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【關(guān)鍵詞】結(jié)腸損傷；腸管吻合術(shù)；造口術(shù)

【中圖分類號】R574.62 【文獻標識碼】B 【文章編號】1007-8231（2011）11-1910-01

近年來結(jié)腸損傷Ⅰ期切除吻合術(shù)的文獻報道較多［1，2]，但多為病例回顧性分析，少見對臨床病例隨機分組用2種不同手術(shù)方式對比研究文獻資料或2種術(shù)式對照的大樣本動物實驗報告。本研究旨在探討人類左半結(jié)腸損傷的手術(shù)方式及其生存狀況的實驗研究，以指導臨床創(chuàng)傷搶救工作。

1 材料及方法

1.1 結(jié)腸損傷腹腔感染動物模型制作

健康新西蘭白兔50只，體重2.0～2.5kg。用氯氨酮(20mg/kg)肌肉注射麻醉，無菌操作下由中下腹正中線剖腹，切口長約4～6cm，進腹后輕緩找出盲腸，在盲腸中部用14號套管針頭貫穿三處擠出腸內(nèi)容物后放回腹腔，關(guān)腹。盲腸穿孔后動物予以統(tǒng)一攝食和飲水。于術(shù)后24小時隨機分為實驗、對照兩組，每組25只。

1.2 結(jié)腸切除吻合術(shù)模型制作

對照組：入腹后探查到穿孔處腸段，將損傷腸段切除，注意保護腸管良好的血供，吻合術(shù)采用“0”線雙層間斷縫合，后壁10～12針，前壁12～14針，兩側(cè)端行半荷包縫合，術(shù)畢檢查吻合口通暢無出血、無漏針，關(guān)閉腸系膜裂孔以防內(nèi)疝。腹腔用0.4%替硝唑液約10ml保留腹腔，關(guān)閉腹腔。

1.3 結(jié)腸切除吻合加近端結(jié)腸造口術(shù)模型制作

實驗組：損傷段腸管切除方法同對照組，完成腸吻合術(shù)后，距吻合口近端6～8cm處，選結(jié)腸系膜無血管區(qū)腸段提出腹壁外，將腹壁肌層用“4”線水平褥式縫合1針，結(jié)腸近、遠端與腹膜腹壁肌層用“1”線各間斷縫合3針，將結(jié)腸固定在腹壁上，防止腸管滑脫入腹腔，造成狹窄、梗阻或出血。術(shù)后用4號圓刀片切開結(jié)腸前壁，使糞便流出，碘伏紗布保護造瘺口防止感染。腹腔用0.4%替硝唑液約10ml保留腹腔內(nèi)，關(guān)閉腹腔。

1.4 手術(shù)后治療方案

實驗、對照兩組術(shù)后所有動物禁食3天，均給予5%GNS 500ml+VitC 2.0g+VitB6 0.2g+10%KCl 5ml/ivdrip，0.4%替硝20ml/ivdrip連續(xù)3天，頭孢噻肟鈉50mg/kg/im Bid連續(xù)7天。術(shù)后觀察指標：(1)一般情況：動物精神狀態(tài)，活動狀況，有無覓食行為;(2)呼吸：正常白兔呼吸30～60次/min，過快時預示體溫升高;(3)腹部：有無腸脹氣，有無大便及大便性狀，造瘺口是否有大便排出及排出量多少;(4)切口：有無出血、感染或造瘺口梗阻;(5)采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)法監(jiān)測白兔血清中腫瘤壞死因子α(TNFα)、白細胞介素8(IL8)、酶譜、糖代謝的變化，準確記錄動物死亡時間，進行尸體解剖，觀察切口或造瘺口有無感染表現(xiàn)，剖腹查看腹腔感染情況、吻合口愈合情況或吻合口瘺;(6)切取死亡動物心、肝、肺、腎及吻合口上下端腸段，按動物編號送病理學檢查。

計量資料以均值±標準差(±s)表示，作單因素方差分析，分類資料作χ2 檢驗數(shù)據(jù)用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件處理，P

1.5 實驗結(jié)果

兩組動物手術(shù)順利，術(shù)后均能迅速蹲立位。對照組18例存活，7例因腸吻合口瘺于術(shù)后72～168小時死亡。實驗組24例存活，1例因嚴重消耗于術(shù)后240小時死亡，無吻合口瘺發(fā)生。兩組白兔血清中TNFα、IL8、血糖(Glu)、胰島素(INS)、C肽、AMY、CK、CKMB、AST、ALT檢測值與術(shù)前對照、組間對照均無顯著性差異，無明顯統(tǒng)計學意義。

2 討 論

盲腸是兔結(jié)腸重要組成部分，長約50～60cm，其病理生理、形態(tài)學特點、解剖學特點與人體左半結(jié)腸相近，但在功能上要比人類復雜的多，其細菌含量高，一旦損傷極易造成腹腔感染。因此，選擇白兔盲腸制作模型更具代表性。

成功制作結(jié)腸損傷伴腹腔感染動物模型是本研究課題的關(guān)鍵條件。本組采用改良盲腸結(jié)扎針刺穿孔法(CLP)法Flammand［3]的方法制作結(jié)腸損傷伴腹腔感染動物模型，并于結(jié)腸損傷24小時后手術(shù)，開腹探查見腹腔內(nèi)腸穿孔處腸壁腫脹明顯，并可見腸內(nèi)容物外溢及膿苔附著，證實結(jié)腸損傷伴腹腔感染動物模型制作成功。

文獻報道TNFα、IL8對人類嚴重創(chuàng)傷后并發(fā)癥的發(fā)生有預警作用［4]，本項研究對實驗動物按實驗標準要求每天抽血監(jiān)測，連續(xù)10天，結(jié)果顯示兩組白兔血清中血糖(Glu)、胰島素(INS)、TNFα、IL8、C肽、AMY、CK、CKMB、AST、ALT檢測值只有3例升高，與術(shù)前對照、組間對照均無顯著性差異，無明顯統(tǒng)計學意義。

本項研究表明結(jié)腸損傷段腸管切除吻合加結(jié)腸造口術(shù)安全可靠。由于結(jié)腸壁薄，血運較差，腸內(nèi)容物流動性差，其細菌含量高，易脹氣，損傷后周圍污染重等原因，結(jié)腸破裂縫合后愈合能力差，容易導致吻合口瘺和腹腔感染。本項研究對照組7例吻合口瘺并腹腔嚴重感染死亡，尸體解剖切取心、肝、肺、腎病理學檢查，病理證實吻合口瘺并膿腫形成，心、肝、肺、腎臟器有一定程度病理形態(tài)學改變及器官功能障礙。實驗組1例于術(shù)后240小時死亡，死于嚴重消耗。對實驗結(jié)果進行分析，P

參考文獻

［1］ 廖金透,牛軍民,劉潞慶.左半結(jié)腸損傷一期手術(shù)25例臨床分析［J].浙江臨床醫(yī)學,2007,9(5)：625-626.

［2] 王金錄.結(jié)腸損傷的診治體會［J].天津醫(yī)科大學學報，2007,13(1):41-43.

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[關(guān)鍵詞] 牙周炎； 動脈粥樣硬化； C反應蛋白； 白細胞介素-6； 白細胞介素-1β

[中圖分類號] R 781.4 [文獻標志碼] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.03.021

An animal experiment study on the effect of periodontitis on atherosclerosis Wang Zhou1, Zhang Mingzhu1, Yu Zhuo2, Shui Yanqing1, Ding Yun1, Lei Yayan1. （1. Dept. of Oral Medicine, The Affiliated Stomatology Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650031, China; 2. Dept. of Cardiovascular Medicine, The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650031, China）

[Abstract] Objective To make an animal periodontitis and atherosclerosis compound model, and to study the effects of periodontitis on atherosclerosis. Methods 36 Japan rabbits were randomly divided into four groups: Including perio-dontitis model group, periodontitis and atherosclerosis compound model group, atherosclerosis model group and control group. Periodontitis model was initiated by ligating floss around teeth cervical and oral inoculating with Porphyromonas gingivalis（P. gingivalis）. Atherosclerosis was established by single iliac artery of balloon-injured rabbit. Histopathological change of injured iliac artery was observed under optical microscope after hematoxylin-eosion stain. Elastica van Gieson-

stained sections were used for the morphometric analysis. We measured intimal and medial lesion areas in iliac artery cross-sections as well as the intimal/medial ratio（I/M）. We also analyzed P. gingivalis 16S rDNA amplification with

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目的:探討小兒珠珀散治療感冒的藥物效應，為臨床應用提供參考。方法:針對感冒過程中兒童可能出現(xiàn)的發(fā)熱、咳嗽、痰多、消化不良等癥狀，分別利用脂多糖(LPS)致熱家兔，氨水誘發(fā)小鼠咳嗽，酚紅排泌法、半固體營養(yǎng)糊小鼠腸推進實驗探討小兒珠珀散對癥治療的作用。結(jié)果:小兒珠珀散可降低小鼠耳腫脹程度、家兔體溫上升幅度;延長小鼠咳嗽潛伏期，減少咳嗽次數(shù)，減少小鼠氣管酚紅排出量;促進小鼠胃排空，增加小鼠小腸推進率(P均<0.05)。結(jié)論:小兒珠珀散可緩解感冒過程中的多種癥狀。

關(guān)鍵詞：

小兒珠珀散 感冒 咳嗽 發(fā)熱 胃腸動力

Animal Experimental Study on Pharmacodynamics of Xiao'er Zhupo Powder in the Treatment of Cold

Wang Min Li Pengfei Li Yaqi Ma Quantao Wang Jingkang Zhang Chi Qiu Minyi Zhang Caijuan Yan Qizhi Wang Ting Zhao Baosheng

School of Chinese Materia Medica,Beijing University of Chinese Medicine; Hong Kong Baohetang Pharmaceutical Co.,Ltd.; Beijing Institute of Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine;

Abstract：

Objective: To probe into the pharmacodynamics of Xiao'er Zhupo powder in the treatment of cold,so as to provide reference for clinical application. Methods: In view of the symptoms such as fever,cough,phlegm and dyspepsia in children with cold,the symptomatic treatment of Xiao'er Zhupo powder for children was investigated by lipopolysaccharide( LPS)-induced fever in rabbits,ammonia-induced cough in mice,phenol red excretion method and semi-solid nutrient paste intestine propulsion experiment. Results:Xiao'er Zhupo powder could reduce the ear swelling degree of mice,decrease the temperature ascending range of rabbits,prolong the cough latency of mice,reduce the cough times and tracheal phenol red excretiona,promote the gastric emptyness of mice,and increase the intestinal propulsion rate of mice( P<0. 05). Conclusion: Xiao'er Zhupo powder can relieve a variety of symptoms of cold.

Keyword：

Xiao'er Zhupo powder; cold; cough; fever; gastrointestinal motility;

感冒一年四季均可發(fā)生，但以冬春季節(jié)為多[1]。現(xiàn)代醫(yī)學認為感冒為多種病原體引發(fā)的急性上呼吸道感染，可引發(fā)鼻、咽、喉、扁桃體等黏膜充血水腫，上皮細胞破壞、漿液、黏液及膿液滲出產(chǎn)生鼻塞、咳嗽等上呼吸道炎性癥狀，并有頭痛、惡寒發(fā)熱等全身癥狀，主要病原體為病毒，其中鼻病毒占30%～40%，冠狀病毒占10%～15%[2]。針對普通感冒病毒，當前尚無特效藥，臨床一致認為普通感冒對癥治療即可，無需服用抗微生物藥物。兒童由于呼吸系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)發(fā)育不成熟，更容易受到病毒侵襲，為感冒高發(fā)群體。臨床上治療感冒的藥品種類繁多，主要是成人型感冒藥，兒童專用型感冒藥相對匱乏，但由于兒童身體機能與成人區(qū)別較大，不宜將成人型感冒藥直接用于兒童。市售兒童感冒藥主要為化學藥物，不合理使用極易引發(fā)嚴重后果[3]。這些兒童感冒藥主要為減充血劑、抗組胺藥、解熱鎮(zhèn)痛藥、鎮(zhèn)咳藥、祛痰藥等，而復方制劑通常為上述兩類或幾類藥物合用，不良反應較多，使用不當會對兒童機體造成較大的損傷[4-5]。

中國傳統(tǒng)醫(yī)學認為感冒多為外感六、時疫所致。風邪為六之首，流于四時之中，與不同季節(jié)之邪氣相合傷人，臨床可見風熱、風寒、暑濕等證。小兒體性純陽，外感風邪，易入里化熱，熱多于寒，風寒證也易寒從熱化，或熱為寒閉，故小兒外感以熱證多見。風邪傷人，先從口鼻而入，肺為華蓋，首當其沖，感冒病位在肺衛(wèi)，肺主皮毛，其宣發(fā)之功使皮毛得以溫潤，皮毛受病，肺失宣發(fā)，則為感冒。又因小兒肺臟嬌嫩，不耐邪擾，肺氣失宣，肅降無權(quán)，水失通調(diào)，聚濕成痰，痰阻氣道。脾為后天之本，主運化水谷，小兒脾常不足，飲食不知自節(jié)，感邪之后，肺病及脾，脾失健運，乳食停滯，積而不化，阻滯中焦。故小兒感冒初起以發(fā)熱、惡寒、鼻塞、流涕、噴嚏、咳嗽、頭痛等為主要表現(xiàn)，并伴隨有感冒夾痰、食滯之證[6]。故治療小兒感冒需以解表散熱為主，治療兼夾證則在解表的基礎上分別配合化痰、消導之法，虛弱者可采用扶正解表法[7]。

本實驗受試藥物小兒珠珀散由保和堂兒童感冒治療驗方珠珀猴棗散演變而來，具有多年兒童感冒治療史，復方由13味中藥組方而成，其中金銀花、防風、薄荷疏風散熱;猴棗、天竺黃清心化痰;珍珠、琥珀、茯苓、鉤藤安神定驚;冰片醒神開竅;麥芽、神曲消食化積，健脾和胃;甘草祛痰止咳，補脾益氣。諸藥合用，共奏祛風清熱、安神定驚、化痰順氣、開胃消積之功效[8-10]。本實驗擬利用經(jīng)典的藥理學實驗方法探討小兒珠珀散的解熱、止咳祛痰作用及其對消化道的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

