導(dǎo)語：心肌細(xì)胞凋亡影響論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【摘要目的摘要：觀察左旋卡尼汀對心肌缺血/再灌注（MI/R）后心肌細(xì)胞凋亡的影響，探索其保護(hù)功能的機(jī)制.方法摘要：制備家兔MI/R模型，缺血45min，再灌注3h.25只家兔隨機(jī)分為三組摘要：對照組（Ⅰ組，n=5），MI/R組(Ⅱ組，n=10),左旋卡尼汀治療組（Ⅲ組，n=10）在缺血后5min靜脈注射左旋卡尼?。?.5mL/（kg%26#12539;h）］.再灌注結(jié)束后檢測心肌組織SOD活性，原位末端標(biāo)記(TUNEL)法測定凋亡心肌細(xì)胞，免疫組化法測定凋亡相關(guān)基因bcl2,fas的表達(dá).結(jié)果摘要：MI/R造成明顯的心臟功能障礙，缺血區(qū)細(xì)胞凋亡.SOD活性明顯升高，凋亡指數(shù)（AI）和Fas含量減少（P%26lt;0.05）,Bcl2含量明顯升高（P%26lt;0.05）.結(jié)論摘要：左旋卡尼汀具有抗缺血再灌注后心肌損傷的功能，其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)Bcl2和Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn).

【左旋卡尼汀；再灌注損傷；心肌缺血；細(xì)胞凋亡

0引言

缺血/再灌注（myocardialischemia/reperfusion，MI/R）損傷是冠狀動脈再通后一個重要的并發(fā)癥，也是致死原因之一.有學(xué)者提出，細(xì)胞凋亡可能為再灌注損傷發(fā)病機(jī)制中的一個重要環(huán)節(jié)［1］；通過干預(yù)凋亡基因的表達(dá)以阻斷細(xì)胞凋亡過程，從而減輕再灌注損傷能否成為防治再灌注損傷的有效方法已受關(guān)注.卡尼汀，又名肉毒堿，可加速脂肪的β氧化，提高三磷酸腺苷（ATP）水平，優(yōu)化心肌能量代謝途徑.近期的大規(guī)模臨床試驗(yàn)CEMID的結(jié)果提示［2］，左旋卡尼汀明顯改善心肌梗死后患者的心功能，降低死亡率，縮小梗死面積.卡尼汀探究的新發(fā)現(xiàn)［3］，提示卡尼汀在對缺血性心臟病的功能中，優(yōu)化心肌能量代謝，抑制MI/R心肌細(xì)胞凋亡可能是保護(hù)缺血再灌注心肌的重要機(jī)制.我們通過MI/R模型，探索左旋卡尼汀對MI/R心肌細(xì)胞的保護(hù)功能及其可能的機(jī)制.

1材料和方法

1．1材料

健康家兔25只，雌雄不限，體質(zhì)量2.5～3.0kg（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供）.卡尼?。ǔＶ萑还I(yè)技術(shù)探究所研制）；InSituCellDeathDetectionPOD試劑盒德國寶麗曼公司產(chǎn)品；Fas和Bcl2mAb，免疫組化試劑盒（購自北京中山生物有限公司）；伊文蘭和氯化三苯基四氮唑（TTC）購自Sigma公司.

1.2方法

1.2.1MI/R模型的制備30g/L戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔麻醉，頸部居中切開.分離左側(cè)頸靜脈插管連接輸液泵.同步記錄心電圖觀察ST變化.心肌MI/R模型參照simpsond的方法加以改進(jìn)，開胸，暴露心臟,于冠脈左室支中1/2處穿線環(huán)繞之,結(jié)扎線向外收緊，造成急性心肌缺血，45min后放松結(jié)扎線使冠狀動脈再通形成再灌注.各組中用以心肌梗死范圍和細(xì)胞凋亡檢測的心臟各半.

1.2.2分組隨機(jī)分為三組摘要:Ⅰ組空白對照組（n=5）,絲線穿過冠狀動脈左室支但不結(jié)扎；Ⅱ組MI/R組（n=10），MI后5min注射生理鹽水，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束.Ⅲ組左旋卡尼汀治療組（n=10），MI后5min注射左旋卡尼汀1.5mL/(kg%26#12539;h).

1.2.3測定SOD含量實(shí)驗(yàn)結(jié)束后即刻分別取缺血區(qū)及正常供血區(qū)左心室心肌組織1.0g，低溫狀態(tài)下生理鹽水沖洗干凈，制成心肌勻漿液，離心后取上清液，按試劑盒說明書操作.

