神經(jīng)源性疼痛實驗?zāi)Ｐ脱芯空撐?/h1>

時間：2022-07-18 08:31:00

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神經(jīng)源性疼痛是嚴重困擾人類的臨床問題之一。為了探索其發(fā)病機理及治療方法，研究人員建立了多種神經(jīng)損傷性疼痛模型，其中大鼠部分脊神經(jīng)結(jié)扎，慢性壓迫性神經(jīng)損傷和L5/L6脊神經(jīng)結(jié)扎的外周神經(jīng)損傷的模型應(yīng)用最為廣泛。細胞模型也顯示出了很好的應(yīng)用前景，原代和永久性感覺神經(jīng)元，作為研究疼痛發(fā)生和發(fā)展的分子機理，特別是神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究非常有用。

【關(guān)鍵詞】外周神經(jīng)源性疼痛模型動物模型細胞

AnimalandCellularModelsofPeripheralNeuropathicPain

LIANGYingxia，CHENNian，ZHAOShunjin

(1.GuangzhouGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand，Guangzhou510010，China；

2.ZhongshanSchoolofMedicine，SunYatsenUniversity，Guangzhou510080，China)

【Abstract】Peripheralneuropathicpainisoftendifficulttobeadequatelytreatedincurrentmedicine.Animalmodelsmayprovidepivotalsystemsforpreclinicalstudyofpain.Partialspinalligation，chronicconstrictioninjury，andL5/L6spinalnerveligationrepresentthreeofthebestcharacteristicrodentmodelsofperipheralneuropathy.Recently，primaryorpermanentculturesofsensoryneuronshavebeenestablishedtostudythemolecularmechanismofpain，especiallyforneurotransmitterreleaseandsignaltransduction.

【Keywords】Peripheralneuropathicpain;Model，animal;Model，cellular

外周神經(jīng)源性疼痛是由于外周神經(jīng)損傷、壓迫、神經(jīng)毒性、感染、免疫、代謝性疾病、腫瘤、維生素缺乏或其他原因引起的復(fù)雜的神經(jīng)性疼痛。多種動物模型能夠模擬人類外周神經(jīng)源性疼痛，其中大部分是通過坐骨神經(jīng)產(chǎn)生，不同之處在于對坐骨神經(jīng)損傷的部位和程度不同，后者包括橫斷，松弛和緊結(jié)扎，壓榨，完全或部分結(jié)扎、低溫凍傷、炎性物質(zhì)和腫瘤浸潤等。動物模型缺點在于接受傷害性刺激時，無法用語言表達他們的疼痛程度，因此對各種異常行為的觀察及正確分析成為動物模型的關(guān)鍵，通過觀察反射性縮足、逃走、躲避、體位異常（包括后爪懸空不與地面接觸或僅以未損傷區(qū)足跟或足內(nèi)側(cè)站立）、自噬、舔咬、搔抓和嘶叫等可觀察的指標［1］。以下就幾種常用的外周神經(jīng)源性疼痛的實驗模型作一概述。

1外周神經(jīng)源性疼痛動物模型

1.1神經(jīng)瘤模型（Neuromamodel）

神經(jīng)瘤模型又稱為坐骨神經(jīng)軸索切斷模型，多用于研究臨床疾病如截肢后的疼痛。雄性Sabra大鼠（250～300g），麻醉后在無菌條件下，暴露坐骨神經(jīng)或隱神經(jīng)，分離周圍組織，在股骨中部，用絲線結(jié)扎、切斷、冷凍或者電切神經(jīng)干［2］，保留的斷端可以在9～40d后形成神經(jīng)瘤。術(shù)后動物出現(xiàn)自噬或咬傷側(cè)肢體、足趾，這種異常行為被稱為“自殘"，可能因缺乏感覺神經(jīng)支配，局部完全失去知覺而被當作異物咬掉。自殘持續(xù)時間和程度依據(jù)手術(shù)方法和操作部位的不同而不同［3］。進一步研究發(fā)現(xiàn)緊接扎和切斷較電切和冷凍的方法，自殘行為的產(chǎn)生要少。在復(fù)制動物模型時要求研究者嚴格遵照動物倫理法防止出現(xiàn)過度的自殘現(xiàn)象［4］。值得注意的是神經(jīng)瘤模型沒有產(chǎn)生異常疼痛和痛覺過敏現(xiàn)象等外周神經(jīng)源性疼痛的特異性的標志［5］。

