導(dǎo)語：糖尿病與糖尿病腎病關(guān)系論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【摘要目的摘要：探索二?；视王；D(zhuǎn)移酶1（DGAT1)K378N基因多態(tài)性和中國人2型糖尿病(T2DM)及糖尿病腎病(DN)的關(guān)系.方法摘要：運(yùn)用熒光偏振模板依靠的染料摻入反應(yīng)法（TDIFP）技術(shù)檢測DGAT1K378N基因多態(tài)性在71例T2DM患者［29例糖尿病腎病患者（DN＋組）和42例糖尿病非腎病患者（DN－組）］和45例健康對照者中的等位基因和基因型分布頻率.結(jié)果摘要：KK，KN和NN基因型在T2DM組的分布分別為摘要：42,40,12例；DN＋組摘要：14,11,4例；DN－組摘要：22,14,6例；正常對照組摘要：13,23,9例.①T2DM患者DGAT1K378等位基因頻率(66.0％)高于健康對照組（54.4％），但未達(dá)顯著性水平；②DN＋組和DN－組K378N等位基因及基因型分布無顯著差異（P%26gt;0.05）.結(jié)論摘要：K378等位基因頻率在T2DM患者組有升高，但未見DGAT1K378N基因多態(tài)性和中國人T2DM及DN發(fā)生的明顯相關(guān)關(guān)系.

【糖尿病，2型；糖尿病腎??；多態(tài)性，單核苷酸；二?；视王；D(zhuǎn)移酶1；TDIFP技術(shù)

0引言

二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGAT)是微粒體酶，催化甘油二酯和脂肪?；o酶A以共價(jià)健結(jié)合，是三酰甘油（TG）合成的限速酶.近來有報(bào)道DGAT1缺陷小鼠可反抗飲食誘導(dǎo)的肥胖、提高胰島素及瘦素敏感性.胰島素反抗是2型糖尿病（T2DM）發(fā)病的重要原因，而肥胖是T2DM最主要的危險(xiǎn)因素之一.DGAT1基因可列為T2DM病因?qū)W探究的候選基因，我們應(yīng)用了具有高敏感性和特異性的檢測單核苷酸多態(tài)性（SNPs）方法熒光偏振模板依靠的染料摻入反應(yīng)法（TDIFP）［1,2］檢測了該基因第378位賴氨酸到天門冬酰胺（K378N）多態(tài)性在T2DM患者和健康人中的分布，以明確其和T2DM及DN的關(guān)聯(lián)性.

1材料和方法

1．1材料

1.1.1血樣標(biāo)本2型糖尿病患者（T2DM組）摘要：94例T2DM患者均系我院內(nèi)分泌科就診患者，依1999年世界衛(wèi)生組織（WHO）糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷.按其是否發(fā)生腎病并發(fā)癥分為兩組摘要：①糖尿病腎病組（DN＋組）29（男15，女14）例，年齡（58.5±7.2）歲，病史5~12a，多次尿白蛋白陽性，排除感染、高血壓引起的尿蛋白.糖尿病腎病常和糖尿病視網(wǎng)膜病變同時(shí)存在，若同時(shí)有尿蛋白但無糖尿病視網(wǎng)膜病變，則尿蛋白不能排除為高血壓造成，因而該組剔除了有尿蛋白無視網(wǎng)膜病變同時(shí)有高血壓患者共17例.②糖尿病非腎病組（DN-組）42（男20，女22）例，年齡（54.9±10.6）歲，病史3~10a，尿白蛋白陰性，因有糖尿病視網(wǎng)膜病變多已伴發(fā)腎臟改變，可能尚處于病變早期而無臨床表現(xiàn)，因而該組剔除了尿白蛋白陰性但同時(shí)有糖尿病視網(wǎng)膜等微血管病變患者共6例.健康對照組（Control組）摘要：隨機(jī)取我院體檢中心體檢健康者45（男21，女24）例，年齡（48.5±13.1）歲，經(jīng)檢查排除糖尿病、高血壓、高血脂、冠心病、肥胖及腎病等，且均無糖尿病家族史.采集所有受檢對象空腹靜脈血樣標(biāo)本，EDTA抗凝，提取DNA，另一管送常規(guī)生化檢驗(yàn).

1.1.2主要試劑及儀器dNTP，TaqDNA聚合酶、pGEMTEasy載體系統(tǒng)購自Promega公司.核酸外切酶I、蝦堿性磷酸酶、AcycloDNA聚合酶和熒光偏振檢測儀Victor2購自PerkinElmer公司.熒光標(biāo)記終止子AcycloTerminatorsTM（AcycloGTPR110/AcycloCTPTAMRA）為PerkinElmer公司專利產(chǎn)品.DNA引物5′CACACCCCACCTACCTGATGC3′及5′CCTGGGGGCTGGGATGG3′；探針5′CTTCTGGCAGAACTGGAA3′由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成.