1.2.4細(xì)胞凋亡檢測及計算凋亡率再灌注3h結(jié)束后，分離左心室心肌，取缺血區(qū)心肌組織，用100g/L甲醛液固定24h，常規(guī)脫水,石蠟包埋，切片，采用末端標(biāo)記TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡.按照試劑盒說明書操作.每一心臟取3張切片，在高倍鏡下（10目鏡×40物鏡）檢測，于凋亡陽性細(xì)胞區(qū)域隨機(jī)選擇10個視野，對凋亡陽性細(xì)胞計數(shù)并行計算機(jī)圖像分析，作半定量測定，以心肌凋亡陽性細(xì)胞數(shù)占總心肌細(xì)胞數(shù)的百分比作為心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（apoptoticindex，AI）.

1.2.5凋亡相關(guān)基因蛋白的檢測石蠟包埋組織連續(xù)切片，用免疫組化SP法觀察心肌細(xì)胞Fas,Bcl2的表達(dá)情況，用HPIAS1000圖像分析系統(tǒng)計算A值作為半定量參數(shù)，測量Fas,Bcl2蛋白表達(dá).

統(tǒng)計學(xué)處理摘要：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示，使用SPSS11.0軟件，多組比較進(jìn)行onewayANOVA及LSDt檢驗(yàn)，P%26lt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2結(jié)果

2．1SOD含量（kat/g)變化和I組（0.84±0.42）比較，II組（0.36±0.30）SOD活性明顯降低（P%26lt;0.05）,III組（0.72±0.30）SOD活性較II組顯著增加（P%26lt;0.05）.

2．2心肌細(xì)胞AI變化II組的AI明顯高于I組（P%26lt;0.01），III組AI明顯低于II組（P%26lt;0.01），但仍高于I組（P%26lt;0.01，表1).

2.3Fas,Bcl2蛋白含量的變化II組Fas含量明顯高于I組（P%26lt;0.01），III組Fas含量明顯低于II組（P%26lt;0.01）,和I組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P%26gt;0.05）.II組Bcl2含量顯著低于I組（P%26lt;0.01）和III組（P%26lt;0.01），III組Bcl2含量和I組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P%26gt;0.05,表1).表1各組間兔MI/R心肌凋亡指數(shù)及Bcl2,Fas含量的比較(略)

3討論

引起再灌注損傷的主要因素，目前認(rèn)為和Ca2+超載［3］、氧自由基［4］和白細(xì)胞聚積有關(guān).此外，已有多項(xiàng)探究報道顯示，氧自由基通過啟動Bcl2［5］，TNFα［6］多種細(xì)胞凋亡相關(guān)因素，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡.

細(xì)胞凋亡是指一定的生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，通過啟動內(nèi)部機(jī)制，主要是通過內(nèi)源性DAN內(nèi)切酶的激活，導(dǎo)致細(xì)胞主動死亡的過程.通過對調(diào)控細(xì)胞凋亡基因的探究，可以將細(xì)胞凋亡相關(guān)基因分為誘導(dǎo)基因（死亡基因）和抑制基因（生存基因）.通常在生理?xiàng)l件下，細(xì)胞有序而協(xié)調(diào)的激活凋亡誘導(dǎo)基因（fas,p53等）和/或凋亡抑制基因（bcl2等）共同控制著細(xì)胞代謝功能而維持細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的動態(tài)變化.探究發(fā)現(xiàn)摘要：bcl2基因的功能主要是抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)細(xì)胞生存.其抗凋亡的機(jī)制主要有摘要：Bcl2通過抑制自由基的產(chǎn)生而抑制細(xì)胞死亡,Bcl2和Bax結(jié)合成雜二聚體，可抑制Bak的促凋亡功能,Bcl2的過度表達(dá)有效地阻斷細(xì)胞色素c由線粒體向細(xì)胞質(zhì)的釋放，對線粒體起始的caspase激活機(jī)制起著阻礙功能，從而抑制細(xì)胞凋亡.Fas又稱Apo1即CD95分子，是I型膜蛋白，屬腫瘤壞死因子受體家族成員.Fas和活化細(xì)胞交聯(lián)區(qū)誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制主要是通過Fas和FasL結(jié)合，誘導(dǎo)神經(jīng)鞘磷脂酶（SMase）的活化，分解SM生成神經(jīng)酰氨

（Ceramide,CM）,CM通過膜結(jié)合性的絲/蘇氨酸激酶等激活第二信使，使胞內(nèi)Ca2+濃度升高，引發(fā)一系列的生化反應(yīng)，從而激活Ca2+Mg2+依靠性核酸內(nèi)切酶，引起凋亡.

