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篇1

【關(guān)鍵詞】 黑色素瘤抗原；MAGE-A9；RT-PCR；基因克隆；基因表達(dá)

Construction of MAGE-A9 gene prokaryotic expression system and its expression in hepatocellular carcinoma

XU Lu，ZHU Jin，QIU Zhen-ning, et al. Department of Pathology, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China

【Abstract】

Objective Its to clone human MAGE-A9 cDNA ，to express its recombinant protein in E. coli and to examine the expression of MAGE-A9 in hepatocellular carcinoma specimens.Methods The cDNA encoding human MAGE-A9 gene was amplified by RT-PCR from human hepatocelluar carcinoma tissue before the MAGE-A9 gene was inserted into plasmids pMD18-T. After sequencing, the MAGE-A9 was cloned into the prokaryotic expression vector pBAD/gIII to construct the recombinant expression vector pBAD/gIII-MAGE-A9 and was transformed into E. coli TOP10．The recombinant MAGE-A9 protein was expressed under induction of L-Arabinose and was purified through Hitrap column. The anti-MAGE-A9 monoclonal antibody was generated. The expression of MAGE-A9 in hepatocellular carcinoma specimens was examined through ABC assay.Results The sequence of MAGE-A9 was identical to the sequence from GenBank. By affinity column and SDS-PAGE , the purified MAGE-A9 fusion protein displayed a band of Mr 35 000． Anti-MAGE-A9 monoclonal antibody was procuced. We found that MAGE-A9 expressed in the cytoplast of positive cells and MAGE-A9 antigen was detected on 8 cases out of 39 (21%) hepatocellular carcinoma specimens.Conclusion MAGE-A9 antigen was expressed in a fair proportion of hepatocellular carcinoma specimens , these patients might be suitable candidates for immune involving antigen encoded by MAGE-A9 gene.

【Key words】 Melanoma antigen ; MAGE-A9; RT-PCR; Gene cloning; Gene expression

MAGE-A（melanoma antigen A）基因是首先從黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)的一組腫瘤相關(guān)抗原，這類抗原在正常組織中除和胎盤組織外均不表達(dá),但在某些惡性腫瘤組織高度特異性表達(dá),同時(shí)它們經(jīng)MHC-Ⅰ類分子遞呈到細(xì)胞表面后,可為自體細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL) 識(shí)別［1］,因

而是一種CTL介導(dǎo)的特異性免疫治療的理想靶分

子［2］。迄今已知MAGE-A基因家族成員達(dá)12個(gè)，各成員間的同源性較高。而肝細(xì)胞癌在我國發(fā)病率高，臨床療效及預(yù)后均很不理想，近來針對(duì)肝細(xì)胞癌的免疫治療成為研究熱點(diǎn)。

MAGE-1A9 cDNA 全長945 bp,編碼分子量約35 Kd的蛋白產(chǎn)物。本文通過克隆、表達(dá)肝細(xì)胞癌MAGE-A9基因，制備抗MAGE-A9的單克隆抗體，觀察MAGE-A9基因在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及定位，為進(jìn)一步進(jìn)行MAGE-A9基因的功能研究及肝細(xì)胞癌的免疫治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 材料 6～8周齡雌性BALB/c小鼠，購自南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。肝細(xì)胞癌手術(shù)切除新鮮標(biāo)本1例，取自江蘇省腫瘤醫(yī)院住院患者，液氮保存。肝細(xì)胞癌蠟塊標(biāo)本39例，其中38例取自南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，1例取自江蘇省腫瘤醫(yī)院病理科，男性共36例，女性3例，年齡31～74歲。大腸桿菌菌株TG1及Top10由本實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒pMD18-T購自大連寶生物公司，pBAD/gIII 載體購自美國Invitrogen公司。PCR試劑，ExTaq酶，限制性內(nèi)切酶EcoR I、Hind III, T4 DNA連接酶,等購自大連寶生物公司； Hitrap鎳親合柱購自美國Amersham公司； ABC免疫組化試劑盒購自美國Vector公司。

1．2 方法

1．2．1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中MAGE-A9基因序列設(shè)計(jì)引物P1：5CACAAGCTTCGGACTCC CTCTTCCTCCTCTCT 3；P2：5CCGGAATTCGAATGT CTCTTGAGCAGAGGAGT 3，分別引入Hind III 和EcoR I酶切位點(diǎn),由北京賽百盛公司合成。

1．2．2 肝癌組織總RNA制備及RT-PCR擴(kuò)增 Trizol一步法提取肝癌組織總RNA，將抽提產(chǎn)物溶于DEPC處理的雙蒸水中，以P1和P2為引物作RT-PCR擴(kuò)增:94 ℃ 4 min預(yù)變性，94 ℃ 50 s變性，58 ℃ 50 s退火，72 ℃ 60 s延伸，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃終末延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1．2．3 MAGE-A9基因的克隆 RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收純化, 將純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行T-A克隆重組, 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TG1,藍(lán)白斑篩選陽性克隆, PCR初步鑒定陽性克隆后,進(jìn)行DNA 序列分析。堿裂解法提取陽性重組體pMD18-T- MAGE-A9質(zhì)粒, 用EcoR I、 Hind III 酶切, 酶切產(chǎn)物與同樣酶切的表達(dá)載體pBAD/gIII用T4 DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TG1,氨芐平板篩選陽性克隆。提取陽性克隆菌質(zhì)粒,以EcoR I、Hind III 酶切, 1％瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定陽性克隆,所得重組質(zhì)粒命名為pBAD/gIII-MAGE-A9。

1．2．4 MAGE-A9基因的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 取1μl質(zhì)粒pBAD/gIII-M9轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Top10, 氨芐平板篩選. 挑取單個(gè)陽性克隆培養(yǎng)至A600 nm=0．5,加入左旋阿拉伯糖(終濃度為0．002%)，于37 ℃

劇烈震蕩誘導(dǎo)表達(dá)4 h后收菌,PBS 重懸,超聲裂解,低溫離心,取上清。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)超聲破碎,離心，上清經(jīng)Hitrap鎳親和柱吸附, 樣品過柱, 以含有0．2、0．3、0．4和0．5 M咪唑的洗脫液依次洗柱，收集純化液, 行12％SDS-PAGE電泳，分析最佳的咪唑洗脫濃度。

1．2．5 單抗制備 常規(guī)雜交瘤法制備單抗。腹腔注射100 μg MAGE-A9蛋白純化產(chǎn)物免疫BALB/c小鼠，對(duì)數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞和免疫小鼠的脾細(xì)胞按常規(guī)PEG方法融合,有限稀釋法克隆細(xì)胞。ELISA法檢測(cè)雜交瘤培養(yǎng)上清,陽性細(xì)胞連續(xù)亞克隆,直至陽性率達(dá)到100%，確定為穩(wěn)定的細(xì)胞株。

1．2．6 免疫組化 肝細(xì)胞癌石蠟切片4～5 μm，常規(guī)乙醇脫蠟至水，0．01%檸檬酸鹽緩沖液微波修復(fù)，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，2%二抗動(dòng)物（馬）血清封閉,以本實(shí)驗(yàn)制備的抗MAGE-A9雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清為一抗，常規(guī)ABC法染色，DAB顯色。以PBS代替一抗作為空白對(duì)照。

2 結(jié)果

2．1 RT-PCR擴(kuò)增MAGE-A9基因 采用RT-PCR從人肝細(xì)胞癌組織中擴(kuò)增目的基因,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,可見大小約945 bp 的條帶，見圖1,與945 bp的MAGE-A9基因目的片段大小一致。

注：1:MAGE-A9;2:DL2 000 Marker

圖1

MAGE-A9基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2．2 MAGE-A9基因克隆載體的構(gòu)建 將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行T-A克隆，獲得pMD18-T-MAGE-A9重組體，見圖2，經(jīng)藍(lán)／白斑篩選和菌液PCR初步鑒定結(jié)果正確。DNA 序列分析表明質(zhì)粒為MAGE-A9基因的克隆,序列與GenBank 報(bào)道序列完全一致。MAGE-A9基因與原核分泌型表達(dá)載體pBAD/gIII經(jīng)EcoR I＋Hind III雙酶切后連接，構(gòu)建MAGE-A9基因的原核分泌型表達(dá)系統(tǒng)pBAD/gIII-MAGE-A9。

注：1: DL15 000 Marker; 2: DL2 000 Marker;3: pMD18-T-MAGE-A9;4: pBAD/gIII-MAGE-A9

圖2

pMD18-T-MAGE-A9及pBAD/gIII-MAGE-A9重組質(zhì)粒酶切鑒定圖譜

2．3 MAGE-A9 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化 菌體經(jīng)左旋阿拉伯糖誘導(dǎo)，冰凍超聲裂解離心后，取上清行SDS-PAGE，結(jié)果見圖3，與空載菌對(duì)比，在分子量約35 Kd的位置有明顯表達(dá)條帶，符合MAGE-A9基因945 bp片段編碼315個(gè)氨基酸的蛋白分子質(zhì)量。用HiTrap鎳親和柱純化帶有(His)6尾的重組蛋白，洗脫液咪唑濃度從0．2～0．5 M，純化液行12％SDS-PAGE電泳。洗脫最佳咪唑濃度為0．4 M。

注：1-4:純化的MAGE-A9（純化咪唑濃度從0．2~0．5 M）；5:Marker；6:空載細(xì)菌；7:誘導(dǎo)表達(dá)的菌體蛋白

圖3

SDS-PAGE 鑒定MAGE-A9蛋白的表達(dá)和純化

2．4 抗MAGE-A9單克隆抗體的制備和鑒定 間接ELISA法檢測(cè)雜交瘤培養(yǎng)上清，經(jīng)3次亞克隆，陽性率達(dá)100%。Western blot法檢測(cè)單抗與MAGE-A9的結(jié)合，結(jié)果 見圖4。

注：1：細(xì)菌空載； 2:MAGE-A9 protein;3: Marker

圖4

Western blotting 鑒定MAGE-A9 單抗

2．5 MAGE-A9在肝癌組織的定位觀察 陽性表達(dá)表現(xiàn)為癌細(xì)胞胞漿被染成棕紅色 見圖5，非癌肝細(xì)胞未著色。39例肝細(xì)胞癌，陽性表達(dá)8例，陰性31例，陽性表達(dá)率為21%。MAGE-A9基因的表達(dá)與部分臨床指標(biāo)的關(guān)系見表1。

注：左圖為陽性癌細(xì)胞胞漿染成棕褐色，右圖為非肝癌細(xì)胞未著色

圖5

肝細(xì)胞癌MAGE-A9基因表達(dá)產(chǎn)物定位觀察。（DAB顯色， 400×）

注：采用u檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P>0．05;MAGE-A9的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小及分化程度無相關(guān)性

