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【摘要】目的優(yōu)選防風色原酮的超聲波提取工藝。方法以升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷和亥茅酚苷的含量為指標,采用正交實驗法優(yōu)選超聲波提取防風色原酮的最佳工藝。結果最佳提取條件為料液比為1∶30,超聲時間45min,超聲溫度50℃,超聲頻率90kHz。結論采用超聲波提取技術提取防風色原酮，提取時間短，提取效率高，可用于防風色原酮的提取。

【關鍵詞】超聲波;防風;色原酮;正交實驗;高效液相色譜

Abstract：ObjectiveTooptimizetheextractionconditionsofchromonefromSaposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk.byultrasonicwave.MethodsThecontentsofprimOglucosylcimifugin,cimifugin,5OmethylvisammiosideandsecOglucosylhamaudolwereservedasindicatingindexes,andtheextractionconditionswereoptimizedbyorthogonaltest.ResultsTheoptimalultrasonicconditionwasasfollows:thefeed-liquidratewas1∶30;theextractivetimewas45min;theextractivetemperaturewas50℃andthesupersonicfrequencywas90kHz.ConclusionTheextractionofchromonefromS.divaricatawithultrasonicwaveisfoundtobearapidandefficientextractionmethodwithshorttimeandhighproductionyield.

Keywords：Ultrasonicwave;Saposhnikoviadivaricata;Chromone;Orthogonaltest;HPLC

防風Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk.為傘形科防風屬多年生草本植物,以未抽薹的干燥根入藥，是我國常用大宗中藥材之一，具有解表祛風、勝濕、止痙功能，用于感冒頭疼、風濕痹痛、風疹瘙癢、破傷風等［1］治療?，F(xiàn)代藥理研究工業(yè)化其主要的活性成分為升麻素苷、升麻素、5O甲基維斯阿米醇苷和亥茅酚苷等色原酮類以及多糖、揮發(fā)油等,具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、抗血小板聚集等多種功效［2～4］。超聲波法提取中藥有效成分是近年來發(fā)展起來的一種新方法,具有設備簡單、操作方便提取時間短、效率高和節(jié)能等優(yōu)點［5］。有關超聲波提取防風中色原酮的研究已有報道［6］,但僅僅以升麻素苷和5O甲基維斯阿米醇苷兩種色原酮為指標,而現(xiàn)在評價防風藥材則以升麻素苷、升麻素、5O甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷4種色原酮為主要藥效物質和質量控制評價指標［7］。本文以升麻素苷、升麻素、5O甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷4種色原酮的質量分數(shù)為指標,對超聲波提取防風中4種色原酮的工藝參數(shù)進行了研究,為防風綜合開發(fā)利用提供有效的提取方法和科學依據(jù)。

1儀器與材料

DL-1000E超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司);Agilent1100高效液相色譜儀(在線脫氣機、四元泵、DAD檢測器、手動進樣器和Agilent化學工作站);AUY220電子天平(日本島津)。提取用甲醇為分析純(北京化工廠)和HPLC用甲醇為色譜純甲醇(Fisher公司)。

實驗材料系200709末采于白城GAP基地3年生未抽薹防風的根,經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學張連學教授鑒定為傘形科柴胡屬防風Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk.。對照品由中國藥品生物制品檢定所提供,升麻素苷、升麻素、5O甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷批號分別為111522，111710，111523，111714。

2方法與結果

2.1防風4種色原酮的HPLC測定

2.1.1色譜分析條件DiamonsilC18(4.6mm×200mm,5μm)色譜柱;柱溫30℃;波長254nm;甲醇-水梯度洗脫：甲醇：0～15min:20%～45%，15～25min:45%～70%;流速1ml·min-1。

2.1.2供試品溶液的制備防風根經(jīng)45℃烘干,粉碎過30目篩。精密稱取0.3g樣品,浸泡2h,按照不同因素-水平進行超聲提取,過濾,定容于100ml容量瓶中,過0.45μm濾膜,精密吸取20μl進樣,按外標法測定。

2.1.3混合對照品溶液的配制精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥后的升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷和亥茅酚苷適量,配成濃度為:升麻素苷:0.3mg·ml-1，升麻素:0.04mg·ml-1，5-O-甲基維斯阿米醇苷:0.5mg·ml-1和亥茅酚苷0.02mg·ml-1的混合對照品溶液。分別精密量取0.25，1，2，3，4，5ml,定容于10ml容量瓶中。

2.1.4標準曲線的制備分別吸取上述對照品溶液20μl按色譜條件進樣,測定峰面積。以色譜峰面積為縱坐標(Y),進樣量為橫坐標(X),繪制標準曲線,計算回歸方程。

升麻素苷:Y=3288.85374X+68.774277(r=0.99985),線性范圍:0.15～3μg;

升麻素:Y=2578.41545X+7.520469(r=0.99972),線性范圍0.02～0.4μg;

5-O-甲基維斯阿米醇苷:Y=2010X+68.751405(r=0.99959),線性范圍0.25～5μg;

亥茅酚苷:Y=4125.81267X+5.313809(r=0.99971),線性范圍0.01～0.2μg。

混合對照品和供試品的色譜圖見圖1。

圖1混合對照品(a)和供試品(b)的HPLC圖（略）

2.1.5穩(wěn)定性實驗精密吸取混合對照品溶液20μl,按色譜條件每隔4h進樣1次,共測定7次。計算4種色原酮峰面積。結果升麻素苷、升麻素、5O甲基維斯阿米醇苷和亥茅酚苷的RSD值分別為0.98%，1.63%，1.53%和0.99%。表明24h內(nèi)4個對照品穩(wěn)定性良好。

