導語：如何才能寫好一篇對聯左右，這就需要搜集整理更多的資料和文獻，歡迎閱讀由公務員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

1、貼對聯的位置，面對大門右手邊貼上聯，左手邊貼下聯。

2、這是最傳統(tǒng)的貼法，一個特例是根據橫批寫的順序來貼。

3、對聯的橫批也指示了對聯的方向，橫批從左往右寫。

4、上聯就貼在左手側，橫批從右往左寫，上聯就貼在右手側。

5、區(qū)分上下聯最主要是按照最后一個字的聲調，來進行區(qū)分的。

篇2

1、面對大門，視自己的右手邊為上首，把對聯上聯貼在大門門框右側，把對聯下聯貼在大門門框左側。

2、對聯，漢族的傳統(tǒng)文化之一，是寫在紙、布上或刻在竹子、木頭、柱子上的對偶語句。對聯對仗工整，平仄協(xié)調，是一字一音的中華語言獨特的文化藝術形式。對聯相傳起于五代后蜀主孟昶。對聯是中國漢族傳統(tǒng)文化瑰寶。

（來源：文章屋網 ）

篇3

關鍵詞：口語訓練；語文教學；情操；方法

隨著教學要求的變化，教學觀念的更新，教學過程中越來越注重培養(yǎng)學生口語表達能力，《課程標準》中也對不同學段的口語訓練提出不同的要求。眾所周知，口語表達訓練和語文教學密不可分，它能直接影響語文教學的順利進行和教學措施的適當實施，語文課堂教學也是培養(yǎng)學生口語能力的一個重要的場所。因此，我們不能把口語訓練和語文教學割裂開來.應把它融入到語文教學中去，充分利用教學中的有利時機，有意識地培養(yǎng)學生的口語交際能力。

一、以說，說寫結合，雙管齊下

表面看，說與寫之間沒有根本聯系，但剖其內部本質，卻發(fā)現兩者有著內在的必然聯系：說是寫的前提，是寫的準備過程；寫是說的進一步深化，是結果。因此，我們應將兩者有效地結合起來，以說來輔助寫，以寫來帶動說，說寫結合，雙管齊下，將會收到很好的效果。例如，在教學寫景文章，當同學們選取了校園景色作為描寫對象后，我先讓學生到校園里仔細觀察，體驗校園景色的優(yōu)美。很多學生都看清了校園里花的種類、形態(tài)，花草掩映的景象，樹木的姿態(tài)等?；氐桨嗉墸覜]有急于讓學生考慮如何動筆，而是啟發(fā)他們將看到的景物說出來，激發(fā)說的興趣，結果，學生情緒高漲，課堂氣氛活躍。有的同學說：“我看到花壇里有各種美麗的花，黃的、粉紅的、白的，顏色各異，簡直就是花的世界?！币灿械耐瑢W說：“給我印象深刻的是雪松，常青不衰，從它身上我看到了一種堅強不屈的精神?！钡葘W生介紹完后，我讓他們再按自己觀察的順序，有條理地介紹校園的風景。在前面發(fā)言的基礎上，學生的思維更加活躍，介紹方法不同，內容不同，但效果很好。通過詳細的敘述，同學們心中已形成了作文的初稿。在學生余興未了時，我讓學生把各自說的內容有條理地寫下來，不知不覺，作文的內容已比較充實，既寫好了作文，又訓練了學生的口語，可謂“一舉兩得”。

二、有的放矢，集中訓練，陶冶情操

根據《課程標準》具體要求，口語訓練應在創(chuàng)設的具體情境中進行，為了達到這一教學目標，蘇教版教材中明確安排了“口語交際”的內容。對此，教師應充分重視，不能包辦代替，更不能敷衍了事，要有一定的目的性和針對性，因為這是集中訓練學生口語能力的重要手段。在課堂上，學生大膽發(fā)言，或講事物的具體特征，或講事情的來龍去脈，或談社會的良好風氣……在這段屬于孩子們自己的時間里，讓他們暢所欲言，既能有效地訓練學生的口語表達，又能凈化孩子的心靈，陶冶情操，從小樹立良好的人生觀和價值觀。例如，在教學一個內容是“某同學過生日，應不應該請同學吃飯”（因為其他同學都有請吃飯的現象）的口語交際時，我決定將課堂上絕大部分時間都由他們自己支配，讓他們自己發(fā)表看法。果然，同學們都大膽地發(fā)表自己的意見。有的同學覺得應該請，因為別人都請，自己不請不好意思；有的認為應該請，不請別人會小看自己。針對“要請”的觀點，也有部分同學提出質疑：“我們是學生，還沒有經濟來源，拿什么來請?！薄拔覀冏x書需要錢，現在再請吃飯，加重父母的負擔?！薄拔覀兪菍W生，應努力學習?！薄白约簭男∫?jié)約。”這樣，雙方同學各執(zhí)一詞，激烈地辯論起來。待辯論結束后，我先肯定學生在活動中的表現，然后指出：“在現在，我們不應該請吃飯，因為沒有經濟基礎。另外，我們要發(fā)揚勤儉節(jié)約的優(yōu)良傳統(tǒng)?！边@樣，既達到了訓練口語的日的，又凈化了學生的思想，陶冶了情操。

三、形式多樣，方法靈活

語文課堂教學要訓練學生的聽說讀寫能力，促進學生的全面發(fā)展。而口語訓練也應融入到教學中，促進教學活動的順利實施。因此，教學中應合理地安排口語訓練。一般來說，小學生童真無鄧，愛說愛聽，在他們平時玩耍或與家人、朋友交談時，會無拘無束地大膽發(fā)言。教師應該根據學生這個特點，采用多種方法，利用和創(chuàng)設各種情趣，讓學生暢所欲言，說他們所說，有利于把他們由課外自發(fā)地說轉化為課內自覺地說。

1.評論

根據課文的內容、書寫方法或結構，讓學生評論課文的特點和文章的思想，還可以讓學生對教師所讀范文進行評論。另外，也可以對老師或學生說話的觀點進行評論。

2.自我介紹

在談堂上，教師可以安排這種以自我介紹為主的活動，介紹自已的姓名、性別、出生年月、性格特點、愛好等，借此來訓練學生出口成句的能力。

3.接待客人

在課堂上，教師可以創(chuàng)設接待客人的情境，組織學生進行模擬表演，在表演中訓練說話，要求能夠根據人物身份的不同，模仿出不同的語言、動作、神態(tài)等。這樣，既活躍了課堂氣氛，又收到很好的口語訓練效果。

4.產品推銷

篇4

同學們在使館教育處老師們的指導下，積極地適應環(huán)境，爭取國外導師的支持和幫助，最高效率、最大限度地利用豐富的學術資源和先進的科研條件開展課題研究。經過一段時間的學習，廣大同學深刻意識到“國家建設高水平大學公派研究生項目”的重大意義，意識到該項目是提供大量了解學術前沿和把握學科發(fā)展方向的重要機會，不但對個人發(fā)展具有重要意義，而且對于汲取新加坡高校建設和科研管理的先進經驗，促進中國高水平大學建設具有更加重要的意義。

