導(dǎo)語：靶向血管緊張素Ⅱ受體基因的短發(fā)夾RNA的功能比較一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【關(guān)鍵詞】RNA干擾；高血壓；血管緊張素Ⅱ受體；載體

GenesilencingtargetedtotheratAT1receptorsbyefficientshRNAsanditsscreening

【Abstract】AIM:ToinvestigatetheefficacyofshorthairpinRNAs(shRNAs)tomodulatetheexpressionofratangiotensinⅡtype1(AT1)receptorgeneinmammaliancellsandtoexplorethecorrelationsbetweenthefeaturesofefficientshRNAsandshRNAsfunctionality.METHODS:Wegenerated4shRNAsexpressionvectorstargetingagainstratangiotensinⅡreceptors.TheshRNAsweretargetedto4differentregionsofthesamegene.TheratC6gliomacellsweretransfectedwithconstructedpGenesil1shRNAplasmidandscrambledplasmid.TheculturedcellswerecollectedatdifferentphasesforRTPCRandWesternblotanalyses.RESULTS:24hlater,nosignificantreductioninAT1mRNAlevelsatalltreatedgroupscouldbedetected.48hlater,AT1mRNAlevelofPbtreatedgroupdropedto(55.7±7.6)%ofthatincontrolgroup,andreachedtheirlowestpointafter72h(43.7±8.2)%.NosignificantinhibitionofAT1receptormRNAexpressionwasfoundinothergroups(P＞0.05).TheAT1mRNAandproteinlevelsbehavedultimatelysimilarly.Athour24and48,theAT1proteinwas(46.9±4.2)%and(37.0±3.7)%respectivelycomparedtocontrolandamaximumreductionwasobservedafter72hincubation［(28.1±4.0%comparedtocontrols)］.CONCLUSION:Besidessomegeneralrules,webelievethattheloopstructureinthemRNAattheregiontargetedbysiRNAandthebetteraccessibilityofthesiRNAtotargetedmRNAdohaveastrongeffectonsilencing.

【Keywords】RNAi;hypertension;angiotensinⅡreceptor;vector

【摘要】目的：研究哺乳動物細(xì)胞中shRNA調(diào)節(jié)大鼠血管緊張素Ⅱ1型受體基因表達(dá)的有效性并探索有效shRNA的特征與shRNA功能性之間的關(guān)系.方法：設(shè)計(jì)并構(gòu)建四個靶向大鼠AT1受體基因不同區(qū)域的shRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞，并在不同時相收集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，進(jìn)行RTPCR和Westernblot檢測.結(jié)果：轉(zhuǎn)染24h之后，各處理組均未見AT1mRNA水平有明顯減少.與對照組相比，Pb組在轉(zhuǎn)染后48h血管緊張素Ⅱ受體mRNA基因水平下降到（55.7±7.6）%，72h后達(dá)到最低點(diǎn)（43.7±8.2）%.其它組AT1受體mRNA表達(dá)無明顯抑制(P＞0.05).抑制大鼠血管緊張素Ⅱ受體mRNA基因及其蛋白的結(jié)果類似.與對照組相比，Pb組血管緊張素Ⅱ受體蛋白在24h和48h分別減少至（46.9±4.2）%和（37.0±3.7）%，最大減少在轉(zhuǎn)染后72h（28.1±4.0）%.結(jié)論：選擇有效的shRNA序列時，除了一般的原則之外，靶位mRNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)及siRNA是否能到達(dá)靶位對基因干擾實(shí)驗(yàn)?zāi)芊癯晒哂兄匾饔?

【關(guān)鍵詞】RNA干擾；高血壓；血管緊張素Ⅱ受體；載體

基因干擾（RNAinterference）可以特異性地靶向降解目的基因mRNA，從而使組織或細(xì)胞中的靶基因表達(dá)減少或沉默［1］.在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用RNAi技術(shù)，擬靶向降解大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞中的血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1R）的mRNA，選取并合成了多條編碼大鼠AT1RmRNA的短發(fā)夾rna（shRNA）的核苷酸單鏈，退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)并將其克隆進(jìn)入質(zhì)粒載體，在構(gòu)建完成四條編碼AT1RshRNA的表達(dá)載體之后，轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞.根據(jù)不同核苷酸序列shRNA質(zhì)粒在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的功能表達(dá)，研究核苷酸序列及堿基不同的shRNA其靶向沉默大鼠AT1R的作用差別，探索篩選有效shRNA的原則.

