純度的目的蛋白;而對于大腸桿菌等原核生產(chǎn)系統(tǒng)，常需要裂解細(xì)菌才能獲得目的蛋白。分離純化中，來自宿主細(xì)胞破碎后的微量蛋白酶會破壞蛋白的穩(wěn)定性，且很難被去除，因此快速純化目的蛋白十分重要。在采用各種分離純化方法及任何新技術(shù)中，須保證分離純化手段的穩(wěn)定，如確保層析柱的柱效等性能一致。并對純化工藝中可能殘存的有害物質(zhì)進(jìn)行嚴(yán)格檢測，這些組分包括但不僅限于固定相或者流動相中的化學(xué)試劑、各類親和層析柱的脫落抗體或配基、以及可能對目標(biāo)產(chǎn)品關(guān)鍵質(zhì)量屬性造成影響的各種物質(zhì)。同時生物技術(shù)來源產(chǎn)品含有一些特定雜質(zhì)，包括病毒、支原體等外源因子、核酸、宿主蛋白、內(nèi)毒素以及源自培養(yǎng)液的各種其它殘余物質(zhì)，因此需特殊的工藝將其去除或降低至可接受的水平。殘留細(xì)胞DNA(rcDNA):生產(chǎn)工藝的優(yōu)化應(yīng)考慮到對殘留宿主DN斷的大小、殘留量和生物活性的影響。采用適宜的方式將rcDNA總量降至可接受的水平，并就降低rcDN段的大小、或者滅活其生物活性的方式進(jìn)行說明。通常產(chǎn)品中rcDNA水平應(yīng)處于小于10ng/劑量至10pg/劑量的范疇。病毒清除:對于人和動物源的細(xì)胞基質(zhì)，病毒去除或滅活工藝均應(yīng)充分顯示能去除/滅活任何污染病毒、確保原液的安全性。該工藝應(yīng)在小規(guī)模研究中驗證，并仔細(xì)選擇所用指示病毒，以評估所選擇生產(chǎn)工藝整體去除/滅活病毒的能力，并確定病毒載量下降程度明顯達(dá)到安全性邊界。

1．4生產(chǎn)工藝變更

在重組DNA產(chǎn)品的生命周期中(lifecycle)，通常因工藝改進(jìn)、規(guī)模擴(kuò)大、場地變換、穩(wěn)定性改進(jìn)、或遵循法規(guī)要求的變化而進(jìn)行相應(yīng)的變更。當(dāng)生產(chǎn)工藝發(fā)生重大變更的時候，應(yīng)對變更前后生產(chǎn)工藝對重組DNA產(chǎn)品質(zhì)量、安全性和有效性的影響進(jìn)行比較和評估。這些可比性研究雖不意味著變更前后質(zhì)量屬性必須完全相同，但須證明它們的高度相似，并且現(xiàn)有知識能充分預(yù)測并確保任何質(zhì)量屬性方面的差異對安全性和有效性無負(fù)面影響。并應(yīng)解釋重大變更的原因，評估變更對質(zhì)量、安全和有效性的潛在影響。

2質(zhì)量控制

生物技術(shù)產(chǎn)品的質(zhì)量控制與產(chǎn)品大小、結(jié)構(gòu)特征、質(zhì)量屬性復(fù)雜程度和生產(chǎn)工藝相關(guān)。其質(zhì)量控制體系主要包括:原輔料檢驗和放行、生產(chǎn)和過程控制及文件、無菌工藝、常規(guī)放行檢定等。應(yīng)通過終產(chǎn)品檢測、過程控制和工藝驗證結(jié)合的方法，確保各類雜質(zhì)已去除或降低至可接受水平。生物技術(shù)產(chǎn)品質(zhì)量控制的基本原則同樣包括使用參照物質(zhì)、用經(jīng)驗證的方法來評估已知和/或潛在產(chǎn)品、工藝相關(guān)物質(zhì)。其和傳統(tǒng)藥物質(zhì)控最主要差異是用于產(chǎn)品鑒別，一致性，純度和雜質(zhì)檢測的分析方法不同。