中國駐新加坡使館教育處的老師們對同學們而言，既是老師又是家長，他們熱情接待每一位赴使館教育處報到的同學，使同學們雖然身在異國他鄉(xiāng)，卻強烈地感受到了祖國的溫暖和親人的關懷。新同學抵新不久，教育處就專門組織了“國家公派留學人員及聯合培養(yǎng)博士生座談會”。座談會上，老師講解了關于公派留學生管理的相關文件，鼓勵同學們牢記使命，刻苦鉆研，學有所成，報效祖國。會上老師還詳細介紹了新加坡的制度、文化和法律法規(guī)，對于同學們關心的問題給出了指導和建議。

考慮到公派學者、學生的特殊性，如訪問、留學時間相對較短，學術層次較高，管理相對獨立和集中，使館教育處老師們指導學生于2007年9月成立了“國家公派學者、學生聯誼會(新加坡)”(Chinese Govem-ment-funded Scholars and Students Association[in Singapore]，CGSSAS，以下簡稱聯誼會)。聯誼會作為國家公派學者和學生自我管理、自我服務的組織，在廣大學者、學生與使館教育處之間發(fā)揮紐帶橋梁作用，搭建同學之間交流生活、學習經驗，共享信息資源的平臺，在使館教育處的指導下開展工作，為公派學者和學生服務。作為在國外建立公派學者、學生組織的一次嘗試，聯誼會在工作中進行組織建設，在實踐中不斷積累經驗，目前已經初步建立了組織，制度，并開展了富有成效的工作。

聯誼會在建立之初，集中進行了網絡平臺的建設，先后建立了聯誼會論壇“留學心園”(http：//vrhere.省略/)，開通了聯誼會博客(http：//v-Fhere.blog.省略/)，通過網絡工具促進廣大公派學者學生進行思想、經驗交流，促進信息共享。目前，“留學心園”論壇集中了大量關于新加坡留學生活經驗，留學生學成回國發(fā)展及其相關管理政策的實用信息，同時也有廣大同學們對于留學生活的體會和感受。

2007年9月～11月，聯誼會組織了“赴機場迎接抵新同學”的服務活動。被提供接機服務的同學達到60余人，同時廣泛開展了協(xié)助聯系住房，學校報到等相關的互助活動，得到了同學們的肯定，已經促成了互幫互助、資源共享的良好局面。

在“歡度中秋，喜迎國慶”暨公派旅新學者學生聚會活動中，使館教育處老師蒞臨活動現場，與廣大學者學生共同慶祝傳統(tǒng)佳節(jié)，祝福祖國?；顒蛹ぐl(fā)了同學們的自豪感，堅定了為國爭光的理想信念。

在課余時間，聯誼會組織了文藝、體育活動，促進了中國文化在新加坡高校內的傳播。

目前，聯誼會從促進科研交流、積極參加學術活動等角度開展工作，組織活動。先后組織同學參加了“新加坡國防科技展”、“范曾教授和楊振寧教授公開演講”、“解讀當代中國大學”等多場科技展覽會和學術報告會，開展了”慷慨激昂，論劍南洋公派留學生互訪系列活動”，討論科研思想，激發(fā)創(chuàng)新靈感，交流學習經驗。

聯誼會的工作不但在廣大公派學者學生中得到了廣泛肯定和一致好評，而且也吸引了一些自費留學生同學，在共同參與活動的過程中，加深了彼此的了解，建立了友誼。

篇5

1、二傳傳球速度越來越快。縱觀近幾年來的世界排球比賽，優(yōu)秀二傳手利用單、雙手跳傳技術來升高擊球點、加快傳球出手速度，縮短球在空中的飛行時間，加快進攻節(jié)奏成為明顯的特點。

2、二傳技術越來越具有攻擊性。當今世界排壇二傳手作為攻擊手的隊伍普遍存在。例如：前世界冠軍古巴女排，場上6名選手都具有相當的進攻能力，因此他們大膽地由原來的“四、二”配備改打“六、二”配各（就是六名攻手，其中兩位是二傳手），這正是美國男排主教練比爾預言的未來排球的陣容配備，也是未來排球的發(fā)展趨勢。其主要特點體現在二傳手的攻擊性越來越強。進攻意識不斷提高，二次扣球和二次輕吊球已經被廣泛應用。在比賽中，攻擊性強的二傳手不僅可以進攻得分，而且也可以有效牽制對方的攔網隊員，為進攻手突破對方攔網創(chuàng)造有利條件，效果十分顯著。

3、二傳的核心作用越來越突出。比賽中，二傳是教練員戰(zhàn)術意圖的直接實施者，是全隊進攻戰(zhàn)術的發(fā)起人和組織者。是全隊由守轉攻的樞紐。在進攻與防守轉換的銜接發(fā)揮著越來越重要的作用。二傳的核心作用越來越突出。

二、現代排球比賽對二傳手的要求

二傳的作用不僅要把球既穩(wěn)又準地調整起來，便于本方隊員扣球；而且應根據臨場情況靈活巧妙地運用各種隱蔽動作，以迷惑對方，造成對方攔網上的錯覺和失誤，為本方進攻隊員創(chuàng)造有利條件。因此，作為一名優(yōu)秀的二傳隊員，必須具備以下幾項要求：

1、良好的身體素質和快速、靈活的移動能力。二傳手應根據第一次傳墊球的方向、弧度、速度和落點準確的判斷，并迅速的起動和移動，保持好人與球的位置關系。

2、視野寬廣。二傳要為本隊的進攻創(chuàng)造好機會。因此，二傳隊員必須有寬廣的視野，才能通觀全場，胸有成竹，并在一剎那做出正確的判斷和行動，而觀察必須適時，邊移動、邊取位、邊觀察。

3、心理素質過硬。比賽時沉著果斷、機智靈敏，戰(zhàn)術意識強。能準確判斷對方的戰(zhàn)術意圖。了解自己每個隊員及對方的特點和特長，善于激勵士氣。鼓舞斗志。勝不驕，敗不餒。能在激烈的比賽中，團結全隊不失時機地組織進攻。

4、技術全面性和運用技術的合理性。例如：一傳高而逼近球網，二傳手應及時跳起作跳傳球。擊球部位約在額上，靠近網的一只手用力應稍大，以免使球傳過球網。一傳離網較遠（即調整二傳），二傳手應迅速回撤取位，傳球時觀察好出球的位置和距離，使出球的方向與扣球手的助跑路線在網前形成恰當的交叉點。一傳平快而沖向球網，二傳手應迅速卡位，注意腳步站穩(wěn)，并使重心穩(wěn)定，避免觸網或過線犯規(guī)。傳球時，靠近球網的一只手要稍加大用力，以免二傳過網或傳球落網。