1.2坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷模型（CCI或者Bennett模型）

Bennett于1988年首次復(fù)制出CCI（chronicconstrictioninjuryofthesciaticnerve），克服了上述模型的缺陷，是國際上應(yīng)用較多的疼痛模型。該模型操作簡單，易掌握。方法是采用150～200g雄性SpragueDawley大鼠，氟烷麻醉，暴露坐骨神經(jīng)干，用40鉻制腸線在大鼠股骨中部水平松弛結(jié)扎坐骨神經(jīng)（左側(cè)或者右側(cè)），結(jié)扎強度以引起小腿肌肉輕度顫動反應(yīng)為宜。術(shù)后第2天開始出現(xiàn)痛反應(yīng)，10～14d達高峰，持續(xù)2個月后痛反應(yīng)消失［6］。用該方法復(fù)制出的大鼠疼痛模型表現(xiàn)為自發(fā)痛（自發(fā)抬起損傷肢體，時而舔足、咬足或甩足避免損傷側(cè)的負重）、痛覺過敏（機械痛敏和冷痛敏），輕度或中度的自殘現(xiàn)象。多用于腫瘤壓迫，重金屬離子中毒，缺氧或代謝異常等誘發(fā)的神經(jīng)病性慢性痛的研究［7］。由于鉻腸線結(jié)扎之松緊度完全取決于實驗操作，不同的松緊度可能導(dǎo)致不同程度的神經(jīng)纖維功能的喪失，因此來自于受損坐骨神經(jīng)向脊髓節(jié)段的傳入沖動可能存在差異。

1.3坐骨神經(jīng)部分結(jié)扎模型（PSL或者Seltzer模型）

1990年，Seltzer報道了PSL（partialsciaticnerveligationmodel）模型，模擬外周神經(jīng)損傷后的燒灼痛，采取單側(cè)高位股骨緊結(jié)扎1/31/2坐骨神經(jīng)。術(shù)后數(shù)小時，PSL大鼠出現(xiàn)抬足、舔足等自發(fā)性痛，痛覺異常和痛覺過敏，可持續(xù)7個月以上。PSL的不同之處在于疼痛相關(guān)行為出現(xiàn)比較早，一般在幾個小時之后；會導(dǎo)致對側(cè)疼痛的產(chǎn)生。多用于同節(jié)段內(nèi)的損傷神經(jīng)元及正常神經(jīng)元之間活動的相互影響的研究。由于這一水平支配外周區(qū)域的神經(jīng)纖維在坐骨神經(jīng)中是隨機分布的，不會造成特定區(qū)域的感覺喪失，且損傷纖維之定量也無法確知。因此，難以確定哪段脊髓節(jié)段損傷最為嚴重，其重復(fù)性和定量分析較差［8］。

研究者在應(yīng)用PSL模型和CCI模型時發(fā)現(xiàn)，兩者都容易引起手術(shù)局部的炎癥反應(yīng)，造成神經(jīng)性疼痛和炎性疼痛的之間的相互影響。2000年，ThiesLindenlaub等改進了實驗方法，采用坐骨神經(jīng)部分橫斷的方法（partialsciaticnervetransection，PST），無外源性結(jié)扎絲線的引入，減少了局部的炎癥反應(yīng)，更單一的模擬了外周神經(jīng)源性疼痛［9］。