2．1表征分析在研發(fā)階段以物理、化學(xué)和生物學(xué)方法對重組DNA產(chǎn)品的理化特性、生物學(xué)活性、免疫學(xué)特性、純度和雜質(zhì)等進(jìn)行嚴(yán)格的表征分析鑒定是至關(guān)重要的，并有助于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的確立。對產(chǎn)品各種屬性進(jìn)行充分鑒定分析的初衷，是為了確保產(chǎn)品安全有效。因此需采用廣泛的分析技術(shù)來展示目標(biāo)分子不同的理化性質(zhì)(分子大小、電荷、等電點、氨基酸組成、疏水性等)。對糖基化等各種翻譯后修飾也應(yīng)充分鑒定，并納入適當(dāng)?shù)臋z測以確認(rèn)產(chǎn)品具有預(yù)期的構(gòu)象、聚集和/或降解狀態(tài)及其高級結(jié)構(gòu)。并應(yīng)在適合的時候或條件下，將各類新型分析技術(shù)應(yīng)用于表征分析。

2．1．1理化特性(1)一級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)，即包括二硫鍵連接方式的氨基酸序列。應(yīng)盡可能使用綜合的方法測定目標(biāo)產(chǎn)品的氨基酸序列，然后與其基因序列推斷的理論氨基酸序列進(jìn)行比較。應(yīng)注意可能存在的N末端甲硫氨酸(如:大腸桿菌來源的產(chǎn)品)，信號或者前導(dǎo)序列和另外可能的N、C末端修飾(如:乙?；?，酰胺化或者由于外肽酶導(dǎo)致的部分降解)，以及各種因N端和C端氨基酸序列變化導(dǎo)致的末端異質(zhì)性(如:C端加工、N端焦谷氨酸、脫酰胺化，氧化，異構(gòu)化，碎片化，二硫鍵錯配，N-連接和O-連接的寡糖，糖基化，聚集)。同時還應(yīng)確定游離巰基和二硫鍵，并就二硫鍵的完整性和正確性進(jìn)行分析。(2)糖基化修飾應(yīng)對糖基化修飾進(jìn)行全面的分析和確定，如糖基化修飾與清除和生物學(xué)活性相關(guān)，則應(yīng)確定糖的含量(中性糖，氨基糖和唾液酸)。另外，應(yīng)盡可能對糖鏈的結(jié)構(gòu)、糖型(觸角、多糖本身的信息及特定位點的多糖分析)以及多肽鏈的糖基化位點進(jìn)行深入分析。應(yīng)特別注意的是，糖型結(jié)構(gòu)可能與不良反應(yīng)相關(guān)(如非人類的糖型結(jié)構(gòu)或其殘基)，必要時應(yīng)進(jìn)一步就電荷異質(zhì)性進(jìn)行檢測分析。(3)高級結(jié)構(gòu)應(yīng)通過適合的物理化學(xué)方法表征高級結(jié)構(gòu)并且通過生物學(xué)功能來確認(rèn)。除生物學(xué)活性對高級結(jié)構(gòu)的確證以外，體外或體內(nèi)證實其治療功能(functionalactivityofthetherapeutic)的活性分析方法，也可作為高級結(jié)構(gòu)確證的補(bǔ)充。聚乙二醇修飾蛋白的分析不僅限于修飾的平均率，還應(yīng)包括修飾位點及占據(jù)位點的分析。

2．1．2生物學(xué)活性生物學(xué)活性是指產(chǎn)品能實現(xiàn)確定的生物學(xué)效應(yīng)的特定能力或潛力。生物學(xué)活性應(yīng)通過體外、體內(nèi)、生物化學(xué)(包括:免疫化學(xué)試驗)的方法和/或適合的物理化學(xué)分析方法評估。效價測定(如:以單位、或國際單位表示)是與產(chǎn)品生物學(xué)特性相關(guān)屬性為基礎(chǔ)的生物學(xué)活性定量分析，而含量(以質(zhì)量/重量表示)是物理化學(xué)方法測定的產(chǎn)品含量。對于效價的評價和賦值，在臨床情況下，采用反映產(chǎn)品生物學(xué)活性的生物測定是較好的方式，但在批放行中未必是可行或者必須的。例如:一些蛋白功能方面的生物學(xué)測定或者作用機(jī)制評價方法(并不是預(yù)期的臨床效果)也可作為效價分析和賦值的基礎(chǔ)。

