導(dǎo)語：骨髓內(nèi)皮細(xì)胞增殖研究論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【摘要】本研究以內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液（EndoM）培養(yǎng)小鼠骨髓內(nèi)皮細(xì)胞，探討粒巨噬系集落刺激因子（rmGMCSF）對(duì)骨髓內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。用EndoM培養(yǎng)小鼠骨髓內(nèi)皮細(xì)胞，通過WrightGiemsa染色計(jì)數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞集落、應(yīng)用免疫熒光法觀察內(nèi)皮細(xì)胞表型；加入不同濃度的GMCSF，通過集落形成率、MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測內(nèi)皮細(xì)胞生長周期，觀察GMCSF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞體外擴(kuò)增的影響。結(jié)果表明：EndoM誘導(dǎo)的骨髓細(xì)胞可以生成內(nèi)皮細(xì)胞集落，vWF檢測呈陽性；集落形成率檢測及MTT法測定均證實(shí)GMCSF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖具有明顯的促進(jìn)作用；生長周期檢測結(jié)果顯示，GMCSF處理組的細(xì)胞進(jìn)入S期的比率為9.3%，而對(duì)照組為2.1%，說明GMCSF可以通過促使內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入S期而加快細(xì)胞的分裂，促進(jìn)細(xì)胞增殖；比較第1代和第4次傳代后細(xì)胞的生長曲線，兩者無明顯差別，說明多次傳代后的細(xì)胞仍保持傳代早期的增殖潛能。結(jié)論：GMCSF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，經(jīng)多次擴(kuò)增傳代后內(nèi)皮細(xì)胞的增殖潛能無明顯改變。

【關(guān)鍵詞】骨髓內(nèi)皮細(xì)胞GMCSF細(xì)胞增殖

EffectsofGranulocyteMacrophageColonyStimulatingFactoronGrowthofMurineBoneMarrowEndothelialCells

AbstractThepurposeofthisstudywastoinvestigatetheeffectsofgranulocytemacrophagecolonystimulatingfactor(GMCSF)onthegrowthofmousebonemarrowendothelialcells.Endothelialcellculturemedium（EndoM）wasusedtoculturemurinebonemarrowendothelialcells.EndothelialcellcolonieswerecountedundermicroscopebyWrightGiemsastaining.TheeffectofdifferentconcentriationofGMCSFontheproliferationofbonemarrowendothelialcellswasobservedbytheformationofendothelialcellcolonies,MTTandflowcytometry.TheresultsindicatedthattheendothelialspecificmarkervWFwasexpressedbythecolonycells,GMCSFpromotedtheproliferationofbonemarrowendothelialcellcoloniesandMTTconfirmedtheeffectofGMCSFonpromotingtheproliferationofbonemarrowendothelialcells.TheresultofdetectingcellcycleshowedthattherateofcellsenteringintoSphasewas9.3%inGMCSFaddedgroupandtherateofcellsenteringintoSphasewas2.1%incontrol.Therewasnosignificantdifferenceincellgrowthcurvebetweenthefirstpassageandfourthpassage.ItisconcludedthatGMCSFcanpromotetheproliferationofbonemarrowendothelialcells,theproliferationpotentialofbonemarrowendothelialcellsbetweenthefirstandfourthpassagenosignificantlychanges.

Keywordsbonemarrowendothelialcells;GMCSF;proliferation

JExpHematol2007;15(3):622-625

目前，已有許多報(bào)道證明內(nèi)皮細(xì)胞（endothelialcells,EC）、內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelialprogenitorcells,EPC）可以用來治療缺血性心臟病以及各種疾病引起的肢體缺血［1,2］也可以用于組織工程的血管構(gòu)建［3］，并取得了一定的成果。Kawamoto等［4］報(bào)道，EPC對(duì)缺血心臟病進(jìn)行治療具有良好的效果，一方面減少了缺血組織的面積，同時(shí)改善了心臟的功能。Kalka等［5］則報(bào)道了利用EPC對(duì)肢體缺血的小鼠模型進(jìn)行治療，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了EPC能顯著增加缺血肢體的灌流，而且組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)缺血部位毛細(xì)血管的數(shù)目也大大增加。內(nèi)皮細(xì)胞的來源有多種，可以從外周血、臍血及骨髓中獲得［6］，而外周血中的內(nèi)皮祖細(xì)胞來源于骨髓。從病人自體的骨髓中獲得內(nèi)皮細(xì)胞，一方面來源比較方便，而且也可以避免GVHD的發(fā)生。但是由于骨髓基質(zhì)細(xì)胞種類多，難以分離純化骨髓內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮祖細(xì)胞。本研究用本實(shí)驗(yàn)室配制的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液（EndoM）體外培養(yǎng)小鼠骨髓細(xì)胞，分離純化骨髓內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)皮祖細(xì)胞，并觀察粒巨噬系集落刺激因子（rmGMCSF）對(duì)小鼠骨髓內(nèi)皮細(xì)胞體外增殖的影響以及體外增殖后內(nèi)皮細(xì)胞增殖機(jī)能的改變，這對(duì)臨床運(yùn)用內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮祖細(xì)胞治療疾病有一定的指導(dǎo)意義。