三、優(yōu)秀二傳手的基本訓練方法

1、加強基本功訓練。基本功是排球技術的基礎環(huán)節(jié)，二傳的基本功主要包括手、腳、視野、戰(zhàn)術意識以及球性五方面內容。其中手是關鍵，腳是基礎，腰是樞紐，[（視野）是向導，意識是靈魂，它們之間相互作用、相互影響。因此，二傳的基本功訓練要求：手、腳、[（視野）、戰(zhàn)術意識和球感練習幾個方面的高度統(tǒng)一。只有抓好二傳的基本功訓練，才能為二傳技術的提高打下堅實的基礎。

2、抓好重點技術與特長技術的訓練。二傳技術的重點主要是指一個球隊的主要進攻戰(zhàn)術的組織方式對二傳球的要求。競技水平高低的不同，二傳技術的重點也因隊而異。例如：對于水平較低的球隊來說，其二傳技術的重點是如何組織各種快攻戰(zhàn)術傳球；對于具備較高水平的球隊來說，其二傳技術的重點是在熟練組織各種快速多變戰(zhàn)術的基礎上，如何提高具有掩護作用的跳傳球、晃傳球以及各種二傳的假動作。同時，二傳隊員在具備能夠組織與全隊配合的各種戰(zhàn)術球基礎上，重點發(fā)展二傳的特長技術，即“絕活”技術，是現代排球比賽對優(yōu)秀二傳隊員的要求。

篇6

關鍵詞：形體訓練；微課；示范；糾錯；自主探究；合作學習

形體訓練是優(yōu)美、高雅的健身項目，通過長期的練習會改善神經系統(tǒng)和大腦的功能，提高心血管系統(tǒng)功能，矯正人的形體，使每個人的形體都具有獨特的魅力。在實踐練習中形體訓練主要通過舞蹈基礎練習，結合芭蕾舞、古典舞、民族民間舞等進行綜合訓練，以動作為語言，強調基本功訓練，以達到塑造人優(yōu)美的體態(tài)，培養(yǎng)高雅的氣質的目的。教學中教師借助微課來進行形體訓練會使學生耳目一新，有效地幫助學生夯實基礎，扎實基本功，達到糾正生活中不正確的姿態(tài)的目的，有利于學生綜合素質的提高。

一、微課方便示范演示，展示生動形象

古人說“窈窕淑女，君子好逑”“形體不蔽，精神不散，亦可以百數”，通過這些語言可以看到形式的重要性。對于學生而言，形體訓練可以培養(yǎng)他們超凡脫俗的氣質，使他們看起來高貴、典雅。隨著科技的發(fā)展，在形體教學中教師亦可以融入微課，通過微課的方式來展示教學內容，達到示范演示的目的，促進學生更加了解動作要領和練習技巧，在觀看中培養(yǎng)學生的觀察力和感知能力，進而采用模仿的方式來提高自己動作的標準性。

例如在進行形體訓練的基本站立姿勢，手位腳位練習，氣息動作結合練習時，教師就可以把這些基本動作錄制成一個簡單的微課，時間不用很長，5～10分鐘即可，展示出動作的要領和技巧。課堂學習時，教師可以通過播放微課的方式給學生進行示范演示，使學生不僅可以掌握動作要領，而且還可以通過生動形象的視頻，看到標準動作，從而提高學生動作的規(guī)范性，更加標準地進行練習。在觀看微課的過程中，學生可以了解正確的立、坐、臥和走、跑，氣息在形體訓練中的運用，通過模仿的方式來練習，在觀看中體會頭面部的形態(tài)和表現，即人的聲、容、笑、貌。微課的幫助減少了教師的重復示范和展示，方便了學生的學習，在觀察中掌握動作要領，提高自己的形體。在形體訓練中，基本站姿正確與否，直接影響人各種運動行為的美。

二、微課便于糾錯更正，體現動作要領

在傳統(tǒng)的授課方式中，教師示范后就會讓學生進行模擬練習，學生只是按照自己的理解和認識來模仿?？墒菍W生做的動作有些是不規(guī)范的，有些是不標準的，甚至是錯誤的。學生心中并沒有一個清晰地認識，他們的模仿并不到位。有了微課的幫助，學生可以反復觀看視頻，在觀看中了解自己的不足和錯誤，從而自主地糾正錯誤，提高自己動作的規(guī)范性。微課短小精煉，把形體訓練中的要點和重點通過寥寥幾句就表達的淋漓盡致，使學生可以關注要點，糾正自己的錯誤和不足，大大提高了學生的練習效率和學習效果。而且視頻的方式具有畫面生動形象的優(yōu)勢，方便了學生的記憶和模仿，促進學生進行準隊形的練習，實現學有所得，樂在其中。例如在進行腿的訓練時，教師就可以把相關的包括胯的開度、腿的力量、膝的直立、腳踝關節(jié)的柔韌靈活和腳背的勾繃制作成微視頻，通過微課的方式來幫助學生糾正自己的錯誤和不足。在訓練中，學生會圍繞著芭蕾基本元素“開、繃、直”來完成。由于剛剛接觸這些動作，學生出現不標準是很正常的事情。通過對于微課的觀察會促進學生觀察細節(jié)，在細節(jié)中追問、思考、發(fā)現，進而形成自己的反思，提高動作的規(guī)范性，在訓練中形成優(yōu)雅姿態(tài)，也傳播了它們高雅的藝術精髓。在視頻微課的幫助下，學生把自己的練習情況及時地反饋給了教師，有利于教師及時地評價和指導，促進學生對于動作的掌握，統(tǒng)一了學生的精神美和形體美，提高了學生的內涵修養(yǎng)和高雅的氣質、風度。

三、微課適合自主探究，學習目標明確

微課是以微視頻為核心，并整合了微教案、微課件等內容，是一種實情境化的教學資源環(huán)境。它時間短，內容精，展示出了學習要點和重點，促進學生在學習過程中可以關注要點，提高自己的探究能力。微課是基于網絡教學基礎上的，它打破了時空的限制，學生可以借助手機、電腦來學習，并不是離開了課堂就不能學習了。這種學習模式使學生感受到了隨時隨地學習的樂趣，他們可以自主觀看，自主探究，自主練習，在實踐中提高自己的形體素質和學習能力。通過學生的自主探究，他們會發(fā)揮自己的的個性，融入自己的理解和認識，促進學生潛能展現，大大提高了學生的學習興趣。

例如為了提高學生的柔韌性，教可以采用對肩、腰、腿等部位的拉伸練習來實現。教師把教學內容錄制成微課，課堂帶領學生一起學習、觀看，課下傳給學生，鼓勵學生自主探究，引導學生養(yǎng)成自主練習的好習慣，讓學生在探索和實踐中發(fā)展柔韌性，實現學生的行為美和形體美。

