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【關(guān)鍵詞】二十碳五烯酸；HepG2細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；線(xiàn)粒體

EffectsofeicosapentaenoicacidonapoptosisandmitochondriainHepG2cells

【Abstract】AIM:ToinvestigatethemitochondriachangesinhumanhepatoblastomaG2（HepG2）cellapoptosisinducedbyeicosapentaenoicacid(EPA).METHODS:IntheHepG2cellsincubatedwithEPAinvitro，cellapoptosiswasdetectedbyDNALadder,thechangesofmitochondriafunctionandquantityweredeterminedwithmethylthiazolyltetrazolium（MTT）colorimetricassayandfluorescenceprobe.TheexpressionandactivityofCaspase9weremeasuredinHepG2cellapoptosiswithWesternblottingandspecialsubstrate.RESULTS:Twentyfourhoursafterexposureto120μmol/LEPA，HepG2cellsdisplayedtheapoptosisbytheDNAladderpattern;thenumberofthemitochondriawasdecreased;theAvaluebytheMTTtestwas0.173±0.065,whichindicatedthatthefunctionofmitochondriawassignificantlydeclined(P<0.01);comparedwiththeuntreatedHepG2cells,theexpressionofCaspase9wasupregulatedandtheactivityofCaspase9wasincreasedto75.4±4.8inHepG2cellstreatedwithEPA(P<0.01).CONCLUSION:ThechangesofmitochondriamayplayagreatroleintheHepG2cellapoptosisinducedbyEPA.

【Keywords】eicosapentaenoicacid;HepG2cells;apoptosis;mitochondria

【摘要】目的：探討二十碳五烯酸（EPA）誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡及其對(duì)線(xiàn)粒體的影響.方法：HepG2細(xì)胞與經(jīng)EPA處理后，DNALadder檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，應(yīng)用線(xiàn)粒體熒光探針和四唑鹽（MTT）比色法分析細(xì)胞線(xiàn)粒體數(shù)量和功能，應(yīng)用免疫印跡法和特異性底物檢測(cè)HepG2細(xì)胞Caspase9蛋白酶的表達(dá)和活性.結(jié)果：終濃度為120μmol/LEPA處理HepG2細(xì)胞24h后，可以檢測(cè)到凋亡標(biāo)志性的DNA梯形帶；細(xì)胞線(xiàn)粒體數(shù)量減少，MTT比色法檢測(cè)A值為0.173±0.065（P<0.01），提示線(xiàn)粒體功能降低；線(xiàn)粒體相關(guān)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)分子Caspase9蛋白表達(dá)增加，Caspase9酶活性增強(qiáng)至75.4±4.8，與未經(jīng)EPA處理HepG2細(xì)胞相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）.結(jié)論：EPA可能通過(guò)損傷線(xiàn)粒體誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡.

【關(guān)鍵詞】二十碳五烯酸；HepG2細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；線(xiàn)粒體

二十碳五烯酸（eicosapentaenoicacid,EPA）屬于n3多不飽和脂肪酸（n3polyunsaturatedfattyacid，n3PUFA），主要存在于深海魚(yú)油中，是一類(lèi)對(duì)人體有益的重要營(yíng)養(yǎng)素.近來(lái)的研究表明n3PUFA可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖，具有一定的抗瘤功效［1］，其中誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡可能是主要機(jī)制之一［2］.有研究發(fā)現(xiàn)，EPA可以通過(guò)p53依賴(lài)，F(xiàn)as介導(dǎo)途徑誘導(dǎo)人肝癌hepg2細(xì)胞凋亡［3］.我們采用DNA梯形帶檢測(cè),MTT比色法和激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)等方法，通過(guò)觀(guān)察EPA對(duì)體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞凋亡和線(xiàn)粒體的影響，初步探討線(xiàn)粒體損傷在EPA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡過(guò)程中所發(fā)揮的作用，為進(jìn)一步研究n3PUFA在抗腫瘤方面的功效提供一定的理論基礎(chǔ).

1材料和方法

1.1材料人肝癌HepG2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生化與細(xì)胞所；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；EPA，四唑鹽（MTT）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；線(xiàn)粒體熒光探針MitoTrackerRed購(gòu)自美國(guó)MolecularProbe公司；小鼠抗人Caspase9mAb為美國(guó)NeoMarker公司產(chǎn)品；Caspase9蛋白酶特異性底物AcLEHDAMC為美國(guó)Alexis公司產(chǎn)品.

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組HepG2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含有10mL/L小牛血清的DMEM培養(yǎng)液.試驗(yàn)分為：處理組HepG2細(xì)胞于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期應(yīng)用EPA（終濃度為120μmol/L培養(yǎng)液）處理24h后收獲；對(duì)照組采用正常培養(yǎng)未經(jīng)EPA處理的HepG2細(xì)胞.