美國癌癥研究所(ICR)小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，購于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，許可證號:SCXK(京) 2016-0002;清潔級新西蘭白兔，雌雄各半，2.0～2.5 kg，購于北京興隆實驗動物養(yǎng)殖中心，許可證號:SCXK(京) 2016-0003，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學屏障環(huán)境動物室，許可證號:SYXK(京) 2016-0038。

1.1.2 藥品和試劑

小兒珠珀散(香港保和堂制藥有限公司，實驗劑量依據(jù)臨床兒童用藥設定);醋酸地塞米松(天津力生制藥股份有限公司，批號1605019);沐舒坦(上海勃林格翰藥業(yè)公司，批號A42044);咳必清(國藥集團容生制藥有限公司，批號16090711);健胃消食片(江中藥業(yè)股份有限公司，批號16120095);阿司匹林泡騰片(阿斯利康制藥有限公司，批號H32026201)。二甲苯(北京化工廠，批號20170506);羧甲基纖維素鈉(CMC-Na,Whatman，批號BS0308);酚紅(Sigma，批號51N00120);碳酸氫鈉(國藥集團化學試劑公司，批號20160819);可溶性淀粉(國藥集團，批號20170414);石蠟油(北京鼎國生物技術(shù)有限公司);安琪高活性酵母(安琪酵母股份有限公司)。

1.1.3 儀器

YLS-25A型電動耳腫打孔器(濟南益延科技發(fā)展有限公司);ME104E型分析天平(METTLER TOLEDO);YLS-7C型足趾容積測量儀(濟南益延科技發(fā)展有限公司);FLUO star Omega全自動多功能酶標儀(BMG LABTECH);MNT-150型游標卡尺(上海美奈特實業(yè)有限公司);980型醫(yī)用超聲霧化器(上海新天緣醫(yī)療用品有限公司);ST 5000型p H計(奧豪斯儀器有限公司);Biofuge Primo型離心機(美國Thermo scientific);獸用體溫計(山東尚農(nóng)電子科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 用藥劑量

小兒珠珀散兒童最大用量為1.8 g/d，實驗用動物均為成年動物，因此用藥劑量按照成年人推算，擬定兒童體質(zhì)量為20 kg，成人體質(zhì)量為60 kg，實驗用藥擬按照兒童用藥3倍計算，實驗劑量換算為5.4 g/d，經(jīng)換算得小鼠等效劑量為0.9 g/kg，家兔等效劑量為0.36 g/kg。

1.2.2 小兒珠珀散抗炎作用研究

小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量隨機分為6組，即正常組、模型組、地塞米松組(1.90 mg/kg)、小兒珠珀散高劑量組(1.80 g/kg)、中劑量組(0.90 g/kg)、低劑量組(0.45g/kg)，每組16只。受試藥物均以0.5%CMC-Na混懸，灌胃給藥，0.1 m L/10 g，每日1次，連續(xù)7 d，正常對照組及模型組灌胃等量CMC-Na。實驗前禁食不禁水12 h，末次給藥1 h后，移液器吸取二甲苯20μL均勻涂抹于右耳(兩面)，0.5 h后，頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼，用電動耳腫打孔器于左右耳相同部位取直徑8 mm的耳片，稱質(zhì)量，觀察各組差異，并計算腫脹度及腫脹抑制率。腫脹度(mg)=右耳片質(zhì)量-左耳片質(zhì)量;腫脹抑制率(%)=(模型組腫脹度-給藥組腫脹度)/模型組腫脹度×100%。

1.2.3 小兒珠珀散祛痰作用研究

小鼠適應性飼養(yǎng)1周，按體質(zhì)量隨機分為5組，即正常對照組、沐舒坦組(20 mg/kg)、小兒珠珀散高劑量組(1.80 g/kg)、中劑量組(0.90 g/kg)、低劑量組(0.45 g/kg)，每組16只，雌雄各半。受試藥物均以0.5%CMC-Na混懸，灌胃給藥，0.1 m L/10 g，每日1次，連續(xù)7 d，正常組灌胃等量CMC-Na。末次給藥30 min后，腹腔注射0.5%的酚紅溶液0.1 m L/10 g,30 min后處死動物，背位固定，沿頸部正中剪開皮膚，剝離氣管周圍組織，暴露氣管，自甲狀軟骨下及氣管分支處分別結(jié)扎，剪下氣管，放入盛有2 m L 5%的碳酸氫鈉溶液的EP管中，靜置30 min。酶標儀測定546nm波長處OD值。做酚紅標準曲線，根據(jù)標準曲線計算氣管酚紅排泌量。

1.2.4 小兒珠珀散止咳作用研究

小鼠適應性飼養(yǎng)1周，實驗前禁食不禁水12 h，置于5 000 m L自制玻璃裝置內(nèi)，打開霧化器，恒壓噴入25%氨水，持續(xù)30 s，觀察小鼠的咳嗽反射(腹肌強烈收縮，同時張嘴呼氣為準)，1 min內(nèi)咳嗽次數(shù)≥3次判定為引咳初篩合格。取初篩合格的80只小鼠，按體質(zhì)量隨機分成5組，即模型組、咳必清組(16.67 mg/kg)、小兒珠珀散高劑量組(1.80 g/kg)、中劑量組(0.90 g/kg)、低劑量組(0.45 g/kg)，每組12只，雌雄各半。受試藥物均以0.5%CMC-Na混懸，灌胃給藥，0.1 m L/10 g，每日1次，連續(xù)7 d，模型組小鼠灌胃給予等量CMC-Na。末次給藥1 h后，將小鼠置于上述裝置，秒表記錄時間，觀察小鼠咳嗽潛伏期(從開始噴霧到出現(xiàn)第一次咳嗽的時間)及3 min內(nèi)咳嗽次數(shù)，并計算抑咳率。抑咳率(%)=(模型組小鼠咳嗽次數(shù)-給藥組小鼠的咳嗽次數(shù))/模型組小鼠咳嗽次數(shù)×100%。

1.2.5 小兒珠珀散解熱作用研究

家兔適應性飼養(yǎng)3 d，適應性測定家兔體溫:將涂有石蠟油的電子體溫計插入家兔直腸內(nèi)6 cm(在6 cm處用膠帶固定，確保插入的深度一致)，待穩(wěn)定后記錄肛溫。選取基礎溫度在38.5℃～39.5℃，且波動在0.4℃內(nèi)的家兔納入實驗。選取符合標準的家兔共50只，雌雄各半，按給藥劑量隨機分為5組:模型組、阿司匹林組(0.13 g/kg)、珠珀散高劑量組(0.72 g/kg)、中劑量組(0.36 g/kg)、低劑量組(0.18 g/kg)，每組10只，受試藥物均以0.5%CMC-Na混懸，灌胃給藥，10 m L/kg，每日1次，連續(xù)7 d，模型組灌胃等體積CMC-Na。末次給藥前測定基礎體溫，并于給藥后40 min，耳緣靜脈注射LPS 200 ng/kg(1 m L/kg)，于注射后0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h檢測體溫，計算各組家兔體溫差(致熱后體溫-基礎體溫)。

1.2.6 小兒珠珀散促胃腸運動作用研究

小鼠適應性喂養(yǎng)1周，按給藥劑量隨機分為5組，即正常組、嗎丁啉組(5.50 mg/kg)、小兒珠珀散高劑量組(1.80 g/kg)、中劑量組(0.90 g/kg)、低劑量組(0.45 g/kg)，每組16只。受試藥物均以0.5%CMC-Na混懸，灌胃給藥，0.1 m L/10 g，每日1次，連續(xù)15 d，正常對照組灌胃給予等量CMC-Na溶液。參考文獻報道[11]，實驗前禁食不禁水24 h，末次給藥后1 h，灌胃營養(yǎng)性半固體糊(10 g CMC-Na，溶于蒸餾水250 m L中，分別加入奶粉16 g、糖8 g、淀粉8 g和墨汁2 m L，攪拌均勻，配制成300 m L(300 g)黑色半固體營養(yǎng)糊，每只小鼠灌胃0.5 m L。20 min后，脫頸椎處死動物。打開腹腔，結(jié)扎賁門、幽門，取出胃，稱質(zhì)量(胃全質(zhì)量)，沿胃大彎剪開，洗凈胃內(nèi)容物，稱質(zhì)量(胃凈質(zhì)量)，計算胃排空率;分離腸系膜，剪取幽門至回盲部的腸管，置于平板上，輕輕拉成直線，平鋪于白紙上，分別測量從幽門到回盲部和從幽門到墨汁前沿的距離，計算小腸推進率。胃排空率(%)=[灌胃量-(胃全質(zhì)量-胃凈質(zhì)量)]/灌胃量×100%;小腸推進率(%)=墨汁推進長度/小腸總長度×100%。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 22.0軟件，計量資料以±s表示。若符合正態(tài)分布，采用t檢驗，若不符合正態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小兒珠珀散對小鼠耳腫脹度的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠耳腫脹度增加(P<0.01)，表明模型建立成功;與模型組比較，各給藥組小鼠耳腫脹度均減少(P<0.01)，但量效關(guān)系不明顯。小兒珠珀散高、低劑量組腫脹抵制率較高，與地塞米松作用相近，表明小兒珠珀散對二甲苯引起的小鼠耳腫脹具有一定的抑制作用，見表1。

表1 小兒珠珀散對小鼠耳腫脹的影響(n=16)

2.2 小兒珠珀散對小鼠氣管酚紅排泌量的影響

與正常對照組比較，沐舒坦可以顯著增加小鼠氣管酚紅排出量(P<0.01)，小兒珠珀散不同劑量均可顯著增加小鼠氣管酚紅排出量(P<0.01)，并表現(xiàn)出一定的量-效關(guān)系，但酚紅排出促進作用低于陽性藥沐舒坦(P<0.05)，見表2。

表2 小兒珠珀散對氣管酚紅排泌量的影響(n=16) 

2.3 小兒珠珀散對小鼠咳嗽的影響

與模型組比較，咳必清可延長小鼠咳嗽潛伏期(P<0.05)，減少咳嗽次數(shù)(P<0.01)。小兒珠珀散低劑量可延長小鼠咳嗽潛伏期，減少咳嗽次數(shù)(P<0.05)，其延長咳嗽潛伏期作用與咳必清相近;中劑量減少小鼠咳嗽次數(shù)(P<0.01)與咳必清較為接近，但對潛伏期延長作用不明顯;高劑量表現(xiàn)出延長咳嗽潛伏期和減少咳嗽次數(shù)的趨勢，與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 小兒珠珀散對小鼠咳嗽的影響(n=16) 

2.4 小兒珠珀散對家兔體溫的影響

與模型組比較，阿司匹林在1～4 h均可抑制家兔體溫升高(P<0.05)。小兒珠珀散高劑量在3～5 h可抑制家兔體溫升高(P<0.05);中劑量在2～5 h具有抑制家兔體溫升高的作用(P<0.05);低劑量在1.5 h以及5 h時與體溫變化與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。小兒珠珀散與阿司匹林比較，起效較慢，表明小兒珠珀散有一定的抑制LPS引發(fā)的家兔發(fā)熱的作用。見表4。

表4 小兒珠珀散對家兔發(fā)熱的影響(n=10) 

2.5 小兒珠珀散對小鼠胃腸推進作用的影響

與正常對照組比較，嗎丁啉可增加小鼠胃排空率和小腸推進率(P<0.05)。小兒珠珀散低劑量可增加小鼠胃排空率和小腸推進率，作用與嗎丁啉相近(P<0.05);小兒珠珀散高、中劑量增加小鼠胃排空率(P<0.05)，對小腸推進促進作用不明顯。見表5。

表5 小兒珠珀散對小鼠胃腸動力的影響(n=16) 

3 討論

小兒珠珀散中多味藥物均為臨床常用藥，現(xiàn)代藥理研究已證明組方中多味藥物對感冒具有一定的治療作用。謝新華等[12]研究表明，金銀花單用具有一定的解熱作用，并初步探索其解熱機制。Kuang Y等[13]發(fā)現(xiàn)甘草多種成分均可有效降低氨水誘咳動物的咳嗽次數(shù)，亦有研究表明神曲中多種消化酶對消化不良具有一定的治療作用。小兒珠珀散通過合理組方，可針對性治療兒童感冒過程中出現(xiàn)的多種癥狀。

感冒通常被認為是上呼吸道急性炎癥，呼吸道分泌多種炎癥產(chǎn)物，即為痰液[14]。痰液可刺激呼吸道黏膜，引發(fā)咳嗽，加重感冒病情。咳嗽是機體正常的保護反應，使機體排出病原物，但頻繁劇烈的咳嗽可能會造成支氣管痙攣，加重肺部疾病[15]。同時由于病毒、細菌等外源性致熱原侵入機體刺激致熱原細胞產(chǎn)生和釋放內(nèi)生致熱原，刺激機體體溫調(diào)節(jié)中樞，升高體溫[16]。持續(xù)高熱，會威脅患者生命安全，應及時進行干預。兒童往往由于高熱不退，出現(xiàn)食欲不振，消化不良等情況[17]。