四、微課實現合作學習，圍繞微課探究

微課的內容可以循環(huán)利用，反復利用，這大大降低了教師的重復勞動，也方便了學生分反復學習。教師可以通過微課的方式把學習內容提供給學生，鼓勵學生通過合作學習的方式來探究學習要點和重點。合作使學生可以暢所欲言，交流彼此的經驗和感受，提高學生對于形體練習動作要領的掌握。學生可以通過一邊觀看一邊討論的方式來學習，大大提高了學生對于動作要領的理解，有利于學生形成自己的體會。

例如，為了提高學生的協(xié)調性、彈跳力和耐力，教師可以把舞蹈、健美操等組合動作的練習來發(fā)展學生的協(xié)調性；采用基本功中的俯臥撐、仰臥起坐、踢腿等動作練習來發(fā)展學生的力量和彈跳力；采用跑跳操等練習來提高學生的耐力。學習內容多而復雜，使學生有些望而生畏。為了減少學生的畏懼心理，教師可以鼓勵學生合作討論，通過合作的方式來溝通、交流，表達自己的理解和認識，進而在你一言，我一語中提高認識，鍛煉能力，讓學生的精力更加充沛、旺盛，使學習和工作更有節(jié)奏和效率。

總之，微課融入形體教學中給教師提供了很多方便，使學生可以隨時隨地進行練習，改善和提高自己的形體，從而幫助學生塑造出優(yōu)美的線條和身形，培養(yǎng)學生良好的體態(tài)、優(yōu)雅的氣質。通過微課的指導和幫助，學生會自主練習，提高了學生的健康水平，改善了身材的不足，實現學生的全面發(fā)展。

參考文獻：

篇7

【關鍵詞】 低聚原花青素；鏈脲佐菌素；糖尿??；血糖；脂質過氧化物

【Abstract】 Objective Observing the effect of OPC on reducing blood glucose in diabetic rats.Methods The diabetic animal models were reproduced by streptozotocin （50mg/kg）abdominal cavity injection. The positive control group were treated with metformin hydrochloride （MH），［30mg/（kg·d）］，the other two treatment groups were treated with oligomeric proanthocyanidin ［50、500mg/（kg·d） respectively］， the model control and blank group were treated with NS water. After 4 weeks ， their blood samples were drawn， blood sugar and lipid peroxide were detected.Results The blood sugar and lipid peroxide did not change distinctly in the treatment groups with MH， To compare before and after treatment ，the plasmic glucose level and content of serum lipid peroxide declined distinctly in two treatment groups（P＜0.05 or P＜0.01）and 40 per cent of the models of diabetic rats were reduced.Conclusion Oligomeric proanIhocyanidin has an effect of decrease the plasmic glucose and lipid peroxide level of diabetes rats.

【Key words】 oligomeric proanthocyanidin; streptozotocin; diabetes; blood glucose

已有相當證據表明糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展過程與氧化應激增強密切相關［1，2］。馬尾松原花青素 （oligomeric proanthocyanidin，OPC）是從馬尾松樹皮中提取出來的一類多酚化合物，具有極強的抗氧化活性，是一種很好的自由基清除劑和脂質過氧化抑制劑［3，4］。一次性大劑量注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）可致β細胞壞死而無胰島炎，制成無炎性1型糖尿病模型，成模后即出現多飲、多尿和多食表現，其癥狀體征與臨床病人比較相似［5］。本文建立 STZ大鼠糖尿病模型，觀察馬尾松OPC對DM病理模型血糖水平的影響，為預防和治療糖尿病的OPC藥物開發(fā)和臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑 馬尾松原花青素（OPC）：桂林萊因生物科技股份有限公司（含量98%）；鏈脲佐菌素（STZ）：美國Sigma公司；鹽酸二甲雙胍片：浙江國光生物制藥有限公司；血糖（FBG） 試劑盒、脂質過氧化物（LPO） 試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供；檸檬酸、檸檬酸鈉等試劑均為分析純。

1.1.2 實驗動物 健康雌性SD大鼠，體重320～330g，購自中國科學院上海實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK（滬）2003-0003；使用許可證號：ZYXK（浙）2003-0003。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型（DM）制備 參照文獻方法［5］，用 0.1mol/L、pH 4.2的檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液配制成0.5％ 的溶液，一次性腹腔注射 STZ（50mg/kg）的方法復制大鼠糖尿病模型，72h（禁食12h）后測定FBG，FBG大于11.1mmol/L者可確定為糖尿病模型大鼠。

1.2.2 分組與給藥 造模前隨機分出10只大鼠作為正常對照組，造模后確定的DM模型大鼠隨機分為模型對照組、陽性對照組（鹽酸二甲雙胍）、OPC高劑量給藥組、OPC低劑量給藥組，每組12只。高劑量組按每日500mg/kg給藥，低劑量組按每日50mg/kg給藥，模型對照組和正常組每日灌等容量蒸餾水。陽性對照組按每日30mg/kg給藥，均于上午灌胃1次，連續(xù)治療4周。

1.3 指標測定 各組大鼠取血前禁食12h，分別斷尾取血，供測定血清 FBG、LPO；血糖測定采用葡萄糖氧化酶法，LPO測定采用TBA法，均按試劑盒說明操作。

1.4 統(tǒng)計學處理 各組實驗數據以均數±標準差表示，應用 SPSS 11．5統(tǒng)計分析軟件進行組間均數差異的 F檢驗，每兩組間均數比較采用 q檢驗。P

轉貼于 　2 結果

2.1 大鼠血清FBG變化 檢測結果表明，模型組動物FBG在整個實驗過程中一直處于升高趨勢，且與正常組差異具有非常顯著性（P

2.2 血清 LPO變化 實驗結果見表2。模型對照組與正常組相比，血清LPO含量明顯升高 （P

3 討論

鏈脲佐菌素通過自由基損傷β細胞，使β細胞功能受損，胰島素合成減少，引發(fā)糖尿病［6］。本研究顯示OPC具有顯著降低糖尿病大鼠血糖，干預 DM 發(fā)展的作用，以高劑量作用更為顯著，其中有40%的DM大鼠FBG值恢復正常。OPC的作用可能與其強大抗氧化能力有關，能夠有效對抗活性氧自由基引起的β細胞毒性的作用、修復胰腺組織氧化損傷作用［7］。

從目前臨床所用的降糖藥物來看，各種西藥都有一定的局限性和肝腎功能損害、胃腸道反應等不良反應，而抗糖尿病中成藥的應用也存在著藥物組分、含量不明、療效緩慢等問題，馬尾松OPC是從天然植物中提取，具有高效、低毒、高生物利用率的特點，隨著世界“回歸自然”熱潮的形成，OPC有望成為一種新的安全的糖尿病預防和臨床治療藥物。

【參考文獻】

1 段有金．氧自由基與糖尿?。毡踞t(yī)學介紹，1999，20（7）：331-332.