1.2.2DNA梯形帶法檢測(cè)細(xì)胞凋亡細(xì)胞經(jīng)處理后收獲約1×106個(gè)細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，加150μLNP40裂解液裂解細(xì)胞5h，離心收集上清，150μLNP40細(xì)胞裂解液重復(fù)抽提沉淀1次，將上清置于等體積10g/LSDS溶液中并混勻，加入RNaseA（終濃度為2μg/mL），56℃孵育2h，加蛋白酶K至終濃度為2μg/mL，37℃水浴2h，加1/2體積的10mol/L醋酸銨和2倍體積的冰冷無(wú)水乙醇，-20℃過(guò)夜，4℃高速離心30s，棄上清，750mL/L冰冷乙醇漂洗沉淀，20μLTE緩沖液溶解DNA，取5μLDNA進(jìn)行20g/L瓊脂糖凝膠電泳.

1.2.3激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞線(xiàn)粒體HepG2細(xì)胞制成細(xì)胞爬片，處理組細(xì)胞經(jīng)終濃度為120μmol/L的EPA處理24h后收獲.兩組細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)液沖洗1次，加入線(xiàn)粒體探針MitoTrackerRed（無(wú)血清培養(yǎng)基1∶5000稀釋?zhuān)?7℃孵育40min，無(wú)血清培養(yǎng)液沖洗3次，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡，綠色激發(fā)光激發(fā)下觀(guān)察并照相.

1.2.4MTT比色法檢測(cè)線(xiàn)粒體功能［4］HepG2細(xì)胞傳代后培養(yǎng)于6孔板中，每孔5.0×106個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔.兩組細(xì)胞用不含血清的培養(yǎng)液清洗，每孔加入100μLMTT（5g/L濃度溶解于PBS中），37℃孵育1h，棄上清液，每孔加入3mL細(xì)胞裂解液，570nm處測(cè)量A值.兩組以相同方法重復(fù)檢測(cè)3次.

1.2.5免疫印跡法檢測(cè)Caspase9蛋白表達(dá)收獲處理組和對(duì)照組細(xì)胞約1×107個(gè)，加入100μL冰預(yù)冷的NP40細(xì)胞裂解液（50mmol/L,pH8.0Tris・Cl,150mmol/LNaCl，25mmol/LNaF，5mmol/LNa4P2O7-，1g/LSDS，1mmol/LPMSF，10μg/mLAprotinin，10μg/mLLeupeptin，10g/LNP40）冰上靜置裂解30min，4℃,12000g離心15min，收集上清，Brodford法測(cè)定蛋白含量.取20μg蛋白，用細(xì)胞裂解液稀釋至20μL，加20μL2×SDS凝膠加樣緩沖液，煮沸5～10min，100g/LSDSPAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，10g/LBSA室溫封閉1h，然后加入小鼠抗人Caspase9mAb（1∶100稀釋?zhuān)?7℃孵育1h，使用羊抗鼠SP試劑盒反應(yīng)，DAB顯色.

1.2.6Caspase9活性檢測(cè)［5］兩組均收獲約1×106個(gè)細(xì)胞，PBS洗滌2次，離心棄上清，加入500μL細(xì)胞裂解緩沖液（10mmol/L,pH7.5Tris，30mmol/LNaCl，10mmol/LNaF，10mmol/LNaPi，10mol/LNaPPi，10mL/LTrionX100）輕柔重懸細(xì)胞沉淀后立即放入液氮中速凍，然后置于-80℃凍存?zhèn)溆?進(jìn)行活性分析時(shí)，細(xì)胞沉淀懸液融化后輕微混勻，18000g，4℃離心12min，取上清以Brodford法進(jìn)行蛋白定量（讀取A595nm值）.取100μL蛋白提取液，加入1.9mL反應(yīng)緩沖液（20mmol/L,pH7.4HepesKOH，100mL/L甘油，20mmol/LDTT，20μmol/LAcLEHDAMC），混勻，37℃避光孵育30～60min，用熒光分光光度計(jì)在狹縫2，激發(fā)光380nm，發(fā)射光460nm條件下測(cè)量A460nm值.兩組以相同方法重復(fù)檢測(cè)3次.酶活性以A460nm／A595nm表示.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2結(jié)果

2.1EPA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的檢測(cè)DNA梯形帶檢測(cè)結(jié)果顯示HepG2細(xì)胞染色質(zhì)DNA裂解成180～200bp和不同倍數(shù)的片段，在瓊脂糖凝膠電泳顯示出凋亡細(xì)胞特有梯形帶（圖1）.