1.2方法

1.2.1DNA引物及探針設(shè)計(jì)根據(jù)引物設(shè)計(jì)的基本原則，應(yīng)用DNAStar軟件，結(jié)合TDIFP反應(yīng)的非凡要求設(shè)計(jì)引物及探針.引物和探針序列不能重疊，探針的3′末端必須緊鄰待測變異基因位點(diǎn).特異性寡核苷酸探針及和變異堿基對應(yīng)互補(bǔ)末端摻入的特異堿基GTP/CTP是基于DGAT1基因擴(kuò)增片段內(nèi)的序列及變異堿基設(shè)計(jì)的，擴(kuò)增靶片段長度為140bp（Fig1）.

1.2.2DNA的提取及PCR擴(kuò)增用標(biāo)準(zhǔn)酚/氯仿法由四周血白細(xì)胞內(nèi)提取基因組DNA.取DNA模板5μL，dNTP150μmol/L，引物各0.25μmol/L，MgCl22.0mmol/L,TaqDNA聚合酶16.67nkat，反應(yīng)體系共25μl.PCR條件摘要：95℃4min；94℃30s，52℃40s，72℃30s，40個(gè)循環(huán)；72℃5min，擴(kuò)增靶片段DNA.標(biāo)本DNA經(jīng)擴(kuò)增后所得產(chǎn)物用20g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測.將經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化、篩選、測序正確的發(fā)生和未發(fā)生變異的質(zhì)粒DNA作為陽性和陰性標(biāo)準(zhǔn)品.

1.2.3DGAT1K378N基因多態(tài)性的檢測鑒定采用TDIFP方法對擴(kuò)增產(chǎn)物中K378N變異堿基進(jìn)行檢測.首先消化處理摘要：蝦堿性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ混合物和PCR產(chǎn)物37℃孵育2h，可分別降解PCR產(chǎn)物中殘余的dNTPs和引物，避免對后續(xù)反應(yīng)的干擾；而后80℃熱處理15min滅活酶.以此產(chǎn)物為模板和探針結(jié)合，再以AcycloGTPR110和AcycloCTPTAMRA這兩種熒光標(biāo)記終止子為底物，在AcycloDNA聚合酶及其緩沖液中于95℃2min,然后95℃15s，50℃30s，25個(gè)循環(huán)雜交延伸,最后15℃延伸10min，4℃保存.PCR產(chǎn)物模板和探針互補(bǔ)雜交，和模板互補(bǔ)的游離熒光標(biāo)記終止子AcycloG/CTP摻入到探針末端，熒光素分子量增加，在熒光偏振檢測儀上分別檢測AcycloGTPR110（波長535nm）和AcycloCTPTAMRA（波長595nm）的熒光偏振（FP）值,據(jù)兩種熒光的FP值,推斷變異堿基類型.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理摘要：正態(tài)分布資料用x±s表示，各組間基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)（方差不齊時(shí)用t′檢驗(yàn)）或方差分析，疾病危險(xiǎn)因素分析采用二分類Logistic回歸，整個(gè)統(tǒng)計(jì)分析用SSPS11.0軟件處理.

2結(jié)果

2.1臨床特征DN＋組和DN－和正常對照組的性別（Sex）、年齡(Age)、體質(zhì)指數(shù)BMI，均無顯著差異(P%26gt;0.05)，DN＋組和DN－的收縮壓(SBP)及舒張壓(DBP)水平高于正常對照組(P%26lt;0.05)，并且DN+組收縮壓高于DN－組(P%26lt;0.05,Tab1).表1各組臨床特征比較（略）

2.2生化特征DN＋組和DN－和正常對照組的血膽固醇(CHOL)、高密度脂蛋白（HDL）等均無顯著差異(P%26gt;0.05)，DN＋組和DN－組的TG水平高于正常對照組(P%26lt;0.05,Tab2).表2各組生化指標(biāo)特征比較（略）

2.3反應(yīng)體系及引物測試PCR擴(kuò)增所有標(biāo)本基因組DNA中DGAT1基因目的片斷,顯示擴(kuò)增片段長度為140bp,無非特異擴(kuò)增條帶，和預(yù)期相符.