3 討論

尋找合適的腫瘤抗原一直是腫瘤免疫治療的難題。自20世紀(jì)50年代以來，科研工作者陸續(xù)在以黑色素瘤為主的多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了一些腫瘤相關(guān)抗原，從而成為腫瘤免疫治療的基礎(chǔ)。應(yīng)用MAGE-A1基因作為疫苗應(yīng)用于腫瘤治療的探索性研究較多:

①用MAGE-A1抗原肽疫苗誘導(dǎo)擴(kuò)增特異性CTL進(jìn)行過繼免疫治療［2］；②用人工合成的MAGE-A1抗原肽脈沖處理樹突狀細(xì)胞(DC)或用MAGE-A1基因修飾的DC制成DC疫苗,對(duì)腫瘤患者進(jìn)行免疫治療［3］。而繼MAGE-A1基因第一個(gè)從黑色素瘤細(xì)胞克隆后,目前已發(fā)現(xiàn)12個(gè)MAGE-A成員并形成一個(gè)家族。由于MAGE-A抗原為許多腫瘤所共有,并具有嚴(yán)格的腫瘤表達(dá)特異性,因此MAGE-A

家族分子被視為腫瘤免疫治療的理想靶點(diǎn)［1］。

MAGE-A9是MAGE-A亞家族成員, 由于MAGE-A家族中的部分基因已成為良好的腫瘤靶基因，同時(shí)MAGE-A家族基因之間有較高的同源性，故MAGE-A9有可能成為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。因此, 對(duì)MAGE-A9基因進(jìn)行克隆、表達(dá),制備特異性單抗，明確其在肝癌中表達(dá)及定位，這不但有助于對(duì)MAGE-A9基因功能的研究，對(duì)肝癌的免疫治療也具有重要意義。

本研究利用RT-PCR 方法,從人肝癌組織中克隆出目的基因全長片段,構(gòu)建了原核表達(dá)載體pBAD/gIII-MAGE-A9，通過細(xì)胞融合技術(shù)，制備了一株抗MAGE-A9分子的單克隆抗體，證實(shí)可與MAGE-A9分子特異性結(jié)合。在以往研究中，由于缺乏特異性單抗，很多腫瘤因子的表達(dá)都是基因水平的研究，關(guān)于MAGE-A9在腫瘤中的表達(dá)研究也不例外［4］，包括MAGE-A9在食管腺癌相關(guān)的Barrett食道中過表達(dá)［5］，在皮膚T細(xì)胞淋巴瘤陽性表達(dá)率27%［6］。但基因與蛋白水平的表達(dá)并不完全一致，更重要的是，腫瘤免疫治療是以抗原的確切定位為基礎(chǔ)的。本文在制備了抗MAGE-A9單克隆抗體的基礎(chǔ)上，應(yīng)用免疫組化技術(shù)，首次證實(shí)MAGE-A9抗原在肝癌癌細(xì)胞中主要表達(dá)在胞漿，未見同一標(biāo)本中部分腫瘤細(xì)胞MAGE-A9抗原陽性而另一部分腫瘤細(xì)胞MAGE-A9 抗原陰性的情況,只是見標(biāo)本中全部腫瘤細(xì)胞MAGE-A9 抗原陽性或全部陰性，這提示,選用MAGE-A9 基因產(chǎn)物作為靶分子對(duì)陽性患者進(jìn)行免疫治療有可能對(duì)全部的腫瘤細(xì)胞都產(chǎn)生殺傷效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，認(rèn)為MAGE-A9在肝癌中的表達(dá)于患者年齡、性別、腫瘤大小和分化程度沒有相關(guān)性，與趙海濤等檢測(cè)MAGE-A10在肝癌中的表達(dá)與臨床病理未見相關(guān)性的結(jié)果相一致［8］。本實(shí)驗(yàn)陽性表達(dá)率為21%（8/39），相比MAGE-A1、MAGE-A10等其他MAGE-A家族抗原在肝癌中超過50%［7，8］的表達(dá)偏低，可能與以下幾方面原因有關(guān)：①以往研究以RT-PCR法檢測(cè)基因表達(dá)居多，而本實(shí)驗(yàn)采用的是免疫組化法，在方法上可能會(huì)存在差異；②肝癌標(biāo)本代表性不足，本實(shí)驗(yàn)標(biāo)本數(shù)量不多，均為肝癌原發(fā)灶標(biāo)本，未涉及肝癌轉(zhuǎn)移灶，且多為中等分化程度的，分化程度較高和較低的肝癌標(biāo)本基本未包括，亦未收集到不伴慢性肝炎的肝細(xì)胞癌標(biāo)本。今后的研究需擴(kuò)大樣本，同時(shí)檢測(cè)MAGE-A9在常用的人肝癌細(xì)胞株（如SMMC-7721、BEL-7402、HepG2等）中的表達(dá)情況。

參考文獻(xiàn)

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篇2

【關(guān)鍵詞】皮膚鱗狀細(xì)胞癌;細(xì)胞周期蛋白;cyclin E;表達(dá)

【中圖分類號(hào)】R739.5 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1006-1959(2009)09-0007-01

2005年2月到2009年4月采用免疫組織化學(xué)法觀察32例皮膚鱗狀細(xì)胞癌中Cyclin E的表達(dá),并進(jìn)行相關(guān)性分析,探討其在皮膚鱗狀細(xì)胞癌是表達(dá)異常的意義及其與皮膚生物學(xué)行為的關(guān)系。

1 臨床資料

1.1 一般資料:皮膚鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本為我院2005年2月到2009年4月經(jīng)病理確診存檔的32例石蠟包埋組織(觀察組),其中男26例,女6例,年齡40-90歲,平均年齡(54.5±12.5)歲。皮損部位:頭面部10例,下唇部1例,軀干部5例,下肢5例,會(huì)10例,足部1例。病理分級(jí)按WHO標(biāo)準(zhǔn),I級(jí)7例,Ⅱ級(jí)15例,Ⅲ級(jí)10例。對(duì)照組為外科手術(shù)中剔除的32例正常皮膚組織。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

1.2.1 試劑及儀器。一抗:鼠抗人Cyclin E單克隆抗體,免疫組織化學(xué)SP試劑盒(生工生物工程公司,武漢)。

1.2.2 染色方法:石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后,經(jīng)高壓鍋熱處理修復(fù)抗原,4% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,蒸餾水洗,10%正常羊血清封閉20min,滴加PBS稀釋的Cyciin E工作液,室溫2h,PBS洗3次,再分別加鼠抗人Cyclin E單克隆抗體及SABC復(fù)合物室溫各孵育30min,兩次孵育后均用PBS洗3次;DAB顯色,蘇木素復(fù)染,中性樹膠封片。

1.3 結(jié)果觀察及判定標(biāo)準(zhǔn):Cyclin E蛋白陽性表達(dá)表現(xiàn)為細(xì)胞核出現(xiàn)棕褐色或棕黃色顆粒。在高倍鏡下取5-8個(gè)視野觀察,計(jì)數(shù)500個(gè)以上細(xì)胞并計(jì)算Cyclin E陽性細(xì)胞百分率,以Cyclin E陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)>5%為Cyclin E蛋白過表達(dá)。Cyclin E蛋白免疫組織化學(xué)結(jié)果均經(jīng)重復(fù)染色一次印證,兩位獨(dú)立觀察者分別觀察計(jì)數(shù)并取均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS15.0程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(x±S>x),若是正態(tài)分布,用方差分析,組間、組內(nèi)比較;若是非正態(tài)分布,用秩和檢驗(yàn)。以P

2 結(jié)果

在對(duì)照組皮膚細(xì)胞核內(nèi)未見陽性表達(dá);在觀察組鱗癌組織中表達(dá)定位于細(xì)胞核,呈棕黃色,陽性染色細(xì)胞散在分布于表皮組織中。Cyclin E在鱗癌組織中陽性表達(dá)較正常人對(duì)照組高,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

3 討論

當(dāng)前細(xì)胞周期中存在幾個(gè)重要關(guān)卡(checkpoint),并受一些細(xì)胞周期蛋白調(diào)控,當(dāng)控制這些關(guān)卡的基因異常表達(dá)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白時(shí),可造成基因組不穩(wěn)或靜止的細(xì)胞越過這些關(guān)卡,引起細(xì)胞周期失控,導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖。 G1向S轉(zhuǎn)變是細(xì)胞周期主要調(diào)控點(diǎn)之一,目前發(fā)現(xiàn)G1期的調(diào)節(jié)因子與癌變關(guān)系最密切。細(xì)胞周期調(diào)控涉及細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CDKI),以CDK的活性表達(dá)與調(diào)控為主。已證實(shí),作為一種細(xì)胞周期正向調(diào)節(jié)因子的細(xì)胞周期蛋白E(Cyclin E)是一種癌基因, Cyclin E的正調(diào)控在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用。Cyclin E表達(dá)在G1晚期達(dá)高峰,是G1/S期轉(zhuǎn)換的限速因子,其過度表達(dá)可加速細(xì)胞進(jìn)入S期,導(dǎo)致細(xì)胞無限制增殖,并進(jìn)一步引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展。CyclinE是1991年美國的研究小組在篩選人cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)的。由4個(gè)外顯子3個(gè)內(nèi)含子組成,轉(zhuǎn)錄2.2 kb的mRNA,編碼395個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),分子質(zhì)量50ku。Cyclin E的合成在G1晚期達(dá)高峰,繼CyclinD后被活化,然后經(jīng)與PEST序列有關(guān)的蛋白水解或泛素路徑降解而迅速下降。因此,CyclinE主要在G1晚期發(fā)揮正性調(diào)控細(xì)胞周期的作用。

Mullerw等研究表明在一大部分早期NSCLC患者中Cyclin E的mRNA水平升高。Geng等研究了87例乳腺癌患者,其中21例有Cyclin E mRNA的高表達(dá),約占24%,雌激素受體陽性及陰性的頻率大致相當(dāng)。一大部分Cyclin E過表達(dá)的人乳腺癌同時(shí)過表達(dá)周期蛋白E mRNA。Payton等發(fā)現(xiàn)肺癌和乳腺癌患者原發(fā)腫瘤Cyclin E的表達(dá)升高。肺神經(jīng)內(nèi)分泌癌Cyclin E2信號(hào)最強(qiáng),其次是乳腺浸潤性導(dǎo)管癌。雌激素受體缺乏的乳腺腫瘤更容易引起Cyclin E升高,提示Cyclin E可能導(dǎo)致乳腺腫瘤發(fā)病機(jī)理的解偶聯(lián)。本組正常皮膚組織cyclin E無表達(dá),皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織cyclin E陽性表達(dá),且在復(fù)發(fā)腫瘤中及隨病理分級(jí)升高而升高。表明在皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的早期,cyclin E陽性表達(dá)逐漸增高,但僅為量變,故其陽性表達(dá)與病理分型、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、顱神經(jīng)侵犯無關(guān);當(dāng)其陽性表達(dá)增至最高點(diǎn),由量變發(fā)生質(zhì)變,細(xì)胞進(jìn)入S期,瘤細(xì)胞進(jìn)入無限增殖期。cyclin E陽性表達(dá)在鼻咽癌患者中的3年生存率差異有顯著性,表明其在判斷鼻咽癌預(yù)后中有參考價(jià)值。

