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摘要:“茶葉中咖啡因的提取”是藥學(xué)專業(yè)有機化學(xué)課程實踐教學(xué)中的一個很經(jīng)典的實驗，“茶葉中咖啡因的含量測定”在儀器分析課程實踐教學(xué)中可設(shè)計成多種分析方法與手段進行，并且學(xué)生學(xué)以致用，創(chuàng)造性地應(yīng)用到創(chuàng)新性實踐項目中，使教學(xué)效果得以升華。本文具體介紹“茶葉中咖啡因的提取與含量測定”在藥學(xué)專業(yè)實踐教學(xué)中的設(shè)計，以及大學(xué)生創(chuàng)新項目設(shè)計的實踐方案，旨在說明教師良好的實踐教學(xué)能為學(xué)生自主學(xué)習和探索創(chuàng)造良好的科學(xué)氛圍。

關(guān)鍵詞:咖啡因;提取;含量測定;實踐教學(xué);設(shè)計

咖啡因是茶葉中主要的生物堿類化合物［1］，是一種嘌呤類衍生物［2］，為白色針狀晶體，在三氯甲烷、乙醇等有機溶劑中有較好溶解性，在乙醚、苯中難溶［3］，其結(jié)構(gòu)如圖1所示?？Х纫蛴猩窠?jīng)刺激作用，常被用作中樞神經(jīng)興奮劑，在鎮(zhèn)痛、利尿、促進胃酸分泌等方面發(fā)揮著重要的治療作用［4］?！安枞~中咖啡因的提取”是藥學(xué)專業(yè)有機化學(xué)實踐課程開設(shè)的一個實踐項目，采取索氏提取法，利用乙醇、三氯甲烷、苯等適當溶劑從茶葉中把咖啡因提取出來，除去溶劑后利用咖啡因升華的性質(zhì)進行純化。而提取后得到的粗溶液或者粗晶體又可用于儀器分析的色譜實驗和光譜實驗，進行“茶葉中咖啡因的含量測定”分析。由于該實驗簡單，學(xué)生還可以進行進一步探索，申請大學(xué)生研究性與創(chuàng)新性實驗，把該實驗進一步升華到創(chuàng)新應(yīng)用。那么，教師如何把這一系列的實踐教學(xué)活動融合，最后成功達到預(yù)期的教學(xué)效果，關(guān)鍵在于教師對整個實踐教學(xué)的安排和設(shè)計。下面就“茶葉中咖啡因的提取與含量測定”在藥學(xué)專業(yè)實踐教學(xué)中的應(yīng)用進行探索性的設(shè)計。

1在有機化學(xué)實踐課程中的設(shè)計

1.1傳統(tǒng)提取純化分離方法

傳統(tǒng)的“從茶葉中提取純化分離咖啡因”的方法有升華和萃取方法［5］。1.1.1升華法［6］稱取茶葉10g，放入紗布中卷成筒狀，放入索氏提取器中，輕壓紗布，使其低于虹吸管的高度。在250mL圓底燒瓶中加入95%乙醇100mL和幾粒沸石，加熱冷凝回流，控制加熱的溫度，使液體保持微沸狀態(tài)約2h［7］?；亓?次，合并提取液，濃縮至20mL，將濃縮液移入蒸發(fā)皿中，加入約4g生石灰，低溫加熱除去溶劑，然后繼續(xù)用酒精燈小火烘烤至干燥。蒸發(fā)皿上加一多孔濾紙，再倒扣一玻璃漏斗，加熱，當冒出大量棕色的煙，并有白色針狀晶體在濾紙上方出現(xiàn)時停止加熱，用藥匙刮下晶體。殘留物攪拌后繼續(xù)小火加熱升華，再次得到晶體，合并兩次晶體，備用。1.1.2萃取法［6］將10g茶葉和300mL水加到燒杯中加熱，保持沸騰狀態(tài)25min，并在沸騰期間將熱水添加到原始體積。趁熱減壓抽濾，在濾液中邊用玻璃棒攪拌邊加入25mL10%乙酸鉛溶液，待鞣質(zhì)等酸性物質(zhì)沉淀后，減壓抽濾，棄去沉淀。濾液濃縮至約20mL，減壓抽濾，濾液中加20mL三氯甲烷，萃取2次，有機萃取液合并，將三氯甲烷用蒸餾裝置回收。將殘留液體轉(zhuǎn)移至小燒杯，水浴加熱蒸去溶劑，得咖啡因固體。

1.2現(xiàn)代提取純化分離方法

有機溶劑萃取法中常常會有溶劑殘留問題，為了克服這個缺點，文獻［8］報道增加二氧化碳超臨界氣體萃取裝置、真空升華裝置與吸附裝置從提取溶液中萃取純化咖啡因。該方法具有萃取時間短、萃取效率高、咖啡因得率高的優(yōu)點，但是操作繁瑣，實驗成本高。任小雨等［9］通過添加碳酸鈉試劑、改用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和微量升華器的方法對實驗進行改進，使提取時間縮短，提取得率提高。但是使用油泵減壓升華，對于實驗室沒有這個裝置的則受到了實驗限制，因此不能普遍采用。在本實驗室中還是使用了傳統(tǒng)升華法，得到的提取液以及咖啡因晶體，置冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2在儀器分析實踐課程中的設(shè)計