動(dòng)物

昆明小鼠，由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動(dòng)物學(xué)部提供，雌雄不限，普通飲食。

主要試劑和儀器

IMDM為Gibco公司產(chǎn)品；新生牛血清購自杭州四季清生物制品研究所；重組小鼠粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rmGMCSF）為R&D公司產(chǎn)品；vWF抗體、CY3標(biāo)記的羊抗兔IgG為Sigma公司產(chǎn)品；MTT、二甲基亞砜（DMSO）為Sigma公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀為Awarens公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱購自美國Forma。

小鼠骨髓內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞集落的培養(yǎng)

用頸椎脫臼法處死小鼠，在無菌條件下取出股骨，用IMDM沖出骨髓細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，取1×106個(gè)小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞種入1ml含有15%新生牛血清的EndoM培養(yǎng)體系，置于24孔板中，于37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)5天后,用胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，按每孔1×104個(gè)細(xì)胞種入24孔板，每組3孔。于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)15天后計(jì)數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞集落數(shù)，以≥50個(gè)細(xì)胞的聚合計(jì)為1個(gè)集落。

內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)觀察及vWF的檢測

培養(yǎng)的骨髓內(nèi)皮細(xì)胞集落經(jīng)WrightGiemsa染色后，顯微鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)。用間接免疫熒光法檢測骨髓內(nèi)皮細(xì)胞vWF。將內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板內(nèi)放置的蓋玻片上，當(dāng)細(xì)胞間沒有明顯的間隙時(shí)，取出蓋玻片，用PBS清洗，用4%的多聚甲醛固定30分鐘，用PBS洗3次：2%的正常羊血清封閉4小時(shí)，加入vWF抗體，4℃過夜，用PBS洗3次，加入二抗CY3IgG，37℃孵育60分鐘,PBS洗3次：置于熒光顯微鏡下觀察。以本室建的小鼠骨髓內(nèi)皮細(xì)胞株［7］為陽性對(duì)照，骨髓成纖維細(xì)胞為陰性對(duì)照。

不同濃度的GMCSF對(duì)小鼠骨髓內(nèi)皮細(xì)胞形成集落的影響

取純化的小鼠骨髓內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板中，每孔5000個(gè)細(xì)胞，在基本培養(yǎng)體系（含1%濃度EndoM）的基礎(chǔ)上分別加入5、10、25ng/ml的rmGMCSF，對(duì)照組不加入GMCSF，每組3孔。置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)15天，于倒置顯微鏡下記數(shù)集落數(shù)，≥50個(gè)細(xì)胞的聚合計(jì)為1個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞集落。

GMCSF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖影響的MTT法測定

將純化的小鼠骨髓內(nèi)皮細(xì)胞按5000個(gè)/孔培養(yǎng)于96孔板，每孔0.2ml，每組3孔。實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)體系中分別加入5、25、100ng/ml的rmGMCSF，對(duì)照組內(nèi)不加。在37℃、5%CO2、飽和濕度下分別培養(yǎng)5天和10天，取出培養(yǎng)板吸去培養(yǎng)液，然后加入無血清的IMDM180μl和20μlMTT溶液，放入培養(yǎng)箱孵育4小時(shí)，吸去液體，各孔加入DMSO150μl，振蕩10分鐘，使結(jié)晶充分溶解。選擇492nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔的光吸收值（OD492）。

