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摘要：目的探討端粒酶活性與增殖細胞核抗原(PCNA)表達之間的關系及聯(lián)合檢測對乳腺癌術后治療方案制定和預測預后的意義。方法采用端粒重復序列擴增聚合酶鏈反應-酶聯(lián)免疫吸附測定法(TRAP-PCR-ELISA)和免疫組織化學鏈霉素生物蛋白過氧化物酶(S-P)法對80例乳腺癌組織、36例乳腺癌相應癌旁組織和10例乳腺良性病變的端粒酶活性及增殖細胞核抗原進行檢測。結果(1)80例乳腺癌患者癌組織標本、36例乳腺癌相應癌旁組織標本中端粒酶表達陽性率分別為650%和83%，差異有統(tǒng)計學意義(P001)；10例乳腺良性病變組織標本中未檢測出端粒酶活性；腋窩淋巴結有無轉移與端粒酶陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義(P005)。(2)80例乳腺癌組織中PCNA的陽性表達率為6375%；乳腺癌有淋巴結轉移組PCNA陽性表達率顯著高于無淋巴結轉移組(P001)，且呈正相關(P001)，即淋巴結轉移程度越低，PCNA陽性表達率亦越低。(3)端粒酶活性與PCNA表達具有一致性(P001)，且呈正相關(P001)，一致率為8625%。結論端粒酶活性與PCNA表達具有一致性，端粒酶活性與PCNA聯(lián)合檢測，可為乳腺癌術后治療方案的制定和預測預后提供輔助依據(jù)。

【關鍵詞】乳腺癌；端粒酶；增殖細胞核抗原；多聚酶鏈式反應；免疫組織化學

增殖細胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)是一種表達細胞增殖周期的36kd多肽，直接參與細胞增殖過程中DNA的復制，其表達程度能客觀反映腫瘤細胞的增殖活性，過度表達增加了瘤細胞轉移趨勢的危險性，PCNA可作為判斷腫瘤預后的指標〔1〕。為探索乳腺癌組織端粒酶活性與增殖細胞核抗原表達的關系，對80例乳腺癌組織、36例乳腺癌相應癌旁組織和10例乳腺良性病變的端粒酶活性及增殖細胞核抗原進行檢測。

1對象與方法

11對象收集我院1992～2002年女性乳腺癌根治標本病理檢查存檔資料80例，乳腺癌相應癌旁組織(距離腫瘤2cm以上)36例，年齡32～72歲，平均年齡4846歲；乳腺良性病變10例，平均年齡3850歲。全部資料經(jīng)2位病理醫(yī)師審核，患者術前未做過放、化療。乳腺癌分類根據(jù)“中國常見惡性腫瘤診治規(guī)范”分為非浸潤性癌、早期浸潤性癌、浸潤性特殊癌、浸潤性非特殊癌4類。

12試劑與儀器端粒多聚酶鏈反應-酶聯(lián)免疫吸附(TelomerasePCRELISA)試劑盒(德國BoehringerMannhein公司)；陽性對照為腫瘤293細胞株(檢測試劑盒提供)；陰性對照為不含蛋白的裂解液；Ⅰ抗PCNApc10和鏈霉素生物蛋白過氧化物酶(S-P)試劑盒及過氧化物酶底物作用液二氨基聯(lián)苯氨(Diaminobenzidine,DAB)(北京中山生物技術有限公司)；用已知乳腺癌組織陽性切片(北京中山生物技術有限公司)為陽性對照，用磷酸鹽緩沖液(phosphatebufferedsaline,PBS)代替Ⅰ抗做陰性對照。酶標儀(SPECTRAⅢ)(美國Dynex公司)PCR(T-1thermoblock)(德國Biometra公司)。

13端粒酶活性檢測(1)端粒酶提?。好糠輼吮居貌±砬衅瑱C切10～15μm厚50片，加入預冷的端粒酶裂解液20μl，放置冰上裂解30min，1600r/min4℃離心20min，取175μl上清液為提取液，放置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?2)端粒酶活性檢測：端粒重復序列擴增-多聚酶鏈反應-酶聯(lián)免疫吸附(TRAP-PCR-ELISA)法〔2，3〕，取細胞提取液1～2μl加入25μl端粒重復序列擴增-多聚酶鏈反應(TRAPPCR)擴增液；無菌二乙基焦碳酸酯(diethyprocarbonate,DEPC)水補足至體積50μl混勻；在PCR擴增儀上按以下步驟進行引物的延伸及擴增反應：95℃5min預變性，再以94℃30s變性、50℃30s退火、72℃90s延伸，共循環(huán)30個周期，最后72℃延伸10min。取上述PCR產(chǎn)物5μl加變性試劑20μl混勻，置室溫10min；加入雜交液225μl混勻后取出100μl移至包被于抗地高辛的酶標板中室溫作用2h；加入抗地高辛過氧化物酶并與底物作用30min后終止反應。用酶標儀測其在波長450nm的吸光度(A)值。

14PCNA檢測采用免疫組織化學S-P法染色，按試劑盒說明書操作：所有標本均經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片。二甲苯脫蠟，梯度酒精至水化后高壓鍋熱處理5～8min，過氧化物酶阻斷血清封閉，加Ⅰ抗60min，PBS液洗3次，每次2min；Ⅱ抗15min，PBS液洗3次。每次2min；Ⅲ抗同Ⅱ抗。DAB顯色5～10min，蘇木素復染5～10s，脫水，透明膠封片。

