導語：兒童急性白血病生存素和細胞周期素B1基因表達一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【關鍵詞】生存素基因；細胞周期素B1基因；急性白血??；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應

ExpressionsofsurvivinandcyclinB1geneinchildhoodacuteleukemia

【Abstract】AIM:ToinvestigatetheexpressionsandsignificanceofsurvivinandcyclinB1geneinchildhoodacuteleukemia(AL).METHODS:TheexpressionsofsurvivinandcyclinB1genewereexaminedbyRTPCRinbonemarrowcellsfrom42childrenwithincipientorrelapsedAL，13withcompletelyremissiveAL(ALCR)and15withoutmalignantdiseaseasacontrolgroup.RESULTS:InincipientandrelapsedALgroups,theexpressionlevelofsurvivinwere0.472and0.810,cyclinB1were0.606and0.739,whichwereremarkablyhigherthanthoseincontrolgroupandALCRgroup(P<0.01).TherewasasignificantlydifferencebetweenincipientALgroupandrelapsedALgroupintheexpressionlevelofsurvivinmRNA(P=0.025).Theexpressionofsurvivingenewasassociatedwithinitialwhitebloodcell(WBC)countandclinicaltypesofAL.TheexpressionofcyclinB1genewasnotcorrelatedwithage,sex,immunogenictype,initialWBCcountandclinicaltypesofAL.TherewasasignificantlypositivecorrelationbetweentheexpressionofsurvivingeneandcyclinB1inChildhoodAL(r=0.6864,P<0.01).Patientswithhighsurvivinexpressionlevelachievedalowerrateofcompleteremission(CR)thanthosewithlowexpressionlevelofsurvivin.CONCLUSION：SurvivinandcyclinB1geneareexpressedwidelyinspecimensofAL,andthereisapositivecorrelationbetweenthem.Overexpressionofsurvivinmayimplythelowersensitivityoftheleukemiccellstochemotherapyandthehigherriskofrelapse.Overexpressionofsurvivinmightbeanindexoftreatmenteffect,andmightberelatedtopoorprognosis.

【Keywords】survivin;cyclinB1;acuteleukemia;reversetranscriptionpolymerasechainreaction

【摘要】目的：探討基因生存素，細胞周期素B1的表達與兒童急性白血病（AL）的關系.方法：采用RTPCR對初治或復發(fā)AL患兒42例和完全緩解AL(ALCR)患兒13例及非惡性疾病患兒15例骨髓單個核細胞進行基因生存素，細胞周期素b1表達的檢測.結(jié)果：初治和復發(fā)AL組生存素mRNA表達水平分別為0.472和0.810，細胞周期素B1mRNA為0.609和0.739，均高于ALCR組（0）和對照組（0）（P<0.01）；復發(fā)AL組生存素mRNA表達水平高于初治組，有統(tǒng)計學差異（P=0.025）.生存素基因的表達與白細胞總數(shù)及臨床分型有關，與性別、年齡、免疫分型無明顯相關性.細胞周期素B1表達與性別、年齡、免疫分型、白細胞總數(shù)及臨床分型無明顯相關關系.兒童AL中生存素與細胞周期素B1的表達呈正相關.生存素mRNA表達水平高者緩解率低.結(jié)論：兒童AL中存在生存素，細胞周期素B1異常表達，兩者表達存在相關性.生存素是AL復發(fā)的高危因素；AL生存素高表達者可以降低AL的化療敏感性，生存素水平對AL有判斷療效和預后的價值.

【關鍵詞】生存素基因；細胞周期素B1基因；急性白血?。荒孓D(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應

凋亡相關基因與白血病的治療及耐藥有關.生存素是一種凋亡抑制蛋白，與腫瘤發(fā)生有密切關系［1］.細胞周期素B1是細胞周期調(diào)節(jié)因子，它的異常表達將導致細胞周期發(fā)生紊亂，致使腫瘤形成.我們采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈式反應(RTPCR)的方法對初治、復發(fā)、化療后達完全緩解的急性白血病(acuteleukemia,AL)患兒以及對照組骨髓單個核細胞生存素基因的表達進行了檢測，以探討生存素和細胞周期素B1基因與兒童急性白血病的關系及其臨床意義.

1對象和方法

1.1對象200402/200411AL患兒55（男36，女19）例，年齡2～14歲.其中急性淋巴細胞白血病(acutelymphoblasticleukemia,ALL)43例(L14例，L236例，L33例)，急性非淋巴細胞白血病(acutenonlymphocyticleukemia,ANLL)12例(M2a6例，M2b1例，M3a3例，M3b1例，M4b1例).初治35例，完全緩解(ALCR)13例，復發(fā)7例.初治組中ALL26例，其中BALL16例，TALL5例，5例未進行免疫分型，ANLL9例.各組性別、年齡等條件相似.對照組15（男9，女6）例，年齡3～14歲.為同期住院非惡性血液?。ㄌ匕l(fā)性血小板減少性紫癜、缺鐵性貧血等）患兒.