對于這個經(jīng)典的、有代表性的有機化學(xué)提取實驗得到的成果進一步進行儀器分析，這是藥學(xué)專業(yè)學(xué)生比較感興趣的應(yīng)用。在儀器分析的實踐教學(xué)中，“茶葉中咖啡因的含量測定”可采取的測定方法有:紫外－可見分光光度法(UV－Vis)、氣相色譜法(GC)和高效液相色譜法(HPLC)，這些常規(guī)的分析方法可精確測定出茶葉中咖啡因的含量。下面介紹這些實踐方案的設(shè)計過程。

2.1紫外－可見分光光度法

咖啡因在近紫外區(qū)270nm波長處有吸收，因此可利用該法對咖啡因含量進行測定。參照文獻［10］進行如下實驗設(shè)計。2.1.1對照品溶液的制備精密稱取一定量的咖啡因?qū)φ掌罚苡诩状?，并于容量瓶中定容制?00μg/mL咖啡因?qū)φ掌穬湟海?1］。精密量取上述咖啡因?qū)φ掌穬湟阂欢w積，逐級稀釋得到濃度為5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0μg/mL系列的咖啡因?qū)φ掌啡芤海?2］，備用。2.1.2供試品溶液的制備(1)取上述提取液三份，配成一定濃度的提取液供試品溶液。(2)精確稱取純化的咖啡因晶體配成20μg/mL的咖啡供試品溶液。2.1.3標準曲線繪制全波長掃描咖啡因?qū)φ掌?，繪制光譜掃描曲線以確定最大吸收波長(λmax)。以λmax為入射波長測定系列咖啡因?qū)φ掌啡芤旱奈舛?，繪制吸光度－濃度(A－c)標準曲線，得線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。2.1.4含量測定對咖啡因晶體和咖啡因提取液進行含量測定，通過計算得到咖啡因晶體的含量和提取液中咖啡因的含量，計算提取率。

2.2高效液相色譜法

參照《分析化學(xué)實驗》教材［13］設(shè)計實驗方案，具體如下:2.2.1咖啡因?qū)φ掌啡芤旱闹苽渚芊Q取一定質(zhì)量咖啡因?qū)φ掌罚眉状既芙?，容量瓶中定容，制?.2mg/mL的咖啡因標準品儲備液。精密量取儲備液一定體積，分別制得到10、20、40、60、80μg/mL系列咖啡因?qū)φ掌啡芤骸?.2.2供試品溶液制備(1)取上述提取液三份，配成一定濃度的提取液供試品溶液。(2)精確稱取咖啡因晶體配成50μg/mL的咖啡供試品溶液。2.2.3色譜條件儀器:LC－2010A(島津);色譜柱:ODSC18柱(150mm×4.6mm×5μm，島津);流動相∶水－甲醇(68∶32);流速:1.0mL/min;進樣體積:10μL;SPD二極管陣列檢測器。2.2.4儀器精密度考察取咖啡因?qū)φ掌啡芤?份，連續(xù)進樣6次，進行儀器精密度實驗，記錄保留時間與峰面積，若它們的RSD小于5%，則精密度良好［14］。2.2.5樣品重復(fù)性考察取同一濃度的咖啡因?qū)φ掌啡芤?份，每份連續(xù)進樣3次，進行重復(fù)性實驗，若保留時間與峰面積的RSD小于5%，則重復(fù)性良好［15］。2.2.6工作曲線繪制取上述咖啡因系列對照品溶液10μL，每份連續(xù)進樣3次，以保留時間為橫坐標、峰面積為縱坐標建立標準曲線，得到線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)＞0.99則說明線性關(guān)系良好。2.2.7樣品含量測定分別取提取液和咖啡因晶體供試溶液10μL，注入HPLC中進行分析，計錄峰面積和保留時間，由回歸方程計算咖啡因的濃度和咖啡因晶體的含量。