總之,細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制,其中Cyclin E的正調(diào)控在此過程中起關(guān)鍵作用。隨著對(duì)Cyclin E作用機(jī)理的深入研究,將為進(jìn)一步闡明皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制帶來曙光,并為皮膚鱗狀細(xì)胞癌的治療和預(yù)防提供新的靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

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篇3

【關(guān)鍵詞】 IgG； 肝癌； 臨床病理學(xué)指標(biāo)； 原位雜交； 免疫組織化學(xué)

【Abstract】 Objective：To investigate the expression and distribution of IgG in human liver cancer cells and its correlation with clinicopathological factors of hepatocellular carcinoma.Method：Fresh and paraffin-embedded tissues from 60 cases of HCC tumor with the matched normal liver specimens were detected by two-step immunohistochemistry and in situ hybridization for the expression of IgG protein and mRNA respectively. The relationship between cancer-derived IgG expression and 9 clinicopathological factors were analyzed statistically.Result：Signals of IgG protein in hepatocellular carcinoma cancer cells was significantly stronger than that in its corresponding normal tissues （P=0.001）； the over-expression of IgG was negatively correlated with several clinicopathological factors such as tumor differentiation grade and pTNM （r=-0.357，P=0.005；r=-0.296，P=0.021）， and positively associated with AFP concentration in serum （r=0.336，P=0.009）. However， no correlationship with age， gender， capsular infiltration，tumor size， tumor quantity and recurrence or metastasis of the disease within 1 year was found （P>0.05）. Conclusion：Liver-cancer-derived IgG may has a profound impact on the differentiation and pTNM staging of liver cancer cell， and might be served as a tumour marker to help pathological diagnosis and evaluate the prognosis for patients.

【Key words】 IgG； Liver cancer； Clinical pathological factors； In situ hybridization； Immunohistochemistry

First-author’s address：Weifang Medicial University，Weifang 261053，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.18.008

近來多項(xiàng)研究證明，乳腺癌、大腸癌、胃癌和肺癌等源于上皮的惡性腫瘤細(xì)胞可以產(chǎn)生IgG[1-6]。邱曉彥等[4]最早發(fā)現(xiàn)Ig樣蛋白的表達(dá)與惡性腫瘤的分化有關(guān)；依據(jù)腫瘤的分化程度不同，Ig樣蛋白的表達(dá)水平也不同，即分化程度越高，表達(dá)強(qiáng)度越低，并證實(shí)該Ig樣蛋白為IgG；葉雪等[7]發(fā)現(xiàn)在惡性卵巢上皮性癌中IgG的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于正常卵巢，IgG的表達(dá)水平與卵巢癌的臨床分期和病理分級(jí)無相關(guān)性；李浩勇等[6]對(duì)膀胱癌研究發(fā)現(xiàn)：膀胱癌細(xì)胞能夠表達(dá)IgG，其抗體體外對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞的生長具有一定的抑制作用，且具有促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的效應(yīng)；Niu等[8]研究了IgG的表達(dá)與結(jié)直腸癌的生物學(xué)指標(biāo)和臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系，通過siRNA干擾下調(diào)IgG的表達(dá)，可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞（LOVO細(xì)胞）的增殖、克隆形成和侵襲能力，提示腫瘤源性IgG具有促進(jìn)腫瘤生長，轉(zhuǎn)移的作用。肝癌亦屬于上皮性惡性腫瘤，但是目前對(duì)于IgG在肝癌組織中的表達(dá)與分布情況及其與臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系的研究尚未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化技術(shù)和原位雜交技術(shù)檢測(cè)肝癌組織中IgG的表達(dá)情況，進(jìn)而分析其表達(dá)水平和肝細(xì)胞肝癌9項(xiàng)臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系，以期為肝細(xì)胞肝癌的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供新的方法和思路。

1 材料與方法

1.1 材料來源 收集濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和濰坊市民醫(yī)院2010-2012年手術(shù)切除的肝癌標(biāo)本60例，其中男40例，女20例，平均年齡45歲，患者術(shù)前均未采取任何治療措施。所有肝癌病例隨訪12～18個(gè)月。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)濰坊醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得患者的書面許可。所有新鮮標(biāo)本均經(jīng)4%多聚甲醛/PBS固定，石蠟包埋，連續(xù)4 μm厚度切片。

1.2 免疫組化方法 采用PV-9000兩步法（試劑盒購自美國Zymed公司）進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。切片常規(guī)脫蠟，入水，枸櫞酸鹽緩沖液微波抗原修復(fù)，經(jīng)3%過氧化氫37 ℃孵育20 min后，滴加小鼠抗人IgG單克隆抗體（1：1000，購自美國sigma公司），4 ℃濕盒過夜，滴加試劑1（聚合物輔助劑），37 ℃孵育30 min，滴加試劑2（辣根過氧化素）標(biāo)記二抗，37 ℃孵育30 min。各步驟之間均是PBS沖洗3次，每次5 min。AEC顯色，蘇木素復(fù)染，甘油明膠封片。以手術(shù)切除的扁桃體組織作為陽性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 原位雜交方法 切片二甲苯脫蠟，乙醇梯度透明至PBS反復(fù)沖洗，酶消化，經(jīng)預(yù)雜交，滴 50μL含探針的雜交液，45 ℃保溫，20 h。將切片浸泡于5×SSC（37 ℃）中，后依次經(jīng)5%甲酰胺2×SSC（37 ℃）清洗15 min。PBS Buffer Ⅰ漂洗一次后，滴加50 μL馬血清封閉液，置濕暗盒中室溫1 h。后滴加Anti-Dig-Ab（1∶100，購自瑞士roche公司），室溫1 h后BufferⅠ、Ⅱ液依次漂洗數(shù)次，NBT-BCIP顯色。以結(jié)腸黏膜下孤立淋巴結(jié)作為陽性對(duì)照，以IgG正義探針代替反義探針作為陰性對(duì)照。

1.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果評(píng)分 采用雙盲法，由3位病理學(xué)教授在400×的顯微放大倍數(shù)下隨機(jī)對(duì)染色切片獨(dú)立評(píng)分，所得平均分作為最終結(jié)果。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）陽性細(xì)胞數(shù)所占比例：小于5%為0，5%～25%為1，25%～50%為2，大于50%為3；（2）染色強(qiáng)度：未著色為0，淡紅色或粉紅色為1，紅色為2，深紅色為3。兩項(xiàng)測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)得分之和為0～3分的切片標(biāo)記為弱染色，陰性；4～6分的切片標(biāo)記為強(qiáng)染色，陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料比較采用Pearson 字2及Fisher確切概率法檢驗(yàn)分析，評(píng)估IgG的表達(dá)情況與臨床病理學(xué)參數(shù)（年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤個(gè)數(shù)、腫瘤分化程度、AFP濃度、pTNM分期、1年內(nèi)是否復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移）之間的相關(guān)性。以P

2 結(jié)果

2.1 IgG蛋白在肝癌組織的表達(dá)及免疫組化檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示60例肝癌組織的IgG蛋白陽性率為85.00%（51/60），癌周正常肝組織的陽性率為6.67%（4/60），兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。IgG蛋白陽性染色主要定位于肝癌細(xì)胞胞漿和胞膜。

2.2 IgG mRNA在肝癌組織的表達(dá)及原位雜交結(jié)果 IgG mRNA陽性信號(hào)位于肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞胞漿，為藍(lán)紫色，呈顆粒狀，與免疫組化結(jié)果具有良好的一致性，從mRNA水平證實(shí)了肝細(xì)胞肝癌組織自身具有產(chǎn)生IgG的能力。

2.3 IgG在肝癌組織中的表達(dá)和臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系 IgG的異常高表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌分化程度和pTNM分期呈負(fù)相關(guān)（r=-0.357，P=0.005；r=-0.296，P=0.021）；與血漿AFP濃度呈正相關(guān)（r=0.336，P=0.009）；與年齡、性別、腫瘤包膜完整性、腫瘤大小、腫瘤個(gè)數(shù)和一年內(nèi)是否復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移無相關(guān)性（P>0.05），見表1。

3 討論

免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）是體內(nèi)免疫球蛋白家族中含量最高的一種，在機(jī)體抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。經(jīng)典免疫學(xué)理論認(rèn)為IgG僅可由B淋巴細(xì)胞經(jīng)成熟分化過程才能夠特異性合成并分泌。近年來多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)IgG在其他多種上皮性惡性腫瘤組織和細(xì)胞系中也存在異常高表達(dá)的現(xiàn)象[1-2，5，7-8]。Niu等[8]最近發(fā)現(xiàn)IgG在結(jié)直腸癌組織中和CRC細(xì)胞中高度表達(dá)，而且此高度表達(dá)與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和炎性細(xì)胞浸潤有密切的關(guān)系，提示腫瘤源性IgG可能對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要影響。有研究顯示在肝細(xì)胞肝癌患者的血漿中和肝癌細(xì)胞系（BCL-7402）中均可檢測(cè)到IgG的含量異常增高[2，5，9]。但是在肝癌組織中的表達(dá)情況未有報(bào)道，肝癌細(xì)胞所分泌的IgG的功能未知，其表達(dá)和癌癥的臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系也有待于研究。

在本項(xiàng)研究中，筆者分別從蛋白質(zhì)水平和mRNA水平證明了肝癌組織可以產(chǎn)生IgG。IgG在肝癌中的高表達(dá)（85.00%）與腫瘤的分化程度和pTNM分期呈負(fù)相關(guān)，IgG在分化較差（低分化或未分化）或在處于pTNM Ⅲ～Ⅳ期的肝細(xì)胞肝癌組織中的表達(dá)比在分化較好（中分化或高分化）或在處于pTNM Ⅰ～Ⅱ期的肝細(xì)胞肝癌組織中更為明顯；IgG的高表達(dá)與血漿AFP濃度呈正相關(guān)，與年齡、性別、腫瘤包膜的完整性、腫瘤大小、腫瘤個(gè)數(shù)和一年內(nèi)是否復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移無相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示腫瘤源性IgG可能與腫瘤生長有關(guān)。免疫球蛋白能促進(jìn)腫瘤生長的現(xiàn)象已有報(bào)道，這主要與“抗癌抗體”阻斷癌細(xì)胞表面的靶表位有關(guān)[10-13]。Taylor等[14]在研究卵巢癌中發(fā)現(xiàn)異常糖基化的免疫球蛋白分子不能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。此外，免疫球蛋白重鏈，T淋巴細(xì)胞受體（例如：TCR-a，TCR-b），免疫球蛋白樣黏附分子（例如：CD47，CD54）均可在癌細(xì)胞中表達(dá)[15]。免疫球蛋白抗體和T淋巴細(xì)胞受體可啟動(dòng)補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用，致使癌細(xì)胞凋亡。所以免疫蛋白超家族對(duì)于腫瘤細(xì)胞可能具有自身保護(hù)作用，并與癌細(xì)胞的增殖有關(guān)。邱曉彥等[4]早期研究了3例肝癌組織，其分化程度均為中度，研究結(jié)果顯示肝癌細(xì)胞中Ig蛋白均具有很高的表達(dá)量，因此認(rèn)為在肝癌組織中IgG的表達(dá)程度與腫瘤的分化無相關(guān)性。而本研究提示IgG在肝癌中的異常表達(dá)與腫瘤的分化程度呈負(fù)相關(guān)。這種差異可能由于樣本量大小不同造成。