二甲苯可誘導組胺、激肽及纖維蛋白溶解酶等炎癥介質(zhì)釋放，引起局部毛細血管通透性增加、急性滲出性炎性水腫等，中藥新藥抗炎實驗中常以二甲苯為致炎劑評價藥物抗炎作用[18];祛痰實驗利用酚紅為指示劑，在祛痰藥的影響下，支氣管分泌液增加，呼吸道黏膜排出的酚紅越多，支氣管中酚紅濃度越高[19];止咳實驗中采用氨水霧化吸入刺激小鼠副交感神經(jīng)系統(tǒng)，引發(fā)咳嗽反射[20]。發(fā)熱實驗常選用內(nèi)毒素刺激家兔，使其體溫調(diào)節(jié)中樞的調(diào)定點上移[21];胃腸蠕動實驗中常采用營養(yǎng)性半固體糊模擬食物在小鼠胃腸道的消化作用。本實驗中，小兒珠珀散可降低小鼠耳腫脹度，抑制炎癥反應;可增加小鼠氣管酚紅的分泌量，具有顯著的祛痰作用;同時小兒珠珀散可有效減少氨水刺激小鼠咳嗽的次數(shù)，說明其具有一定的止咳作用;還具有抑制LPS引起的家兔體溫升高、促進小鼠胃排空、增強小腸推進的作用。

小兒珠珀散用于治療小兒感冒，有多年臨床經(jīng)驗，廣泛應用于多個地區(qū)，可有效治療兒童感冒的發(fā)熱、咳嗽、咳痰等癥狀，同時有效改善兒童感冒期間消化不良的問題，但是相關(guān)實驗研究較少，因此本實驗利用經(jīng)典的藥效學實驗方法，針對不同的感冒癥狀分別進行相應的動物實驗，驗證其藥效。本研究結(jié)果為小兒珠珀散臨床治療感冒提供了參考，希望能為新藥研發(fā)提供更多資料，促進新藥研發(fā)實驗工作的展開。

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篇4

【摘要】

目的: 通過卵巢癌細胞株SKOV3細胞增殖及動物荷瘤實驗探討siRNA沉默Her2/neu基因的表達效果。方法: 靶向Her2/neu 的siRNA經(jīng)脂質(zhì)體LipofectAMINE2000介導轉(zhuǎn)染到SKOV3中， 通過嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定抑制Her2/neu基因表達的SKOV3/siRNA細胞株， 通過RTPCR和免疫組化方法檢測Her2/neu基因抑制效果， 運用四甲基偶氮唑藍(MTT)檢測各組細胞增殖水平并將SKOV3/siRNA細胞接種到裸鼠皮下檢測荷瘤情況。結(jié)果: 建立了穩(wěn)定抑制Her2/neu基因表達的細胞株SKOV3/siRNA， RTPCR和免疫組化結(jié)果顯示Her2/neu基因表達受到較強抑制， MTT檢測結(jié)果顯示SKOV3/siRNA組細胞增殖較SKOV3明顯下調(diào)（P

【關(guān)鍵詞】 Her2/neu基因 RNA干擾 卵巢腫瘤

Her2/neu基因是人類腫瘤中常發(fā)生異常改變的基因之一， 定位于人類染色體17q21， 編碼Mr為185000的蛋白， 命名為p185[1]。Her2/neu（p185）受體屬于受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase， RTK）超家族， 其過度表達可以賦予卵巢癌、 乳腺癌等腫瘤細胞更高的惡性生物學行為， 且與腫瘤的化療敏感性及預后呈明顯的負相關(guān)[2]。 RNA干擾(RNA Interference， RNAi)是指在生物體細胞內(nèi)， 外源性或內(nèi)源性的雙鏈RNA引起與其同源mRNA的特異性降解， 因而抑制其相應基因表達的過程。本研究中利用RNAi技術(shù)， 用脂質(zhì)體將靶向Her2/neu基因的siRNA轉(zhuǎn)染入卵巢癌細胞株SKOV3， 建立了穩(wěn)定抑制 Her2表達的SKOV3/siRNA細胞株， 并探討其體外增殖特性及在動物體內(nèi)的成瘤力， 以期為逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞惡性生物學行為的研究提供動物實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 SKOV3細胞株購自上海細胞所， McCoy’s 5A改良培養(yǎng)基、 胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品（SKOV3細胞在37℃ 50 mL/L CO2飽和濕度下培養(yǎng)）; BALB/c系雌性裸小鼠(14只， 8周齡， 質(zhì)量20～25 g)， 購自上海實驗動物中心; 脂質(zhì)體LipofectAMINE2000、 總RNA提取試劑TRIzol購自Invitrogen公司; 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司; Taq DNA聚合酶購自華美生物工程有限公司; siRNA載體、 上、 下游引物由上海生工合成; 免疫組化試劑盒SAP9102和Her2/neu小鼠抗人單克隆抗體（mAb）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司; 四甲基偶氮唑藍（MTT）為Sigma 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 人卵巢癌細胞株SKOV3細胞培養(yǎng)與siRNA轉(zhuǎn)染 對數(shù)生長期SKOV3細胞按1×105/孔移至6孔板以含100 mL/L胎牛血清的McCoy’s 5A改良培養(yǎng)液培養(yǎng)。實驗對照組不轉(zhuǎn)染siRNA， 轉(zhuǎn)染試驗組轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒。細胞80%融合時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染按照LipofectAMINE2000說明書進行， 4 h后更換完全培養(yǎng)液， 48 h后更換含嘌呤霉素的完全培養(yǎng)液篩選培養(yǎng)， 每3～4 d換液， 約20 d后篩選成活并完全匯合的細胞， 傳代培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染組細胞株命名為SKOV3/siRNA。

1.2.2 RTPCR檢測Her2/neu基因mRNA的表達 提取各組SKOV3細胞的總RNA， 按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄成cDNA， 逆轉(zhuǎn)錄體系25 μL。隨后行PCR反應， 以βactin為內(nèi)參， Her2/neu上下游引物為5′TGCGGCTCGTACACAGGGACTT3′和5′TGCGGGAGAATTCAGACACCAACT3′， 反應體系為25 μL， 產(chǎn)物大小420 bp， βactin大小500 bp。10 g/L TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 免疫組化檢測p185蛋白的表達 將細胞分別接種在置有無菌處理過蓋玻片的6孔板中， 細胞融合80%時收獲細胞爬片， 采用免疫組化檢測p185蛋白的表達， 通過SAP9102試劑盒檢測， Her2/neu mAb稀釋度為1∶100， DAB顯色， 細胞質(zhì)或膜出現(xiàn)棕褐色為陽性染色， 陰性對照片用PBS代替Her2/neu mAb。免疫組化半定量分析采用病理科醫(yī)學彩色圖像分析系統(tǒng)（Image Pro Plus）: 在光鏡(×400)下隨機選取40個染色較好的視野， 細胞染色陽性部位的顏色深淺及范圍以平均積分光密度值（IOD）表示， 該值越大， p185蛋白表達量越多。

1.2.4 MTT法檢測各組細胞增殖 收獲對數(shù)生長期的各組細胞接種到96孔板（1×104個/孔）， 置于37℃培養(yǎng)， 每隔2 d用四甲基偶氮唑藍（MTT）法測定A570值， 每組測5孔， 取平均值， 以A值為縱坐標， 時間為橫坐標繪制細胞生長曲線。

1.2.5 裸鼠卵巢癌移植瘤模型的建立 采用常規(guī)培養(yǎng)細胞移植法， 實驗分SKOV3/siRNA實驗組和SKOV3對照組， 取對數(shù)生長期的SKOV3/siRNA、 SKOV3細胞， 分別制成1×1010個/L的細胞懸液0.1 mL， 用1 mL注射器接種于每只裸鼠背部皮下， 每組7只鼠。觀察腫瘤生長情況， 分別于接種后35、 45、 55、 65、 75 d測量2組瘤體積， 用游標卡尺測量腫瘤3個方向的直徑， 分別記為a， b， c， 按公式V=πabc/6計算瘤體積并繪制腫瘤生長曲線。

1.2.6 統(tǒng)計學處理 采用統(tǒng)計學軟件SPSS13.0分析， 實驗數(shù)據(jù)以x±s表示， 兩兩比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 siRNA對Her2/neu基因的抑制 RTPCR檢測結(jié)果表明siRNA可以有效沉默Her2/neu基因mRNA的表達， SKOV3/siRNA組Her2/neu基因mRNA的表達明顯弱于SKOV3組（圖1）。

圖1 siRNA對Her2/neu基因表達的影響（略）

M: DNA marker; 1: SKOV3; 2: SKOV3/siRNA.

2.2 干擾后SKOV3細胞p185蛋白的表達 免疫組化半定量分析結(jié)果顯示SKOV3/siRNA細胞P185蛋白的表達明顯減弱（圖2）， 其細胞染色陽性部位平均積分光密度值（IOD: 416.2±89.4）只有SKOV3組（IOD: 192.6±58.4）的46.3%。兩組IOD值比較， 差異有統(tǒng)計學意義（P

圖2 轉(zhuǎn)染前后2種細胞爬片免疫組化結(jié)果比較（×1000）（略）

A: SKOV3細胞株的細胞膜可見強烈的Her2棕黃色膜反應; B: SKOV3/siRNA細胞株細胞膜棕黃色膜反應明顯減弱.

2.3 MTT細胞增殖結(jié)果 MTT檢測結(jié)果表明靶向沉默Her2/neu基因后， 細胞增殖下調(diào)， SKOV3/siRNA的生長曲線明顯比SKOV3生長曲線右移，其生長速度明顯慢于SKOV3組， 二者在2、 4、 6、 8、 10 d的A值比較， 差異均有統(tǒng)計學意義（P

圖3 siRNA處理后SKOV3生長曲線（略）

2.4 裸鼠荷瘤實驗結(jié)果 細胞接種后35、 45、 55、 65、 75 d進行腫瘤體積測量， 發(fā)現(xiàn)接種SKOV3/siRNA細胞實驗組的瘤體積明顯小于SKOV3對照組（圖4）， 說明通過RNAi抑制Her2/neu基因后， 腫瘤的生長速度明顯減慢， 在各時間點2組結(jié)果比較均有統(tǒng)計學意義（P

圖4 裸鼠荷瘤實驗腫瘤生長曲線（略）

3 討論

Her2/neu基因又稱cerbB2， 是種原癌基因， 主要在胚胎發(fā)生時開始表達， 成年后在少數(shù)正常組織中低表達或不表達， 而在多種惡性腫瘤中有不同程度的Her2/neu異常表達， 尤其在乳腺癌（44%）、 卵巢癌（20%～40%）等組織中存在著擴增和（或）p185的高表達狀態(tài)。主要包括胞外區(qū)、 跨膜區(qū)、 胞內(nèi)區(qū)3個部分， 其中胞外區(qū)富含半胱氨酸， 含2個配體結(jié)合域; 跨膜區(qū)起錨定作用; 胞內(nèi)區(qū)具有內(nèi)在酪氨酸激酶活性， 且含自身酪氨酸磷酸化位點[3]。Her2/neu是表皮生長因子受體（EGFR）家族中的一員， 易與EGFR家族其他成員形成異二聚體， 激活自身酪氨酸激酶活性產(chǎn)生強烈的致瘤作用。參與抑制細胞凋亡， 促進腫瘤細胞存活; 上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和血管通透性因子， 促進腫瘤新生血管生成，增加腫瘤細胞的侵襲力， 破壞機體組織抗侵襲屏障等。因此， Her2/neu基因被認為是上皮細胞起源的腫瘤治療的有效靶點之一[4]， 同時還認為檢測Her2/neu基因的表達可提供一項有效的臨床預后指標[5]。本研

究中建立了穩(wěn)定抑制Her2/neu基因表達的SKOV3細胞株， 實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后的SKOV3細胞Her2/neu基因的表達受到明顯抑制， RTPCR和免疫組化的結(jié)果共同驗證了抑制的效果， MTT結(jié)果顯示抑制Her2/neu基因后， 轉(zhuǎn)染組細胞增殖也有明顯下調(diào)， 說明抑制Her2/neu基因表達后， SKOV3細胞的惡性生物學行為得到一定控制， 為動物體內(nèi)荷瘤試驗提供一定體外實驗基礎。

RNAi是近年被發(fā)現(xiàn)的細胞本身固有的對抗外源基因侵害的一種自我保護現(xiàn)象， 人們利用這一現(xiàn)象對要研究的基因表達進行阻斷， 從而形成了RNA干擾技術(shù)。我們通過動物體內(nèi)成瘤試驗進一步驗證了特異性RNA 干擾的效果。發(fā)現(xiàn)抑制Her2/neu基因表達后裸鼠的成瘤體積在同一時間點明顯小于對照組， 這對延長生存期， 提高聯(lián)合化療、 放療療效有重大意義。針對RNAi后雖然瘤細胞生長緩慢、 癌蛋白表達減少， 但畢竟還存在一定成瘤能力的現(xiàn)象， 在后期實驗中我們將運用RNAi技術(shù)聯(lián)合生物療法進行深入研究， 為增強腫瘤的臨床治療效果， 減少腫瘤微小病灶的殘留作進一步的探索。

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篇5

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis)是一組有不同病因但有相似的生物學、形態(tài)學和臨床表現(xiàn)的疾病。該病不僅發(fā)生關(guān)節(jié)軟骨損傷，還累及整個關(guān)節(jié)，包括軟骨下骨、韌帶、關(guān)節(jié)囊、滑膜和關(guān)節(jié)周圍肌肉，最終發(fā)生關(guān)節(jié)軟骨退變，纖維化，斷裂，潰瘍及整個關(guān)節(jié)面的損害。

本病的病理過程是以應力較高部位的關(guān)節(jié)軟骨接觸面廣泛纖維化為特點，并伴有軟骨下骨的骨質(zhì)象牙化和硬化，關(guān)節(jié)邊緣常常出現(xiàn)骨贅形成和骨的改建活動，關(guān)節(jié)滑膜囊的纖維化，與常見的滑膜非特異性炎癥[1]。但是骨關(guān)節(jié)炎的致病機理仍然是一個充滿爭議和需要繼續(xù)探索的課題，為了澄清骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病和病程進展過程中，在關(guān)節(jié)組織中細胞分子水平的變化，這就需要使用實驗動物模型觀察。通過動物實驗可以確定軟骨基質(zhì)的降解方式以及滑膜、軟骨中的生物合成作用是如何被抑制的，同時還可以用來評價潛在的拮抗藥物，為發(fā)現(xiàn)新的抗骨關(guān)節(jié)炎藥物奠定基礎?，F(xiàn)就常用的骨關(guān)節(jié)炎實驗動物模型的制備方法，應用優(yōu)缺點和意義討論如下。