1.4L5/L6脊髓神經(jīng)結(jié)扎模型（SNL）

Kim和Chung等在1992年研制成功SNL(L5/L6spinalnerveligationmodel)模型，又稱為節(jié)段性脊神經(jīng)結(jié)扎損傷模型。雄性SpragueDawley大鼠（160～180g）吸入麻醉后置于熱板，暴露脊柱周圍區(qū)域，打開3～4cm皮膚切口，找到并分離單側(cè)腰5和/或腰6脊神經(jīng)，用60號絲線緊結(jié)扎，切斷結(jié)扎遠端，術(shù)后用生理鹽水清洗傷口，逐層縫合，盡量減少周圍組織的損傷［10］。結(jié)扎后異常疼痛和痛覺過敏很快出現(xiàn)，至少持續(xù)4個月。坐骨神經(jīng)是由腰4～6脊神經(jīng)匯合而成，腰5和腰6脊神經(jīng)在坐骨神經(jīng)前緊扎造成坐骨神經(jīng)的部分損傷。大鼠下肢的神經(jīng)支配來源于隱神經(jīng)和坐骨神經(jīng)的分枝，至少部分隱神經(jīng)的傳入纖維通過腰3節(jié)段進入脊髓，因此腰5和腰6脊神經(jīng)損傷后下肢的神經(jīng)支配由腰3和腰4節(jié)段神經(jīng)支配。這種明顯分區(qū)的節(jié)段性損傷模型具有較明確的損傷定量和脊髓節(jié)段定位，而且有利于研究受損與未受損的神經(jīng)纖維在疼痛機制中的作用。SNL的優(yōu)點在于能產(chǎn)生自發(fā)性疼痛的行為（保護，舔嗜和同側(cè)后腳的抬起），但是并不產(chǎn)生自殘的現(xiàn)象［11］。但有實驗發(fā)現(xiàn)脊神經(jīng)結(jié)扎能夠引起神經(jīng)性疼痛，但是不是所有的脊神經(jīng)結(jié)扎都會伴有神經(jīng)性疼痛的產(chǎn)生［12］。

與CCI和PSL相比，SNL的結(jié)扎部位和結(jié)扎程度更加一致；保留了完整的脊髓部位，便于脊髓疼痛部位的研究。但是，在以上3個動物模型的制備過程中，SNL對手術(shù)操作者的要求最高，技術(shù)比較復(fù)雜［13］。以上CCI，PSL和SNL3種動物模型都可通過大鼠復(fù)制產(chǎn)生［14］，是目前國際上最為常用的外周神經(jīng)源性疼痛的動物模型，得到認可和肯定。

1.5L5脊髓神經(jīng)結(jié)扎（L5spinalnerveligation）

SNL模型出現(xiàn)后不久，分別結(jié)扎L4或者L5的脊髓神經(jīng)的動物模型相繼出現(xiàn)。結(jié)扎L4脊髓神經(jīng)后引起自主行為的缺陷，嚴重影響了疼痛行為的測定，因此無法應(yīng)用。盡管L5脊髓神經(jīng)結(jié)扎機制不是很清楚，但發(fā)現(xiàn)結(jié)扎L5后，大鼠能產(chǎn)生持續(xù)痛敏和機械刺激異常疼痛［15］。L5脊髓神經(jīng)結(jié)扎手術(shù)操作與SNL相差無幾，但是比SNL所需要的手術(shù)操作簡單，因此L5脊髓神經(jīng)的結(jié)扎大鼠模型可能是一個不錯的選擇，特別基因敲除或者轉(zhuǎn)基因大鼠。近期，研究人員還發(fā)現(xiàn)損傷的脊神經(jīng)會對周圍正常的神經(jīng)有一定的影響，這也可能是產(chǎn)生神經(jīng)性疼痛的原因之一［16］。

1.6低溫損傷模型（SCN）

與以上不同，SCN模型是通過低溫損傷坐骨神經(jīng)，導(dǎo)致自殘和痛覺過敏。簡單說就是采用-60℃的冷凍探頭直接接觸坐骨神經(jīng)干，以30s/5s/30s的時間間隔冷凍/解凍/冷凍而造成坐骨神經(jīng)損傷［17］。綜合以上發(fā)現(xiàn)，不同的操作（結(jié)扎、橫斷和低溫）產(chǎn)生的這些模型之間存在一定的差別，體現(xiàn)在術(shù)后的7d不同疼痛的行為。由于SCN模型損傷的神經(jīng)干周圍結(jié)締組織的保存使神經(jīng)再生可以進行，因此該模型適用于研究暫時性外周神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)源性疼痛及損傷后修復(fù)過程［18］。但是與SNL、PSL和CCI相比，SCN產(chǎn)生的自殘、自發(fā)性傷害性行為和觸覺異常的現(xiàn)象只能持續(xù)15～21d［19］