1.2方法Trizol試劑（Gibco公司）；逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV(Promega公司)，Taq酶（Sangon公司）；PCR擴增儀（MJ公司220型）.抽取患者骨髓液1～2mL，ACD抗凝，采用Ficoll密度梯度離心分離出單個核細胞(mononucleiccell,MNC)，采用Trizol試劑抽提并制備總RNA.cDNA的合成包括總RNA2μL(1g/L),oligo(dT)181.0μL，加ddH20至12μL，70℃反應5min，冰上冷卻，加入5×Buffer4.0μL，RNasin核糖核酸酶抑制物1.0μL，10mmol/L的dNTPs2.0μL，37℃反應5min，加MMuLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200MU/L)1.0μL，終體積20μL，42℃反應60min，70℃反應10min后冰上冷卻完成反應.PCR擴增生存素上游引物：5′ACCGCATCTCTACATTCAAG3′，生存素下游引物：5′CTTTCTTCGCAGTTTCCTC3′；細胞周期素B1上游引物：5′CCATTATTGATCGGTTCATGCAGA3′，細胞周期素B1下游引物：5′CTAGTGCAGAATTCAGCTGTGGTA3′；βactin上游引物：5′AAGAGAGGCATCCTCACCCT3′，βactin下游引物：5′TACATGGCTGGGGTGTTGAA3′.生存素擴增產(chǎn)物長度342bp，細胞周期素B1擴增產(chǎn)物長度585bp，βactin擴增產(chǎn)物長度218bp.PCR反應體系為25μL，包括逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA2μL，10×PCR反應緩沖液2.50μL，10mmoldNTP0.5μL，25mmol/LMgCl21.5μL，生存素（或細胞周期素B1）上、下游引物,βactin上、下游引物各1.0μL（10μmol/L），TaqDNA聚合酶(83.35mkat/L)0.2μL，其余用水補足.生存素反應條件為：94℃30s，54℃30s，74℃40s，30個循環(huán).細胞周期素B1反應條件為：94℃60s，54.7℃60s，74℃40s，32個循環(huán).取擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，有目的基因擴增片斷特異性條帶者的為陽性，以無模板的PCR產(chǎn)物為陰性對照.利用GelDoc2000系統(tǒng)對凝膠圖像進行分析，計算樣本生存素，細胞周期素B1基因PCR產(chǎn)物條帶光密度與βactinPCR產(chǎn)物條帶光密度比值，即為生存素，細胞周期素B1基因表達水平.

統(tǒng)計學處理：使用SPSS10.0軟件包處理.生存素，細胞周期素B1基因的表達數(shù)據(jù)用中位數(shù)(P25～P75)表示，組間比較進行秩和檢驗，對列聯(lián)表資料進行相關分析，檢驗水準α=0.05.

2結(jié)果

2.1生存素，細胞周期素B1mRNA的表達初治和復發(fā)組表達均高于對照組；緩解組和對照組表達無差異；復發(fā)組生存素表達高于初治組（圖1,2），復發(fā)組細胞周期素B1表達和初治組間無差異（表1）.ANLL患者生存素mRNA表達中位數(shù)為0.536，ALL為0.450，兩者比較無顯著性差異（P=0.853）.ANLL細胞周期素B1mRNA表達中位數(shù)為0.606，ALL為0.592，兩者的表達水平無統(tǒng)計學差異（P=0.590）.表1兒童白血病生存素，細胞周期素B1mRNA的表達比較

2.2生存素，細胞周期素B1mRNA表達與臨床特征初治AL組中生存素mRNA在WBC≥50×109/L患者表達水平為0.748，在WBC<50×109/L患者為0.442，兩者差異有顯著意義（P=0.019）.高危型患者生存素mRNA表達水平為0.699，低危型患者為0.433，兩者差異有顯著意義（P=0.010）.細胞周期素B1mRNA表達在高危型和低危型患兒間、在WBC≥50×109/L和WBC<50×109/L患兒間差異無顯著性；生存素，細胞周期素B1mRNA在年齡≥10歲或<1歲與1～10歲患兒之間差異無顯著性；在男女間差異無顯著性；在TALL和BALL兩者差異無顯著性（表2）.對初治35例AL患者的生存素和細胞周期素B1mRNA表達進行相關分析，發(fā)現(xiàn)兩者的mRNA表達成正相關（r＝0.6864，P<0.01，表3）.35例初治AL患者中13例可進行療效評估（2例早期死亡，20例未治療）.10例獲得完全緩解（completeremission,CR）.獲得CR的患兒化療前生存素mRNA表達中位數(shù)為0.473，細胞周期素B1mRNA表達中位數(shù)為0.677，而未獲得CR的患兒化療前生存素mRNA表達中位數(shù)為0.810，細胞周期素B1mRNA表達中位數(shù)為0.606.提示生存素mRNA表達高的患者化療療效差、不易達到CR.，但尚需進一步積累病例，以便分析生存素mRNA表達水平與急性白血病類型、療效的關系.7例復發(fā)的AL患者，只有2例用化療藥后達到CR，其生存素，細胞周期素B1mRNA表達均陽性.余5例均未達到CR.表2兒童白血病生存素，細胞周期素B1的表達與臨床特征的關系