2．1．3免疫化學(xué)特性需全面說明產(chǎn)品的相關(guān)免疫學(xué)特性。并應(yīng)使用純化的抗原和抗原確定的區(qū)域進(jìn)行結(jié)合實驗測定。如可能的話，應(yīng)確定親合力和免疫反應(yīng)性(包括與其它類似結(jié)構(gòu)蛋白的交叉反應(yīng)性)。對目標(biāo)分子中，與相應(yīng)表位作用的部分應(yīng)盡可能的表征確證，如應(yīng)包括這些結(jié)構(gòu)的生物化學(xué)鑒別(如;蛋白質(zhì)，低聚糖，糖蛋白，糖脂)和相關(guān)適合的特征研究(氨基酸序列，糖型)。由于糖基化和聚乙二醇化可能對產(chǎn)品的藥理學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生影響，并可能影響其免疫原性，因此應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋碚餮芯俊?/p>

2．1．4純度、雜質(zhì)和污染物生物技術(shù)產(chǎn)品異質(zhì)性的幾個來源(如:C-端加工，N-端焦谷氨酸化，脫酰氨化，氧化，異構(gòu)化，片段化，二硫鍵錯配，N-連接和O-連接的寡糖，糖基化，聚集)通常造成其組成中存在幾種分子或變異體，導(dǎo)致了其純度/雜質(zhì)情況的復(fù)雜性，因此需要通過綜合的方法來評估，對于產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)和雜質(zhì)應(yīng)建立個體的和/或總體的可接受標(biāo)準(zhǔn)。雜質(zhì)可能與生產(chǎn)工藝或與產(chǎn)品本身相關(guān)。如可能，這些雜質(zhì)應(yīng)盡可能地被分析鑒定，并采用適宜的方法評價其對生物學(xué)活性的影響。同時應(yīng)恰當(dāng)?shù)罔b別、評估潛在的工藝相關(guān)雜質(zhì)(如:宿主細(xì)胞蛋白，宿主細(xì)胞DNA，細(xì)胞培養(yǎng)殘留物，下游工藝的殘留物)，并對其定性和/或定量分析。污染物，包括所有引入且并非生產(chǎn)過程所需的物質(zhì)(如:各種微生物，內(nèi)毒素)。應(yīng)嚴(yán)格避免引入污染物/或?qū)ζ溥M(jìn)行相應(yīng)控制。還應(yīng)考慮采用其他檢測方法，對可能的包括肽聚糖等在內(nèi)的“非內(nèi)毒素促炎性污染物”進(jìn)行控制。(1)工藝相關(guān)的雜質(zhì)和污染物工藝相關(guān)的雜質(zhì)來源于生產(chǎn)工藝本身，主要包括細(xì)胞基質(zhì)來源、細(xì)胞培養(yǎng)來源和下游工藝來源這三類。過程相關(guān)的雜質(zhì)，并且可以分為三個主要類別:細(xì)胞物質(zhì)衍生，細(xì)胞培養(yǎng)衍生和下游衍生。另一方面，例如外源病毒等污染物，因意外引入至生產(chǎn)工藝，并且是對生產(chǎn)工藝無用的材料。(2)產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)和包括降解產(chǎn)物的雜質(zhì)為了確定各種類型的修飾，可能需要付出相當(dāng)大的努力對目標(biāo)產(chǎn)品的各種分子變異體進(jìn)行分離、鑒別和分析。當(dāng)這些變異體的活性與目標(biāo)產(chǎn)品一致時(comparable，一致性?)，這些變異體應(yīng)被包括在產(chǎn)品的純度中。但應(yīng)適當(dāng)考慮在生產(chǎn)和/或儲存期間產(chǎn)品降解產(chǎn)物是否顯著增加。3．1．5含量應(yīng)采用適宜的物理化學(xué)和/或免疫化學(xué)方法進(jìn)行含量測定。以適宜的參考品為對照，蛋白含量(以質(zhì)量/重量表示)可通過合適的方法進(jìn)行測定(如:HPLC)。蛋白含量也能通過一個絕對定量的方法測定，例如:采用280nm處的消光系數(shù)，并以紫外分光光度法測定。建議采用第二種絕對定量的含量測定方法進(jìn)行溯源和驗證，如果偏差太大，應(yīng)考慮采用其他方法重新測定。

