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【關(guān)鍵詞】抑制性消減雜交技術(shù)；哮喘；嗜酸細(xì)胞；細(xì)胞支架蛋白質(zhì)類

Differentiallyexpressionofgenesassociatedwithcytoskeletalremodelingofperipheralbloodeosinophilsduringasthmaticattack

【Abstract】AIM:Todeterminethedifferentiallyexpressedgenesassociatedwithcytoskeletalremodelingofperipheralbloodeosinophils(EOS)inpatientsduringasthmaticattack.METHODS:DoublestrandedcDNAwasamplifiedfromtotalRNAofEOSatthetimeofasthmaticattackandafterimprovementrespectivelybySuperSMARTcDNASynthesistechology,Suppressionsubtractivehybridization(SSH)andPCRselectdifferentialscreeningtechnologywereusedtodetectdifferentiallyexpressedgenesandthendifferentiallyexpressedgenesweresequenced.HomologyanalysiswasconductedbycomparingthesegenesequencesbasedonGenBankdatabase.RESULTS:HighefficientlyupregulatedanddownregulatedsubtractivecDNAlibrarieswereconstructedsuccessfully;differentialscreeningandhomologyanalysisidentified6differentiallyexpressedgenesassociatedwithcytoskeletalremodeling,includingslingshot2L(SSH2L),PP1catalyticsubunit,betaisoform(PP1Cβ),dedicatorofcytokinesis8(DOCK8),Homosapiensproteintyrosinephosphatasenonreceptortype6and12(PTPN6,PTPN12),myosinregulatorylightchaininteractingprotein(MIR).CONCLUSION:Thedifferentiallyexpressedgenesassociatedwithcytoskeletalremodelingmayparticipateinexacerbationofasthma.Furtherstudyonthegenesfunctionmayprovidenewgenetargetforasthmatreatment.

【Keywords】suppressionsubtractivehybridization;asthma;eosinophils;cytoskeletalproteins

【摘要】目的：研究外周血嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)在哮喘發(fā)作時(shí)與細(xì)胞骨架相關(guān)基因的差異表達(dá).方法：應(yīng)用SuperSMARTcDNAsynthesis技術(shù)從總RNA合成足量的雙鏈cDNA.經(jīng)液相雜交消減兩組共同序列，以抑制性PCR方式擴(kuò)增差異表達(dá)序列.構(gòu)建上調(diào)與下調(diào)cDNA文庫，菌落PCR擴(kuò)增差異片段，應(yīng)用差異篩選技術(shù)進(jìn)一步鑒定差異表達(dá)基因并測序，結(jié)果通過核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比較.結(jié)果：構(gòu)建了高效的上調(diào)與下調(diào)消減cDNA文庫，經(jīng)鑒定及同源性分析有6個(gè)與細(xì)胞骨架重建有關(guān)，包括上調(diào)基因slingshot磷酸酶(SSH2L)，蛋白磷酸酶1β亞型(PP1Cβ)，無功能糖基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白(DOCK8)，蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型6(PTPN6)與非受體型12(PTPN12)；下調(diào)基因，肌凝蛋白調(diào)節(jié)輕鏈結(jié)合蛋白(MIR).結(jié)論：這些骨架重建相關(guān)基因的差異表達(dá)可能參與了哮喘發(fā)作，進(jìn)一步進(jìn)行功能研究可能為哮喘治療提供新的作用靶點(diǎn).

【關(guān)鍵詞】抑制性消減雜交技術(shù)；哮喘；嗜酸細(xì)胞；細(xì)胞支架蛋白質(zhì)類

0引言

哮喘是一種復(fù)雜的多基因遺傳病，病理上是以伴隨淋巴細(xì)胞與嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophils,EOS）浸潤為主的慢性炎癥性疾病.有證據(jù)表明外周血EOS數(shù)目與哮喘的癥狀，一秒用力呼氣量（Forcedexpiratoryvolumeinonesecond,FEV1）及氣道反應(yīng)性相關(guān)，尤其在持續(xù)性及重癥哮喘，外周血EOS增多與持續(xù)性氣流阻塞顯著、獨(dú)立相關(guān)［1-2］.細(xì)胞骨架重建在細(xì)胞黏附，伸展，運(yùn)動(dòng)及細(xì)胞內(nèi)眾多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控等過程中發(fā)揮重要作用［3］.哮喘患者外周血EOS已經(jīng)被激活或活化，但其真正分子機(jī)制遠(yuǎn)未清楚，因此我們利用SSH技術(shù)研究哮喘患者在發(fā)作與緩解時(shí)外周血EOS與細(xì)胞骨架重建相關(guān)基因差異表達(dá)，探索其調(diào)控分子本質(zhì)，為哮喘診治提供幫助.