甲胎蛋白（AFP）是分子量為64 000～70 000道爾頓的一種糖蛋白，主要由肝細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體合成，是胎兒成長發(fā)育的重要蛋白，具有保護(hù)胚胎不受母體排斥的作用。AFP在出生后立即消失，若再次出現(xiàn)則提示肝癌或生殖胚胎癌，因此AFP是肝癌診斷、治療和預(yù)后判斷的重要指標(biāo)。賈戶亮等[16]分析腫瘤數(shù)目、大小和pTNM分期不同的肝細(xì)胞肝癌的患者血清AFP水平顯示，AFP水平的高低與腫瘤的大小、數(shù)目和pTNM分期均呈正相關(guān)，其中pTNM Ⅰ期與pTNM Ⅲ～Ⅳ期以及pTNM Ⅱ期與pTNM Ⅲ～Ⅳ期肝細(xì)胞肝癌患者血清AFP水平具有顯著的差異。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，血清AFP水平較高（>400 μg/L）

的肝細(xì)胞肝癌患者組的IgG陽性表達(dá)率（92.8%，39/42），比血清AFP水平較低（≤400 μg/L）的肝細(xì)胞肝癌患者（66.7%，12/18）組顯著增高，與先前文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。盡管血清AFP含量水平對(duì)肝癌的早期診斷有重要意義，但是并非所有AFP升高都可以斷定為肝癌，而且并非所有血清AFP含量水平正常就能排除肝癌的可能。在肝炎、肝硬化活動(dòng)灶等疾病中亦可檢測(cè)到高水平含量的血清AFP，因此僅僅根據(jù)血清AFP濃度來對(duì)肝細(xì)胞肝癌進(jìn)行早期診斷是不夠準(zhǔn)確的[17-18]。所以聯(lián)合腫瘤源性IgG表達(dá)水平的檢測(cè)可提高陽性檢出率，降低漏診率和誤診。

綜上所述，在肝癌組織中IgG表達(dá)顯著增高，IgG的表達(dá)水平與腫瘤的分化、分期有著密切的關(guān)系。這可為以后的肝癌的早期診斷和分期判斷提供了又一重要指標(biāo)。研究IgG的表達(dá)與腫瘤的生長分化的關(guān)系，有助于為腫瘤的免疫治療提供理想的理論依據(jù)，但是對(duì)于其功能與分子機(jī)制的關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。

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篇4

[關(guān)鍵詞] T細(xì)胞共刺激分子；T細(xì)胞亞群；胃癌；大腸癌

[中圖分類號(hào)] R735 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2017）02（a）-0003-03

[Abstract] Objective To discuss and analyze the significance of T cell co-stimulatory molecules and their subgroups in the expression of gastric carcinoma and colorectal cancer tissues. Methods 41 cases of patients with gastric carcinoma and 39 cases of patients with colorectal cancer treated in our hospital from September 2014 to October 2016 were selected as the research objects and the patients with gastric carcinoma were selected as the group A， while the patients with colorectal cancer were selected as the group B， and 33 cases of healthy persons at the same period were selected as the group C， and the admission persons were tested by the Flow cytometry， and test results of T cell co-stimulatory molecules and their subgroups of the three groups were compared. Results The T cell co-stimulatory molecule CD28+CD3+ level in the group A and group B was higher than that in the group C[（25.81±10.55），（28.94±9.28）% vs （0.81±0.97）%]， and T cell CD3+ level in the group A and group B was higher than that in the group C[（53.62±13.83），（55.95±10.67）% vs （72.06±7.82）%]，the T cell CD4+CD3+ level in the group A and group B was lower than that in the group C[（29.83±9.72），（33.74±9.03）% vs （38.78±5.07）%]， the T cell CD8+CD28+CD3+ level in the group A and group B was higher than that in the group C， [（1.58±1.98）%，1.92±2.62）% vs（0.04±0.03）%]，the T cell CD8+CD28-CD3+ and CD4/CD8 levels in the group A was lower than that in the group C[（16.07±6.95）， （1.15±0.54）%vs （20.55±6.55），（1.35±0.32）%]， and the T cell CD4+CD25+CD3+ level in the group B was higher than that in the group C[（19.75±6.88）% vs （13.71±3.07）%]， and the difference had statistical significance（P0.05）. Conclusion The T cell number of patients with gastric carcinoma and colorectal cancer obviously decreases， but the expression of CD28 increases， and CD4+T cell number of patients with gastric carcinoma obviously decreases， but the regulatory T cell number of patients with colorectal cancer obviously increases.

[Key words] T cell co-stimulatory molecules； T cell subgroup； Gastric carcinoma； Colorectal cancer

臨床上，腫瘤發(fā)生、發(fā)展同抗腫瘤免疫存在一定的聯(lián)系，抗腫瘤免疫的機(jī)理目前主要有腫瘤細(xì)胞免疫逃逸學(xué)以及免疫監(jiān)視學(xué)[1-3]。為了探討和分析T細(xì)胞共刺激分子及其亞群在胃癌和大腸癌組織中表達(dá)的意義，該次研究方便選擇該院于2014年9月―2016年10月期間收治的41例胃癌患者和39例大腸癌患者作為研究主體，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該次研究選擇該院收治的41例胃癌患者和39例大腸癌患者作為研究主體，胃癌患者為甲組，大腸癌患者為乙組，選擇同期進(jìn)行檢測(cè)的33名健康人作為丙組。其中甲組患者男性為23例，女性為18例；年齡在43～79歲之間，平均為（59.61±3.15）歲。乙組患者男性為22例，女性為17例；年齡在42～78歲之間，平均為（59.31±3.24）歲。丙組中男性為19名，女性為14名；年齡在41～79歲之間，平均為（58.68±3.61）歲。甲乙丙3組上述資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），可對(duì)比。

1.2 方法

在術(shù)前和術(shù)后1周對(duì)甲乙兩組患者進(jìn)行外周靜脈血抽取，抽取量為2 mL，行ETDA3K抗凝。丙組抽取2 mL的外周靜脈血抽取，行ETDA3K抗凝，在室溫下進(jìn)行保存，檢測(cè)要在18 h之內(nèi)完成。

取100 μL的血樣全血分別加入熒光標(biāo)記的CD3-Pc5、CD4-FITC、CD8-PE、CD25-PE、CD28-FITC單抗和相應(yīng)同型對(duì)照，在室溫下行避光孵育，時(shí)間為25 min左右，之后加入0.5 mL的溶血?jiǎng)?，作用時(shí)間為30 min，加入PBS直到0.5 mL。在混合均勻后通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，在檢測(cè)前行熒光微球矯正，保證機(jī)器的誤差

1.3 觀察指標(biāo)

觀察并記錄3組的檢測(cè)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

通過SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)此次研究數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，并采用 t 檢驗(yàn)，以 P

2 結(jié)果

甲乙兩組T細(xì)胞共刺激分子CD28+CD3+水平高于丙組，甲乙兩組T細(xì)胞CD3+水平低于丙組，甲乙兩組T細(xì)胞CD4+CD3+水平低于丙組，甲乙兩組T細(xì)胞CD8+CD28+CD3+水平高于丙組，甲組T細(xì)胞CD8+CD28-CD3+以及CD4/CD8水平低于丙組，乙組T細(xì)胞CD4+CD25+CD3+水平高于丙組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），見表1、表2。

3 討論

T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及NK細(xì)胞是機(jī)體抗腫瘤免疫主要效應(yīng)細(xì)胞，而CD4+T細(xì)胞能調(diào)節(jié)和活化上述細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)。Ts細(xì)胞（CD8+CD28-CD3+）組織抗原的呈遞，并可阻斷Th細(xì)胞功能。T細(xì)胞的完全活化是CD28共刺激活化，CD8+CD3-細(xì)胞的亞群參與到了腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)中，同機(jī)體的帶瘤狀態(tài)存在一定關(guān)系[4-7]。此次研究結(jié)果表明，甲乙兩組CD3+、CD4+以及CD8+等T細(xì)胞亞群的表達(dá)都明顯降低，尤其是甲組CD4+降低最為明顯，所以無法發(fā)揮出正?？鼓[瘤的作用；丙組的CD28表達(dá)比較微弱，甲乙兩組增高明顯。甲乙兩組的CD4+、CD8+表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。甲乙兩組的CD8+、CD3-較術(shù)前有所增加，但同丙組對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這同傅冷西等[8]的研究結(jié)果： CD28+CD3+表達(dá)：胃癌組（25.80±10.56）%，大腸癌組（28.95±9.29）%，均明顯高于對(duì)照組的（0.82±0.98）%（P

綜上所述，在胃癌患者中T細(xì)胞亞群的異常表現(xiàn)主要為T細(xì)胞共刺激分子（CD28）的無效表達(dá)增加，CD4+T細(xì)胞的數(shù)量明顯減少。而大腸癌患者的主要特征為CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量增多，所以，T細(xì)胞亞群是腫瘤治療效果以及預(yù)后判斷有效的一個(gè)重要檢測(cè)指標(biāo)。

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篇5

[關(guān)鍵詞] eIF-4E基因;表達(dá);非小細(xì)胞肺癌;預(yù)后

[中圖分類號(hào)] R734 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）01（a）-0012-04

Expression of eIF-4E in non-small cell lung cancer and its correlation with prognosis

WANG Binliang LI Xiaobo KONG Yiming ZHANG Rongying

Department of Respiratory Medicine， the Affiliated Huangyan Hospital of Wenzhou Medical University the First People's Hospital of Taizhou City， Zhejiang Province， Taizhou 318020， China

[Abstract] Objective To investigate eIF-4E expression in patients with non-small cell lung cancer （NSCLC）， and its correlation with prognosis. Methods Tumor tissues were collected from 60 NSCLC patients who underwent surgical resection from January 2009 to December 2010 in the Affiliated Huangyan Hospital of Wenzhou Medical University， and 30 adjacent normal tissues samples were also collected. The expression level of eIF-4E in NSCLC tissues and adjacent normal tissues were measured by immunohistochemical method. All the NSCLC patients after resection were subject to treatment with elemene plus cisplatin for more than 2 weeks. A systematic follow-up evaluation was also performed to investigate the correlation of eIF-4E expression level with disease-free survival （DFS） and overall survival （OS）. Results The expression rate of eIF-4E in the tumor tissues （80.00%） was significantly higher than that in adjacent normal tissues （33.33%）， the difference was statistically significant （P < 0.01）. The eIF-4E high expression rate of the patient with age≥60 years and clinical stage of Ⅲ-Ⅳ was higher than whose age<60 years and clinical stage ofⅠ-Ⅱ， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The DFS and OS values of patients with low eIF-4E expression level were significantly larger than those of patients with high eIF-4E expression level， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion eIF-4E is highly expressed in NSCLC tissues; the DFS and OS values of patients with low eIF-4E expression level are significantly larger. High eIF-4E expression level may be an independent predictor of poor NSCLC prognosis.