2.4TDIFP方法檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物消化后，和DGAT1基因特異探針及兩種熒光標(biāo)記堿基混合反應(yīng)，AcycloCTPTAMRA摻入，TAMRAFP值增高，對應(yīng)N378等位基因；AcycloGTPR110摻入，R110FP值增高，對應(yīng)K378等位基因；兩者都有摻入時(shí)，為雜和基因型.DN+，DN-，T2DM，正常對照組基因型及等位基因頻率經(jīng)χ2檢驗(yàn)符合HardyWeinberg遺傳平衡定律(P%26gt;0.05)，樣本具有群體代表性.①T2DM患者DGAT1K378等位基因頻率(66.0％)和健康對照組（54.4％）比較未達(dá)顯著性水平（χ2=3.432,P=0.064,Tab3).②DN＋組和DN－組的K378N等位基因頻率及基因型頻率無顯著差異（P%26gt;0.05,Tab4).表3T2DM組和正常對照組等位基因及基因型頻率比較（略）表4DN+組和DN-組等位基因及基因型頻率比較（略）

2.5用Logistic回歸進(jìn)行疾病危險(xiǎn)因素分析以是否有T2DM為因變量進(jìn)行Logistic回歸分析，SBP（P=0.000），TG（P=0.003）進(jìn)入方程，提示SBP（OR=1.122，95％CI摘要:1.055～1.193）,TG升高（OR=6.532，95％CI摘要:1.923～22.185）是T2DM發(fā)生的危險(xiǎn)因素.

3討論

DGAT是TG合成的限速酶，包括DGAT1和DGAT2兩種.DGAT1的表達(dá)廣泛，在腎上腺皮質(zhì)髓質(zhì)、睪丸、小腸高表達(dá)，在甲狀腺、胃、心、骨骼肌、肝中等量表達(dá)，而DGAT2表達(dá)較受限制［3］.已發(fā)現(xiàn)DGAT1缺陷小鼠可通過增加能量消耗反抗飲食誘導(dǎo)的肥胖，組織TG水平降低，胰島素及瘦素敏感性提高［4］.而過表達(dá)DGAT的胰島β細(xì)胞在高糖水平下培養(yǎng)72h后，糖刺激的胰島素分泌明顯受損［5］.DGAT被認(rèn)為和胰島素反抗密切相關(guān)，抑制該酶可能是治療肥胖及糖尿病的新靶點(diǎn).還有報(bào)道過表達(dá)DGAT1可減少信號脂質(zhì)(DAG、磷脂酶C、磷脂酶A2和膜脂質(zhì)）而合成TG，調(diào)節(jié)膜脂質(zhì)和信號脂質(zhì)的合成，因而在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長方面有重要功能［6］.

SNPs被目前認(rèn)為是疾病臨床表現(xiàn)的遺傳基礎(chǔ).SNPs的探究熱點(diǎn)是啟動(dòng)子區(qū)的SNPs和cSNPs即及蛋白質(zhì)編碼區(qū)域內(nèi)的SNPs.cSNPs又分同義cSNPs和非同義cSNPs.非同義cSNPs指堿基序列的改變可使以其為模板翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變，從而可能影響蛋白質(zhì)的功能，這種改變常是導(dǎo)致生物性狀改變的直接原因.已有報(bào)道DGAT1基因啟動(dòng)子C97T變異和土耳其女性低體質(zhì)量指數(shù)、高HDLch及低DBP有關(guān)［7］.但Coudreau等［8］探究則認(rèn)為該變異和法國人肥胖無關(guān).DGAT1基因SNPs變異和糖尿病關(guān)系尚未見報(bào)道.我們檢索了美國國家生物技術(shù)信息中心Entrez的SNP數(shù)據(jù)庫，檢索到該基因的一個(gè)cSNPs變異K378N并進(jìn)行了病例對照探究，T2DM患者DGAT1K378等位基因頻率(66.0％)高于健康對照組（54.4％），雖未達(dá)顯著性水平；但不能否認(rèn)該基因和糖尿病可能存在關(guān)聯(lián).催化同樣反應(yīng)的DGAT2，和DGAT1分屬于不同的基因家族［9］，是否會(huì)補(bǔ)償由于DGAT1K378N基因多態(tài)性造成的異常.這有待DGAT1及DGAT2各自功能的進(jìn)一步闡明，以及基因變異和酶活性間的對應(yīng)關(guān)系的探究.另外可能受到該基因其他多態(tài)性位點(diǎn)的影響，如和C97T變異有無交互功能存在.

本探究還顯示DN＋組和DN－組K378N等位基因頻率及基因型頻率無顯著差異，DGAT1基因多態(tài)性和糖尿病腎病發(fā)生無關(guān).Logistic回歸結(jié)果提示TG及SBP為糖尿病的危險(xiǎn)因素，因此可以從對TG代謝或?qū)BP有影響的眾多候選基因中進(jìn)行多基因篩查，這將有助于糖尿病遺傳學(xué)的探索.

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