左旋卡尼汀本身并不是機(jī)體的基本營養(yǎng)素，是脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行β氧化所必需的輔助因子，可加速轉(zhuǎn)運(yùn)長鏈脂肪酸通過線粒體內(nèi)膜，進(jìn)入線粒體進(jìn)行β氧化供能.左旋卡尼汀作為一種有效的氧自由基清除劑，在緩解氧化應(yīng)激、減少脂質(zhì)過氧化中均具有明顯的保護(hù)功能［7］.

本實(shí)驗(yàn)我們觀察到再灌注早期給予左旋卡尼汀，家兔MI/R過程中SOD活性增加，心肌梗死面積減少，細(xì)胞AI下降，F(xiàn)as蛋白表達(dá)減弱，Bcl2蛋白表達(dá)增強(qiáng)，表明左旋卡尼汀能抑制MI/R過程中細(xì)胞凋亡的發(fā)生.提示在MI/R損傷中，細(xì)胞凋亡是可以預(yù)防的.驗(yàn)證了左旋卡尼汀通過調(diào)節(jié)Bcl2和Fas抑制心肌細(xì)胞凋亡，可能是保護(hù)MI/R心肌的重要機(jī)制這一假設(shè).

至于左旋卡尼汀抑制MI/R心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制，可能和左旋卡尼汀提高SOD活性，減輕細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，抗缺血，缺氧，減少氧自由基生成、增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化損傷能力，從而發(fā)揮其抗氧化、抗凋亡的細(xì)胞保護(hù)功能.另外心肌缺血后，脂肪酸，如棕櫚酸鹽在血漿和心肌組織中生成增多，而棕櫚酸鹽被認(rèn)為能促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡［8］，棕櫚酸鹽通過調(diào)控棕櫚酰激酶（palmitoy1COA）介導(dǎo)的線粒體膜通透性的變化在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮功能［9］.

【參考文獻(xiàn)

［1］ColonnaP,LlicetoS.MyocardialinfarctionandleftventricularremodelingresultoftheCEDIMtrial［J］.AmHeartJ,2000,139(Suppl2)摘要:S124-S130.

［2］VescovoG,RavaraB,GobboV,etal.LCarnitine摘要:Apotentialtreatmentforblockingapoptosisandpreventingskeletalmusclemyopathyinheartfailure［J］.AmJPhysiolCellPhysiol，2002,283(3)摘要:802-810.

［3］ShigematsuS,AritaM.Anoxiadepressessodiumcalciumexchangecurrentsinguineapigventricularmyocytes.［J］.JMolCellCardiol,1999,31(4)摘要:895-906.

［4］SalieR,HarperI,CillieC,etal.Melatoninprotectsagainstischemiareperfusionmyocardialamagec［J］.JMolCellCardiol,2001,33(2)摘要:343-357.

［5］HseuYC,HuangHW,WangSY,etal.Humicacidinducesapoptosisinhumanendothelialcell［J］.ToxicolApplPharmacol,2002,182(1)摘要:34-43.

［6］ChristakosS,BarlettaF,HueningM,etal.VitaminDtargetproteins摘要:Functionandregulation［J］.JCellBiochem,2003,88(2)摘要:238-244.

［7］VirmaniA,GaetaniF,ImamS,etal.TheprotectiveroleofLcarnitineagainstneurotoxicityevokedbydrugofabuse,methamphetamine,couldberelatedtomitochondrialdysfunction［J］.AnnNYAcadSci,2002,965摘要:225-232.

［8］SparagnaGC,HicksonBickDL,BujaLM,etal.Ametabolicroleformitochondriainpalmitateinducedcardiacmyocyteapoptosis［J］.AmJPhysiolHeartCircPhysiol,2000,279(5)摘要:H2124-H2132.

［9］FurunoT,KannoT,AritaK,etal.Rolesoflongchainfattyacidsandcarnitineinmitochondrialmembranepermeabilitytransition［J］.BiochemPharmacol,2001,62(8)摘要:1037-1046.