[Key words] eIF-4E gene; Expression; NSCLC; Prognosis

目前，肺癌是發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，其引起的死亡在各種癌癥導(dǎo)致的死亡中居首位，這與其腫瘤細(xì)胞侵襲性和轉(zhuǎn)移性的生物學(xué)特征密切相關(guān)[1]。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell cancer，NSCLS）約占肺癌的80%，大部分患者發(fā)現(xiàn)患有非小細(xì)胞肺癌時(shí)已屬于晚期，因此化療是治療非小細(xì)胞肺癌的主要方法[2]。真核細(xì)胞翻譯起始因子-4E（eukaryotic initiation factor-4E，eIF-4E）是相對(duì)分子質(zhì)量25 000、堿基序列>50 kb、包括7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子的多肽[3]，在許多腫瘤中過度表達(dá)，并且與多種惡性腫瘤的發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。eIF-4E在諸如甲狀腺癌、食管癌、前列腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、肺癌、白血病以及膽管癌等惡性腫瘤和腫瘤旁組織中過度表達(dá)并與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)。eIF-4E基因科是肺癌演進(jìn)過程中重要的標(biāo)志物，可指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌的生物治療并為其臨床分期和預(yù)后判斷提供參考價(jià)值，在肺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移方面有著重要的意義。本研究EIF4E基因在NSCLC的表達(dá)及其與療效及預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2009年1月～2010年12月于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬黃巖醫(yī)院（以下簡稱“我院”）進(jìn)行外科手術(shù)切除的60例非小細(xì)胞肺癌組織樣本，同時(shí)收集30例癌旁正常組織（距離癌組織大于5 cm以上的組織）作為對(duì)照。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行過化療或者靶向治療。根據(jù)2002年美國癌癥聯(lián)合會(huì)和國際抗癌聯(lián)盟制訂的TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期27例，Ⅲ～Ⅳ期33例，根據(jù)2002年WHO分類標(biāo)準(zhǔn)，60例非小細(xì)胞肺癌組織中鱗癌29例，腺癌31例，低分化36例，中高分化24例。60例非小細(xì)胞肺癌組織中男31例，年齡35～83歲，平均（56.47±18.85）歲，女29例，年齡32～86歲，平均（58.75±19.23）歲。30例癌旁正常組織中男18例，年齡34～85歲，平均（58.94±19.62）歲，女12例，年齡33～81歲，平均（55.84±18.52）歲。非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁正常組織性別、年齡等基本資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)通過，患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 60例患者均在術(shù)后接受2～4周期的欖香烯（大連金港制藥公司，生產(chǎn)批號(hào)：0705131）聯(lián)合順鉑（山東德州制藥廠，生產(chǎn)批號(hào)：9050212DC）化療：欖香烯：125 mg/m2，d1、d8;順鉑;30 mg/m2，d1～d3。藥物均靜脈滴注給藥，所有患者均接受至少2周的化療，對(duì)于耐受良好患者進(jìn)行3～4周期的化療。

1.2.2 檢測(cè)方法 將獲得標(biāo)本制成3 μm厚的石蠟切片，常規(guī)脫蠟后使用蘇木精染色和DAB顯色（北京中杉金橋生物科技有限公司），脫水后二甲苯透明并以中性樹脂封固后置于顯微鏡下觀察。

1.2.3 結(jié)果判讀方法 以細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。免疫組化標(biāo)準(zhǔn)[5]：每例標(biāo)本均在400倍視野下選取500～1500個(gè)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度的觀察并計(jì)算陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。按陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度：無著色為0分;黃色為1分;棕黃色為2分;深棕色或棕褐色為3分。按陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)：0%～10%為0分，>10%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～100%為3分。以按陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度得分和按陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)得分之和為最終結(jié)果。0～1分：陰性（-），2～3分：弱陽性（+），4～5分：中陽性（++），6分：強(qiáng)陽性（+++）。-～+為低表達(dá)，++～+++為高表達(dá)。

1.2.4 預(yù)后評(píng)價(jià)方法 無瘤生存期（DFS）[4]：從開始化療至轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)或死亡之間的時(shí)間?？偵鏁r(shí)間（OS）[4]：從開始化療至死亡或者最后1次隨訪之間的時(shí)間，最后1次隨訪時(shí)間為2014年3月20日。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 真核細(xì)胞翻譯起始因子-4E在癌組織以及正常肺組織中的表達(dá)

非小細(xì)胞肺癌組織中eIF-4E基因的陽性表達(dá)率為80.00%（48/60），顯著高于癌旁正常組織的33.33%（10/60），差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.38，P < 0.01）。見圖1（封四）。

2.2 真核細(xì)胞翻譯起始因子-4E的表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系

非小細(xì)胞肺癌組織中eIF-4E表達(dá)與患者的性別、病理類型和分化程度無關(guān)（P > 0.05），年齡≥60歲及TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期患者的eIF-4E高表達(dá)率明顯高于年齡<60歲及分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。提示IF-4E表達(dá)與患者的年齡及臨床病理分期有關(guān)。見表1。

2.3 真核細(xì)胞翻譯起始因子-4E的表達(dá)與患者的無瘤生存期和總生存時(shí)間關(guān)系分析

與eIF-4E基因高表達(dá)患者比較，eIF-4E基因低表達(dá)患者的DFS和OS均延長，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖2、3。

圖2 真核細(xì)胞翻譯起始因子-4E的表達(dá)與患者無瘤生存期的關(guān)系

圖3 真核細(xì)胞翻譯起始因子-4E的表達(dá)與患者總生存時(shí)間的關(guān)系

3 討論

肺癌是發(fā)病率和病死率增長最快的惡性腫瘤，目前在世界范圍內(nèi)已成為嚴(yán)重危害人類生命和健康的主要疾病，肺癌的發(fā)病率和病死率在男性中均占第一位，在女性中，肺癌的發(fā)病率僅次于乳腺癌。腫瘤的形成是一個(gè)復(fù)雜的多階段連續(xù)過程，受多種因素的影響。目前對(duì)肺癌的治療仍缺乏有效的方法，對(duì)于失去手術(shù)機(jī)會(huì)的患者來說藥物治療的有效性緊密關(guān)聯(lián)著其生存質(zhì)量及生存期。對(duì)肺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制、預(yù)后影響因素和藥物對(duì)肺癌細(xì)胞作用的分子機(jī)制的研究可為肺癌的藥物治療提供依據(jù)[6]。eIF-4E是真核細(xì)胞翻譯起始和調(diào)控的核心成分，它與mRNA 5'端帽子結(jié)構(gòu)結(jié)合，在蛋白質(zhì)翻譯起始過程中發(fā)揮重要作用[7]。有研究進(jìn)展表明eIF-4E是影響腫瘤的生長、侵襲、演進(jìn)等生物學(xué)行為的腫瘤相關(guān)因子，在許多腫瘤中過度表達(dá)且與多種惡性腫瘤的發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8]，其過度表達(dá)成為腫瘤惡性改變及判斷其惡性程度的一個(gè)重要分子標(biāo)志，可為抗腫瘤治療提供新思路[9-10]。通過反義mRNA介導(dǎo)降低eIF-4E的表達(dá)可以抑制癌細(xì)胞的腫瘤特性，有研究表明，可以通過降低eIF-4E的表達(dá)抑制頭頸部惡性腫瘤細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲[11-13]。欖香烯是在中藥姜科植物溫莪術(shù)的揮發(fā)油中提取的有效成分，是由α-欖香烯、β-欖香烯、δ-欖香烯和γ-欖香烯組成的復(fù)合物，是臨床上一種被廣泛應(yīng)用并取得了治療效果的廣譜抗腫瘤藥物，β-欖香烯通過阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)其在甲狀腺癌中的抗腫瘤效果[14]，在臨床上其不僅具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，而且可逆轉(zhuǎn)化療產(chǎn)生的多藥耐藥性[15]。目前關(guān)于eIF-4E基因在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及其與欖香烯聯(lián)合順鉑治療非小細(xì)胞肺癌的效果與預(yù)后關(guān)系的研究甚少，明確eIF-4E基因在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及其與欖香烯聯(lián)合順鉑治療非小細(xì)胞肺癌的效果與預(yù)后關(guān)系可為非小細(xì)胞肺癌的治療提供依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，eIF-4E基因在非小細(xì)胞肺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，提示eIF-4E基因在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能起著重要的作用。eIF-4E的表達(dá)與患者的性別、病理類型和分化程度無關(guān)。本研究結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，年齡較大以及分化等級(jí)較高的非小細(xì)胞肺癌患者的eIF-4E陽性表達(dá)水平明顯增高，提示非小細(xì)胞肺癌患者的eIF-4E基因表達(dá)與其年齡和腫瘤分化程度密切相關(guān)。欖香烯順鉑聯(lián)合化療后eIF-4E低表達(dá)患者的DFS和OS均明顯延長。eIF-4E低表達(dá)患者欖香烯順鉑聯(lián)合化療效果較eIF-4E高表達(dá)患者明顯提高，提示eIF-4E低表達(dá)患者對(duì)化療更加敏感，因此eIF-4E的低表達(dá)是影響非小細(xì)胞肺癌化療效果的重要因素，eIF-4E基因的高表達(dá)可能成為非小細(xì)胞肺癌治療效果及預(yù)后不良的預(yù)測(cè)因子。欖香烯聯(lián)合順鉑化療可能通過組織有活性的eIF-4E基因的低表達(dá)抑制細(xì)胞的增長，導(dǎo)致致癌細(xì)胞的自我繁殖受阻，從而控制癌細(xì)胞進(jìn)展及擴(kuò)展eIF-4E復(fù)合物的形成，起到抑制腫瘤形成、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的目的。eIF-4E基因表達(dá)在肺癌治療效果和預(yù)后中的作用可從分子學(xué)角度找到肺癌診斷和預(yù)后的分子指標(biāo)。

綜上所述，eIF-4E基因在非小細(xì)胞肺癌組織存在過表達(dá)。欖香烯聯(lián)合順鉑化療后eIF-4E低表達(dá)患者的DFS和OS均明顯延長，因此eIF-4E基因的高表達(dá)可能成為非小細(xì)胞肺癌治療效果及預(yù)后不良的預(yù)測(cè)因子。