3討論

腫瘤的發(fā)生是一個多因素多階段相互作用的過程，細胞增殖與細胞凋亡的失衡是腫瘤發(fā)生的重要機制.生存素基因表達水平與細胞凋亡間存在明顯的負相關［2］.我們發(fā)現(xiàn)初治AL組和復發(fā)AL組中細胞普遍表達生存素基因，比完全緩解組和對照組骨髓細胞的表達明顯增高(P<0.01)，完全緩解組生存素基因的表達與對照組無差異，提示AL中生存素基因的表達可能阻礙了細胞的凋亡，延長了細胞的生存時間，使白血病細胞在體內(nèi)呈蓄積性增加，亦即兒童急性白血病的發(fā)生可能與抑制凋亡基因生存素的高表達有關.生存素基因不僅與腫瘤發(fā)生有關，而且與腫瘤耐藥、腫瘤預后不良也有關［3-6］.我們的實驗結(jié)果顯示，復發(fā)組的生存素基因表達水平明顯高于初治組(P<0.01)；高危組AL患者的生存素基因表達水平明顯高于低危組AL患者，差異顯著（P<0.05）；在臨床療效比較中生存素高表達者臨床完全緩解率低于低表達者.提示生存素基因可能是兒童AL的一個高危因素，高表達生存素基因者易復發(fā)，臨床預后差，說明生存素異常表達影響腫瘤細胞臨床藥物的耐受.Takeno等［7］認為細胞周期素B1是食管癌預后不良的指標.馬衛(wèi)東等［8］發(fā)現(xiàn)細胞周期素B1高表達者的無病生存率高于正常表達者，說明細胞周期素B1高表達對患者預后有積極意義，可作為預后較好的標志.本研究表明AL細胞普遍表達細胞周期素B1基因，比完全緩解組和對照組骨髓細胞的表達明顯增高(P<0.01)，完全緩解組的表達與對照組無差異，復發(fā)組表達水平與初治組之間、高危組與低危組之間均無顯著差異(P>0.05).提示兒童急性白血病的發(fā)生可能與細胞周期素B1表達有關.

【參考文獻】

［1］劉江偉,李開宗,竇科峰,等.胰腺癌組織survivin和COX2表達的相關性［J］.第四軍醫(yī)大學學報,2004,25(7):635-636.

［2］MorinagaS,NakamuraY,IshiwaN,etal.ExpressionofsurvivinmRNAassociateswithapoptosis,proliferationandhistologicallyaggressivefeaturesinhepatocellularcarcinoma［J］.OncolRep,2004，12(6):1189-1194.

［3］ChakravartiA,ZhaiGG,ZhangM,etal.Survivinenhancesradiationresistanceinprimaryhumanglioblastomacellsviacaspaseindependentmechanisms［J］.Oncogene,2004，23(45):7494-7506.

［4］KamiK,DoiR,KoizumiM,etal.Survivinexpressionisaprognosticmarkerinpancreaticcancerpatients［J］.Surgery,2004，136(2):443-448.

［5］ZhangM,MukherjeeN,BermudezRS,etal.Adenovirusmediatedinhibitionofsurvivinexpressionsensitizeshumanprostatecancercellstopaclitaxelinvitroandinvivo［J］.Prostate,2005，64(3):293-302.

［6］KennedySM,ODriscollL,PurcellR,etal.Prognosticimportanceofsurvivininbreastcancer［J］.BrJCancer,2003，88(7):1077-1083.

［7］TakenoS，NoguchiT，KikuchiR，etal.PrognosticvalueofcyclinB1inpatientswithesophagealsquamouscellcarcinoma［J］．Cancer,2002，94(11)：2874-2881.

［8］馬衛(wèi)東,徐世榮,郭曉楠,等.急性白血病患者細胞周期蛋白B1表達的臨床意義［J］.中華血液雜志，2003，24（10）：523-526.