1 關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射化合物誘導骨關(guān)節(jié)炎

多種化合物以關(guān)節(jié)內(nèi)注射方式注入動物關(guān)節(jié)以后，可以出現(xiàn)許多類似于骨關(guān)節(jié)炎的病理改變。木瓜蛋白酶引起實驗動物骨關(guān)節(jié)炎的機制可能在于其對軟骨基質(zhì)中蛋白多糖的分解作用，并能除去軟骨細胞膜上有絲分裂抑制因子[2]。向C57Bl10小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)注射細菌源性膠原酶誘導骨關(guān)節(jié)炎的實驗研究證實，在關(guān)節(jié)不穩(wěn)定的程度與軟骨損傷的嚴重程度（數(shù)量）和形成骨贅的大小之間，存在著顯著的相關(guān)性[3]。關(guān)節(jié)內(nèi)注射IL-1模型已經(jīng)成功的用于確定某些蛋白酶抑制劑，但是否有抗骨關(guān)節(jié)炎藥物的潛力有待研究。

2 骨關(guān)節(jié)炎制動造模方法

保證關(guān)節(jié)的正?；顒雍拓撝夭拍芫S持關(guān)節(jié)軟骨的構(gòu)成成分、結(jié)構(gòu)和功能。固定肢體使關(guān)節(jié)制動可以誘發(fā)關(guān)節(jié)軟骨萎縮，致使軟骨變薄、水腫，蛋白聚糖含量下降，結(jié)構(gòu)改變以及合成數(shù)量的下降，同時還有膠原合成及含量的增加。因為這些軟骨改變與我們所見的人類骨關(guān)節(jié)炎病理改變相似，所以這種模型特別用于軟骨退變過程的研究。但在著重軟骨基本形態(tài)學的研究差別上，這一模型的使用逐漸減少。骨關(guān)節(jié)炎的軟骨中，軟骨細胞灶性增殖呈細胞團或細胞巢，通?；钴S至骨關(guān)節(jié)炎的后期，而與此對比的固定關(guān)節(jié)的觀察發(fā)現(xiàn)，軟骨細胞沒有這種變化，不形成灶性細胞團卻常出現(xiàn)壞死，特別是在夾板固定牢靠無任何活動的時候。軟骨的這種改變可能是軟骨細胞缺乏營養(yǎng)造成的，因為制動肢體缺乏運動和負重。而且，如果允許制動的肢體小范圍活動，那么軟骨退變的范圍將明顯減少。

3 自發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎模型

許多種類的動物可以自發(fā)形成骨關(guān)節(jié)炎，如拉布拉多犬，德國牧羊犬和比格犬，可隨年齡增加發(fā)生骨關(guān)節(jié)炎，但在此模型中，早期的病理形態(tài)變化特征和人的骨關(guān)節(jié)炎相比，出現(xiàn)了更為嚴重的滑膜炎和關(guān)節(jié)囊的纖維化。許多品系的小鼠都可以出現(xiàn)自發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎，較常用的有：斑點雜交鼠，STR/ORT，C57Bl品系小鼠。該模型骨關(guān)節(jié)炎病程的典型特征包括：關(guān)節(jié)間隙變窄，骨贅形成，局部軟骨損傷，染色顯示的蛋白聚糖減少。恒河猴和食蟹猴都有較高的自發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率，其流行病學和病理學改變與人相似，其關(guān)節(jié)的大小可以滿足放射學、組織學和生物化學的研究，另外對實驗研究廣泛使用的平行對照而言，這種動物也容易找到與實驗組年齡相匹配非骨關(guān)節(jié)炎的對照。但缺點是此動物活動范圍大又有較長的生命跨度，研究可能要持續(xù)許多年，還可能受到無法控制的環(huán)境因素以及倫理和資金條件的限制。

4 前交叉韌帶橫斷模型（ALCT模型）

Stoop等[4]切斷Wistar大鼠的膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶，于第2、3、14、28、70天處死動物，取膝關(guān)節(jié)軟骨常規(guī)組織學及免疫組化檢測變性的Ⅱ型膠原，在前交叉韌帶切斷后軟骨損害最早改變發(fā)生于表層帶的軟骨細胞和軟骨基質(zhì)。術(shù)后14天出現(xiàn)表層帶軟骨細胞數(shù)量減少，剩余的軟骨細胞腫脹，表層帶纖維化。術(shù)后4周、10周，上述改變更明顯。在纖維化的區(qū)域，變性的Ⅱ型膠原降解產(chǎn)物染色明顯增加，膠原酶分裂位點染色與變性膠原分布相同，但染色明顯較淡；在膠原發(fā)生纖維化前及沒有出現(xiàn)纖維化的部位不能檢測到膠原的損害。Myers證實在開放手術(shù)中使用電燒止血和關(guān)節(jié)內(nèi)沖洗與不使用止血方式的手術(shù)相比，滑膜炎的發(fā)生率由原來的69％下降到24％。但開放性橫斷前交叉韌帶后會造成早期軟骨增生，并在4~5年后形成骨關(guān)節(jié)炎，以及包括軟骨全層侵蝕及關(guān)節(jié)內(nèi)的多種改變[8]。

近年采用較多的建立OA模型的方法是ACLT手術(shù)法，ACLT模型手術(shù)簡單創(chuàng)傷小，穩(wěn)定性好，對動物生理結(jié)構(gòu)改變較少，能全面反映OA軟骨退行性變化的病理過程，但該法造模時間長，一般需6周以上才能造模成功[5]。

常用的Hulth造模法，切除兔膝關(guān)節(jié)前后交叉韌帶及內(nèi)側(cè)副韌帶，切除內(nèi)側(cè)半月板，破壞家兔膝關(guān)節(jié)正常的力學軸線，由正常的外翻10度變?yōu)閮?nèi)翻，關(guān)節(jié)最大壓力由正常的外側(cè)脛骨平臺轉(zhuǎn)移到內(nèi)側(cè)脛骨平臺與股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)承擔，關(guān)節(jié)的負重面減少，局部關(guān)節(jié)軟骨所承受的壓應力相對增加，韌帶的破壞加重關(guān)節(jié)的不穩(wěn)定，從而形成了關(guān)節(jié)軟骨變形的起始環(huán)節(jié)。

5 骨關(guān)節(jié)炎負重模型

家兔全身麻醉后，在右后腿膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)作切口至關(guān)節(jié)腔，推開髕骨、髕韌帶，屈曲膝關(guān)節(jié)，暴露前交叉韌帶并切斷，以前抽屜實驗確認斷裂后，逐層縫合，3天后以石膏將左腿固定于腹部，右腿負重，每日跑步訓練2小時，術(shù)后1周傷口絡合碘護理，分籠飼養(yǎng)，每兔一籠。

負重模型能明顯縮短OA發(fā)生發(fā)展的時間。提示負重增加OA關(guān)節(jié)液中細胞因子的產(chǎn)生，在同樣造模時間內(nèi)，較ACLT模型組造成OA病變更為嚴重[6]。

6 動物半月板切除骨關(guān)節(jié)炎模型

半月板是膝關(guān)節(jié)的緩沖裝置，是位于股骨和脛骨的髁部之間的半月形纖維軟骨盤。半月板的作用在于承重，并使壓力分布均勻；增加關(guān)節(jié)穩(wěn)定性；作用并且通過滑液的表面擴散，有助于關(guān)節(jié)軟骨的營養(yǎng)；并且具有保護關(guān)節(jié)軟骨的作用。Lozoya等[7]切除Wistar大鼠膝半月板的30％~50％，致膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)，關(guān)節(jié)載荷傳導紊亂，所有大鼠均出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨退行性變，軟骨表面粗糙、侵蝕、纖維化，甚至完全缺失。Colombo及同事切除兔外側(cè)半月板的同時還切除外側(cè)副韌帶及籽骨，此方法造成的家兔骨關(guān)節(jié)炎的病變一致性好，并在后來的研究中被廣泛用來評估眾多抗骨關(guān)節(jié)炎藥物在軟骨病變進程中的藥效作用。

7 其他的動物骨關(guān)節(jié)炎模型

因為人的骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率與職業(yè)相關(guān)（如一些要求重復機械性活動的工作），可以對動物關(guān)節(jié)再現(xiàn)與應力相關(guān)的病理變化實驗，強制家兔跑踏輪鍛煉5天結(jié)果顯示，軟骨中蛋白聚糖的合成和含量均發(fā)生了改變；支撐重力的變化也能誘導關(guān)節(jié)軟骨的病變，反復縱向沖擊家兔關(guān)節(jié)炎[8]和橫向施加應力的犬關(guān)節(jié)炎均得到證實。一些手術(shù)方法使關(guān)節(jié)不再負重，如狗的脛骨截骨術(shù)，前爪切除術(shù)等，這些模型證實了負重對軟骨完整的重要性。

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篇6

【關(guān)鍵詞】 關(guān)節(jié)炎，類風濕；動物模型；實驗；綜述

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.12.019

類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以滑膜的持續(xù)增生、軟骨及骨破壞的病理學特征為主的自身免疫性疾病，主要以慢性炎癥、多發(fā)關(guān)節(jié)腫脹、疼痛及其引起的關(guān)節(jié)僵硬，甚至功能喪失為臨床表現(xiàn)[1]。其病因和發(fā)病機制尚不明了。本文對幾種常用的類風濕關(guān)節(jié)炎模型的建立、發(fā)病機制及特點做一綜述，為更好地研究其機制以及尋求防治方法提供依據(jù)。

1 佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）模型

AA是比較經(jīng)典的RA動物模型[2]。弗氏佐劑包括不完全佐劑（incomplete Frennd' adjuvant，IFA）

和完全佐劑（Freund's complete adjuvant，CFA）。

CFA是將減毒卡介苗（BCG）10 mg經(jīng)80 ℃水浴滅活1 h，與高壓滅菌的液體石蠟和無水羊毛脂的混合液1 mL充分乳化混勻制成。此法多用大鼠。

1.1 造模方法 在消毒后的大鼠足跖皮下注入已經(jīng)乳化混勻的CFA，濃度為10 mg?mL-1，每側(cè)注射0.1 mL。原發(fā)病變主要是注射部位的炎癥表現(xiàn)，踝關(guān)節(jié)及足跖部紅腫，可侵及足墊、全足。繼發(fā)病變則呈現(xiàn)對側(cè)踝關(guān)節(jié)和前足腫脹，呈不斷加重趨勢，耳朵和尾根部出現(xiàn)“關(guān)節(jié)炎”結(jié)節(jié)，這些表現(xiàn)與人RA類似[3]。病理改變表現(xiàn)為關(guān)節(jié)周圍及軟組織的炎癥，可造成滑膜增生，血管翳形成，軟骨破壞，后期關(guān)節(jié)間隙變窄，關(guān)節(jié)粘連，以致形成不可逆的改變。

1.2 發(fā)病機制 AA的發(fā)病機制主要為分子模擬理論。關(guān)節(jié)軟骨的自身抗原Hsp60與結(jié)核桿菌中一個相對分子量為65 ku熱休克蛋白（Hsp65）結(jié)構(gòu)高度相似，可以通過分子模擬或交叉反應，被同一株T細胞克隆識別，進一步引起自身的免疫反應[4]。有研究表明，T淋巴細胞免疫功能異常在RA的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。AA造模成功后，檢測指標中CD3+、CD4+、CD8+下降，CD4+/CD8+升高，表現(xiàn)有明顯的免疫功能紊亂現(xiàn)象，提示T細胞亞群紊亂是AA大鼠的病理機制之一[5]。另一方面，細胞因子在AA發(fā)病的免疫調(diào)節(jié)中也起著核心的作用[6]。有研究證實，AA的發(fā)病過程中有氧化應激反應發(fā)生[7]，發(fā)病過程中產(chǎn)生大量的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-1β（IL-1β）[8]。Stoop等[9]研究表明，佐劑的選擇可影響Th1和Th17細胞的總比例，而不一定影響細胞因子的產(chǎn)生以及疾病的發(fā)生率和嚴重的水平。

1.3 特 點 AA模型制備方法簡單易行，在臨床表現(xiàn)、病理學及免疫學上與人RA有很多相似之處，所以被普遍應用于RA相關(guān)研究。但AA缺乏慢性病理過程，與RA的病變過程不盡相同。如只用AA模型研究RA，局限性較大，所以，還需要參照其他模型從多個方面綜合考慮。

2 膠原誘導性關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）

模型

1977年，Trentham等[10]根據(jù)動物可被Ⅱ型膠原誘導產(chǎn)生免疫性關(guān)節(jié)炎這一理論，初次成功建立了由Ⅱ型膠原誘導的大鼠實驗性關(guān)節(jié)炎模型。該模型隨著研究的深入進一步發(fā)展和完善，目前造模動物多選用SD或Wistar大鼠、DBA/l或C57BL/6

小鼠。

CIA模型是一種免疫炎癥模型，主要表現(xiàn)為多發(fā)性末端關(guān)節(jié)炎。通過抗原刺激引起自身免疫反應誘導關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生，并形成抗CⅡ抗體，且可持續(xù)發(fā)展，并且更加符合人類疾病特點，包括關(guān)節(jié)紅腫、滑膜增生、炎性細胞浸潤、血管翳形成、關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞等，與RA臨床表現(xiàn)更相似，是研究以及篩選治療RA藥物的理想模型。

2.1 造模方法 以DBA/1小鼠為例，首先將CⅡ（Ⅱ型膠原）溶于0.1 mol?L-1的醋酸中，濃度為2 g?L-1，在4 ℃環(huán)境中過夜后與等量CFA充分乳化，制得CⅡ乳劑（即每毫升含1 mg CⅡ和1 mg BCG），可于冰上配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。免疫時，在小鼠尾根部、背部多點進行皮內(nèi)注射0.1 mL，21 d后，對每只小鼠進行腹腔內(nèi)注射CⅡ乳劑0.1 mL，達到加強免疫的目的。