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篇6

[關(guān)鍵詞] 肺腫瘤；化療；Stathmin；β-tubulin-Ⅲ

[中圖分類號(hào)] R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）12-0059-03

2011年肺癌NCCN指南中指出：對(duì)于行R0切除的Ⅱ期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），術(shù)后需行輔助化療（一類證據(jù)），但不同患者對(duì)化療的反應(yīng)及預(yù)后差別很大。這可能與個(gè)體的生物學(xué)差異有關(guān)，因此建立循證醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)上，以藥物基因組學(xué)研究為依托的個(gè)體化治療已成為未來NSCLC臨床研究的重要方向。目前研究表明，微管基因是許多抗腫瘤藥物的作用位點(diǎn)，其中Stathmin、β-tubulin-Ⅲ表達(dá)增高與紫杉醇類藥物的敏感性降低相關(guān)。那么它們的表達(dá)水平與長春堿類藥物療效的關(guān)系怎么樣呢？國內(nèi)外的研究結(jié)果很不一致，甚至自相矛盾[1]。

因此，本文篩選出73例接受手術(shù)且術(shù)后病理明確為Ⅱ期NSCLC患者，術(shù)后均給予長春瑞濱聯(lián)合順鉑輔助化療，并檢測(cè)腫瘤組織中Stathmin、β-tubulin-Ⅲ蛋白表達(dá)水平，隨訪患者無瘤生存時(shí)間（DFS）和總體生存時(shí)間（OS），統(tǒng)計(jì)學(xué)分析蛋白表達(dá)水平與患者DFS和OS的關(guān)系，探討Stathmin及β-tubulin-Ⅲ蛋白表達(dá)水平與化療藥物療效的相關(guān)性，希望能為個(gè)體化治療方案的制定提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本及資料收集

所有標(biāo)本均從本院標(biāo)本庫中篩選（所有入標(biāo)本庫患者均簽定知情同意書，醫(yī)院倫理委員會(huì)討論通過）。術(shù)后病理按照2006年國際抗癌聯(lián)盟（UICC）TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，共篩選2007年9月～2010年6月經(jīng)根治性手術(shù)切除的Ⅱ期NSCLC患者73例?；颊叩呐R床特征：男58例、女15例；年齡≤60歲55例、>60歲18例；腫瘤大小≤3 cm2 2例、>3 cm 51例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例；高-中分化53例、低分化20例；腺癌33例、鱗癌36例、其他病理類型4例。

1.2 輔助化療

患者術(shù)后轉(zhuǎn)至化療科室進(jìn)行長春瑞濱聯(lián)合順鉑化療，順鉑75 mg/m2分3天給予，長春瑞濱25 mg/m2第1、8天，以上方案每3周重復(fù)。其中1例患者因骨轉(zhuǎn)移只進(jìn)行2周期化療，4例患者第1周期在本院進(jìn)行，余3個(gè)周期化療當(dāng)?shù)剡M(jìn)行，其余患者均在本院完成4個(gè)周期的化療。

1.3 隨訪資料（DFS和3年生存率）的收集

均通過電話隨訪，由指定醫(yī)生完成，每3個(gè)月1次。共隨訪70例，失訪3例，隨訪率為95.89%。

1.5 結(jié)果判斷

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用COX模型進(jìn)行單因素分析，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)。

3討論

近年來腫瘤的個(gè)體化治療越來越受到從事腫瘤臨床和基礎(chǔ)研究的學(xué)者的重視。NSCLC患者的治療更是需要這一原則。真正意義的個(gè)體化治療是對(duì)每一個(gè)肺癌患者“量體裁衣”，根據(jù)腫瘤生物學(xué)特征和藥物基因組學(xué)改變進(jìn)行針對(duì)性的治療。2006年《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》發(fā)表了肺癌個(gè)體化化療里程碑式的文章。在該研究中，只有腫瘤ERCC1蛋白低表達(dá)者可從輔助化療中獲益[2]。

Stathmin是一種微管不穩(wěn)定蛋白，在細(xì)胞周期的不同階段通過磷酸化和去磷酸化作用對(duì)細(xì)胞微管系統(tǒng)動(dòng)力平衡的調(diào)節(jié)發(fā)揮十分重要的作用。通過對(duì)幾種肺癌細(xì)胞的研究表明，微管的聚合狀態(tài)能夠影響其與化療藥物的結(jié)合。增加微管的聚合狀態(tài)能夠增加紫杉醇與微管的結(jié)合，減少長春堿與微管的結(jié)合，從而影響肺癌患者對(duì)化療藥物的反應(yīng)[3]。蒲驍麟等[4]報(bào)道：在晚期NSCLC中，免疫組織化學(xué)方法測(cè)得的Stathmin表達(dá)水平與長春瑞濱+順鉑/卡鉑（NP）方案的化療療效負(fù)相關(guān)。但我們的研究結(jié)果表明，Ⅱ期NSCLC術(shù)后標(biāo)本中Stathmin的蛋白表達(dá)與患者預(yù)后無關(guān)，不能作為患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。其高表達(dá)患者與低表達(dá)患者相比，DFS和OS均無明顯差異。

那么β-tubulin-Ⅲ的表達(dá)水平與長春堿類藥物療效的關(guān)系怎么樣呢？國內(nèi)外用免疫組化方法檢測(cè)得到的結(jié)果很不一致，甚至相互矛盾。Seve等[5]研究了術(shù)后接受NP方案輔助化療的ⅠB～Ⅱ期NSCLC或者， 發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中β-tubulin-Ⅲ蛋白高表達(dá)者，其無復(fù)發(fā)生存期和總生存期均優(yōu)于低表達(dá)者。Reiman T探討了JBR.10等4個(gè)臨床試驗(yàn)中1149例已切除NSCLC的患者與β-tubulin-Ⅲ蛋白表達(dá)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)β-tubulin-Ⅲ蛋白表達(dá)水平可以作為預(yù)測(cè)患者預(yù)后的指標(biāo)，但并不能作為預(yù)測(cè)化療療效的指標(biāo)[6]。我們的研究結(jié)果表明，Ⅱ期NSCLC術(shù)后標(biāo)本中β-tubulin-Ⅲ的蛋白表達(dá)與患者預(yù)后無關(guān)，其高表達(dá)患者與低表達(dá)患者相比，DFS和OS均無明顯差異。

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篇7

【中圖分類號(hào)】R711.74【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B文章編號(hào)：1004-7484（2012）-05-0786-02宮頸癌發(fā)病與很多因素有關(guān)。筆者對(duì)宮頸癌患者進(jìn)行輔助檢查，以研究TRAIL、Survivin兩項(xiàng)指標(biāo)在宮頸病變患者疾病中的表達(dá)和其與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系，并進(jìn)行分析，現(xiàn)總結(jié)如下：1.對(duì)象與方法

1.1對(duì)象：收集2007年-2010年北京市順義區(qū)醫(yī)院74例患者的標(biāo)本，都為進(jìn)行陰道鏡室活檢及手術(shù)切除的標(biāo)本。輔助病理檢查均明確診斷，27例患者為宮頸浸潤癌設(shè)為宮頸癌組。22例患者為CINII-III級(jí)設(shè)為CIN II-III級(jí)組；25例患者為CIN I級(jí)設(shè)為CIN I級(jí)組。并設(shè)立對(duì)照組進(jìn)行研究，對(duì)照組15例患者為筆者所在醫(yī)院宮頸正常的患者，其標(biāo)本為子宮肌瘤手術(shù)切除標(biāo)本。所有宮頸癌患者在手術(shù)之前都沒有進(jìn)行化療、放療的治療。RT-PCR方法檢測(cè)Survivin、TRAIL的表達(dá)，采用SPSSll.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。

1.2結(jié)果：宮頸癌組的Survivin基因的表達(dá)指標(biāo)l.293±0.438，CIN II-III級(jí)組為1.010±0.367，CIN I級(jí)組為0.718±0.205，正常宮頸組為0.596±0.229。結(jié)果顯示正常宮頸組明顯低于CIN組，CIN組明顯低于宮頸癌組。CIN I級(jí)組指標(biāo)明顯低于CINII-III級(jí)組，差異明顯有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05)。CINI級(jí)組和正常宮頸組比較無明顯差異，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

宮頸癌組TRAIL基因的表達(dá)指標(biāo)為0.441±0.117，CIN II-III級(jí)組為0.536±0.150，CIN I級(jí)組為0.675±0.211，正常宮頸組為0.940±0.427。宮頸癌組和CIN II-III級(jí)組的指標(biāo)明顯高于正常宮頸組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：對(duì)宮頸癌組織中的各項(xiàng)表達(dá)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，應(yīng)用Spearman等級(jí)處理，其呈負(fù)相關(guān)關(guān)系表現(xiàn)。相關(guān)系數(shù)r=-0.541，P

在人體腫瘤的研究中，Survivin基因在此疾病的檢查中都有明顯表現(xiàn)。其高度表達(dá)可讓患者的細(xì)胞凋亡受到抑制，從而致使患者的細(xì)胞出現(xiàn)了增殖異常的表現(xiàn)。這表明此指標(biāo)和患者發(fā)生腫瘤疾病有著很大的關(guān)聯(lián)。筆者應(yīng)用RT-PCR的方法對(duì)患者的標(biāo)本進(jìn)行檢查，經(jīng)對(duì)比分析顯示此指標(biāo)在早期宮頸癌惡性轉(zhuǎn)化的時(shí)候可能會(huì)高表達(dá)。分析結(jié)果還顯示其和宮頸癌疾病地發(fā)生有很大的關(guān)系。

TRAIL指標(biāo)為腫瘤壞死因子，其本身在正?；颊唧w內(nèi)為高表達(dá)的表現(xiàn)，其在腫瘤患者及胚胎中的表現(xiàn)為低表達(dá)或者為沒有表達(dá)。本組資料顯示其在宮頸癌組中的表達(dá)指標(biāo)為最少，這表明患者在發(fā)生腫瘤疾病時(shí)TRAIL表現(xiàn)為逐漸地丟失。這表明其和疾病的產(chǎn)生和法則有很大的關(guān)系。故對(duì)其進(jìn)行研究可能會(huì)有新的突破。

篇8

【摘要】

目的： 研究轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物MALA1的表達(dá)水平與早期非小細(xì)胞型肺癌(NSCLC)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。方法： 用實(shí)時(shí)定量PCR分析了MALA1基因在70例NSCLC患者中的表達(dá)情況。 結(jié)果： 在對(duì)Ⅰ期和Ⅱ期NSCLC患者超過5年的隨訪期中發(fā)現(xiàn)，MALA1高表達(dá)的患者死亡率超過40 %(12/28)，而MALA1低表達(dá)的患者死亡率僅有9 %(2/22) （P=0.01)。說明高表達(dá)量的MALA1很可能是早期NSCLC 患者預(yù)后不良的一個(gè)指標(biāo)。此外，也發(fā)現(xiàn)了MALA1基因與腫瘤組織的轉(zhuǎn)移有關(guān)。結(jié)論： MALA1的轉(zhuǎn)錄水平不僅可以作為預(yù)測(cè)發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的高危人群的生物學(xué)標(biāo)記，并有望在今后用于早期NSCLC患者的診斷或治療中。

【關(guān)鍵詞】 轉(zhuǎn)移； 非小細(xì)胞型肺癌； MALA1； 表達(dá)； 扣除雜交

［Abstract］Objective: To investigate the relationship of the expression level of the transcript MALA1 and the metastasis of early stage nonsmall cell lung cancer(NSCLC).Methods： Expression level of MALA1 was analyzed with real time quantitative PCR in 70 patients of NSCLC.Results： In the study of an over fiveyear followup for stage Ⅰand Ⅱ NSCLC patients.It was found that the death rate was more than 40% in patients with high MALA1 expression， whereas only 9%(2/22) in patients with low MALA1 expression died(P=0.01)， suggesting high expression of MALA1 was potentially predictive for a poor prognosis in early NSCLC.Additionally， it was found that the association of MALA1 gene with metastasis depended on the tumor′s histology.Conclusion： These results demonstrated that MALA1 transcript could be used as a biological marker， which may predict high risk for the development of distant metastasis and could be further helpful in improvement of treatment for earlystage NSCLC patients.