15結果判斷端粒酶以吸收度(A)020為陽性判斷標準。PCNA以細胞核內出現(xiàn)清晰的棕色或棕黃色顆粒為陽性診斷標準，每例切片至少觀察5個高倍視野。

16統(tǒng)計分析采用SPSS100軟件對各組端粒酶及PCNA陽性表達率進行χ2檢驗，F(xiàn)isher確切概率檢驗和Kendall等級相關分析。

2結果

21各部位端粒酶活性表達及與淋巴結轉移的關系80例乳腺癌患者癌組織標本端粒酶表達陽性率為650%(52/80)；36例乳腺癌相應癌旁組織標本端粒酶表達陽性率為83%(3/36)；10例乳腺良性病變組織標本中未檢測出端粒酶活性。各部位端粒酶陽性表達率總體差異有統(tǒng)計學意義(P001)，但進一步分析，癌組織與癌旁相應組織、癌組織與良性病變組織端粒酶陽性表達率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=31975，P≤0001；χ2=15395，P≤0001)，而癌旁相應組織與良性病變組織端粒酶陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義(P005)；端粒酶陽性表達率與部位呈正相關(rs=055,P0001)。端粒酶陽性表達率與腋窩淋巴結轉移之間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=2473，P005)。

表1PCNA陽性表達率與乳腺癌組織類型及淋巴結轉移的關系（略）

注：*P005,**P001；rsKendall等級相關系數(shù)

22PCNA與乳腺癌組織類型及淋巴結轉移的關系(表1)在80例乳腺癌標本中，PCNA的陽性表達率為6375%(51/80)。其中有淋巴結轉移且PCNA陽性表達的為39例，無淋巴結轉移且PCNA陽性表達的為12例；有淋巴結轉移組PCNA陽性表達率顯著高于無淋巴結轉移組(P001)，且呈正相關(P001)，即淋巴結轉移程度越低，PCNA陽性表達率亦越低。組織類型與PCNA陽性表達率呈正相關(P005)，即腫瘤惡性程度越高，PCNA陽性表達率亦越高，但各組間差異無統(tǒng)計學意義(P005)。

23PCNA表達和端粒酶活性之間的關系(表2)端粒酶活性與PCNA表達具有一致性(χ2=3926，P001)，且呈正相關(rs=0643,P001)，即端粒酶活性陽性表達率高，PCNA陽性表達率亦高。一致率為8625%［(46+23)/80］。

表2PCNA表達和端粒酶活性之間的關系（略）

3討論

研究表明，幾乎所有的永生細胞和絕大部分惡性腫瘤組織均有明顯的端粒酶活性，而正常細胞、部分良性腫瘤組織和非永生細胞系中則無或僅有極低的端粒酶活性〔4〕。本研究結果顯示，乳腺癌患者癌組織標本端粒酶陽性表達率顯著高于乳腺癌相應癌旁組織和乳腺良性病變組織，而乳腺良性病變組織中無端粒酶活性的表達。端粒酶陽性表達與腋窩淋巴結轉移無關。上述結果與俞喬〔5〕報道一致。有文獻報道〔6〕，瘤細胞增殖活性高者，PCNA高表達，易發(fā)生淋巴結轉移，說明PCNA過度表達增加了瘤細胞轉移的危險性。本研究結果顯示，PCNA陽性表達率在乳腺癌淋巴結有轉移組與淋巴結無轉移組分別為750%和4286%，差異有統(tǒng)計學意義(P001)；且PCNA陽性表達率與淋巴結轉移情況呈正相關(P001)。PCNA陽性表達率與乳腺癌組織類型間雖呈一定的正相關(P005)，但各組間PCNA陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義(P005)，可能與本次研究樣本量較少有關。另外，本結果顯示，端粒酶活性與PCNA表達具有一致性且呈正相關，說明端粒酶活性陽性表達率高，PCNA陽性表達率亦高，2者具有協(xié)表達的關系，臨床上可將端粒酶檢測及PCNA表達結合起來，為指導治療或預測預后提供輔助依據(jù)；同時通過阻斷端粒酶活化亦可達到預防和治療腫瘤的目的。

參考文獻

〔1〕TakashimaT,OnodaN,IshikawaT,etal.Proliferatingcellnuclearantigenlabelingindesxandp53expressionpredictoutcomeforbreastcancerpatientswithfourormorelymphnodemetastases［J］.IntJMed,2001,8(2):159-163.

〔2〕文忠，肖健云，李遠斌，等.用TRAPPCRELISA及TRAPPCRPAGE測定鼻咽癌端粒酶活性的比較［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2000，10(9)：15-17.

〔3〕余紅平，張必翔，李媛媛，等.食管癌端粒酶表達與其活性關系［J］.中國公共衛(wèi)生，2005，21(7)：777-779.

〔4〕倪曉謙，奚偉紅，沈玉琴，等.端粒酶活性與腫瘤相關性研究［J］.中國臨床醫(yī)學，2002，9(6)：627-629.

〔5〕俞喬，俞軍，趙祥生，等.乳腺癌患者外周血中端粒酶活性表達及其臨床意義［J］.臨床腫瘤學雜志，2005，10(3)：278-280.

〔6〕黃建康，陶儀聲，馬玲.乳腺癌中PCNA的表達及共臨床意義［J］.解剖與臨床，2005，10(2)：113-114.