CIA模型具有典型的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)，Zhang等[11-12]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在致炎后24 d左右出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫，最早出現(xiàn)癥狀的是后足踝關(guān)節(jié)，隨后發(fā)展到前足和尾部并呈持續(xù)性加重，最終導致關(guān)節(jié)畸形。36 d左右最嚴重，病理變化為增生性滑膜炎，關(guān)節(jié)腔內(nèi)有炎性細胞浸潤，并有豐富的血管翳形成，關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨質(zhì)均受到侵蝕和破壞，這些臨床表現(xiàn)及病理學改變與RA密切相關(guān)。但CIA在同種屬、同周齡、相同誘發(fā)因素和生活環(huán)境下，發(fā)病時間相差較大，臨床表現(xiàn)輕重不一。CIA關(guān)節(jié)炎發(fā)病率比單獨使用CFA注射顯著提高。

2.2 發(fā)病機制 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，該模型建立的主要原因是CⅡ在免疫系統(tǒng)的高敏感性[13]。CIA的機制主要通過體液及細胞免疫完成，依靠于自身

T細胞和B細胞的激活。有研究發(fā)現(xiàn)，CIA的發(fā)生和發(fā)展主要由Th1、Th2這兩種T細胞共同調(diào)節(jié)，正常狀態(tài)下處于平衡狀態(tài)，而初次免疫和加強免疫后小鼠外周血出現(xiàn)Th1/Th2亞群失衡狀態(tài)[14]。此外有研究表明，IL-1β、TNF-α在CIA模型建立過程中起重要的誘導作用，且在病變過程中血清

IL-1β、TNF-α水平持續(xù)升高[15-16]。

2.3 特 點 CIA模型與人RA的相似之處包括易侵犯肢體遠端關(guān)節(jié)、關(guān)節(jié)滑膜增生、血管翳形成、軟骨與骨的破壞，以及免疫反應等。目前，CIA是公認的RA最佳模型，在免疫學、治療效果評價及藥物篩選等方面的研究中，CIA模型為研究者提供了極大幫助。但是，CIA是在一定實驗條件下形成的疾病，不會出現(xiàn)病情的波動和復況，以及類風濕因子和抗核抗體，也沒有RA的皮下結(jié)節(jié)、漿膜炎、血管炎等表現(xiàn)，這表明CIA仍有一些不足之處，仍然需要繼續(xù)探索更加符合RA特征的動物模型。

3 卵清蛋白（ovalbumin，OVA）誘導的關(guān)節(jié)炎模型

1962年由Dumonde和Glynn首次建立[17]。OVA作為一種外源性抗原已被廣泛運用于主動致敏建立如支氣管哮喘等病的動物模型[18]。

3.1 造模方法 用生理鹽水溶解OVA配成濃度為20 mg?mL-1的溶液，與等量CFA混勻，在動物肩胛部及背部5個部位皮下注射，每周1次，連續(xù)注射3周，第4周于雙膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入OVA 5 mg[19]。

3.2 發(fā)病機制 OVA在關(guān)節(jié)內(nèi)作為抗原長期存在，刺激滑膜產(chǎn)生抗體并形成抗原-抗體-C3復合物，激活補體造成局部滑膜炎癥反應。另一方面，T細胞引起的免疫反應，使炎性細胞浸潤于滑膜，使血管翳逐步形成，進而出現(xiàn)軟骨及骨破壞[20-21]。

3.3 特 點 該模型方法簡單，易制備，適合較大病變關(guān)節(jié)的研究，比如兔、羊等動物。其病理過程與人RA相似，但免疫學指標有一定的差異，因此該模型有其局限性。

4 Ⅱ型膠原抗體誘導性關(guān)節(jié)炎（collagen-antibody-

inducedarthritis，CAIA）

CAIA是抗體誘導性關(guān)節(jié)炎模型中較常用的模型之一，多采用C57BL/6小鼠，通過注射Ⅱ型膠原抗體誘導模型的發(fā)生，后期注射脂多糖以增加疾病的發(fā)生率及嚴重程度。該模型被用來研究基因、年齡、性別，以及效應細胞在關(guān)節(jié)炎終末階段的發(fā)病機制中的影響。發(fā)病部位組織學檢查發(fā)現(xiàn)大量中性粒細胞浸潤，伴隨著骨與軟骨的侵蝕，血管翳形成以及纖維蛋白沉積。

研究表明，CAIA的發(fā)生與MHC等位基因相互獨立，而CIA則主要依賴于MHC等位基因，其中Aq分子是最易感的等位基因之一。這表明，CAIA與MHC限制性T細胞以及T細胞依賴性

B細胞無關(guān)[22]。

5 自發(fā)性關(guān)節(jié)炎模型

轉(zhuǎn)基因動物是指將外源重組基因整合在動物受體基因組內(nèi)，將其遺傳給后代的動物。常用的轉(zhuǎn)基因動物模型有K/BxN模型、人TNF-α轉(zhuǎn)基因模型、IL-1Ra基因敲除小鼠模型、SKG模型、TS1×HA CⅡ模型等。

5.1 K/BxN小鼠模型 K/BxN小鼠模型是KRN轉(zhuǎn)基因小鼠（攜帶有TCR基因）與非肥胖糖尿病（non-obese diabetes，NOD）小鼠雜交的后代[23]。在3周齡左右，小鼠可出現(xiàn)對稱性關(guān)節(jié)炎，最開始表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹，進一步發(fā)展為關(guān)節(jié)損傷、畸形（遠端關(guān)節(jié)表現(xiàn)最明顯）；組織病理學表現(xiàn)為滑膜及血管增生，血管翳形成，軟骨及骨破壞等。

該模型血清中存在大量自身抗體，可造成關(guān)節(jié)破壞。其主要發(fā)病機制是T細胞受體可特異性識別自身葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶（glueose-6-phosphate-isomearse，GPI），導致針對GPI的自身抗體（anti-GPI）分泌增加。該抗體屬于致病性抗體，從而誘導小鼠發(fā)展為RA。GPI在體內(nèi)還可同時誘導T細胞、B細胞產(chǎn)生抗體，導致關(guān)節(jié)及軟骨損

害[24]。另有研究表明，NOD小鼠的MHC-II（I-Ag7）基因與KRN轉(zhuǎn)基因小鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)生密切相關(guān)，說明K/BxN小鼠模型受到MHC-II類分子的限制。此外，補體通過替代途徑的激活以及Fc受體在K/BxN小鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中同時具有重要作用。該模型主要針對研究RA中自身抗體的作用。

5.2 人TNF-α轉(zhuǎn)基因模型 1991年P(guān)robert等通過修飾3'端的UTR區(qū)域，使C57B L/6小鼠高表達人TNF-α，從而建立此模型[25]。小鼠在4周左右可出現(xiàn)自發(fā)性慢性炎癥，主要表現(xiàn)為對稱性關(guān)節(jié)炎、血管翳增生、關(guān)節(jié)軟骨及骨破壞等，這些都與RA臨床表現(xiàn)相似，同時還可有小腸透壁性炎癥，生長緩慢等癥狀。病理表現(xiàn)主要為大量纖維組織增生、軟骨損傷及骨質(zhì)溶解；新骨形成的缺乏和生長發(fā)育遲緩也見于這些小鼠，可能是由鈣穩(wěn)態(tài)受損與腸道對鈣吸收的減少而造成。該模型成模率100%，且模型的同質(zhì)性高，并有利于衡量TNF-α抑制劑相比其他治療方法的優(yōu)勢，表明TNF-α抑制劑的作用取決于病變初始階段，可明顯減輕

損害[26]。

5.3 IL-1受體拮抗劑（IL-1Ra）基因敲除小鼠模型 IL-1是由多種細胞類型產(chǎn)生的促炎細胞因子，包括活化的單核細胞、巨噬細胞、成纖維細胞和滑膜細胞，這些都是在RA中導致關(guān)節(jié)炎癥及破壞的重要因素。天然存在的IL-1Ra對限制過度的炎癥反應有至關(guān)重要的作用。IL-1Ra缺失突變（敲除）小鼠與BALB/c小鼠的后代自發(fā)形成關(guān)節(jié)炎，其病變類似于RA，表現(xiàn)為炎癥細胞浸潤、滑膜細胞增殖、血管翳形成、軟骨破壞與骨質(zhì)溶解，還有關(guān)節(jié)中類風濕因子以及IL-6、TNF-α等炎癥因子表達升高。與人RA相比，在IL-1Ra基因敲除小鼠模型中T細胞的作用同樣是關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制的核心[27]。

5.4 SKG模型 SKG小鼠是通過選擇具有隱形突變基因的BALB/c小鼠培育出來的自發(fā)關(guān)節(jié)炎模型，其病理機制主要通過T細胞介導，小鼠在

8周左右即出現(xiàn)對稱的足趾及踝關(guān)節(jié)腫脹，呈慢性進行性發(fā)展，后期多發(fā)生關(guān)節(jié)強直[28]。關(guān)節(jié)外的病變可表現(xiàn)為肺炎、皮炎和淋巴結(jié)節(jié)，其表現(xiàn)與RA類似，適合研究RA發(fā)展與T細胞的關(guān)系。研究表明，SKG模型的發(fā)生發(fā)展與TCR Vβ2和Vβ8.2的T細胞克隆型關(guān)系密切[29]。

5.5 TS1×HACⅡ模型 將HATⅡ轉(zhuǎn)基因小鼠與TS1小鼠培育的后代可自發(fā)關(guān)節(jié)炎，其機制為TS1小鼠通過轉(zhuǎn)基因能夠表達針對HACⅡ小鼠產(chǎn)生流感病毒PR8 HA特異性的TCR，主要表現(xiàn)為長期的關(guān)節(jié)腫脹，關(guān)節(jié)外病變表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎。研究表明，TS1×HACⅡ模型是由CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T（Treg細胞）細胞識別新的自身抗原通過全身性分布的抗原呈遞細胞表達的。可見，CD4+

CD25+Treg細胞在預防自身免疫性疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[30]。

除此以外，還有油誘導的關(guān)節(jié)炎、鏈球菌誘導的關(guān)節(jié)炎、佐劑角叉菜膠誘導的關(guān)節(jié)炎、蛋白多糖誘導的關(guān)節(jié)炎等，這些模型目前運用較少，主要應用于某一方面的研究，尚不夠成熟，仍需進一步的研究觀察[31]。

在對RA動物模型的長期研究過程中，隨之發(fā)展的是對RA病因及發(fā)病機制的進一步認識。但是仍存在一些問題：①RA動物模型均是在一定實驗條件下，針對某單一方面的因素建立起來的，不能全面反映RA遺傳、感染、免疫等特點；②不同的RA動物模型，其發(fā)病機制和病理特點的異同有待進一步闡釋；③RA動物模型中一些指標如關(guān)節(jié)腫痛、晨僵、發(fā)熱等不適不能夠被客觀地體現(xiàn)出來，因此模型評價標準仍需完善。綜上所述，探尋一種能完全符合RA特點的動物模型仍是今后的重中之重。

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篇7

論文摘要：董事的注意義務和忠實義務是董事義務的兩個重要組成部分，對董事注意義務的判斷標準的不斷發(fā)展完善對公司、企業(yè)的健康發(fā)展有著十分重要的意義。

一、董事注意義務的內(nèi)容和演變

董事的注意義務，是指董事在實施行為時應達到一定的標準的義務。它要求董事在管理公司業(yè)務時，應當盡一個理性、謹慎的人在同樣情況下能夠盡到的注意，積極謀求公司利益的最大化。董事的注意義務包括勤勉、注意、技能三個方面的內(nèi)容。

董事的信義義務主要源自信托法。在維多利亞時期，董事是一般性的官員，他們基本上是為公司服務并獲得費用，這與當前的非執(zhí)行董事有相似之處。在19世紀，公司董事的職責主要基于以下事實，即董事一般是兼職的，定期參加公司的會議，可以將其職責委任給他人，可以信任其下級。董事身份似乎代表特定的社會階級，因此他們經(jīng)常因其階級屬性而被任命為董事，而不是因為其能力或技能。早期的很多公司未經(jīng)官方登記和確認，屬于自由設立，而當公司未注冊也未獲得官方確認，而是由協(xié)議契據(jù)所設立的時候，該契據(jù)規(guī)定董事是公司資金和財產(chǎn)的受托人，由此，法院規(guī)定其承擔此嚴格的義務標準。從這一點來看，董事就是受托人，因此要求其承擔受托人的信義義務是完全適當?shù)?。但隨著公司實踐的發(fā)展，公司越來越多的是按照法律規(guī)定登記設立，而不是按照信托協(xié)議設立，而且，董事從最初的非專業(yè)化轉(zhuǎn)化為越來越專業(yè)，董事對公司管理的參與也越來越積極。人們開始認識到董事地位與受托人相似甚至相同是一種不明智的解釋和不完善的理解。而二者的不同主要在于董事被期待從事積極的商業(yè)經(jīng)營。但董事從事的各類商業(yè)活動有可能會偏離股東的最大利益，甚至是明顯的錯誤決策。因此，為了將董事的行為約束在一定的可接受的范圍之內(nèi)，防止其濫用自己的權(quán)利而損害股東的利益，法律開始確認董事的注意義務。從這一點來說，董事的注意義務是董事不同于受托人的根本之處，也是公司法獨立發(fā)展出來的董事義務制度，而不是從信托法中借鑒過來的內(nèi)容。