2．2常規(guī)放行質(zhì)量控制在原液和成品的日常放行檢定中，并不需要進(jìn)行所有的表征分析檢測。其中一些檢測可能僅需在最初和/或定期進(jìn)行，以建立或驗證產(chǎn)品在生產(chǎn)過程的有效性或可接受性，如對生產(chǎn)初期的批次進(jìn)行全面深入的表征分析，以確認(rèn)在鑒別、純度和效價等方面的一致性。而另一些檢測要求在常規(guī)質(zhì)量控制中進(jìn)行。應(yīng)對某一特定質(zhì)量屬性是否放入常規(guī)放行標(biāo)準(zhǔn)予以說明。應(yīng)對一定數(shù)量的連續(xù)批次進(jìn)行分析，以確定分析參數(shù)的一致性。任何批間的差異均應(yīng)得到關(guān)注。應(yīng)根據(jù)這些研究中得到的數(shù)據(jù)，綜合臨床和非臨床研究，以及穩(wěn)定性評價中收集的數(shù)據(jù)作為建立產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是一系列包括各種分析方法、及含有具體數(shù)值限度、范圍可接受標(biāo)準(zhǔn)的綜合描述。其目的是為了使原液、成品或原料在其生產(chǎn)的各階段符合其預(yù)期用途所建立的一系列標(biāo)準(zhǔn)。“符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)”意味著當(dāng)按照列出的分析程序檢測原液和成品時，其質(zhì)量符合可接受標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的可接受范圍應(yīng)依據(jù)研發(fā)過程收集的數(shù)據(jù)，包括從非臨床、臨床和穩(wěn)定性研究得到的數(shù)據(jù)。可接受標(biāo)準(zhǔn)的范圍確定應(yīng)該考慮到所使用的分析方法的靈敏度。

2．1．1鑒別鑒別實驗應(yīng)高度特異，并應(yīng)基于分子結(jié)構(gòu)和/或其他專有屬性的獨特之處進(jìn)行分析(如:肽圖，抗獨特型免疫或其他適宜的方法)。根據(jù)不同產(chǎn)品，其鑒別試驗可能需要不止一種檢測(物理化學(xué)的、生物和/或免疫化學(xué))，這些檢測應(yīng)具備充分的特異性，以區(qū)分在同一生產(chǎn)設(shè)施下生產(chǎn)的其它產(chǎn)品。

2．1．2純度和雜質(zhì)需采用類似正交組合的方法來評估重組DNA產(chǎn)品純度/雜質(zhì)的復(fù)雜的情況，并為產(chǎn)品相關(guān)的變異體建立單獨和/或總體的可接受標(biāo)準(zhǔn)。此外如適用，這些控制可進(jìn)一步的確保產(chǎn)品的一致性。質(zhì)量控制計劃中包括的對工藝相關(guān)雜質(zhì)的質(zhì)量控制(如:蛋白A、宿主細(xì)胞蛋白、DNA、其他潛在的培養(yǎng)或純化殘留物)是原液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的典型組成部分。在一些情況下，如經(jīng)充分證明，工藝相關(guān)雜質(zhì)的質(zhì)量控制可在恰當(dāng)工藝步驟中的中間產(chǎn)品進(jìn)行。如經(jīng)充分驗證，生產(chǎn)工藝對工藝相關(guān)雜質(zhì)的去除已達(dá)到高水平時，則這些工藝相關(guān)雜質(zhì)的測定并非必須列入常規(guī)放行標(biāo)準(zhǔn)。