1材料和方法

1．1材料載體pGenesil1質(zhì)粒購自武漢市晶賽生物工程技術(shù)有限公司，限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ，HindⅢ，SalⅠ，PstⅠ購自大連寶生物工程有限公司;T4DNA連接酶及緩沖液購自NewEnglandBiolabs公司;大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株C6細(xì)胞購自中國典型物保藏中心;細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM購自Hyclone公司;轉(zhuǎn)染試劑Metafectamine購自德國Biotex公司.所有的DNA合成及引物合成服務(wù)均由上海博亞生物技術(shù)有限公司提供.

1．2方法

1．2．1靶基因AT1RmRNA的shRNA的構(gòu)建在GenBank上選取大鼠AT1R的基因序列（序列號NM_030985），利用網(wǎng)上設(shè)計(jì)軟件siRNATargetFinder，選取siRNA以堿基TT結(jié)尾、長度為21個核苷酸的序列，并且GC含量最大不超過60%，剔除含有連續(xù)四個或四個以上的A或T堿基的核苷序列，并通過BLAST驗(yàn)證的靶基因核苷酸序列四條，化學(xué)合成編碼shRNA序列的DNA前向和反向序列單鏈如下：靶基因核苷酸序列同時設(shè)計(jì)一對非特異性序列作為陽性對照.將合成的shRNA序列退火，與線性化的pGenesil1質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化并提陽性克隆，PstⅠ和SalⅠ酶切和測序鑒定證實(shí).以上不同的靶基因序列質(zhì)粒分別稱為pGenesilA（Pa），pGenesilB（Pb），pGenesilC（Pc）和pGenesilD（Pd）質(zhì)粒.

1．2．2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染按2×108/L密度以相同的細(xì)胞數(shù)接種培養(yǎng)板，過夜至細(xì)胞鋪滿50%～60%.用Metafectamine轉(zhuǎn)染細(xì)胞，按1∶6的比例，根據(jù)試劑提供商的轉(zhuǎn)染方案進(jìn)行轉(zhuǎn)染.

1．2．3RTPCRAT1基因引物序列為：5′TGTTCCCTTTCCTTATCATTCT3′,5′CTTTGCTTGGTTACT

CCTTCA3′，內(nèi)參GAPDH的引物序列為：5′TTCAACGGCACAGTCAAGG3′,5′TTAGTGGGGTCT

CGCTCC3′.反應(yīng)體積25μL包括5μLcDNA，各引物0.25μL，1.5μLMgCl2，0.25μLTaqDNA聚合酶，0.5μLdNTP混合物和5μL10×緩沖液.反應(yīng)條件:在94℃退火3min之后，94℃15s，55℃15s，72℃15s進(jìn)行30個循環(huán).畢后，產(chǎn)物上瓊脂糖凝膠電泳.

1．2．4WesternBlot分析轉(zhuǎn)染pGensilAT1shRNA質(zhì)粒和對照質(zhì)粒之后，不同時相收獲C6細(xì)胞.PBS液洗滌后，上樣緩沖液溶解細(xì)胞.煮沸溶解液10min后，離心，取上清，棄沉淀物.確定蛋白濃度.電泳分離細(xì)胞溶解液，轉(zhuǎn)膜.50g/L脫脂奶封閉后，加入抗AT1抗體（1∶1000）和抗βactin抗體（1∶1500）室溫下孵育1.5h，再加入二抗（抗兔HRP抗體）孵育，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光顯色.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：根據(jù)RTPCR和WesternBlot分析結(jié)果，用圖像處理軟件ImageTool3.0測灰度值，并與內(nèi)參照相比得相對值.用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件onewayANOVA進(jìn)行組間方差分析.顯著性水平為P＜0.05.

2結(jié)果

2．1不同shRNA表達(dá)質(zhì)粒靶點(diǎn)及二級結(jié)構(gòu)我們選擇大鼠血管緊張素Ⅱ受體基因mRNA序列的部分序列,即556~575bp，469~488bp，595~614bp，663~682bp,做為基因沉默靶位（圖1）.構(gòu)建了四條堿基序列不同的pGenesilAT1shRNA質(zhì)粒，預(yù)計(jì)產(chǎn)生的短發(fā)夾RNA如圖2所示.