因此，董事注意義務的產(chǎn)生源自董事管理職能的獨立和強化，源自法律對股東利益的保護需求。

二、國外關(guān)于董事注意義務判斷標準的規(guī)定

（一）英國

英國最早在ReCityEquitableFireInsuranceCo.Ltd案中確立了董事注意義務的主觀標準。在該案中，羅默（Rome）法官指出：首先，董事在履行職務時，它的技能水平應合理地從他的知識和經(jīng)驗來判斷，他不必展示比此更高的水平。其次，董事不必對公司事務給予持續(xù)的關(guān)注。他的職責是間歇性的。他只需定期參加董事會的會議，當其是董事會委員會成員時，則是定期參加董事會委員會的會議。然而，董事不必參加每一次會議，盡管他應盡可能多地參加會議。再次，根據(jù)公司業(yè)務需要和章程細則的規(guī)定，董事的所有職責可以適當?shù)叵路沤o其他高級職員。在不存在可疑根據(jù)時，董事有理由相信該高級職員的行為是誠實的。后來，有關(guān)注意義務的標準被逐漸客觀化，即董事的應該具有理性之人在相似的環(huán)境下應該具有的注意。

（二）美國

《1984年模范公司法》對董事的注意義務進行了規(guī)定。該法第8.03條規(guī)定：第一，一個人作為董事，包括作為董事會下屬委員會成員，應該這樣履行其義務：以誠信方式；以普通謹慎之人處于相似職務、在相似環(huán)境下能夠做到的注意；并且，按照一種其合理相信是符合公司最佳利益的方式。第二，在履行其義務時，董事有權(quán)利信賴由下列人員準備或呈報的信息、意見、報告和報表，包括財務報表和其他財務數(shù)據(jù)：一個或多個公司高級職員或雇員，董事合理相信他們提供的有關(guān)材料是可信賴的，并且是勝任其工作的；法律顧問、注冊會計師或其他人員，董事合理地相信他們所提供的材料是屬于其能勝任的職業(yè)或?qū)I(yè)領(lǐng)域；董事會的一個下屬委員會，他雖不是該下屬委員會的成員，但他合理相信該委員會值得信賴。第三，如果一個董事知道有關(guān)材料有問題，從而使所允許的信賴變得不可靠，則該董事的行為就不是誠信的。第四，一個董事根據(jù)本條規(guī)定履行了他的職責，就無須為他作為一名董事所實施的任何行為或不采取任何行動而承擔責任。

這是一種典型的客觀標準。類似地，日本法中規(guī)定董事的注意義務標準為善良管理人的標準，即善良家父的標準，這也是一種客觀標準。

主觀標準有打擊高水準董事、放縱低水平董事的嫌疑，因此是不可取的?？陀^標準有利于執(zhí)法和明確法律責任，而主客觀相結(jié)合的標準對董事的責任要求最為嚴格。目前中國董事的義務和責任規(guī)定很不完善，為了提高董事的責任心和素質(zhì)，應該強化董事的注意義務標準，采用主客觀相結(jié)合的標準來認定董事是否違反注意義務。應以客觀標準為原則，即認為董事首先具有普通謹慎之人（善良家父）的注意，同時如果董事具有法律、財務或其他方面的專長，則應對其在表決或執(zhí)行涉及該領(lǐng)域的事務時要求更高的注意義務標準，其行為要符合自身的高素質(zhì)。同時還要區(qū)分執(zhí)行董事和非執(zhí)行董事的注意標準。董事的注意義務可以分為注意、勤勉和技能義務。雖然原則上，執(zhí)行董事與非執(zhí)行董事的注意義務不應有區(qū)別，但由于非執(zhí)行董事多位兼職，而執(zhí)行董事則應該持續(xù)地參與公司的運營，故而人們對其勤勉程度的期望會低于對執(zhí)行董事的期望。執(zhí)行董事執(zhí)行公司的事務，應當具有經(jīng)營才能，而非執(zhí)行董事主要參與公司的決策和履行監(jiān)督職責，因此不一定要具有經(jīng)營管理才能。所以，對執(zhí)行董事的技能義務要求要與對非執(zhí)行董事的技能義務要求不同，后者更低一些。另外，對一些明顯屬于對注意義務違反的行為應該進行類型化的規(guī)定，直接將其規(guī)定為違反注意義務。例如，當董事在瀕臨破產(chǎn)時不采取法定措施、無正當理由長期不出席董事會、對其他董事及高級管理人員的不合理信任等行為規(guī)定為對注意義務的違反。

三、注意義務的緩解——商業(yè)判斷原則的引入

董事的注意義務并不是要求董事對所有的決策失誤和經(jīng)營損失承擔責任，而是要對未盡到合理注意的行為和沒有達到公司的經(jīng)營能力要求時造成的損失負責。如果對董事的注意義務要求過高，則很多有能力的人會對董事職位望而卻步，即使擔任董事職位之人，也會畏首畏尾，在做出決策時過于保守，以一種不求有功但求無過的心態(tài)履行自己的職責。這顯然不利于公司和整個國民經(jīng)濟的發(fā)展，因此，在美國首先發(fā)展了商業(yè)判斷原則作為對誠實董事的保護手段。董事的注意義務要求董事具有進行經(jīng)營管理所必備的經(jīng)營技能，并且勤勉地參與公司的管理。

（一）商業(yè)判斷原則的含義

商業(yè)判斷原則是指如果董事和經(jīng)營管理者在執(zhí)行的業(yè)務在公司權(quán)力和管理者權(quán)限范圍之內(nèi)，并且有合理的理由表明該行為是以合理注意和善意的方式為之，則免除董事和經(jīng)營管理者對合理的經(jīng)營失誤所應承擔的責任。對上述概念可以做如下理解：

第一，董事在授權(quán)從事公司的交易時，只要沒有個人的利害關(guān)系，法院不能以董事在執(zhí)行職務時沒有達到應有的標準為理由而禁止或取消該項交易。第二，授權(quán)從事該項交易的董事，只要不符合上述三個條件中的一個，就不必因該項交易使公司遭受損失而負賠償責任。第三，商業(yè)判斷原則既是一種舉證責任分配機制，也是一種實體法規(guī)則。作為一種舉證責任分配機制，它的出發(fā)點是假設董事行為是善意的，并以適當注意的方式行使的。因此，主張董事違反義務的原告應該證明董事在做出行為時具有重大過失等非善意因素。作為一項實體法規(guī)則，即使事后證明董事的行為是錯誤的，公司因此而遭受了損失，但如果董事在做出決策之時符合商業(yè)判斷原則，則不對該損害結(jié)果承擔責任。第四，商業(yè)判斷原則體現(xiàn)了對董事等管理人員的寬容，但對于忠實義務是不能通過商業(yè)判斷原則豁免的。而且，各國公司法一般規(guī)定股東會可以通過一致決議免除董事對注意義務的違反所應當承擔的責任，同樣也不能豁免董事對忠實義務的違反所應當承擔的責任。忠實義務更多地體現(xiàn)了強制性義務的特色，而注意義務則更多地體現(xiàn)了具有任意性色彩的特點。轉(zhuǎn)（二）商業(yè)判斷原則的構(gòu)成要件

董事主張商業(yè)判斷原則的保護，應具備以下條件：第一，董事的行為只限于商業(yè)判斷的場合。第二，董事遵守了忠實義務，商業(yè)判斷中不含有其個人利益與公司利益之間的沖突。即商業(yè)判斷原則僅適用于董事對注意義務的違反，而不適用于董事對忠實義務的違反。第三，董事獲取的據(jù)以做出商業(yè)判斷原則的信息在當時有理由被其認為是充分和準確的。第四，董事有充分的理由認為其商業(yè)判斷原則最為符合公司利益。第五，董事在做出商業(yè)判斷時不存在重大過失。第六，商業(yè)判斷本身不違反法律、法規(guī)或公司章程的規(guī)定。

（三）不適用商業(yè)判斷原則的情形

具體內(nèi)容包括以下方面：第一，董事所從事的不是根據(jù)有關(guān)決定的行為，或者所做的為失敗的失職行為，不適用商業(yè)判斷原則。第二，商業(yè)判斷原則僅適用于慎重且審慎地做出的決定。即在做決定時，不僅要做出積極行為的決定，而且要做出消極行為的決定。第三，商業(yè)判斷原則不適用于修改或變更按照法律而確定的董事或管理管理者的義務。也不適用于必須獲得董事會承認的重要財產(chǎn)的處分，公司重要組織的變更以及不需要董事會承認的決議。第四，商業(yè)判斷原則不適用于企圖或者允許董事或者管理管理者從事違法行為的決定。第五，商業(yè)判斷原則不適用由于董事或高級管理者對某種決定缺乏充分自信而做出的違法的決定。第六，商業(yè)判斷原則不適用于董事或者管理者沒有充分地收集資料并慎重地進行準備而做出的決定。第七，商業(yè)判斷原則不適用于董事或者高級管理者不誠實地或具有同公司相反利益關(guān)系而做出的決定。第八，在提起追究董事或者高級管理者責任的原告，在證明董事或高級管理者的決定中沒有任何合理的理由時，不適用商業(yè)判斷原則。

（四）董事會權(quán)利委托時董事注意義務的判斷

董事會是公司的經(jīng)營決策機構(gòu)和執(zhí)行機構(gòu)。董事會的決策職能是由全體董事通過董事會形式來行使，而董事會的執(zhí)行職能一般是通過執(zhí)行董事、董事長、董事會專門委員會、公司雇員和其他人來行使的，即董事會的執(zhí)行職權(quán)可以委任第三人行使。例如，新西蘭1993年公司法第130節(jié)規(guī)定了董事的委任：首先，董事會可以將權(quán)力授予董事會委員會、董事、公司雇員或其他人，這些權(quán)力包括一項或更多的董事會職權(quán)。其次，董事會要對他們授予權(quán)力的受托人的行使權(quán)力的行為承擔責任，就像這些權(quán)力是由董事會行使的一樣，除非董事：在合理的基礎上相信被任命人在行使其權(quán)力時會遵守法律或公司章程所強加于其的責任；已經(jīng)通過正確的使用合理的方法對被任命人的行為進行了監(jiān)督。

由此可知，董事會只有在受托人的信賴是合理的時候，才可以免除責任。至于什么是合理的信賴，新西蘭法律同樣也有規(guī)定。新西蘭1993年公司法第138節(jié)規(guī)定了董事對信息和建議的信賴：第一，（董事）信賴特定人的權(quán)力。該節(jié)第2分節(jié)規(guī)定，在行使權(quán)力和履行職責的時候，公司的董事可以信賴由以下人士準備或提供的報告、陳述、財務數(shù)據(jù)和其他信息，以及專業(yè)或?qū)＜医ㄗh。這些人包括：公司的雇員，如果對該雇員董事有合理理由相信其值得信賴并勝任涉及的事務；職業(yè)建議者或?qū)＜遥绻掠泻侠砝碛上嘈糯巳司哂写隧椔殬I(yè)或?qū)I(yè)能力；任何其他董事或者該董事未任職的董事會專業(yè)委員會的董事，如果此項事務屬于這些董事和董事會委員會的授權(quán)范圍內(nèi)。第二，誠實。第一分節(jié)規(guī)定只有董事：誠實行事，根據(jù)客觀環(huán)境做了適當?shù)恼{(diào)查，并且不清楚這種信賴是沒有保障的。而澳大利亞新公司法在第226節(jié)D中規(guī)定了可排除的完全授權(quán)，基本內(nèi)容與新西蘭公司法相似。

總之，通過對董事注意義務的判斷標準的研究和合理應用，可以使我國公司、企業(yè)吸引更多的優(yōu)秀人才，為公司、企業(yè)的健康發(fā)展起到良好的保障作用。為社會經(jīng)濟的整體健康發(fā)展發(fā)揮積極作用。

參考文獻：

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關(guān)鍵詞：任務驅(qū)動式教學法；血液學檢驗；骨髓細胞形態(tài)學

血液學檢驗是檢驗專業(yè)的一門重要專業(yè)課程[1]，其教學難點是細胞形態(tài)學，尤其是骨髓細胞形態(tài)種類繁多。大部分高職學生對血液學檢驗課程不感興趣，認為其理論知識抽象，難以理解，學習難度較大。為了提高教學質(zhì)量及學生滿意度，調(diào)動學生學習積極性，我們在血液學檢驗教學中引入新的教學方法———任務驅(qū)動式教學法，與傳統(tǒng)教學方法相結(jié)合，使教學效果更加理想。

1正常骨髓細胞形態(tài)教學

正常骨髓細胞形態(tài)特點是血液學診斷的基礎，只有熟練掌握正常細胞的形態(tài)，在后續(xù)血液疾病學習中學生才能理解異常細胞的特點。以往我們采取的是多媒體教學，教師講解各種細胞特點，分析細胞形態(tài)，學生被動聽講，很難有完整印象，效果很不理想[2]。因此，在這一階段授課中，我們將骨髓細胞各個系統(tǒng)分解為若干個任務，將全班分為多個小組，每個小組分配一個任務，任務內(nèi)容包括：將各系統(tǒng)細胞形態(tài)特點配圖片制作成PPT，在課堂上詳細講解，并且引導其他組學生在鏡下找到相關(guān)細胞。這一任務驅(qū)動式教學法在前期教學中存在一些不足，如部分學生敷衍了事、照本宣科，或者完全講解錯誤，起不到引導作用，反而對其他學生造成誤導。針對這一情況，教師預先指導學生，講清楚各系統(tǒng)細胞各期發(fā)育階段的要點，列出其最突出、最易于辨認的特點，再讓學生查閱資料，尋找細胞圖片，結(jié)合課本制作PPT。每個小組推選一位學生多次試講合格后為其他同學授課，并拍下視頻作為教學資料。待學生在大腦中對細胞形態(tài)有初步印象后，立即發(fā)放骨髓片，讓學生趁熱打鐵在鏡下找到已講解的細胞。在實驗課總結(jié)階段[3]，教師可以從圖庫中選取細胞圖片對學生進行提問，了解學生知識掌握程度。對于學生不易掌握的形態(tài)特點再次講述，加深學生印象。這種學生主導、任務驅(qū)動、教師總結(jié)的教學模式，調(diào)動了學生獲取知識的自覺性，鍛煉了閱讀資料、歸納總結(jié)、口頭表述、團結(jié)協(xié)作和組織實施等能力[4]。通過初步教學應用，發(fā)現(xiàn)學生對細胞的認知能力、辨認準確度均有很大提高。