生長曲線

純化的小鼠骨髓內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中，每孔5000個(gè)細(xì)胞，加0.2ml含15%新生牛血清的基本培養(yǎng)液，并加入25ng/ml的rmGMCSF。共種6組，每組3孔，培養(yǎng)5天后，分別于第7、9、11、13、15天用胰酶消化后計(jì)數(shù)細(xì)胞，每次3孔，求平均值，做出生長曲線。按公式DT=t×1g2/(1gN-1gN0)算出第1代內(nèi)皮細(xì)胞生長的倍增時(shí)間。

細(xì)胞周期的流式細(xì)胞術(shù)檢測

無菌條件下取小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，按2×106個(gè)細(xì)胞種于6孔培養(yǎng)板中（2ml培養(yǎng)體系中含15%新生牛血清的EndoM），置于37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)5天，然后吸去培養(yǎng)液，加入兩種不同培養(yǎng)體系，對(duì)照組加含15%新生牛血清的IMDM，實(shí)驗(yàn)組加15%新生牛血清的IMDM和100ng/ml的rmGMCSF，每組各10孔，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天后，用胰酶消化細(xì)胞，200×g,離心5分鐘，用PBS洗滌細(xì)胞2次之后，用300μlPBS重懸細(xì)胞，加入冰冷的乙醇（-20℃）約700μl（終濃度為70%），將細(xì)胞放于-20℃過夜處理后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

細(xì)胞傳代培養(yǎng)

取小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，按2×106個(gè)細(xì)胞種于6孔培養(yǎng)板中（2ml體系中含15%新生牛血清的EndoM），置于37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)5天，然后吸去培養(yǎng)液，加入15%新生牛血清的IMDM培養(yǎng)液和100ng/ml的rmGMCSF，促使細(xì)胞融合，再按1∶4傳代于6孔板中，同樣加入15%新生牛血清的IMDM和100ng/ml的rmGMCSF，等細(xì)胞生長至融合，按1∶4傳代，加入相同培養(yǎng)體系。按上述方法傳4代后，繪制生長曲線，方法同前。公式DT=t×1g2/(1gN-1gN0)算出第4代內(nèi)皮細(xì)胞生長的倍增時(shí)間，并與第1代的倍增時(shí)間進(jìn)行比較。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次結(jié)果，以mean±SD表示。不同處理組兩組間比較采用t檢驗(yàn)，應(yīng)用SPSS軟件分析，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

細(xì)胞形態(tài)每孔種入小鼠骨髓內(nèi)皮細(xì)胞5000個(gè)，對(duì)照組加基礎(chǔ)培養(yǎng)液,實(shí)驗(yàn)組在基礎(chǔ)培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上分別加入rmGMCSF5、10、25ng/ml。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組集落數(shù)均明顯增多（圖3），說明rmGMCSF對(duì)小鼠骨髓內(nèi)皮細(xì)胞的增殖有明顯刺激作用。

rmGMCSF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響

小鼠骨髓內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)5、10天，分別進(jìn)行MTT的檢測，結(jié)果表明rmGMCSF對(duì)小鼠骨髓內(nèi)皮細(xì)胞生長促進(jìn)作用明顯，各組與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.01）（圖4）。

GMCSF對(duì)EC細(xì)胞周期的影響

運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，觀察GMCSF對(duì)EC細(xì)胞周期的影響。結(jié)果顯示GMCSF使細(xì)胞進(jìn)入S期的比例為9.3%，與對(duì)照組2.1%相比有明顯差別。此結(jié)果說明GMCSF能夠促使細(xì)胞進(jìn)入S期，加快細(xì)胞的分裂，從而促進(jìn)了細(xì)胞的增殖（圖5）。Figure5.EffectofGMCSFoncellcycleofendothelialcells.A:grouptreatedbyGMCSF.B:controlgroup.

體外擴(kuò)增傳代對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響

圖6為小鼠骨髓第1代和第4代內(nèi)皮細(xì)胞的生長曲線。利用計(jì)算公式［DT=t×1g2/(1gN-1gN0)］計(jì)算出第1、4代細(xì)胞生長的倍增時(shí)間分別為30.25±0.55小時(shí)、31.67±0.26小時(shí)。第1代與第4代的細(xì)胞倍增時(shí)間相比，無明顯差異，表明經(jīng)體外擴(kuò)增傳代4次，仍能保持傳代早期的增殖潛能。

Figure6.Growthcurveofthefirstandfourthpassagegenerationsofmurineboneendothelialcells.討論