2 郭婷，逢鍵粱，王曉波．氧自由基與胰島素依賴型糖尿病發(fā)病機制．國外醫(yī)學·生理、病理科學與臨床分冊，1999，19（4）：320-321.

3 吳春，陸海燕，代麗君，等．原花青素的抗氧化活性研究．哈爾濱商業(yè)大學學報（自然科學版），2005，21（4）：457-460.

4 劉葉玲．原花青素的藥理學研究進展．現代醫(yī)藥衛(wèi)生，2006，22（15）：2321-2322.

5 黃琛，顧志峰，曹曉蕾，等．Ⅰ型糖尿病大鼠模型建立及穩(wěn)定性研究．現代檢驗醫(yī)學雜志，2007，22（3）：49-51.

篇8

【摘要】 目的 探討丹參酮ⅡA(TanⅡA)對谷氨酸(Glu)聯合β淀粉樣蛋白2535 (Aβ2535)誘導PC12細胞、Meynert核(nbM)神經元損傷的保護作用。方法 培養(yǎng)PC12細胞，用MTT法觀察TanⅡA三個不同濃度(2.5、5.0、10 μmol/L)對Glu聯合Aβ2535損傷PC12細胞的保護作用;運用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)技術，檢測急性分離nbM神經元在Glu聯合Aβ誘導損傷時細胞內鈣離子濃度(〔Ca2+〕i)變化，及不同濃度TanⅡA對這種〔Ca2+〕i變化的影響。結果 MTT檢測結果表明，TanⅡA 各組細胞活力、損傷程度與單純Aβ+Glu損傷組相比有顯著差異(P

【關鍵詞】 阿爾茨海默病;β淀粉樣蛋白;谷氨酸;Meynert基底核;PC12細胞

【Abstract】 Objective To explore the protection of TanshinoneⅡA (TanⅡA) on damage of PC12 cells and nucleus basalis of meynert (nbM) neurons induced by glutamate (Glu) and βamyloid protein 25～35 (Aβ25～35). Methods MTT assay was used to observe the protection of different dosages of Tan ⅡA(2.5， 5.0， 10 μmol/L)on cellular damage induced by Glu and Aβ2535. Laser scanning confocal microscopy (LSCM) technique was adopted to detect the change of the intracellular free calcium concentration (〔Ca2+〕i). Results There were significant differences on the cell survival and the extent of damage between the each Tan ⅡA group and Aβ+Glu group (P

【Key words】 Alzheimer′s disease (AD); βamyloid protein (Aβ); Glutamate (Glu); Nucleus basalis of Meynert (nbM); PC12 cells

目前西醫(yī)治療阿爾茨海默病(AD)主要是停留在緩解癥狀上。相比之下，祖國醫(yī)學在延緩衰老以及老年性疾病的防治方面有著豐富的理論和實踐經驗，具有潛在的優(yōu)勢和廣闊的開發(fā)前景。中藥丹參〔1〕屬于活血化瘀類中藥，同時具有養(yǎng)血安神功效。丹參酮ⅡA(TanⅡA)為丹參有效成分之一，為脂溶性、櫻紅色、針狀結晶。TanⅡA分子式C19H18O3，分子量294.33，含有醌型結構，易被氧化還原，可參與機體的多種生化反應而有多種生物活性，如降低血液黏滯度、擴張冠狀動脈、抗血小板聚集、清除氧自由基、抗脂質氧化、抗腫瘤、抗菌、消炎、雌激素樣作用、保護神經元細胞及改善心腦缺血等廣泛的藥理作用。在心肌缺血/灌注損傷防治中，TanⅡA具有類異搏停樣L型鈣通道阻斷劑作用〔2〕。本研究將探索TanⅡA對谷氨酸(Glu)聯合β淀粉樣蛋白2535(Aβ2535)誘導PC12細胞、Meynert核(nbM)神經元損傷的保護作用，以便為尋找有效防治AD中藥提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料 TanⅡA (西安鴻生生物技術有限公司);噻唑藍(MTT)(Sigma公司);DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司);新生牛血清(杭州四季青生物工程公司);Glu、Aβ2535、Fluo3/AM、HEPES、鈣離子載體Ionomycin均購于美國Sigma公司;EGTA(Amresco)。PC12細胞為張葳蕤惠贈。實驗動物：正常SD大鼠(10～15 d)，體重約20～30 g，雌雄不拘，由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 PC12細胞的培養(yǎng)及大鼠nbM神經元的急性分離 PC12細胞用含有15%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內，隔2 d換液一次，當細胞生長達70%～80%融合時傳代、繼續(xù)培養(yǎng)。取對數生長期的細胞用于實驗。急性分離nbM神經元的方法參照文獻〔3，4〕：根據包新民等〔5〕所編的大鼠腦立體定位圖譜來定位nbM。大鼠在10%水合氯醛腹腔麻醉下，快速斷頭取腦，移入冰的標準細胞外液(通O2)中冰浴約1 min，快速修剪后黏到標本臺上放入切片機槽內切活腦片，片厚400 μm，將切片移入標準細胞外液中(通O2)，孵育平衡50 min;31℃條件下，用 0.016% pronase E消化20～30 min;再移入標準細胞外液中平衡1.5～2 h，用特制的針扎取nbM，放入充氧的標準細胞外液中，使用不同內徑并經過熱拋光的Pasteur玻璃管吹散組織塊，使之成為單細胞懸液。移細胞懸液至多聚賴氨酸預處理的Petri培養(yǎng)皿中，20 min后待神經元完全貼附于培養(yǎng)皿上，用標準細胞外液輕輕沖洗培養(yǎng)皿2～3次，洗掉未貼壁的細胞及組織碎片，繼續(xù)下一步實驗。整個實驗過程在20℃～26℃條件下進行。

1.2.2 主要溶液及其配制 Aβ的“老化處理”：將Aβ2535溶解于消毒的三蒸水，37℃孵育72 h，使其變成聚集狀的Aβ，儲備濃度10 μmol/L，4℃保存，用時用DMEM培養(yǎng)液稀釋成工作濃度;TanⅡA配制：用二甲基亞砜(DMSO)避光震蕩溶解TanⅡA干粉，配成1 mmol/L儲備濃度，4℃保存;用時再和培養(yǎng)液稀釋成工作濃度;標準細胞外液(mmol/L)：NaCl 150，KCl 5，CaCl2 2，MgCl2 1，HEPES 10，葡萄糖10，將以上成分按濃度溶解于去離子水中，用Trisbase將pH值調至7.4;Fluo3/AM，用DMSO配成885 μmol/L，置20℃避光保存。

1.3 實驗處理

1.3.1 PC12細胞的實驗處理 取對數生長期的PC12細胞，使其密度約105個/ml，每孔100 μl，接種于96孔板。實驗分3組：空白對照組、Glu組、Aβ+Glu損傷組，Aβ+Glu損傷組又分為單純Aβ+Glu損傷組和TanⅡA組，其中TanⅡA組再分為2.5、5.0、10 μmol/L三個濃度亞組。用100 nmol/L的Aβ提前處理Aβ+Glu損傷組細胞12 h，再加入5 mmol/L Glu處理24 h，TanⅡA組將Glu和TanⅡA同時加入處理24 h，倒置顯微鏡下觀察形態(tài)學變化，MTT法觀察細胞活力。其中空白對照組加等量的培養(yǎng)液代替。