2病理骨髓細胞形態(tài)教學

病理骨髓細胞形態(tài)教學在血液學檢驗教學中包括很多內(nèi)容，如紅細胞系統(tǒng)疾?。ㄈ辫F性貧血、巨幼細胞性貧血、溶血性貧血等），白細胞系統(tǒng)疾?。毙园籽?、慢性白血病、骨髓增生性疾病等），血小板系統(tǒng)疾病。細胞形態(tài)變化大而奇特，同一種疾病的不同個體間或疾病不同發(fā)展階段，其細胞形態(tài)也不盡相同。要在短短的實驗課時內(nèi)了解各種疾病的特點，對于學生而言難度太大。因此，我們在講解這部分內(nèi)容時也引入了任務驅(qū)動式教學法。理論課上，教師對某一類型血液病的某一具體病例做全面而簡單的介紹，包括病史、癥狀、體征、臨床表現(xiàn)、相關(guān)檢查及結(jié)果分析[5]，并在此基礎上重點講解骨髓涂片檢查，特別是病理骨髓片在診斷這類血液病中的重要作用。理論課后，教師將提前準備好的相應疾病病例資料和顯微鏡系統(tǒng)拍攝的外周血及骨髓圖譜分發(fā)給學生，讓學生通過小組討論、上網(wǎng)查找資料等方式，對骨髓象進行分析并出具診斷意見，提出相關(guān)檢查。在下一次實驗課上各小組分別進行匯報講解，再與教師和其他組討論，得出自己的實驗結(jié)果。之后，在圖譜引導下，學生再利用顯微鏡觀察骨髓涂片，了解各種細胞形態(tài)，這樣學生不會覺得無所適從，其效果比理論課后直接讓學生看骨髓片好很多。

3考核制度改革

為了準確了解學生辨認細胞的水平，提高學生學習興趣，提高其對骨髓細胞形態(tài)學的重視程度，我們在教學中實行了嚴格的考核措施，將細胞形態(tài)考核+卷面考試形式改為過程性考核+卷面考試形式，將卷面成績由占總成績的80%降至50%。改革后的過程性考核包括考勤、個人作業(yè)、團隊作業(yè)、技能考核、課堂討論等。

3.1個人作業(yè)

（1）看圖認細胞[6]：針對課堂內(nèi)容，從骨髓細胞資源庫中選取相關(guān)細胞圖片讓學生辨認，學生將結(jié)果交給教師批改，教師以此了解學生理解程度[7]。我們用這種方法取代了傳統(tǒng)依葫蘆畫瓢的用紅藍鉛筆畫出鏡下細胞的方法，發(fā)揮了學生主觀能動性。（2）骨髓報告書寫：在以往的教學中，教師往往將注意力集中在讓學生辨認細胞形態(tài)，容易忽視與理論的聯(lián)系。我們通過考核方式改革，讓學生書寫骨髓檢驗報告，使其全面熟悉、掌握常用血液病的血象及骨髓象特征，學會分析骨髓象，掌握相關(guān)骨髓檢驗技術(shù)，并為常見病下準確診斷，為將來實習、就業(yè)打下良好基礎。

3.2團隊作業(yè)

包括分組講解正常骨髓細胞形態(tài)和分析診斷常見血液病骨髓片。高職學生普遍主動學習能力差，缺少學習動力。通過團隊作業(yè)考核形式創(chuàng)建良好的學習環(huán)境，使學生在從眾心理驅(qū)使下主動參與學習活動，使不愛學習的學生迫于環(huán)境壓力參與學習，從而優(yōu)化學習氛圍。

3.3技能考核

（1）正常細胞形態(tài)考核[8]：在要考核的內(nèi)容（包括各期粒、紅、單、淋、漿、巨核細胞，還有肥大細胞、成骨細胞、破骨細胞、退化細胞等其他細胞）中選取20個細胞，以PPT形式自動播放，讓學生在規(guī)定時間內(nèi)寫出正確名稱。（2）常見血液病骨髓片考核：選擇形態(tài)典型的常見疾病骨髓片（正常骨髓片、缺鐵性貧血、巨幼細胞性貧血、再生障礙性貧血、急性白血病、慢性白血病等骨髓片），讓每位學生隨機抽取一張，要求在90分鐘內(nèi)完成對骨髓片的檢驗，包括填寫骨髓細胞學檢驗報告單。任務驅(qū)動式教學法是指整個教學過程以完成某個具體任務為線索，在完成任務的同時培養(yǎng)學生自主學習習慣，提高其自學能力、合作能力及創(chuàng)新能力[9]。這種教學法將理論教學和實訓教學有機融合，以學生為主導、工作任務為主線，注重技能培訓，不僅能使學生提高學習興趣，明確學習目的，增強學習欲望，培養(yǎng)團結(jié)協(xié)作能力，還能提高教師教學水平[10]。

作者:何艷 劉芝蘭 鄧陽勇 張諾 單位:湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學院

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篇9

關(guān)鍵詞 電子商務 動態(tài)實驗 模擬環(huán)境 教學體系

中圖分類號：G424 文獻標識碼：A

1 緒論

1.1 研究的意義

目前高校逐步建立了電子商務專業(yè)綜合實驗室，通過計算機硬件和電子商務軟件來構(gòu)建綜合電子商務實驗環(huán)境。電子商務是集經(jīng)濟學科、管理學科、信息學科、計算機學科的交叉和邊緣學科，它的綜合性學科特點決定了電子商務理論知識和實驗教學具有復雜性和多樣性的特點。電子商務理論知識是實踐教學的基礎，理論知識讓學生深入了解整個電子商務框架結(jié)構(gòu)，而實驗教學則是實現(xiàn)專業(yè)實踐教學的重要訓練手段，只有通過實驗教學，模擬現(xiàn)實環(huán)境和參與企業(yè)實踐，才能使學生深刻領(lǐng)會電子商務的理論框架、概念模型、技術(shù)手段、表現(xiàn)形式、交易規(guī)則，應用途徑、技巧方法等，才能讓學生了解企業(yè)電子商務需要什么專業(yè)人才。電子商務設計實驗課程的合理性，實驗教學方式多樣性，實驗教學的先進性都將直接影響到電子商務人才培養(yǎng)質(zhì)量和培養(yǎng)目標。因此建立一個動態(tài)的、多層次、多樣化的適合現(xiàn)代社會需求的電子商務實驗室是電子商務專業(yè)建設目前亟需解決的一項重要工作。

1.2 研究的思路與結(jié)構(gòu)

以建立一個現(xiàn)代的、動態(tài)的、多層次、多樣化的電子商務實驗環(huán)境也叫做實踐教學體系為目標，綜合運用現(xiàn)代實驗教學方面的最新研究成果，通過對電子商務實驗教學必要性和目前電子商務實驗教學開展現(xiàn)狀的分析，最終建立一個現(xiàn)代的、動態(tài)的、多層次、多樣化的電子商務實踐教學體系。

（1）現(xiàn)狀背景分析：了解目前理論界對電子商務實驗教學環(huán)境的研究和電子商務實驗教學中存在的問題。

（2）理論模型構(gòu)建：綜合運用現(xiàn)代實驗教學方面的最新研究成果，結(jié)合電子商務專業(yè)的特點，建立現(xiàn)代的、動態(tài)的、多層次、多樣化的實踐教學體系模型。

（3）核心觀點形成：探討如何運用此模型選擇適當?shù)碾娮由虅諏嶒灲虒W模式。

1.3 國內(nèi)外電子商務實驗教學研究綜述

目前電子商務實驗教學環(huán)境作為電子商務課程教學的重要內(nèi)容和組成部分，對于高校培養(yǎng)電子商務專業(yè)人才具有重要作用，影響到課程教學質(zhì)量乃至人才培養(yǎng)目標的實現(xiàn)（楊紅兵，2008）。國外高校較早開始了電子商務模擬環(huán)境的研究和嘗試（Philip Joyce，1999；Howard Rosenbaum，2000），已經(jīng)有很成熟的教學方法和實驗環(huán)境，而國內(nèi)高校電子商務實驗環(huán)境與教學方式目前不是很成熟，主要是購買一些軟硬件，學習國際上的成功案例（馬洪娟，2010；樊斌，2010；陳晴光，2010；張金輝，2010；李曼，2009）。但是模擬實驗軟件內(nèi)容很難與電子商務日新月異的發(fā)展速度相匹配，與實際電子商務也存在差距。伴隨電子商務快速發(fā)展，在實驗經(jīng)費不足、實驗課程內(nèi)容復雜，教材更新速度慢，與社會聯(lián)系少導致實際環(huán)境脫節(jié)，學生學習較為被動的局面，是一個亟需解決的問題（談曉勇，2010）。目前電子商務教學方法研究上主要有，建立建全完善的電子商務教學體系，大融合的電子商務教學方法，個性化需求的電子商務教學方法和面向?qū)嶋H應用的電子商務教學方法等。

2 電子商務實驗教學必然性

2.1 由電子商務的學科特點決定

電子商務人才培養(yǎng)模式中，除了強化理論教學外，還需要通過一些實踐環(huán)節(jié)使學生對電子商務整個應用過程進行深入了解，同時學生也應該經(jīng)常瀏覽和參與目前的電子商務網(wǎng)站的交易活動，才能有更清晰的認識。由于目前不可能讓每個學生都到電子商務企業(yè)去參與各個方面的實習，所以電子商務實驗教學成為鏈接電子商務理論與實踐內(nèi)容的重要橋梁與紐帶。

2.2 由電子商務人才社會需求決定

21世紀是網(wǎng)絡經(jīng)濟、知識經(jīng)濟和互聯(lián)網(wǎng)高速發(fā)展的時代，電子商務領(lǐng)域的商業(yè)模式創(chuàng)新發(fā)展使得電子商務的人才需求范圍得以持續(xù)擴大。而互聯(lián)網(wǎng)的普及應用和移動商務的快速發(fā)展，包括電子商務、移動商務應用在內(nèi)的互聯(lián)網(wǎng)應用開始提速，相關(guān)的人才需求數(shù)量也相應增加。企業(yè)招聘電子商務人員多數(shù)希望招到既掌握一般計算機網(wǎng)絡技術(shù)，又具有商務策劃、營運推廣、物流管理的綜合型商務人才。對于電子商務人才必須要掌握相應的理論知識和網(wǎng)絡技術(shù)在實踐中的應用，兩者相輔相成，缺一不可。因此，電子商務人才市場社會需求的特點，也決定了電子商務實驗教學的必然性。

3 目前電子商務實驗教學環(huán)境的現(xiàn)狀

3.1 目前電子商務實驗教學的主要環(huán)境

良好的實驗環(huán)境是開展課程實驗教學的基礎，目前電子商務實驗教學的主要環(huán)境有基于電子商務模擬軟件的實驗教學，基于互聯(lián)網(wǎng)準公司的實驗教學，基于實戰(zhàn)型實驗教學?；陔娮由虅漳M軟件的實驗教學，優(yōu)勢在于創(chuàng)立一種高度仿真系統(tǒng)，使學習者如身臨其境，和現(xiàn)實情況很相似，更貼近真實的電子商務活動，自由空間更多，更加符合學生的思維習慣，學生在實驗中學會電子商務工作的主要業(yè)務技能。目前電子商務模擬實驗軟件有多個開發(fā)公司開發(fā)，沒有統(tǒng)一的標準，存在著流程固定、內(nèi)容形式和版權(quán)保護等問題。隨著電子商務在企業(yè)和用戶中廣泛應用，模擬實驗軟件內(nèi)容很難與實際電子商務相似，于是基于實際電子商務網(wǎng)絡應用的實驗教學環(huán)境得到大多數(shù)老師和學生的喜愛。基于互聯(lián)網(wǎng)準公司的實驗教學環(huán)境為學生提供了一個全面、系統(tǒng)和靈活的實驗訓練，幾乎和實際環(huán)境一樣，保證了與現(xiàn)實發(fā)展同步，有效地解決了課程教學與實際需求脫節(jié)的矛盾。基于實戰(zhàn)型實驗教學是指在學校建立校園網(wǎng)網(wǎng)上商城，通過在學校內(nèi)部進行推廣使用，通過校內(nèi)的電子商務對學生的實踐能力，技術(shù)應用能力、社會活動能力的培養(yǎng)有更積極直接的影響，為學生提供了電子商務真實活動環(huán)境，為畢業(yè)以后的工作奠定了堅實的基礎。

3.2 目前電子商務實驗教學中存在的問題

目前，電子商務實驗室建設在實際使用和操作中，主要存在以下問題。首先，電子商務實驗室功能上的不完善，過多重視電子商務業(yè)務的實現(xiàn)，而忽視了一些輔助業(yè)務的環(huán)節(jié)，電子商務網(wǎng)站最大的優(yōu)勢是給學生提供了一個真實的實驗環(huán)境，例如阿里巴巴、易趣網(wǎng)、京東商城、蘇寧易購等電子商務網(wǎng)站，通過這些企業(yè)電子商務網(wǎng)站不僅使學生學習更具有現(xiàn)實意義，而且也可以為學生日后網(wǎng)上開店積累經(jīng)驗，對于提高學生的電子商務應用技能極為有利。但網(wǎng)上實驗環(huán)境的缺陷是無法看到電子商務運作的全部流程，無法全面了解電子商務技術(shù)和管理內(nèi)容，如域名申請與解析，搜索引擎設定，網(wǎng)絡營銷服務，第三方的業(yè)務接口等。因此，在實驗教學中，必須和企業(yè)結(jié)合使用企業(yè)的電子商務系統(tǒng)讓學生親自體驗電子商務中的廠商、消費者、銀行、認證中心、物流等各環(huán)節(jié)的具體操作過程和管理內(nèi)容。電子商務模擬軟件將電子商務的業(yè)務流程固定化、實驗流程固定化，系統(tǒng)一定開發(fā)完成，很少能夠根據(jù)各學校的應用需求進行個性化和本地化的開發(fā)，雖然業(yè)務固化固然加強學生對這一流程的深入了解，但是過于強調(diào)流程固化，對學生創(chuàng)造性思維培養(yǎng)極為不利。由于電子商務的快速發(fā)展，教學老師具有很深的理論知識，但是缺乏一定的實踐經(jīng)驗，和實際有可能有些脫節(jié)，因此，加強教師隊伍建設，讓教師進入企業(yè)實習，提高教師的實踐動手能力也是重要的內(nèi)容。