國內(nèi)外對(duì)于骨髓內(nèi)皮細(xì)胞的純化報(bào)道較少，但已經(jīng)進(jìn)行了一些關(guān)于細(xì)胞因子對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖影響的研究，如Yonekura等［8］報(bào)道VEGF可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，Rieck等［9］則報(bào)道bFGF可促進(jìn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的生長。我們此前曾報(bào)道了VEGF、bFGF、SCF、IL6、GMCSF等對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞株的增殖有促進(jìn)作用［10］。GMCSF對(duì)未經(jīng)轉(zhuǎn)化的骨髓內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用尚未見報(bào)道。本研究中，我們用本室配制的培養(yǎng)基在較短的時(shí)間內(nèi)純化了小鼠的骨髓內(nèi)皮細(xì)胞，vWF為陽性，并在此基礎(chǔ)上觀察了GMCSF對(duì)骨髓內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。應(yīng)用基本培養(yǎng)基培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞集落時(shí)，形成的集落數(shù)較少，加入rmGMCSF后，集落生成明顯增多。MTT的結(jié)果亦支持GMCSF對(duì)小鼠骨髓內(nèi)皮細(xì)胞生長的刺激作用。細(xì)胞生長曲線的結(jié)果表明，在含GMCSF培養(yǎng)的條件下，內(nèi)皮細(xì)胞生長的倍增時(shí)間為30.25±0.55小時(shí)，經(jīng)4次傳代后細(xì)胞倍增時(shí)間無明顯延長，表明體外培養(yǎng)擴(kuò)增4代后，細(xì)胞仍能保持早期的增殖能力，GMCSF對(duì)骨髓內(nèi)皮細(xì)胞的體外增殖有明顯刺激作用。文獻(xiàn)報(bào)道內(nèi)皮細(xì)胞表面有GMCSFR的存在，而內(nèi)皮細(xì)胞本身也可以分泌GMCSF［11］。結(jié)合細(xì)胞周期測定的結(jié)果，可以認(rèn)為，GMCSF促內(nèi)皮細(xì)胞增殖的機(jī)制可能是GMCSF與GMCSFR結(jié)合，通過細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞使更多的細(xì)胞進(jìn)入S期來實(shí)現(xiàn)的。

【參考文獻(xiàn)】

1LuttunA,CarmelietG,CarmelietP.Vascularprogenitors:frombiologytotreatment.TrendsCardiovascMed,2002;12:88-96

2RafiiS,LydenD.Therapeuticstemandprogenitorcelltransplantationfororganvascularizationandregeneration.NatMed,2003;9:702-712

3ZammarettiP,ZaischAH.Adult‘endothelialprogenitorcells’.Renewingvasculature.IntJBiochemCellBiol,2005;37:493-503

4KalkaC,MasudaH,TakahashiT,etal.Transplantationofexvivoexpandedendothelialprogenitorcellsfortherapeuticneovascularization.ProcNatlAcadSciUSA,2000;97:3422-3427

5KawamotoA,TkebuchavaT,YamaguchiJ,etal.Intramyocardialtransplantationofautologousendothelialprogenitorcellsfortherapeuticneovascularizationofmyocardialischemia.Circulation,2003;107:461-468

6HristovM,ErlW,WeberPC.EndothelialProgenitorCells:isolationandcharacterization.TrendsCardiovascMed,2003;13:201-206

7王綺如，嚴(yán)燕，汪保和.小鼠骨髓內(nèi)皮細(xì)胞系的建立.中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，1997；5：360-366

8YonekuraH,SakuraiS,LiuX,etal.PlacentagrowthfactorandvascularendothelialgrowthfactorBandCexpressioninmicrovascularendothelialcellsandpericyts.Implicationinautocrineandparacrineregulationofangiogenesis.JBiolChem,1999;274:35172-35178

9RieckP,OliverL,EngelmannK,etal.Theroleofexogenous/endogenousbasicfibroblastgrowthfactor(FGF2)andtransforminggrowthfactorsbeta(TGFbeta1)onhumancornealendothelialcellsproliferationinvitro.ExpCellRes,1995;220:36-46

10周小瑩,王綺如,黃艷紅等.骨髓內(nèi)皮細(xì)胞無血清條件培養(yǎng)液對(duì)骨髓內(nèi)皮細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用.生理學(xué)報(bào),2005；57：199-204

11仲照東,鄒萍,劉凌波等.利用基因芯片技術(shù)研究造血生長因子在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá).中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2004；12：637-639