［Key words］ metastasis; nonsmall cell lung carcinoma; MALA1; expression; subtractive hybridization

Bronchogenic carcinoma continues to be the leading cause of cancer death in both men and women ［1］.Nonsmall cell lung carcinoma(NSCLC) accounts for approximately 80% of all bronchogenic carcinomas， with SCLC(small cell lung carcinoma) accounting for the remainder［1］.Survival following treatment of NSCLC is stagerelated， and the patients with earlystage disease have the best chance for curative treatment.Although the patients with stage Ⅰ and Ⅱ disease undergo surgical resection of primary carcinomas， a considerable number of them will eventually die of metastatic neoplasm， implying a need for reliable indicator not only to predict survival of the patients with early stage NSCLC， but to provide information for the high risk patients who might benefit from additional therapy［2］.

Up to date， while there are some reports about DNA ploidy and DNA deletions， SPF(Sphase fraction)， PCNA(proliferating cell nuclear antigen)， the gene family of erb B， p53 mutation， EGFR and Ki67 antigen and so on as biological indicators of prognosis in most solid tumors， still have been conflicting results in lung cancer studies［3-9］.Recently， applying a subtractive hybridization procedure， we identified a few new genes whose expression levels were significant differences between NSCLC tumors that were cured by surgical resection and the tumors that subsequently metastasized.An approach to find the genes related to metastasis has been made by a cDNA subtractive hybridization［10］.In the present study， we investigated expression level of the identified genes in the subtracted cDNAs by realtime quantitative RTPCR.The results demonstrated that MALA1(Metastasis associated in lung Adenocarcinoma)， the most frequently appeared gene in identification of subtractive cDNA library， was associated with metastasis in the patients with early stage NSCLC.Therefore it is suggested that expression level of MALA1 could be one valuable molecular biological marker to predict survival for patients in early stage NSCLC.

1 Materials and methods

1.1 Tumor specimens and survival data

Tumor samples were obtained from 70 patients with stage Ⅰ to Ⅱ IA NSCLC at the time of initial surgical resection at Muester university hospital in Germany.Pathohistory examination showed no evidence for remaining tumor.RNA isolation and consequently cDNA preparation， characterization of the cohort of NSCLC patients were described previously ［11］.Parts of the surgically resected tumors were immediately shockfrozen and stored at -70℃ until analysis.All specimens were confirmed to contain a high percentage of tumor cells(>70%).Lung tissue without histological evidence of tumor infiltration was isolated from 12 inpiduals to serve as a control.

1.2 cDNA subtractive hybridization

To exclude differences in gene expression independent on the metastatic potential， all the patients in this study were male with more than five years of followup， all the tumors were at stage I and were completely resected by surgery(R0 resection). Histological classification were confirmed to be adenocarcinomas as described ［11］.The cDNA hybridization procedure was described as the method［11］.In brief， cDNA was prepared and amplified using realtime RTPCR in the ABI Prism 7 700 sequence detector(PE Biosystems， Foster City， CA).One gram of total RNA was reverse transcribed using random primers and Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase(Promega) following the manufacturer′s protocol.cDNA samples were diluted to 100 μl， and 2.5 μl of cDNA were used for each PCR.PCR amplification of the housekeeping gene glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase was used to confirm the quality of cDNA and standardize the total amount of cDNA between different samples.The primers for amplication of the MALA1 gene were: forwardTGAGAGAAAGGACTACAGA， and reverseCTTCCC GTACTTCTGTCTT.

1.3 Statistical Analysis

Statistical Analysis was carried out with SPSS software system(SPSS for Windows Version 10.0).Difference in gene expression level between metastasizing and nonmetastasizing tumors was analyzed statistically with MannWhitney Utest.Cancerspecific survival curves were plotted using the KaplanMeier method and the logrank test was used to assess the statistic significance of differences between groups.Cox proportional hazards regression analysis was used to define gene expression level with independent predictive value with respect to cancer specific survival.

2 Results

2.1 Cloning of MALA1 gene

Two hundred and twentyfive independent sequences were obtained totally in metastatic cDNA library after subtractive hybridization.Twentysix transcripts were found more than once.The most frequently identified transcript was a so far uncharacterized mRNA derived from chromosome 11q13 by DNA homology comparison in Genbank(Accession number AF203815).To obtain more of the sequence of this transcript， we used 5′ and 3′ Rapid Amplification of cDNA(RACE).The full length of this DNA sequence was 737 base pairs.Database searches revealed that this sequence had before been identified only as an EST(Expression sequence terminal).The sequence of the transcript is shown in Fig.1， in which the longest open reading frame for peptides of 52 amino acids(aa) was predicted in both directions.However， it is currently unclear whether this sequence codes for a peptide in vivo.We have named this RNA MALA1.To confirm the reliability of MALA1 expression， this transcript was analyzed in the pooled samples as well as in the subtracted libraries(metastasis minus nonmetastasis and nonmetastasis minus metastasis).These analyses demonstrated for MALA1 an about 3fold higher expression in the pooled sample from metastasizing tumors compared to the nonmetastasizing tumors.

2.2 Expression analysis of MALA 1 gene in patients

The issue of the association of MALA1 gene with metastasis was specific for certain histological subtypes or stages of disease was analyzed.When only stage Ⅰ and Ⅱ patients were included into the analyses， expression levels of MALA1(P=0.017) was significantly higher in metastasizing tumors， and another one was EIF4A1(Eukaryotic translation initiation factor A1)(P=0.031).Also， further analyses indicated that the association of MALA1 gene with metastasis was highly specific for histological subtypes.Twentysix tumors were histologically classified as adenocarcinomas.For three out of five genes(MALA1， EIF4A1， NPCRP) that we identified by our screening method， expressed in metastatic adenocarcinomas was several folds higher than in nonmetastatic adenocarcinomas.Interestingly， no significant differences in gene expression were found for squamous cell carcinomas(n=34).For large cell carcinomas(n=10) mixed results were obtained: whereas some of the genes were clearly enriched in metastasizing tumors(MALA1， EIF4A1， MDM2)， others were clearly not(NPCRP).These data provided evidence that the association of the identified genes with metastasis depended on the tumor′s histology.The relative expression of MALA1 in three types of lung carcinoma was shown in Fig.2.

To evaluate the relationship of the identified metastasisassociated transcripts and survival， all samples were classified for couples of gene as high or low expressers.High or low expression was determined according to the expression level of the samples with regard to median expression of all 70 samples ［11］.KaplanMeier plots indicated that high expression level of MALA1 was associated with significantly worse survival of patients with stage Ⅰ and Ⅱ disease(Fig.3).High expression of MALA1 was highly predictive for a poor prognosis in early disease.Indeed， only 2/22(9%) of low expressing stage Ⅰ and Ⅱ disease patients died during a fiveyear follow up period but more than 40%(12/28) of patients with high levels of MALA1 ultimately died.When a stepwise Cox regression analysis was performed for stage Ⅰ and Ⅱ patients， high levels of MALA1(P=0.02) emerged as independent prognostic parameters for patient survival(Fig.4).

3 Discussion

We identified genes that might be associated with metastasis of NSCLC.The direct comparison of subsequently metastasizing primary tumors with nonmetastasizing primary tumors could offer important advantages.Firstly， it avoided changes in gene expression and metastasis due to the different environments of tumor; secondly， for clinical patient management， the knowledge of differences between metastasizing and nonmetastasizing primary tumors can lead to better prognosis prediction and ultimately to risk adapted therapeutic strategies［12］.Several unknown genes were identified in our study.One of these， a novel transcript on chromosome 11q13， was the most frequently found transcript.To determine the 5′and 3′ends of the sequence we used 5′and 3′ RACE techniques and obtained a 737 base pair fragment that potentially encodes for a 52 amino acid peptide.This transcript was named as MALA1.Currently， it is unclear whether this sequence has peptidecoding potential in vivo， or whether its expression is merely an epiphenomenon for processes on 11q13 that are associated with the metastasisbearing potential of NSCLC tumors.The region 11q13 has been known to be relevant for tumorigenesis and metastasis ［13-15］， there were some important genes， such as CCND1(cyclin D1) and MEN1(Multiple endocrine neoplasia 1) located in this region as well.However， in most cases， 11q13 mutation was associated with lung carcinoma.It might hint that MALA1 in the region of 11q13 was translocated to a new area and affected other genes expression in that area.Nevertheless， even if MALA1 is nonfunctional， it bears strong prognostic potential in early stage NSCLC.

Tumors of patients were grouped for each gene in high vs.low expressing ones based on the expression of tumor in comparison to the median expression of all patients.Kaplan Meier survival plots are shown for patients with adenocarcinoma or squamous cell carcinoma and stage Ⅰ or Ⅱ disease.The logrank test was used to calculate statistical significance

Recently， Clark et al.［16］ published microarray data derived from a melanoma metastasis model.The thymosin β4 gene， identified by them， was also cloned by our strategy.Therefore， we tested to test whether the two other main genes identified by them were associated with metastasis in NSCLC.Thymosin β4 proved to be associated with metastasis and prognosis in our patient group， whereas no significant differences were found for either Rho C or fibronectin.These findings provided another strong hint that the stage and cell type specific gene expression profiles were associated with metastasis.