2.2EPA對(duì)HepG2細(xì)胞線(xiàn)粒體數(shù)量的影響線(xiàn)粒體熒光探針可以特異性標(biāo)記細(xì)胞線(xiàn)粒體，在綠色激發(fā)光激發(fā)下發(fā)出紅色熒光.激光共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)未經(jīng)EPA處理的HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，紅色熒光明亮，均勻分布于胞質(zhì)區(qū).經(jīng)120μmol/LEPA處理24h后，HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)稀疏，形態(tài)趨于圓形，熒光強(qiáng)度明顯減弱，提示細(xì)胞線(xiàn)粒體數(shù)量明顯減少（圖2）.

2.3EPA對(duì)HepG2細(xì)胞線(xiàn)粒體功能的影響研究結(jié)果顯示，未經(jīng)EPA處理的HepG2細(xì)胞測(cè)得A570nm值為0.470±0.023，經(jīng)120μmol/LEPA處理24h后測(cè)得HepG2細(xì)胞A570nm值為0.173±0.065，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）.

2.4EPA對(duì)HepG2細(xì)胞Caspase9蛋白酶表達(dá)和活性的影響免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示Caspase9蛋白表達(dá)增加.以特異性熒光底物分析Caspase9蛋白酶活性，結(jié)果表明，未經(jīng)EPA處理的HepG2細(xì)胞Caspase9活性為32.7±3.6，經(jīng)EPA處理24h后細(xì)胞Caspase9活性達(dá)到75.4±4.8，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，圖3）.

3討論

作為一種人體需要的重要營(yíng)養(yǎng)素，n3PUFA的抗瘤功能逐漸受到關(guān)注.研究發(fā)現(xiàn)n3PUFA可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［6］，而我們使用EPA處理肝癌HepG2細(xì)胞后可以檢測(cè)到凋亡標(biāo)志性的DNA梯形帶，說(shuō)明EPA也可以在體外誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的發(fā)生.

線(xiàn)粒體是參與細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素，目前的觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為線(xiàn)粒體既是細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)者，又是凋亡信號(hào)的放大者.凋亡過(guò)程中一個(gè)重要的特征就是線(xiàn)粒體膜功能的改變即線(xiàn)粒體的通透性改變，這是調(diào)節(jié)凋亡的中心環(huán)節(jié).凋亡誘導(dǎo)因素可以誘導(dǎo)MPT開(kāi)放，導(dǎo)致線(xiàn)粒體跨膜電位(△ψm)下降或消失，隨后呼吸鏈脫耦聯(lián)，造成線(xiàn)粒體自身?yè)p傷，產(chǎn)生活性氧類(lèi)及向胞質(zhì)釋放多種蛋白酶活化物，包括凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosisinducingfactor,AIF）,細(xì)胞色素C(CytC)和凋亡蛋白酶激活因子1（apoptosisproteaseactivatingfactor1,Apaf1）等.AIF可以直接進(jìn)入細(xì)胞核，導(dǎo)致染色體濃縮、斷裂［7］.而Caspase9蛋白酶是線(xiàn)粒體依賴(lài)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)分子，與線(xiàn)粒體釋放的CytC和Apaf1結(jié)合形成凋亡復(fù)合體后被激活，活化的Caspase9可以進(jìn)一步裂解活化下游Caspase蛋白酶，啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生.國(guó)外曾報(bào)道在n3脂肪酸誘導(dǎo)人白血病HL60細(xì)胞凋亡過(guò)程中，線(xiàn)粒體去極化和上調(diào)半胱氨酸蛋白酶（Caspase）的表達(dá)和/或活性可能與此過(guò)程密切相關(guān)［8］.

我們的試驗(yàn)結(jié)果表明，HepG2細(xì)胞經(jīng)EPA處理后，細(xì)胞生長(zhǎng)減緩，死亡細(xì)胞增多，同時(shí)可以觀(guān)察到細(xì)胞線(xiàn)粒體數(shù)目明顯減少，應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞線(xiàn)粒體功能，發(fā)現(xiàn)在EPA作用下HepG2細(xì)胞線(xiàn)粒體功能顯著降低.對(duì)細(xì)胞Caspase9蛋白酶的檢測(cè)結(jié)果表明，在EPA作用下HepG2細(xì)胞Caspase9蛋白酶表達(dá)增加，活性增強(qiáng).由此我們認(rèn)為在誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，EPA對(duì)細(xì)胞線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響可能發(fā)揮了重要作用，其中線(xiàn)粒體依賴(lài)的Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)可能是凋亡事件的重要組成部分.此外，有報(bào)道EPA可以通過(guò)促進(jìn)線(xiàn)粒體生成過(guò)氧化物，釋放AIF1，通過(guò)不依賴(lài)Caspase的途徑誘導(dǎo)鼠白血病RBL2H3細(xì)胞凋亡［9］，但在EPA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡過(guò)程中是否存在相同機(jī)制還有待進(jìn)一步研究.

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