1材料和方法

1.1材料分離哮喘患者外周血EOS的Percoll試劑購自瑞典AmershamPharmacia公司；Trizol總RNA分離試劑購自美國Invitrogen公司；SuperSMARTcDNAsynthesis試劑盒及Chromaspin1000depc水純化柱購自美國Clontech公司.DIG標(biāo)記和檢測試劑為Roche公司DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitI；構(gòu)建文庫的cDNA來自哮喘患者治療前與緩解時(shí)外周血EOS總RNA經(jīng)SuperSMARTcDNAsynthesis技術(shù)合成［4］.

1.2方法

1.2.1抑制性消減雜交以治療前后EOScDNA互為檢測子(Tester)和驅(qū)動(dòng)子(Driver).取純化Tester及Driver的雙鏈cDNA各2μg，分別用限制性內(nèi)切酶RsaⅠ37℃酶切1.5h，酶切完全后鑒定酶切效率.SSH其他過程按照SSH試劑盒說明及參考文獻(xiàn)［5］進(jìn)行.

1.2.2差異基因片段分離將第二次PCR產(chǎn)物純化并定量，混合1μL(100ng)及3μL(155ng)純化后的PCR產(chǎn)物及1μLPBSTT載體(50mg/L)，在1μLT4DNA連接酶作用下，12℃連接16h.取2μL連接質(zhì)粒與50μL感受態(tài)細(xì)胞DH5α混勻，用Cacl2將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌.取100μL轉(zhuǎn)化菌液均勻涂布于Xgal,IPTG的氨芐青酶素瓊脂培養(yǎng)板上，37℃過夜培養(yǎng).隨機(jī)挑取100株白斑菌落接種于含100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，置37培養(yǎng)箱中，250r/min振搖過夜，重復(fù)實(shí)驗(yàn)直至獲得250株轉(zhuǎn)化菌.

1.2.3目的基因片段的獲取轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)一步分別以接頭1和接頭2R的內(nèi)、外側(cè)序列為引物，進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，參數(shù)：94℃30s,68℃30s,72℃2min,20循環(huán)后電泳分析.

1.2.4差異篩選鑒定差異表達(dá)基因采用PCRselect差異篩選技術(shù)對(duì)目的片段進(jìn)行雜交鑒定.實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitI試劑盒說明書進(jìn)行.

1.2.5測序及同源性分析進(jìn)一步用巢式PCR確認(rèn)質(zhì)粒內(nèi)差異片段，然后純化質(zhì)粒，測序由上海博亞公司協(xié)助完成，編碼序列提交美國國立醫(yī)學(xué)圖書館GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比較.

2結(jié)果

2.1酶切及連接效率酶切后經(jīng)1.5g/L瓊脂糖/EB凝膠電泳分析，表現(xiàn)為平均大小在0.1~2.0kb之間的條帶，說明cDNA酶切較完全.接頭序列引物與G3PDH3’引物擴(kuò)增產(chǎn)物的灰度值較G3PDH5’,3’引物所得產(chǎn)物的灰度值比值大于50%，說明連接效率較高.

2.2消減雜交效率用G3PDH基因特異性引物分別擴(kuò)增兩次消減雜交前后的cDNA產(chǎn)物(圖1)，經(jīng)消減雜交的cDNA33循環(huán)可見擴(kuò)增產(chǎn)物，而未消減在18循環(huán)就可見，說明雜交效率較高.

2.3目的基因片段的電泳以轉(zhuǎn)化菌株重組質(zhì)粒為模板行PCR擴(kuò)增目的基因片段，結(jié)果采用1.5g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，顯示目的基因片段分子質(zhì)量分布范圍均在200~800bp，250個(gè)菌株擴(kuò)增獲得陽性目的基因片段228個(gè)，陽性率達(dá)91.2%.

M:1000bpDNAMarker；1,5:18循環(huán)；2,6:23循環(huán)；3,7:28循環(huán)；4,8:33循環(huán).

圖1消減雜交效率分析（略）

M:1000bpDNAMarker；1,5:18循環(huán)；2,6:23循環(huán)；3,7:28循環(huán)；4,8:33循環(huán).