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篇9

[關(guān)鍵詞] 肺癌; Beclin1; p53; p16

[中圖分類號(hào)] R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701(2010)07-26-02

Expression of Beclinl,p53 and p16 in Different Stages of Lung Cancer

LI Xiaoyan1 WANG Guiqin2

1.Affiliated Fenyang Hospital of Shanxi Medical University,Fenyang 032200,China;2.Teaching and Research Section of Microbiology and Immunology,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China

[Abstract] ObjectiveTo investigate expression of Beclinl,p53 and p16 in lung cancer tissue of different stages and provide reliable data for early diagnosis of lung cancer and the assessment of its m alignant degree. MethodsWe selected 50 patients with lung cancer from Shanxi Fengyang Hospital between Jan.2009 and Dec.2009. The expression levels of tissue Beclinl,p53 and p16 in different stages of lung cancer were detected and the analysis of variance and LSD-t test were used for their expression and their corresponding stage. ResultsThere were significant differences in the expression levels of Beclinl,p53 and p16 in different stages. ConclusionThe expression levels of Beclin1,p53 and p16 in the tissue of lung cancer in different clinical stages are different. With the increase in staging of lung cancer,the p53 expression level is increased,the p16 expression level is down-regulated and the Beclin1 expression level is decreased.

[Key words]Lung cancer; Beclin1; p53; p16

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。多數(shù)患者在確診時(shí)已失去根治的機(jī)會(huì),早期發(fā)現(xiàn)和診斷肺癌及其惡性度的評(píng)估對(duì)其治療和預(yù)后都有重要意義。肺癌早期診斷與惡性度評(píng)估分子標(biāo)志物的篩選是臨床腫瘤工作者亟待解決的課題[1,2]。

自噬現(xiàn)象是一種高度保守的細(xì)胞行為,存于所有的物種。研究表明Beclin1是唯一發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物的自噬基因,是自噬的執(zhí)行者;又是一類新的抑癌基因,只有在雙等位染色體都表達(dá)時(shí)才發(fā)揮抑癌作用。Beclin1基因的缺失性突變導(dǎo)致自發(fā)性腫瘤發(fā)生率提高。Beclin1基因表達(dá)異常(減少或缺失)是否為腫瘤細(xì)胞早期事件?如果研究結(jié)果是肯定的,那么我們可以將其作為早期診斷的指標(biāo)之一,甚至有可能成為高危人群篩選指標(biāo)之一。

p53是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關(guān)性最高的腫瘤抑制蛋白,在多種惡性腫瘤中有異常表達(dá)。正常狀態(tài)下,其效應(yīng)分子的基因產(chǎn)物可防止細(xì)胞轉(zhuǎn)化癌變,當(dāng)發(fā)生突變時(shí)可成為一個(gè)直接的腫瘤基因,在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中起作用,被認(rèn)為是早期癌標(biāo)志。p16蛋白是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)直接控制細(xì)胞增殖周期的固有蛋白,通過調(diào)節(jié)Rb蛋白的活性防止細(xì)胞過度增殖。p16蛋白的丟失、突變廣泛存在于人類惡性腫瘤中,因此p16蛋白既可作為早期診斷癌變的指標(biāo),也可用于評(píng)估預(yù)后。

本文旨在通過分析處于肺癌各個(gè)分期的50例肺癌患者的Beclin1、p53、p16的表達(dá)情況,探討B(tài)eclin1、p53、p16與肺癌惡性度的關(guān)系,從而為臨床診斷、治療肺癌提供依據(jù)[3]。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本與來源

選擇2009年1～12月在山西省汾陽醫(yī)院就診的肺癌患者,取肺組織50例(每期10例)。入選條件和排除條件如下:(1)手術(shù)切除標(biāo)本。所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí),術(shù)前均未接受放、化療。(2)均經(jīng)病理確診為肺癌。(3)另取癌旁正常肺組織(至少距癌邊緣3cm)。(4)病理排除合并炎性改變等的可能。

1.2 方法

1.2.1 分組方法 依據(jù)1997年UICC公布的肺癌TNM分期,同時(shí)結(jié)合臨床、胸部CT、X線檢查將入選病例進(jìn)行分組:按腫瘤分期0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分為5組,各組年齡、性別等控制情況基本匹配。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 肺癌及相應(yīng)癌旁手術(shù)標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定,石蠟包埋連續(xù)切片,蘇木精-伊紅染色,進(jìn)行組織病理學(xué)觀察后,采用PV-9000通用型二步法免疫組化法進(jìn)行Beclin1、p16和p53基因表達(dá)水平的檢測(cè)。

1.2.3 結(jié)果判斷 定性:光學(xué)顯微鏡觀察Beclin1、p16和p53,陽性著色部位分別為細(xì)胞漿和細(xì)胞核,呈棕黃色,而陰性細(xì)胞不著色而顯示復(fù)染的藍(lán)色。定量:每張切片隨機(jī)地在200倍顯微鏡下取5個(gè)視野,錄入GD-6多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng),測(cè)定Beclin1、p53、p16的積分光密度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS10.0軟件包對(duì)Beclin1、p53、p16的表達(dá)情況與其各自對(duì)應(yīng)的分期分別進(jìn)行方差分析與LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

肺癌分期的五組Beclin1、p53、p16的表達(dá)情況差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

本研究顯示:各期肺癌組織中Beclin1、p53、p16表達(dá)的高低與肺癌的臨床分期有關(guān)聯(lián);隨肺癌分期的增高,p53表達(dá)量增高,p16表達(dá)量下調(diào),同時(shí)Beclin1表達(dá)量降低。見圖1。

3 討論

國內(nèi)外學(xué)者對(duì)Beclin1的研究大多集中在宮頸癌等生殖系統(tǒng)腫瘤,對(duì)其與肺癌的關(guān)系研究很少。對(duì)于p53、p16及Beclin1的測(cè)定方法大多是RT-PCR法、Western blot等,這些方法只能判斷陽性病例而不能定量診斷[4,5]。Beclin1與肺癌相關(guān)性的研究目前國內(nèi)報(bào)道較少,與肺癌病理分期相關(guān)的研究尚未見報(bào)道。

本文通過檢測(cè)不同分期肺癌組織中Beclin1、p53、p16的表達(dá)情況,揭示自噬蛋白與凋亡蛋白在肺癌發(fā)生發(fā)展中的相互作用,研究三者之間及其與肺癌臨床病理分期的關(guān)系,為早期診斷肺癌提供理論依據(jù)。通過研究了解肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中Beclin1、p53、p16的表達(dá)情況,通過對(duì)肺癌組織中Beclin1、p53和p16表達(dá)的定量分析揭示自噬蛋白與凋亡蛋白在肺癌發(fā)生發(fā)展中的相互作用,為腫瘤早期診斷提供一條新思路。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Gorski DJ,Chittaranjan S,Pleasance ED,et al. A SAGE approach to discovery of genes involved in autophagic cell death[J]. Curr Biol,2003,13(4):358-362.

[2] Tan EM,Zhang J. Autoantibodies to tumor-associated antigens:reporters from the immune system[J]. Immunol Rev,2008,22(5):328-340.

[3] Gadducci A,Ferdeghini M,Buttitta F,et al. Assessment of the prognostic relevance of serum anti-p53 antibodies in epithelial ovarian cancer[J]. Gynecol Oncol,1999,72(3):76-81.

[4] Tang R,Ko MC,Wang JY,et al. Humoral response to p53 in human colorectal tumors:a prospective study of 1,209 patients[J]. Int J Cancer,2001,94(13):859-863.

篇10

關(guān)鍵詞：  S100A2；喉鱗癌；免疫組織化學(xué)方法

1  材料與方法

1.1  實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1  資料  收集40例瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科2005年1月至2007年5月行手術(shù)切除后經(jīng)病理學(xué)診斷為喉鱗狀細(xì)胞癌（lscc）的存檔蠟塊。所有病例術(shù)前均行喉部高分辨率CT檢查，均未行放化療治療。40例喉鱗癌中，男性39例，女性1例,年齡45～71歲，平均61.8歲；病程2～36個(gè)月。將病例按年齡、不同分化程度、有無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期進(jìn)行分組。年齡以60歲為界，分為兩組；按組織病理學(xué)分級(jí)分為高分化鱗癌22例，中分化鱗癌10例，低分化鱗癌8例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例；按1997年國際抗癌協(xié)會(huì)（UICC）制定的TNM分期， T1～T2期有14例，T3～T4期有26例;將40例同期手術(shù)切除經(jīng)病理證實(shí)無腫瘤浸潤的癌旁喉黏膜標(biāo)本作為對(duì)照組。

1.1.2  主要實(shí)驗(yàn)試劑  兔抗人多克隆S100A2抗體（購于sigma公司），SP免疫組化試劑盒、DAB顯色盒購于（北京中杉生物技術(shù)有限公司）。

1.1.3  主要實(shí)驗(yàn)儀器  輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（Leica-RM2035 產(chǎn)于德國），OLYMPUS顯微鏡（BX-50，日本），CS2002-1恒溫干燥箱孵育盒 （重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器廠），SAYYO低溫冰箱-20℃(MDF-330.產(chǎn)于日本），病理圖像分析處理系統(tǒng)(GD-8,中國)。

1.2  實(shí)驗(yàn)方法  所有樣本經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度為4μm。免疫組化染色按試劑盒說明進(jìn)行，組織切片經(jīng)脫蠟、水化、微波處理，進(jìn)行抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)過氧化物酶30 min ，PBS 沖洗3 次，每次3min，非特異性血清封閉30 min，PBS 沖洗3 次，每次3 min，抗原一抗4℃孵育過夜，PBS 沖洗3 次，每次3 min，二抗孵育30 min，PBS 沖洗3 次，每次3 min，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，脫水，透明，封片，鏡檢及攝像。采用預(yù)實(shí)驗(yàn)反復(fù)多次證實(shí)均呈陽性的組織切片為陽性對(duì)照，空白對(duì)照以PBS代替一抗。

1.3  結(jié)果判斷及資料整理  S100A2陽性結(jié)果判定：細(xì)胞核或核與胞漿染成黃色或棕黃色或彌漫的棕黃色為陽性細(xì)胞；每張切片選擇典型部位，隨意選5個(gè)不同高倍視野(400×)計(jì)數(shù)，以平均數(shù)做最后判定。根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)占視野中總細(xì)胞數(shù)比例進(jìn)行判定：陽性細(xì)胞數(shù)≤10％為陰性結(jié)果，陽性細(xì)胞數(shù)≥ 11%，為陽性結(jié)果。切片均經(jīng)2位病理醫(yī)生盲法獨(dú)立計(jì)數(shù)閱片,兩者不一致時(shí)重新計(jì)數(shù)。最后根據(jù)免疫組化染色編號(hào)，對(duì)應(yīng)的病理號(hào)及住院號(hào)整理檢測(cè)結(jié)果。

1.4  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過SPSS14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)а=0.05。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，比較其差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2  結(jié)果

   

60例標(biāo)本全部進(jìn)入結(jié)果分析，S100A2蛋白經(jīng)免疫組化染色后于細(xì)胞核或細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)，出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒為陽性表現(xiàn)。