1.3.2 MTT法檢測 取對數生長期的PC12細胞，使細胞密度約105個/ml，每孔100 μl，接種于96孔板。按照上述實驗分組(每組8孔)和處理后進行MTT 檢測：每孔加入噻唑藍(5 mg/ml)20 μl，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，小心吸棄每孔的培養(yǎng)液后，每孔加入150 μl DMSO，置振蕩器震蕩至紫色結晶完全溶解，酶聯免疫檢測儀492 nm 波長，630校正參數，測定光密度(OD)值，以對照組存活率為100%作為基準，來研究分析其他各組變化。重復實驗3次。

1.3.3 大鼠nbM 神經元〔Ca2+〕i測定 實驗分為空白對照組和Aβ+Glu損傷組，Aβ+Glu損傷組又分為單純Aβ+Glu損傷組、TanⅡA組，其中TanⅡA組再分為2.5、5.0、10 μmol/L三個濃度亞組。nbM神經元Fluo3/AM負載：急性分離的nbM神經元接種于Petri培養(yǎng)皿。Petri培養(yǎng)皿加入終濃度為8.85 μmol/L的Fluo3/AM 100 μl，37℃避光孵育40 min負載。上機檢測細胞負載情況，用標準細胞外液洗去負載液?！睠a2+〕i動態(tài)變化的LSCM檢測：將裝有負載好的nbM 神經元的Petri培養(yǎng)皿置入載樣臺，在TCS SP2型激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)下動態(tài)掃描細胞熒光強度變化，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長526 nm。首先在熒光屏的直視下找出Fluo3負載良好的細胞，觀察其熒光圖像，于靜息狀態(tài)下快速預掃描2～3 min，獲得基線值，然后用微量進樣器加入干預因素即時進行檢測，并繪出細胞〔Ca2+〕i變化的熒光光密度曲線圖。每40 s掃描一次，共掃描40 min。〔Ca2+〕i計算公式為：〔Ca2+〕i=Kd×〔(F-Fmin) /(Fmax-F)〕。Kd是Fluo3與Ca2+反應的解離常數，Kd=400 nmol/L;F為所測到的熒光光密度值;Fmax為加入8 μmol/L的Ionomycin使Ca2+飽和后所測得的最大值;Fmin為加入10 mmol/L EGTA測得的最小值。

1.4 統(tǒng)計學處理 所有數據均以x±s表示，組間的顯著性采用單因素方差分析，數據處理過程由SPSS13.0軟件完成。

2 結 果

2.1 各組PC12細胞形態(tài)學變化 倒置顯微鏡下形態(tài)學觀察結果(圖1)可見對照組細胞表面光滑、光暈明顯、突起長，胞體呈梭形、錐形和橢圓形等;Glu損傷組胞漿內有細小黒色顆粒，細胞形狀和對照組比較無明顯差異，但細胞周圍光暈減弱、細胞密度降低;經100 nmol/L Aβ2535預處理的細胞與對照組比較變化不明顯，當再加入5 mmol/L Glu繼續(xù)孵育24 h后，部分細胞突起回縮，胞體腫脹，胞漿內出現大量黑色顆粒物質，細胞密度顯著降低，個別細胞完全崩解;用不同濃度TanⅡA處理后，細胞形態(tài)接近對照組，沒有明顯變化。細胞密度比Glu損傷組明顯提高。

2.2 TanⅡA對Glu聯合Aβ2535誘導PC12損傷的影響 Aβ+Glu組細胞存活力比對照組降低了12.3%，有顯著性差異(P

2.3 TanⅡA對大鼠nbM 神經元〔Ca2+〕i的影響 見表1，與空白對照組比較，Aβ+Glu組〔Ca2+〕i水平顯著升高(P

A～F：分別為空白對照組;Glu組;Aβ+Glu組;Aβ+Glu+TanⅡA 2.5、5、10 μmol/L組

圖1 各組PC12細胞形態(tài)學變化(×250)

3 討 論

制備可靠的AD模型將有助于研究、尋找AD的有效防治措施，因此建立AD動物模型和細胞模型的研究一直是國內外學者探索的熱點。以往用PC12細胞模擬AD細胞模型〔6〕的報告不少，本研究應用的細胞模型是借鑒本課題組前期研究采用原代培養(yǎng)基底前腦神經元模擬AD細胞模型方法〔7，8〕，其特長在于：將亞毒性劑量(100 nmol/L)的Aβ2535與Glu(5 mmol/L)聯合作用于PC12細胞和急性分離nbM神經元，在細胞水平以模擬出AD病變發(fā)生發(fā)展過程中的一個重要的側面，即與AD病相關的β淀粉樣蛋白的神經毒性，谷氨酸的興奮性毒性的機制，為篩選開發(fā)防治AD新藥奠定了基礎，提供了實驗依據。

Aβ是一個含有39～42個氨基酸的肽，為β淀粉樣蛋白前體蛋白(βAPP)水解產物。Aβ在腦內沉積是AD組織病理學特征性改變。Aβ引起神經毒性重要部位是第25～35位的氨基酸序列。Glu是哺乳動物腦內正常的且含量最高的興奮性氨基酸，參與中樞神經系統(tǒng)的信號傳遞，對神經系統(tǒng)正常功能的維持及學習記憶功能起重要的作用。研究表明興奮性氨基酸產生的興奮性毒性與Aβ細胞毒性有協(xié)同作用〔7，9〕。早期的Glu持續(xù)興奮作用最終可導致Glu能遞質系統(tǒng)衰竭而引起Glu及其受體或受體后改變，這種變化有利于APP產生Aβ。突觸間隙高濃度的Glu可間接的通過酸化環(huán)境增加Aβ的聚合，導致具有神經毒性的淀粉樣蛋白纖維數量增加〔10〕。生理狀態(tài)下，Glu對神經細胞的興奮作用快速而短暫，導致神經細胞去極化，產生興奮性突觸后電位，直接參與腦的學習和記憶活動〔11〕;病理情況下，中樞神經系統(tǒng)內的興奮性/抑制性氨基酸平衡被打破，組織內Glu濃度急劇升高，神經元上的NMDA受體門控的通道是Glu引起的Ca2+內流的主要途徑，當其過度激活時可致細胞內鈣超載，激活系列鏈式反應直接導致神經元的退行性病變和遲發(fā)性壞死。