2．1．3效價效價測定是以產(chǎn)品生物學(xué)特性相關(guān)屬性為基礎(chǔ)的生物學(xué)活性定量分析，并且只要有可能，效價測定應(yīng)反映或模擬其作用機(jī)制。比活性(每毫克產(chǎn)品具有的生物學(xué)活性單位)對證明產(chǎn)品的一致性具有重要的價值。只要有可能，原液和最終制劑的每個批次的效價應(yīng)該使用適宜的國家或國際參比品，這個參比品的單位生物活性(比活性)通常已經(jīng)過校準(zhǔn)，例如國際單位(IU)。如果沒有這樣的參比品，經(jīng)批準(zhǔn)的內(nèi)控參比品也可以用于方法的標(biāo)準(zhǔn)化(saystandardization)。

2．1．4含量采用適宜方法和參考品作為對照，測定原液和成品的含量3．1．5常規(guī)檢測應(yīng)該根據(jù)相關(guān)產(chǎn)品的個論視情況而定。檢測可以包括外觀(例如，形狀、顏色)、溶解度、pH值、摩爾滲透壓、裝量、無菌、細(xì)菌內(nèi)毒素、穩(wěn)定劑和水分、可見和亞－可見微粒。

2．3包裝及密閉容器系統(tǒng)原液和成品密閉容器系統(tǒng)的描述應(yīng)包括容器組成成份的說明。如果蛋白質(zhì)和制劑輔料和/或容器包裝系統(tǒng)發(fā)生物理化學(xué)作用，可能導(dǎo)致潛在的免疫原性復(fù)合物形成。應(yīng)評估但不僅限于容器吸附、產(chǎn)品和包裝材料之間的浸出、容器完整性、產(chǎn)品免于污染及保持無菌的適用性，并描述預(yù)期用途。

3標(biāo)簽、儲存和運輸

除按中國藥典對藥品標(biāo)簽規(guī)定的內(nèi)容外，標(biāo)簽還應(yīng)標(biāo)示下列內(nèi)容:(1)每毫升的國際單位數(shù)(如必要);(2)每瓶容器的單抗含量或蛋白含量;(3)每瓶容器中液體樣品的體積;(4)凍干粉中;(5)所加復(fù)溶液體的名稱及體積;(6)復(fù)溶后的使用期限，確保該期限內(nèi)各項檢測均應(yīng)符合規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn);(7)使用之前進(jìn)行適量稀釋(如果需要)。運輸條件應(yīng)能確保產(chǎn)品保持在適合的環(huán)境條件下。

4討論及展望

篇10

【關(guān)鍵詞】 胃腫瘤 胃癌 生物學(xué)特性 病理學(xué)分型 化學(xué)療法 生存期

胃癌的腹膜種植轉(zhuǎn)移是胃癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)的主要原因［1］，而胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移對胃癌的預(yù)后有一定的影響。作者對289例胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和漿膜脫落細(xì)胞進(jìn)行研究，擴(kuò)大手術(shù)范圍，采用術(shù)前、術(shù)中化療，以探討胃癌生物學(xué)特性與預(yù)后的關(guān)系，為預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，延長生存期，提高生存質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 資料和方法

1．1 一般資料 1990年—1999年我院共施行進(jìn)展期胃癌手術(shù)289例，男210例，女79例。年齡40～77歲，平均65歲。

1．2 方法 胃癌手術(shù)開腹后探查前用100～150 ml生理鹽水倒入腹腔上部或盆腔，輕輕攪動后收集沖洗液，離心沉淀，吸取有核細(xì)胞層涂片4～6張，以瑞氏法和蘇木精－伊紅染色鏡下觀察有無脫落細(xì)胞，并對沖洗液的有核細(xì)胞層懸液進(jìn)行了臺盼藍(lán)染色觀察。