圖2目的基因片段的電泳分析（略）

2.4序列分析及同源性對(duì)確定的12個(gè)陽性克隆測序后，通過BLAST進(jìn)行同源性比較，經(jīng)查閱文獻(xiàn)共確定6個(gè)與細(xì)胞骨架重建相關(guān)的基因，分別為上調(diào)基因SSH2L,PPP1Cβ,DOCK8,PTPN6及PTPN12；下調(diào)基因MIR(表1).

表1哮喘治療前后EOS差異cDNA克隆同源性比較（略）

P:上調(diào)表達(dá)基因；R:下調(diào)表達(dá)基因.

2.5消減cDNA文庫的篩選采用PCRselect差異篩選技術(shù)對(duì)72個(gè)目的基因(包括45個(gè)上調(diào)表達(dá)克隆與27個(gè)下調(diào)表達(dá)克隆)進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，根據(jù)Clontech公司提供的參考標(biāo)準(zhǔn)確定真正差異表達(dá)克隆.

3討論

哮喘的發(fā)作和分子病理學(xué)過程是由于多種類型細(xì)胞特異性基因的表達(dá)變化決定的，對(duì)常見疾病哮喘進(jìn)行基因表達(dá)的分析，可幫助尋找疾病診斷與療效判斷的分子靶點(diǎn).本研究應(yīng)用SuperSMARTcDNAsynthesis技術(shù)與SSH技術(shù)，經(jīng)測序、同源性比對(duì)及文獻(xiàn)查詢，初步證實(shí)了6條在哮喘發(fā)作期與EOS細(xì)胞骨架重建相關(guān)基因差異表達(dá).

細(xì)胞骨架在物質(zhì)運(yùn)輸、白細(xì)胞的遷移及基因表達(dá)等方面起著重要作用.肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白(ADP/confilins)家族是影響肌絲重建的關(guān)鍵因素.高度活化的cofilins促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生片足及可決定細(xì)胞運(yùn)動(dòng)方向［6］.EOS從外周血向肺組織遷移是過敏性哮喘的重要特點(diǎn)，EOS遷移也依賴于細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié).

我們的初步研究結(jié)果提示：

①上調(diào)基因SSH2L屬于酪氨酸磷酸酶亞類之一，SSH在cofilins去磷酸化上發(fā)揮關(guān)鍵作用［7］.本研究SSH2L在EOS表達(dá)升高，可加快EOS內(nèi)肌動(dòng)蛋白快速組裝，促進(jìn)細(xì)胞遷移，趨化，跨膜運(yùn)動(dòng)，可能是EOS內(nèi)重要的分子調(diào)控機(jī)制.

②下調(diào)基因MIR可以被多種因素所調(diào)節(jié)，MIR可以通過泛素化作用降低肌球蛋白輕鏈(myosinlightchain,MLC)功能，其在EOS表達(dá)的下調(diào)可能使其抑制肌球蛋白功能作用下降，從而促進(jìn)馬達(dá)蛋白活性，可能參與EOS的趨化調(diào)節(jié).

③蛋白磷酸酶1(PP1)參與調(diào)控糖代謝，基因表達(dá)，細(xì)胞分化等.果蠅PP1β可以調(diào)節(jié)非肌細(xì)胞肌球蛋白，如果缺失PP1β功能會(huì)導(dǎo)致MLC磷酸化水平升高及肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)破壞［8］.PP1β在EOS表達(dá)的增高可能通過cofilin，肌球蛋白及微管等途徑引起細(xì)胞骨架重建.

④DOCk8是一種潛在的鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF),GEF可以激活某些小分子鳥苷三磷酸酶.DOCK8參與細(xì)胞內(nèi)具體作用機(jī)制尚不清楚，可能通過介導(dǎo)Rho激酶家族某一成員參與協(xié)調(diào)細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng).

⑤蛋白酪氨酸磷酸酶（proteintyrosinephosphatase,PTPase）是一個(gè)多基因家族，主要分為受體和非受體樣PTPase兩類，PTPase參與多種激素（如胰島素等）介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖和促進(jìn)MHCI類抗原表達(dá).PTPN6屬于PTPase家族成員之一，主要在血細(xì)胞發(fā)育，增生及受體介導(dǎo)的絲裂原信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用.

⑥PTPN12也是PTPase家族成員之一，PTPN12可以參與蛋白與蛋白相互作用，與細(xì)胞內(nèi)蛋白半衰期有關(guān)，可以去磷酸化眾多細(xì)胞骨架蛋白及細(xì)胞粘附分子，參與控制細(xì)胞的形態(tài)及運(yùn)動(dòng)［9］.

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