1989年Disterhoft〔12〕提出了AD和腦老化的胞內鈣(〔Ca2+〕i)平衡自體失衡假說，認為神經細胞內的生理鈣濃度是維持其正常功能所必須的，但〔Ca2+〕i的持續(xù)升高會導致神經元損傷，為AD的退行性變提供了最后共同通路。本研究采用Glu聯合Aβ2535誘導PC12細胞、nbM神經元損傷，一方面表現為PC12細胞活力降低;另一方面觀察到了nbM神經元〔Ca2+〕i增加，提示Glu和Aβ2535聯合作用可能激活了神經元上NMDA受體，引起Ca2+通道過度開放，Ca2+內流增加致細胞內鈣超載。

中藥丹參已在臨床廣泛應用，TanⅡA是丹參提取物有效活性成分之一，文獻報道〔13～15〕其具有多種功效。本實驗結果表明TanⅡA能提高PC12細胞活力，LSCM觀察分析顯示TanⅡA濃度在2.5～10 μmol/L之間均可以減輕Glu聯合Aβ引起的nbM神經元內鈣超載。但TanⅡA對PC12細胞和nbM神經元的神經保護作用在本實驗采用的濃度范圍內不存在劑量依賴關系。本研究提示，TanⅡA通過提高細胞存活力和維持細胞內鈣離子濃度穩(wěn)態(tài)以對抗Glu聯合Aβ2535損傷作用。TanⅡA防治AD的詳細作用及其機制有待于進一步深入研究。

參考文獻

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篇9

【關鍵詞】 泮托拉唑； 幽門螺桿菌； 慢性胃炎； 對照研究

胃炎是臨床最為常見的消化道疾病之一，是指任何病因引起的胃黏膜炎癥，常伴有上皮損傷和細胞再生。慢性胃炎的發(fā)病率較高，占接受內鏡檢查患者中的80％～90％。Hp是慢性活動性胃炎、消化性潰瘍、胃癌和黏膜相關淋巴組織淋巴瘤的重要病因。根治Hp感染至關重要，但仍有近20％的患者采用推薦的根除方案治療后，Hp仍未轉陰，其原因主要與菌株對抗生素耐藥有關［1］。近幾年來，由于幽門螺桿菌耐藥性增加，標準三聯治療的根除率有所下降［2］。本研究采用泮托拉唑5 d療法治療幽門螺桿菌感染的慢性胃炎，取得了較好的效果，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 入選2010年6月～2011年6月本科住院及門診有明顯異常的慢性胃炎且幽門螺桿菌陽性患者60例。入選標準：（1）符合第三次全國幽門螺桿菌感染若干問題共識制定的納入標準［3］；（2）患者有消化不良癥狀，并經胃鏡檢查證實為慢性胃炎；（3）胃鏡胃黏膜活檢病理組織切片染色及快速尿素酶法檢測Hp均陽性；（4）治療前1個月內未用過抗酸劑、鉍劑及抗生素。排除標準：（1）合并有心、肝、腎功能異常者；（2）妊娠期及哺乳期女性；（3）伴有哮喘、自身免疫性疾病、精神疾病等其他系統(tǒng)性疾病有可能影響觀察過程者或長期服用類固醇激素或非甾體抗炎藥者；（4）有消化性潰瘍出血或中晚期癌癥者；（5）對試驗中任一種實驗藥物過敏者。60例患者中，男39例，女21例。年齡25～72歲，平均43.5歲。將患者隨機入選三聯、四聯組，每組各30例。兩組患者的性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性。

1.2 方法 治療組實行PAC方案：泮托拉唑40 mg(2次/d)+阿莫西林1.0 g(2次/d)+克拉霉素500 mg(2次/d)，口服7 d。四聯治療組實行PBMT方案：泮托拉唑40 mg(2次/d)+膠體次枸櫞酸鉍220 mg(2次/d)+四環(huán)素750 mg(2次/d)+甲硝唑400 mg(2次/d)，口服5 d。治療結束后至少停藥4周后復查13C-尿素呼氣試驗，結果≤4‰為Hp陰性，表示根除成功。所有患者治療期間隨訪記錄服藥期間的不良反應，包括頭痛、頭暈、嗜睡、惡心、食欲不佳、腹瀉、嘔吐、便秘、皮疹等，評估治療藥物的安全性。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，Hp根除率均以按實驗方案(PP)和按意圖治療(1TT)分析表示，計量資料以均數±標準差（x±s)表示，兩組間比較采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，以P

2 結果

2.1 一般情況 三聯治療組30例，有1例因惡心、嘔吐自行停藥，1例患者失訪；四聯治療組30例，1例患者失訪。

2.2 根除率比較 三聯治療組根除成功18例，四聯治療組根除24例。三聯治療組ITT根除率為60.0%(18/30)，低于四聯治療組的80.0%(24/30)；三聯治療組PP根除率為64.3%(18/28)，亦低于四聯治療組的82.8%(24/29)，兩組Hp根除率比較差異均有統(tǒng)計學意義（P

2.3 安全性比較 各組患者的不良反應無差別，均以惡心、食欲不佳較多見，腹瀉、嘔吐、皮疹較少見，且癥狀較輕，停藥后不良反應自行消失。三聯和四聯治療組不良反應發(fā)生率分別為53.3%(16/30)和60.0%(18/30)。

3 討論

Hp根除治療是治療慢性胃炎、消化道潰瘍等上胃腸道疾病以及不明原因的缺鐵性貧血等胃腸外疾病的重要方面。目前推薦使用的一線根除治療方案是PPI三聯，即聯合應用質子泵抑制劑(PPI)和兩種抗生素，抗生素一般從克拉霉素、甲硝唑和阿莫西林中選取兩種［4］。傳統(tǒng)四聯療法Hp根除率可達到90%以上，但是很少用于一線治療，多用于三聯方案根除治療失敗后的補救治療。四聯療法不能廣泛應用的一個重要原因是該方案治療復雜，不良反應發(fā)生率高，患者的依從性也較差。在抗生素選擇上，隨著克拉霉素和甲硝唑耐藥率不斷增高，對于甲硝唑、克拉霉素耐藥率較高的地區(qū)，不少研究嘗試使用左氧氟沙星、呋喃唑酮等耐藥率較低的抗生素組成新的一線治療方案，以提高Hp根除率，但不良反應較高，效果也不是很明顯［5，6］。

有研究表明， 4 d療法療效與7 d療法相同，但費用明顯減少，是效價比較好的方案［7］。因此本研究采用了四聯的5 d治療方案。本研究結果顯示，三聯治療組ITT根除率為60.0%，低于四聯治療組的80.0%；三聯治療組PP根除率為64.3%，低于四聯治療組的82.8%，兩組Hp根除率差異均有統(tǒng)計學意義，表明四聯療法的療效較三聯療法好，且不良事件發(fā)生率也無明顯差別，體現了四聯療法在根治幽門螺桿菌方面的優(yōu)勢，如患者的依從性好，三聯療法不能根除，可使用四聯療法進行治療。