1.3 病理學(xué)分型及分組 根據(jù)病理學(xué)分型，分為高分化腺癌組（n＝135）、中分化腺癌組（n＝83），低分化腺癌組（n＝51）和其他病理類型組（n＝20），回顧性分析術(shù)后3年和5年生存率、復(fù)發(fā)及死亡原因。

1.4 術(shù)式及化療方案 根據(jù)腫瘤分期、部位、類型選擇D2、D3、D4式手術(shù)?；煼桨福盒g(shù)前選用FAM方案，術(shù)中溫生理鹽水420 ml+5-Fu 500 mg腹腔灌注沖洗。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用行×列表χ2檢驗，P

2 結(jié) 果

2.1 不同分化程度胃腺癌患者不同術(shù)式及化療方案3年生存率的比較 見表1。

2.2 不同分化程度胃腺癌患者不同術(shù)式及化療方案5年生存率的比較 見表2。表1 3種分化胃腺癌患者不同術(shù)式及化療方案3年生存率的比較表2 3種分化胃腺癌患者不同術(shù)式及化療方案5年生存率的比較組內(nèi)與D2清除及D3、D4清除比較：P＜0.05

2.3 其他病理類型組生存情況 其他3種類型胃癌病例較少，其中印戒細(xì)胞癌9例，黏液細(xì)胞癌7例，其他類型癌4例（包括未分化癌、不能分類的癌等）。這20例患者亦采用了以上幾種手術(shù)方式，經(jīng)統(tǒng)計，無論采用何種術(shù)式及術(shù)前、術(shù)中是否化療，生存期均未超過1年。

2.4 不同分化胃腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、沖洗液脫落細(xì)胞學(xué)陽性率、網(wǎng)膜種植轉(zhuǎn)移率情況 見表3。表3 不同病理分型患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、沖洗液脫落細(xì)胞陽性率和網(wǎng)膜種植轉(zhuǎn)移率情況

2.5 胃癌死亡原因 本組死亡病例共84例，其中腹腔廣泛種植轉(zhuǎn)移52例，肝轉(zhuǎn)移22例，其他原因10例。

3 討 論

胃癌的發(fā)病率及死亡率始終居消化系統(tǒng)惡性腫瘤之前列。當(dāng)今胃癌的淋巴結(jié)清除范圍，應(yīng)根據(jù)患者的胃癌病期和癌腫的生物學(xué)特性加以區(qū)別對待。在此原則下，應(yīng)充分考慮到患者的諸多個體特點，優(yōu)選出合理的手術(shù)方案。對胃癌應(yīng)根據(jù)不同病理類型和不同的病期選擇合理的治療方案，術(shù)前對于病理類型的判斷尤為重要。很多研究表明新輔助化療可以提高進(jìn)展期胃癌的手術(shù)切除率及改善預(yù)后，因而廣受重視。本組結(jié)果顯示，早期及高分化癌的手術(shù)根治率較高，行新輔助化療的意義不大，中晚期及高惡度胃癌則明顯可以看出其作用，故術(shù)前對患者進(jìn)行腫瘤分期和明確病理類型極為重要。

許多文獻(xiàn)表明新輔助化療可以提高進(jìn)展期胃癌的手術(shù)切除率及預(yù)后，因而廣受重視。早、中期胃癌手術(shù)切除治療率高，行新輔助化療的意義不大。腫瘤腹腔廣泛播散或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者預(yù)后太差，也不應(yīng)納入其范疇內(nèi)。所以準(zhǔn)確的術(shù)前術(shù)中分期對病例的術(shù)式選擇至關(guān)重要［2］。從本組可以看出，腫瘤細(xì)胞分化程度越低，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越多，腹膜種植轉(zhuǎn)移概率越高，說明其浸潤廣泛，對術(shù)后5年生存率有明顯的影響。胃癌新輔助化療有幾個優(yōu)勢：①可以殺滅術(shù)區(qū)以外的亞臨床轉(zhuǎn)移灶，預(yù)防醫(yī)源性腫瘤播散。②殺滅癌細(xì)胞，降低臨床分期，增加手術(shù)切除率或根治性切除的機(jī)會。③獲得腫瘤的個體藥敏資料，為術(shù)后選擇輔助化療提供依據(jù)。④腫瘤對化療的效果是判斷患者預(yù)后的指標(biāo)之一。