2.3氣相色譜法

參照文獻［16］方法設(shè)計氣相色譜法測定茶葉中咖啡因的含量，具有方案如下:2.3.1內(nèi)標溶液制備精密稱取一定量的鄰苯二甲酸二丁酯(內(nèi)標)對照品0.1g，甲醇溶解，置容量瓶定容，配成2mg/mL的儲備液。2.3.2咖啡因?qū)φ掌啡芤旱闹苽渚芰咳】Х纫騼湟阂欢w積，加入一定體積的內(nèi)標，用甲醇定容，配成10、20、100、200、300、400、500μg/mL系列咖啡因標準溶液及含160μg/mL的內(nèi)標溶液。2.3.3供試品溶液制備(1)取咖啡因提取液三份，配成一定濃度的供試品溶液。(2)精確取咖啡因晶體配成100μg/mL的咖啡供試品溶液。2.3.4色譜條件GC2014氣相色譜儀(島津)，HP－5型毛細管柱(30m×0.32mm×0.25μm，島津)，色譜柱、汽化室和檢測器溫度分別為230℃、250℃、250℃，N2流速2.5mL/min，分流比1∶20，進樣體積0.2μL。2.3.5儀器精密度考察取咖啡因?qū)φ掌啡芤?份，連續(xù)進樣6次，若保留時間與峰面積RSD小于5%，則精密度良好。2.3.6樣品重復(fù)性考察取咖啡因?qū)φ掌啡芤?份，每份連續(xù)進樣3次，若保留時間與峰面積RSD小于5%，則重復(fù)性良好。2.3.7工作曲線繪制取0.2μL咖啡因系列對照品溶液，進樣，以保留時間為橫坐標、峰面積為縱坐標建立標準曲線，得到線性回歸方程，若相關(guān)系數(shù)＞0.99則線性關(guān)系良好［17］。2.3.8樣品含量測定分別取0.2μL咖啡因提取液和咖啡因晶體供試液，注入GC進行分析，計錄峰面積與保留時間，根據(jù)工作曲線計算得到咖啡因溶液的濃度和咖啡因晶體的含量，計算咖啡因提取得率。

3在創(chuàng)新性實踐項目中的設(shè)計

大學(xué)生創(chuàng)新性實踐項目是國家和各省市對在校大學(xué)生提供學(xué)習和創(chuàng)新實踐項目開展的一項有力舉措，教學(xué)團隊在教學(xué)實施過程中，往往將專業(yè)實踐教學(xué)內(nèi)容與大學(xué)生創(chuàng)新實踐項目結(jié)合，為學(xué)生的科研訓(xùn)練鋪造一個有益的、合適的平臺［18］，將項目能真正落實到學(xué)生的創(chuàng)新過程中，有利于鍛煉學(xué)生的科研能力，為以后的科研開展奠定基礎(chǔ)［19］。教學(xué)團隊把“茶葉中咖啡因的提取與含量測定”的實驗用于藥學(xué)專業(yè)有機化學(xué)與儀器分析的教學(xué)實踐活動中，使學(xué)生獲得了良好的教學(xué)實踐效果，同時對茶葉的提取與含量測定產(chǎn)生了極大的興致，學(xué)生們設(shè)想:一種茶葉能做出來的結(jié)果，多種茶葉也能做出結(jié)果，如果對不同品種、不同產(chǎn)地的茶葉中咖啡因的含量進行測定，可能咖啡因的含量會有差別。那么，是否可以根據(jù)咖啡因的含量對茶葉進行分類，進而探討同一品種不同產(chǎn)地或者同一產(chǎn)地不同品種的茶葉中咖啡因含量差異的原因?在這種思路的引導(dǎo)下，學(xué)生申報了省級大學(xué)生研究性與創(chuàng)新性實踐項目“HPLC法測定8個不同品種茶葉中咖啡因的含量”，還申報了校級的開放性實踐項目。他們設(shè)計的實驗方案為:從24種不同茶葉中提取咖啡因(優(yōu)化提取方法)→咖啡因純化(純化方法優(yōu)化)→HPLC色譜方法探索(色譜條件優(yōu)化)→HPLC方法考察(包括精密度、重復(fù)性、線性關(guān)系、穩(wěn)定性和加樣回收率試驗)→樣品含量測定(測定24種茶葉中咖啡因的含量)→數(shù)據(jù)處理(PCA、OPLS－DA分析)→實驗結(jié)果(分析不同茶葉咖啡因含量差異的原因)。有了前期的實踐，學(xué)生已經(jīng)熟練掌握了天然藥物有效成分的提取分離方法、中藥的前處理方法、高效液相色譜儀的使用及基本的實驗操作等，在指導(dǎo)老師指導(dǎo)下，精心設(shè)計實驗方案，并進行切實有效的實施，能夠完成該創(chuàng)新項目。

4結(jié)語

一個實踐項目在兩門專業(yè)基礎(chǔ)課程中進行綜合性的實踐教學(xué)設(shè)計，并調(diào)動了學(xué)生積極的創(chuàng)新意識，積極申報并實質(zhì)性地開展了創(chuàng)新性實踐項目，使教師的教學(xué)效果得到最大體現(xiàn)，使學(xué)生的學(xué)習效果、實踐能力和創(chuàng)新思維得到極大的提升，把教學(xué)相長發(fā)揮到極致［20］。因此，在實踐教學(xué)中，教師應(yīng)精選實踐項目，力求驗證和推廣實驗結(jié)果和理論結(jié)果，重視并指導(dǎo)項目的創(chuàng)新點，真正讓學(xué)生在實踐教學(xué)中學(xué)有所悟，為學(xué)生自主學(xué)習和探索創(chuàng)造良好的科學(xué)氛圍。

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作者：袁治倩 傅春燕 曾偉 龍一鳴 王婷 單位：邵陽學(xué)院藥學(xué)院