除在3′端缺乏兩個連續(xù)的胸苷之外，AT1shRNA的正義鏈與大鼠AT1基因的mRNA序列的靶位基因序列是相同，反義鏈與靶序列互補(bǔ).其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA，預(yù)計(jì)可以折疊成短發(fā)夾siRNA.所轉(zhuǎn)錄出的shRNA在理論上應(yīng)可裂解靶基因mRNA，而經(jīng)重新洗牌的對照質(zhì)粒所轉(zhuǎn)錄出的shRNA則不應(yīng)對AT1受體基因產(chǎn)生有效的基因沉默效應(yīng).

2．2AT1shRNA轉(zhuǎn)染后AT1mRNA水平和蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)染四組陽性質(zhì)粒24h后，各組AT1mRNA水平無明顯減少.在48h后與對照組相比，轉(zhuǎn)染Pb質(zhì)粒組的AT1mRNA表達(dá)水平下降到（55.7±7.6）%，72h下降到最低點(diǎn)［僅為對照組的（43.7±8.2）%］.轉(zhuǎn)染重新洗牌的siRNA大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞其AT1受體mRNA表達(dá)水平無明顯抑制(P>0.05).結(jié)果提示，Pb質(zhì)粒明顯抑制了AT1受體mRNA基因的表達(dá)，其它三組質(zhì)粒抑制AT1受體mRNA基因作用不顯著（圖3，4）.將抑制AT1受體mRNA有效的Pb質(zhì)粒進(jìn)行WesternBlot分析.在24h和48h，AT1蛋白的表達(dá)分別為（46.9±4.2）%和（37.0±3.7）%.與對照組相比，表達(dá)減少的最大時相在轉(zhuǎn)染后的72h［僅為對照組的（28.1±4.0）%］.結(jié)果表明，Pb質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，AT1蛋白水平下降.而轉(zhuǎn)染重新洗牌的shRNA質(zhì)粒和對照組則并不能減少AT1基因的表達(dá)（圖5）.所有的結(jié)果清楚表明，轉(zhuǎn)染Pb質(zhì)粒能夠抑制AT1基因的表達(dá).

3討論

腎素血管緊張素系統(tǒng)其主要的效應(yīng)分子血管緊張素Ⅱ具有調(diào)節(jié)血壓、水鈉平衡、神經(jīng)功能等作用.研究證實(shí)，血管緊張素Ⅱ參與了動脈硬化、心肌梗塞、血管和心肌重塑以及充血性心力衰竭的病理生理過程.血管緊張素Ⅱ通過直接激活A(yù)T1R并間接刺激一些生長因子和細(xì)胞因子的釋放，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞,血管細(xì)胞肥厚和增生［2］.同時也可刺激AT2，激活與AT1相反的生物學(xué)效應(yīng)而導(dǎo)致血管擴(kuò)張、緩激肽生成增加、抑制纖維化和血管重塑［3］.本研究構(gòu)建AT1短發(fā)夾RNA表達(dá)質(zhì)粒，試圖用基因沉默技術(shù)抑制哺乳動物細(xì)胞的AT1mRNA的表達(dá)，希望在阻滯AT1受體之后，通過血管緊張素Ⅱ?qū)T2的作用，達(dá)到血管擴(kuò)張，降低血壓、抑制血管重塑等目的［4］.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我們觀測到AT1基因mRNA的表達(dá)在早期即有減少，而隨著mRNA水平的抑制，相應(yīng)的蛋白也有所減少.結(jié)果表明，U6啟動子驅(qū)動的shRNA序列可有效地和特異地抑制AT1基因在轉(zhuǎn)染的C6細(xì)胞中的表達(dá).因此，通過shRNA的表達(dá)，在細(xì)胞中抑制與高血壓病理生理相關(guān)的AT1基因的表達(dá)，有可能成為一種有效的治療方法.