2.1.6精密度實驗精密吸取混合對照品溶液20μl,按上述色譜條件進行分析,連續(xù)5次。計算4種色原酮峰面積積分的RSD值分別為0.91%，1.54%，1.76%和1.95%。

2.1.7重復性實驗精密稱取防風樣品5份，按上述操作方法制備供試品溶液,分別精密吸取供試品溶液20μl,按照上述色譜條件測定峰面積,結果4種色原酮峰面積積分的RSD分別為1.74%，2.68%，2.30%和2.16%。

2.1.8回收率實驗取已知含量的供試品5份,分別加入定量的升麻素苷、升麻素、5O甲基維斯阿米醇苷及亥茅酚苷對照品,按上述色譜條件測定。計算4種色原酮的回收率,結果升麻素苷平均回收率為104.72%,RSD為1.57%(n=5);升麻素平均回收率為104.98%,RSD為1.64%(n=5);5-O-甲基維斯阿米醇苷平均回收率為104.93%,RSD為1.41%(n=5);亥茅酚苷平均回收率為104.47%,RSD為1.53%(n=5)。

2.2單因素分析

2.2.1料液比對總色原酮提取率的影響精密稱定0.3g防風樣品,分別準確加入甲醇3ml(料液比1∶10)、6ml(料液比1∶20)、9ml(料液比1∶30)、12ml(料液比1∶40)和15ml(料液比1∶50)在相同的條件下考察料液比對提取率的影響,結果總色原酮質量分數(shù)依次為0.9321%，0.9538%，0.9623%，0.9656%，0.9666%?？梢娫谝欢ǚ秶鷥?nèi),隨著料液質量體積比的增加，提取率增幅增大，在料液比為1∶30處達到最大。當料液比繼續(xù)增加時，總色原酮提取量的增加幅度較小。鑒于節(jié)約溶劑的原則,故將料液比定為1∶30左右。

2.2.2超聲時間對提取率的影響在料液比1∶30,其它條件相同下選擇時間15，30，45，60，75min進行超聲萃取,結果總色原酮質量分數(shù)依次為0.9325%，0.9669%，0.9863%，0.989%，0.9906%。可以看出，隨著超聲波提取時間的加長，總色原酮提取率的增幅不斷減少，這可能由于提取率正在接近最高值，并且由于在提取過程中雜質的不斷增加，影響了色原酮提取量的繼續(xù)升高。因此選擇45min左右進行正交實驗。

2.2.3超聲頻率提取率的影響在料液比1∶30,其它條件相同下選擇超聲頻率30，50，70，90kHz進行超聲萃取,結果總色原酮質量分數(shù)分別為0.9051%，0.9744%，1.008%，1.0144%。隨著超聲頻率的增加,總色原酮的提取率不斷增加,考慮超聲波儀器本身的頻率限制,故將頻率定為70kHz左右。

2.2.4提取溫度溫度過高雜質溶出增加;溫度過低,影響色原酮在甲醇的溶出。因此，綜合考慮,選擇30，40，50℃進行正交實驗。

2.3正交實驗設計及個因素水平設置根據(jù)單因素實驗結果,選取料液比(A)、超聲時間(B)、超聲溫度(C)和超聲頻率(D)為主要考察因素,各因素及水平設置見表1。正交實驗采用4因素3水平正交表即L9(34)正交表進行實驗,結果見表2,并對4種色原酮總量進行極差分析及方差分析。結果見表3～4。

表1因素水平（略）

以總色原酮為考察指標,極差R值大小顯示因素作用主次分別為C>D>B>A;即提取溫度C的極差值最大,表明提取溫度是影響超聲波萃取的最重要因素。方差分析結果(表4)表明，C、D因素對防風中色原酮的提取影響達到極顯著水平(P<0.01)。B因素對防風中色原酮的提取影響達到顯著水平(P<0.05)。其最適宜的提取工藝組合為A2B2C3D3,即料液比為1∶30,超聲時間45min,超聲溫度50℃,超聲頻率90kHz。

2.4驗證實驗根據(jù)以上所選最佳工藝A2B2C3D3的條件,對防風樣品中色原酮類成分的含量進行測定,結果總色原酮質量分數(shù)為1.0894%,1.0927%,1.0938%,平均值為1.092%,大于正交設計中的含量,所得結果正確,并且具有良好的重復性和較高的準確率,所篩選的提取工藝條件基本穩(wěn)定,可作為防風中色原酮化合物的測定方法。

表2提取工藝正交設計實驗結果（略）

表3極差分析（略）

表4方差分析（略）

3討論

實驗曾使用不同濃度的乙醇進行提取,但水溶性雜質也一起萃取出來,干擾了4種色原酮的HPLC檢測,而用甲醇提取時水溶性雜質少,故本實驗選用甲醇作為提取溶劑。

實驗結果表明，提取溫度和超聲頻率對提取效果有極顯著的影響。分析原因認為適度增加溫度有利于提高溶劑的溶解度，但溫度過高導致溶劑揮發(fā)嚴重，雜質溶出增加；而高頻率的超聲波可產(chǎn)生強烈震動和空化效應，從而加速植物材料中有效成分的溶出。

通過單因素和L9(34)正交實驗，確定防風4種色原酮超聲波提取最佳工藝為：料液比為1∶30，超聲時間45min，超聲溫度50℃，超聲頻率90kHz，其結果經(jīng)驗證實驗確認條件可行。該法具有實驗設備簡單，操作方便，提取時間短，提取效率高等優(yōu)點。作為中藥提取新工藝，具有良好的應用前景和實際的指導意義。

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