4 現(xiàn)代化電子商務實驗教學體系的構(gòu)建

電子商務教學實驗環(huán)境不應僅僅包括實驗教學的軟硬件設備，而應該是一個現(xiàn)代的、動態(tài)的、多層次、多樣化的立體實踐教學體系。既要考慮學校的基礎條件，也要考慮今后發(fā)展的可擴展性，它應該既要包括傳統(tǒng)的實驗室教學軟硬件，同時還應該包括完整的教學組織模式和豐富靈活的教學支持。

為了彌補傳統(tǒng)的電子商務實驗教學環(huán)境的不足，我們應在此基礎上進行擴展，首先，以專業(yè)競賽帶動實踐教學，組織教師和學生參與政府、企業(yè)和學校舉辦的各種專業(yè)競賽，師生通過專業(yè)競賽能夠調(diào)動大家的主觀能動性和學生參與電子商務競爭意識，培養(yǎng)學生的學習興趣和創(chuàng)造性思維能力。

其次，利用互聯(lián)網(wǎng)資源。比如目前有很多的電子商務網(wǎng)站，通過電子商務網(wǎng)站流程了解一部分實驗環(huán)境，同時利用互聯(lián)網(wǎng)上電子商務網(wǎng)站源代碼，下載并安裝在學校的服務器上，讓學生了解建立互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)站的整個過程，同時熟悉網(wǎng)站的管理流程、資金結(jié)算等信息。

另外，通過校企合作開展電子商務實驗。企業(yè)永遠站在市場的最前沿，通過企業(yè)建立學生實驗實訓基地，教師利用企業(yè)實訓基地進行現(xiàn)場教學，學生參與商業(yè)軟件測試版測試，到企業(yè)直接頂崗實習，同時企業(yè)也為學生建立實習導師，采用雙導師制，同時指導學生將理論知識應用到企業(yè)實踐中，雙導師根據(jù)學生的實習情況給予指導，開展現(xiàn)場教學，使學生在實驗中得到鍛煉，了解目前電子商務可能會出現(xiàn)的各種問題，進而提高分析問題、解決問題的能力。

最后，學校組織編寫實驗大綱、實驗教材，教學指導書、學生實驗報告、實驗記錄卡，師生答疑與反饋交流平臺等，對學校組織學生參與電子商務實驗教學而言，都是必不可少的。

通過建立電子商務教學動態(tài)實驗環(huán)境，按照體現(xiàn)基礎性、先進性、系統(tǒng)性、綜合性和創(chuàng)新性的原則，建立分層次、多模塊、互相銜接的、科學系統(tǒng)的實驗教學體系，全面提高電子商務實驗教學水平，使學生完整、系統(tǒng)地掌握電子商務實驗的基本原理、方法和技能，才能培養(yǎng)滿足社會需求的電子商務實用人才。

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篇10

關(guān)鍵詞：實驗動物；屏障系統(tǒng)；改造；設計與建設

實驗動物科學作為生命科學研究的基礎和條件，是衡量一個國家或科研單位科學研究水平的重要標志。2008～2013年，"Science"評選出50項重大科技進展中，生命科學占22項，其中利用實驗動物的研究就占13項[1]。隨著科學研究的深入，SPF及以上等級的實驗動物的使用越來越廣泛。近幾年，我國不斷地完善實驗動物法規(guī)與標準，并頒布實施新國標GB14925-2010《實驗動物環(huán)境及實施》[2]，實驗動物屏障系統(tǒng)建設體系作為保證SPF級動物質(zhì)量、動物實驗準確性的載體[3]，已取得了顯著發(fā)展。建立和管理與生命科學相適應的實驗動物屏障環(huán)境，已成為現(xiàn)代醫(yī)學學科建設和科研發(fā)展的必然趨勢。四川大學華西第二醫(yī)院是集醫(yī)療、教學、科研和人才培養(yǎng)為一體的大學附屬醫(yī)院，擁有婦兒疾病與出生缺陷教育部重點實驗室、早期發(fā)育與損傷的基礎與臨床嵌合研究教育部長江學者創(chuàng)新團隊及PI實驗室團隊等學科特色。為適應醫(yī)學科學研究的快速發(fā)展，醫(yī)院于2016年啟動對原實驗動物中心升級改造工程。本文結(jié)合本次實驗動物中心升級改造過程中積累的經(jīng)驗，探討如何有效實施舊設施環(huán)境改造的設計與建設，以供借鑒參考。

1實驗動物屏障系統(tǒng)概況

四川大學華西第二醫(yī)院實驗動物中心按照國家有關(guān)法規(guī)和標準規(guī)劃、設計、建設，是一個集科研和教學為一體的公共服務平臺。經(jīng)改造擴建后的實驗動物中心室內(nèi)建筑面積約為1100m2，位于大樓的第四、五層，其中四樓的SPF級實驗動物屏障設施約400m2，平面布局如圖1所示，滿足了人流、物流、動物流的合理走向，避免往返交叉；五樓建有普通級實驗動物房200m2，并兼顧AAALAC認證推薦的"GuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals"[4]，設立動物行為學觀察室、動物準備室、手術(shù)室、安樂死處置室、解剖室、動物觀察室等功能區(qū)域。具有動物飼養(yǎng)分區(qū)合理，實驗設施功能齊全，充分保障實驗動物福利等優(yōu)點，滿足不同種類、微生物控制級別的實驗動物使用需求。

2實驗動物屏障系統(tǒng)的設計布局

2.1空調(diào)凈化系統(tǒng)設計

空調(diào)系統(tǒng)作為整個屏障系統(tǒng)運行和管理的核心[5]，采用全新風，氣流組織從高潔凈區(qū)向低潔凈區(qū)降低：清潔走廊動物飼育間污染走廊輔助功能區(qū)。中心根據(jù)不同的等級要求采用不同的調(diào)節(jié)控制方式，四、五樓各設計獨立空調(diào)系統(tǒng)，并配置了兩套互為備用的機組設備；輔助功能區(qū)單獨設計一套多聯(lián)機系統(tǒng)，不用不開，既節(jié)約能耗，又方便管理?？照{(diào)機組安裝于大樓屋頂，不占室內(nèi)有效面積，同時降低管網(wǎng)造價。凈化系統(tǒng)采用頂送下排的送、排風方式，送入新風經(jīng)粗、中及高效三級過濾處理達萬級潔凈度。送、排風系統(tǒng)采用變頻風機，使通風系統(tǒng)能夠隨著室內(nèi)控制指標的變化調(diào)節(jié)送、排風量，減少通風負荷。排風終端采用了除臭過濾排風機，排放的廢氣經(jīng)除臭過濾處理后可有效防止環(huán)境污染。每臺空調(diào)通風機組設置獨立的自動控制系統(tǒng)，以強弱電一體化恒溫恒濕控制柜智能化控制空調(diào)通風機組的啟動、備用切換、參數(shù)調(diào)節(jié)等功能。通過遠程控制終端監(jiān)控空調(diào)凈化系統(tǒng)，符合“互聯(lián)網(wǎng)+”時代的智能化行業(yè)發(fā)展趨勢要求。

2.2照明系統(tǒng)設計

照明系統(tǒng)主要包括動物生物節(jié)律照明與工作照明，為使動物照明分布盡量均勻，在滿足國家標準15lx～20lx的光照強度前提下，增加動物照明燈數(shù)量，降低每個照明燈功率，并通過時控開關(guān)控制14h/10h的生物節(jié)律。屏障內(nèi)外各個獨立區(qū)域設置了帶蓄電池的應急照明燈，便于緊急斷電時，人員的安全疏散。

2.3安防系統(tǒng)設計

設置重要區(qū)域的視頻監(jiān)控、內(nèi)外通訊、門禁系統(tǒng)等安防設施，減少區(qū)域間的交叉污染，便于實時控制實驗動物屏障系統(tǒng)的流向管理與規(guī)范運行，解決屏障內(nèi)外人員間的交流，降低人流、物流出入頻率，又有效控制并減少閑雜人員的進出。由于實驗動物屏障系統(tǒng)密閉性高，人員流動線路復雜，且潔凈區(qū)內(nèi)人員少，事故難發(fā)現(xiàn)，在消防設施設計上設置了煙感火災探測器及兩個不相鄰的安全出口，便于及時發(fā)現(xiàn)事故與緊急疏散。由于潔凈區(qū)禁止設置消防栓，在非潔凈區(qū)的前后走廊均安裝消防栓，保證了消防栓的工作半徑符合消防規(guī)定。

2.4新型高效設備的選用

結(jié)合實驗動物中心的開放式管理及不同PI項目制實驗需要，安裝獨立通風系統(tǒng)籠具(簡稱IVC)，避免同一飼育間內(nèi)不同實驗項目的相互影響，以提高屏障設施利用率。在輔助區(qū)域的設計上，采用現(xiàn)代化設施進行管理，以提高輔助區(qū)面積的有效利用率，并節(jié)省了人力、物力成本。安裝新型落地式脈動真空滅菌器，既未破壞地平影響舊房承重，又無外置推車，節(jié)省操作空間與外置車清潔工作環(huán)節(jié)?？紤]在高密度飼養(yǎng)條件下繁重的日常清洗工作，安裝運用小型籠盒全自動清洗機，以小巧、高效、節(jié)水等優(yōu)勢降低人員的勞動強度，進一步節(jié)省了用人用水等成本，為屏障系統(tǒng)的高效運轉(zhuǎn)提供基礎保障。

2.5充分保障動物福利

動物實驗數(shù)據(jù)的準確性和可靠性很大程度上受實驗動物福利水平高低的影響，在本次的設計與建設中，采取了許多有力措施充分保障實驗動物福利。設置前室既可作為潔凈走廊與動物飼育間的緩沖區(qū)，又可減少實驗操作對其他動物產(chǎn)生的不良影響；設置術(shù)前準備室，用于實驗動物的術(shù)前準備、與術(shù)中操作隔離，避免動物產(chǎn)生恐懼、焦躁等情緒；設置安樂死處置室并購置安樂死專業(yè)設備，在適當?shù)臅r機以人道方式使動物達到仁慈終點，最低程度降低動物的痛苦，既維護實驗動物的福利，也確保了實驗數(shù)據(jù)的準確性。

3實驗動物屏障系統(tǒng)建設施工管理

在實驗動物屏障系統(tǒng)施工前，建立完備的技術(shù)監(jiān)督、管理、控制體系，協(xié)調(diào)好設計、施工、監(jiān)理及過程控制等單位的關(guān)系，充分發(fā)揮各自優(yōu)勢，不僅能保證工程施工質(zhì)量，也有利于新技術(shù)、新工藝、新方法的運用。實驗動物屏障系統(tǒng)建設涉及面廣、技術(shù)水平要求高，工程設計質(zhì)量是工程項目質(zhì)量的直接決定因素，選擇有經(jīng)驗、實力強的設計單位非常重要。設計初始方案完成后，組織相關(guān)專家進行設計優(yōu)化，從安全、功能、標準、經(jīng)濟等多方面全面權(quán)衡，形成最終設計方案。設立過程控制單位，從第三方角度針對建筑工程變更或增量進行咨詢、審核、造價評估，嚴把設計變更關(guān)更有利于項目成本控制。在施工之前，組織各方做好設計圖紙會審工作，通盤考慮基建、安裝、電氣、凈化等方面要求，及時梳理圖紙中的“錯、漏、碰、缺”部分，并與設計單位溝通變更，作為今后施工的依據(jù)。在施工過程中，依托監(jiān)理單位嚴控施工工序、施工作業(yè)、原材料質(zhì)量、工程進度及安全生產(chǎn)，每周召開監(jiān)理例會，通報當前施工進展與下階段計劃，及時溝通解決存在的問題，掌控施工階段工程質(zhì)量、造價、進度及安全管理主動權(quán)。

4討論

在實驗動物屏障系統(tǒng)的設計與建設過程中，不同單位的設計與建設理念、工藝各具特色。在平面設計中，采用的雙走廊設計同趙頌軍等人[6]的單走廊設計相比，雖減少了屏障系統(tǒng)的有效利用面積，但能有效分隔潔凈區(qū)與污物區(qū)，易于控制交叉污染的危害。嚴鶴峰[7]、周慶生[8]等人在節(jié)能技術(shù)的研究中，介紹了定向流技術(shù)、能量回收裝置等節(jié)能措施，與傳統(tǒng)的技術(shù)相比節(jié)省人力與財力投資，進一步降低運行能耗，而我們根據(jù)不同區(qū)域的劃分應用不同的變頻空調(diào)系統(tǒng)，不用不開；采用屏障系統(tǒng)與IVC相結(jié)合的飼養(yǎng)模式，在夜間或無人工作時段，維持屏障系統(tǒng)通風量的同時可降低換次次數(shù)，節(jié)約能耗[9]；在滿足設備對凈高的需求，適當降低系統(tǒng)室內(nèi)凈高，使凈高達國標最低標準2.5m，局部區(qū)域為2.4m，減少冷熱負荷[10]。

5結(jié)語

對實驗動物屏障系統(tǒng)的改造設計與建設過程中，要遵循因地制宜的利舊原則[11]，充分利用新理念、新產(chǎn)品、新技術(shù)，降低能耗、節(jié)約運營成本、提高飼養(yǎng)水平，為實驗動物屏障環(huán)境系統(tǒng)標準化、規(guī)范化及信息化建設與管理提供基礎支撐。

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