目前尚無選擇siRNA序列的共識性意見或標(biāo)準(zhǔn)［5］.為了優(yōu)化siRNA誘導(dǎo)的基因沉默效率，許多研究小組對寡核苷酸長度、二級結(jié)構(gòu)及siRNA雙鏈的序列特異性進(jìn)行了研究.普遍認(rèn)為［6］，siRNA序列應(yīng)在靶基因起始密碼子下游100個堿基之后進(jìn)行選擇，應(yīng)避開起始密碼子的5′或3′端非編碼區(qū)選擇siRNA序列.選擇的正義鏈序列應(yīng)是AA（N19）TT，其中N代表任何核苷酸，即選擇的siRNA應(yīng)該有兩個尿嘧啶核苷的3′突出末端.并且所選的siRNA的長度應(yīng)是21個核苷酸.決定RNA干擾研究成功與否的因素還有很多，包括靶位在mRNA三級結(jié)構(gòu)中的位置、轉(zhuǎn)染效率以及雙鏈shRNA的特異性等［7-8］.在比較本實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)的四條質(zhì)粒時我們注意到，其中Pc和Pd的靶向裂解部位均位于靶基因mRNA二級結(jié)構(gòu)中的核心位置尤其以Pd明顯，這可能是質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的短發(fā)夾RNA在與RISC(RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合物)結(jié)合后無法進(jìn)入靶mRNA裂解部位而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗的原因之一.而Pa和Pb的靶向裂解部位位于靶基因mRNA二級結(jié)構(gòu)中的表面位置，但質(zhì)粒Pa也無效，分析可能的原因：①質(zhì)粒Pa的GC含量偏低可以導(dǎo)致對靶基因mRNA的識別效率的減少;②與RISC雜交效率的下降.除此之外，我們還發(fā)現(xiàn)Pb質(zhì)粒裂解靶基因的局部二級結(jié)構(gòu)比質(zhì)粒Pa裂解的部位更松散一些，也就是前者靶位中的氫鍵相對弱于后者的靶位.在這些影響因素中，我們認(rèn)為最重要的因素是siRNA能否進(jìn)入靶位，而靶位中mRNA的結(jié)構(gòu)是否足夠松散，允許siRNA與RISC復(fù)合體進(jìn)行靶向裂解.

總之，在進(jìn)行短發(fā)夾RNA設(shè)計(jì)時，除了要遵循如靶序列應(yīng)位于開放閱讀框，而不能選擇非編碼區(qū)；GC含量應(yīng)在50%左右；避開起始密碼子后至少100個堿基；搜索5′AA（N19）序列并進(jìn)行BLAST等一些普遍的規(guī)則［9］之外，我們認(rèn)為siRNA能否進(jìn)入靶裂解部位并且靶位的二級結(jié)構(gòu)是否松散是有效shRNA合理設(shè)計(jì)并取得實(shí)驗(yàn)成功的最重要的因素.

【參考文獻(xiàn)】

［1］FireA,XuS,MontgomeryMK,etal.PotentandspecificgeneticinterferencebydoublestrandedRNAinCaenorhabditiselegans［J］.Nature,1998,391（6669）:806-811.

［2］DinhDT,FraumanAG,JohnstonCI,etal.Angiotensinreceptors:Distribution,signalingandfunction［J］.ClinSci(Lond)，2001,100(5):481-492.

［3］LevyBI.CanAngiotensinIIType2receptorshavedeleteriouseffectsincardiovasculardisease?Implicationsfortherapeuticblockadeofthereninangiotensinsystem［J］.Circulation,2004,109(1):8-13.

［4］EslerM.Thesympatheticsystemandhypertension［J］.AmJHypertensSuppl,2000,13(6):99S-105S.

［5］WadhwaR,KaulSC,MiyagishiM,etal.KnowhowofRNAinterferenceanditsapplicationsinresearchandtherapy［J］.MutatRes,2004,567(1):71-84.

［6］MiyagishiM,HayashiM,parisonofthesuppressiveeffectsofantisenseoligonucleotideandsiRNAsdirectedagainstthesametargetsinmammaliancells［J］.AntisenseNucleicAcidDrugDev,2003,13(1):1-7.

［7］MiyagishiM,TairaK.DevelopmentandapplicationofsiRNAexpressionvector［J］.NucleicAcidsResSuppl,2002,(2):113-114.

［8］HamadaM,OhtsukaT,KawaidaR,etal.EffectsonRNAinterferenceingeneexpression(RNAi)inculturedmammaliancellsofmismatchesandtheintroductionofchemicalmodificationsatthe30endsofsiRNAs［J］.AntisenseNucleicAcidDrugDev,2002,12(5):301-309.

［9］ElbashirSM,HarborthJ,WeberK,etal.AnalysisofgenefunctioninsomaticmammaliancellsusingsmallinterferingRNAs［J］.Methods,2002,26(2):199-213.