1.7坐骨神經(jīng)炎神經(jīng)疼痛模型（SIN）

據(jù)統(tǒng)計，將近50%神經(jīng)性疼痛是由炎癥、感染和神經(jīng)損傷后的炎癥反應(yīng)引起，因此人們開始使用神經(jīng)炎性模型來研究神經(jīng)性疼痛［20］，如SIN模型。在坐骨神經(jīng)周圍注入酵母聚糖，幾小時后產(chǎn)生異常性疼痛，如果劑量足夠大，則誘導(dǎo)對側(cè)肢體疼痛的產(chǎn)生。缺點是SIN模型不存在熱痛敏［21］。經(jīng)周圍注入死亡的細菌或者角叉菜膠［22］樣能誘導(dǎo)產(chǎn)生痛覺過敏和異常疼痛。

2疾病誘導(dǎo)的外周神經(jīng)性疼痛模型

帶狀皰疹和糖尿病為兩種常見的伴有神經(jīng)性疼痛的疾病。據(jù)研究在西方國家，66%的糖尿病患者有神經(jīng)性疼痛［23］。帶狀皰疹性神經(jīng)性疼痛，往往是急性感染皰疹病毒后，導(dǎo)致病人持續(xù)性或者終身疼痛。糖尿病神經(jīng)源性疼痛模型（diabeticneuropathicpainmodel，DNP）［24］和帶狀皰疹神經(jīng)性疼痛模型（postherapeuticneuralgiamodel，PHN）［25］是兩種常見的由疾病引起的外周神經(jīng)源性疼痛模型，還有其他類型神經(jīng)病理性疼痛，如化療藥物引起的毒性神經(jīng)病變，靜脈注射長春新堿模擬疼痛模型。

3細胞模型

3.1原代感覺神經(jīng)元的培養(yǎng)

原代感覺神經(jīng)元可以來自不同物種，一般來源于新生鼠或者胎鼠，分離進行體外培養(yǎng)。感覺神經(jīng)元還可取自傷害性動物或者藥物處理的動物［26］。實驗發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的三叉神經(jīng)節(jié)和背根神經(jīng)節(jié)的感覺神經(jīng)元，對辣椒素，緩激肽、P質(zhì)和PGE都能產(chǎn)生反應(yīng)，顯示出與體內(nèi)神經(jīng)元相似的特點［27］。已有的利用細胞模型進行疼痛神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細胞表面疼痛的介質(zhì)的研究，證明具有可行性［28］。但是細胞模型之所以沒有廣泛應(yīng)用在于還不明確細胞體外培養(yǎng)是否會引起感覺神經(jīng)元某些基因和蛋白發(fā)生改變，對實驗造成影響。

3.2永久性感覺神經(jīng)元的培養(yǎng)

原代感覺神經(jīng)元的培養(yǎng)保留了體內(nèi)神經(jīng)元的特點，更接近實際情況；但是原代培養(yǎng)操作煩瑣，細胞數(shù)量有限和細胞來源的復(fù)雜多樣，給實驗造成了一定影響。目前建立了的永久性感覺神經(jīng)元細胞系同樣具有體內(nèi)感覺神經(jīng)元的特點，或是通過病毒或者特殊原癌基因轉(zhuǎn)染［29］；或者與其他無限繁殖細胞相融合建立［30］。

4結(jié)語

感覺神經(jīng)元細胞模型雖然已有20年歷史，但在疼痛的研究中并沒有廣泛應(yīng)用，原因在于，在培養(yǎng)分化的過程中，感覺神經(jīng)元的受體、離子通道和神經(jīng)物質(zhì)可能發(fā)生改變，與體內(nèi)細胞不同。隨著基因芯片和蛋白質(zhì)組學的發(fā)展，可以系統(tǒng)全面的比較在不同的生長和分化環(huán)境下基因和蛋白的表達的改變，有利于細胞模型的推廣應(yīng)用。但是就目前來看，細胞模型在研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和神經(jīng)遞質(zhì)釋放方面有較好的實用價值。不管是動物模型還是細胞模型，都將促進針對慢性疼痛的有效治療方案治和藥物的研發(fā)。

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