腹膜種植轉(zhuǎn)移是胃癌患者術(shù)后最常見的復(fù)發(fā)形式，由于其早期診斷有一定困難，目前腹膜種植轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)患者尚無有效的治療方法［3］。從死因可以看出，患者術(shù)后復(fù)發(fā)主要為腹膜種植轉(zhuǎn)移，術(shù)中預(yù)防醫(yī)源性癌細(xì)胞脫落尤為重要。術(shù)中應(yīng)注意無瘤操作技術(shù)，不用紗布擦拭手術(shù)野外的臟器，盡量減少暴露、擦拭、損傷腹膜，以免增加癌細(xì)胞的黏附因素；盡量防止血液流入腹腔，去除白細(xì)胞、血小板高黏附癌細(xì)胞的因素；同時腹腔灌注化療必不可少，優(yōu)點是腹腔內(nèi)藥物濃度高，可有效殺滅脫落的癌細(xì)胞。術(shù)前或術(shù)中證實有腹膜轉(zhuǎn)移患者，除術(shù)中化療以外，應(yīng)于術(shù)后輔以腹腔灌注化療及全身化療，可望減少術(shù)后腹膜種植復(fù)發(fā)率。

手術(shù)范圍的選擇也極為重要。一些學(xué)者認(rèn)為擴(kuò)大胃周圍淋巴結(jié)清除能夠提高患者術(shù)后5年生存率，并且淋巴結(jié)清除及病理學(xué)檢測對術(shù)后的正確分期判斷預(yù)后、指導(dǎo)術(shù)后監(jiān)測和選擇術(shù)后治療方案都有重要的價值［4］。D3術(shù)式在高分化癌中，并不比D2能提高生存率，反而增加了手術(shù)風(fēng)險，而對于低度分化癌中，D3術(shù)式則是明顯提高了5年的生存率，故根據(jù)病理切片類型選擇術(shù)式，對于胃癌的預(yù)后也有明顯的影響。從本組結(jié)果可以看出：高中分化腺癌行D2術(shù)式已能完成患者的治療，而D3術(shù)式并不比D2術(shù)式生存率高，術(shù)前化療及術(shù)中的腹腔化療并不能提高生存率，反而增加了患者的創(chuàng)傷。低度分化癌單純的擴(kuò)大手術(shù)范圍及單純的腹腔沖洗、單純的術(shù)前化療，均能延長患者的生存期，而且聯(lián)合應(yīng)用時更明顯地增加了療效。 印戒細(xì)胞癌、黏液細(xì)胞癌等極高惡度胃癌，無論采取何種術(shù)式或是否采用術(shù)前術(shù)中化療，均不能明顯延長生存期。我們的研究結(jié)果表明，胃癌治療應(yīng)根據(jù)其生物學(xué)特性及病理學(xué)分型，采用合適的手術(shù)范圍及術(shù)前術(shù)中化療等措施，可明顯延長生存期，改善生存質(zhì)量。

總之，在胃癌治療過程中，應(yīng)重視其生物學(xué)特性對預(yù)后的影響，結(jié)合病理診斷及其分期，采取不同的術(shù)式，術(shù)前術(shù)中采用不同的預(yù)防措施，可明顯延長患者的生存期及改善生存質(zhì)量。胃癌的治療選擇及預(yù)后取決于多種因素，本文僅從病理類型方面作了初步探討，其他因素的影響還有待深入研究。

【參考文獻(xiàn)】

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［2］ Fink U， Stein HJ， Schuhmacher C， et al. Neoadjuvant chemotherapy for gastric cancer： update［J］. World J Surg，1995，19(4)：509-516.