我國“第三次幽門螺桿菌感染若干問題共識報告”中指出，為提高Hp根除率，避免繼發(fā)耐藥，可以將四聯療法作為一線治療方案?？傊?，泮托拉唑、鉍劑、四環(huán)素和甲硝唑的5 d四聯方案Hp根除率高，療程更短，不良反應少，用藥安全。

參 考 文 獻

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篇10

[關鍵詞] 骨髓間充質干細胞 視網膜色素上皮細胞 全反視黃酸 共培養(yǎng) 誘導分化

BMSCs是來源于骨髓的非造血干細胞，具有多潛能分化特性。與存在倫理學爭議的胚胎干細胞及增殖能力有限的視網膜祖細胞相比，BMSCs以其具有自體同源性、易分離和操作簡單等顯著優(yōu)勢，成為視網膜細胞移植治療的理想供體。已有研究表明，視網膜細胞培養(yǎng)上清液能夠體外誘導胚胎干細胞向神經細胞分化[1]。本研究旨在探討B(tài)MSCs誘導分化的條件培養(yǎng)基。

1 材料和方法

1.1 主要儀器

THERMO FORMA 3111 CO2培養(yǎng)箱（美國）；AIR-TECH BCM-1000A型生物潔凈工作臺（蘇州）；OLYMPUS 1×70熒光倒置式相差顯微鏡（日本）；OLYMPUS PMCB20攝影器材（日本）；OLYMPUS BH-2型光學顯微鏡（日本）。

1.2 試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25％胰蛋白酶（均為Gibco公司）、PBS粉（Sigma）、實驗用體重為80g清潔級sD大鼠。培養(yǎng)基（DMEM、DMEM／F12）、胎牛血清（FBS）購自Gibco公司；抗體為鼠抗人角蛋白-18單克隆抗體（北京中杉公司），小鼠抗大鼠神經元特異性標志烯醇化酶（NSE），星形膠質細胞特異性標志小鼠抗大鼠單克隆抗體神經膠質酸性蛋白(GFAP)，光感受器特異性標志小鼠抗大鼠單克隆抗體視紫質(Rhodopsin)，(均為Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 hRPE細胞的取材、原代、傳代培養(yǎng)及鑒定

采用眼杯消化法[2]，沿角鞏緣后3.5mm環(huán)形剖開眼球，棄除眼前節(jié)、玻璃體及神經視網膜獲得眼杯，用0.25%胰酶消化獲取HRPE細胞、15％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，細胞接近融合狀態(tài)時進行傳代培養(yǎng)。將第二代hRPE細胞置入六孔板中，孔板中放入18×18蓋玻片，利用免疫細胞化學EnVision法檢測角蛋白表達。

1.3.2 BMSCs的分離培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)及鑒定

清潔級SD大鼠，無菌條件下取出雙側股骨，從股骨干和脛骨干中間剪斷，用10mLDMEM/F12培養(yǎng)液+20%FBS+肝素反復沖洗骨髓腔，沖洗液經200目不銹鋼標準篩過濾掉大的團塊后充分吹打混勻獲取細胞懸液，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。3d后首次換液，換液時倒除舊的培養(yǎng)液，加入含0.04%EDTA的PBS 4mL，37℃孵育10min，倒除PBS，加入新的完全培養(yǎng)液。當第3代MMSC細胞融合達80%~90%時，利用流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD34、CD44和CD90表達對細胞純度進行鑒定[3]。

1.4 實驗分組

1.4.1 hRPE培養(yǎng)上清液+BMSCs+RA組：取二代hRPE細胞懸浮液含2000個細胞接種在transwell六孔雙層培養(yǎng)板的上層，將BMSCs接種于下層培養(yǎng)板中，接種密度2.0×103個細胞/孔，在雙層六孔板的每孔中加入終濃度為1μmol/L的RA，同時在下層放入18mm×18mm蓋玻片進行細胞爬片，隔天換液。（還是每日半定量換液）倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.4.2 hRPE培養(yǎng)上清液+BMSCs組：取二代HRPE細胞懸浮液含2000個細胞接種在六孔transwell六孔雙層培養(yǎng)板的上層，將MSC接種于下層培養(yǎng)板中，接種密度2000個細胞/孔，同時在下層放入18 mm×18mm蓋玻片進行細胞爬片，隔天換液。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.4.3 單獨BMSc置于六孔板中爬片

2周后取出蓋玻片進行GFAP，NSE， Rhodopsin，細胞化學染色。

1.5 免疫細胞化學染色

將雙層六孔板中爬有HRPE和誘導前、后的BMSCs的玻片取出。

PBS潤洗3min×3次；

4％多聚甲醛室溫下固定20min，PBS沖洗3min ×3次；

0.1％TritonX.100室溫下處理l0min，PBS沖洗3min ×3次；

3%H2O2去離子水孵育10min，阻斷內源性過氧化物酶PBS沖洗3min ×3次；

羊血清孵育20min，封閉非特異性結合，勿洗；

適當稀釋度的一抗（角蛋白 1:300），GFAP 1:100，NSE 1:10，Rhodopsin 1:25，4℃孵育過夜，PBS沖洗3min ×3次；陰性對照片為用PBS 代替一抗；

二抗（生物素標記的羊抗鼠IgG抗體）37℃ 濕盒孵育30min，PBS沖洗；

DAB顯色6min；

蘇木素復染；

中性樹膠封片。

1.6 統(tǒng)計學分析

將三種培養(yǎng)條件下所表達的陽性細胞進行定量分析。利用HPIAS-2000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)對GFAP、NSE、Rhodopsin表達進行定量分析，每個標本隨機選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測定每個視野下陽性反應的平均光密度，以每個5個視野的平均光密度的平均值作為該例的測量值；同時選取至少10個隨機視野，每個視野在200倍物鏡下統(tǒng)計陽性細胞數和整個視野細胞總數，計算陽性細胞率，測量值均以 表示，統(tǒng)計數據采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理。組間差異采用ANOVA分析。以P

2 結果

2.1 hRPE以及BMSCs的取材和原代、傳代培養(yǎng)參照文獻[2]、[3]報告的方法

2.2 誘導分化的細胞形態(tài)學觀察及鑒定

hRPE培養(yǎng)上清液+BMSCs+RA組共培養(yǎng)3d后原來梭行的BMSCs 胞體已發(fā)生收縮，呈錐形，細胞邊緣變得不規(guī)整，有零星的細的突起（圖1A）。在誘導后14d后，BMSCs 呈漸進性的向神經元樣細胞轉化，有較多的長突起，有些長突起末端形成生長錐樣的膨大及絲性偽足呈典型的核周體形態(tài)，多極狀（圖1B）； 同時BMSC在誘導7D后，部分細胞發(fā)生遷移并相互之間建立突觸聯系(圖1C)。與hRPE培養(yǎng)上清液+BMSCs+RA組相比，不加RA則分化細胞明顯減少，也少有建立突觸聯系的細胞（圖1D）。

A：3d×400；B:14d×400；C:7d×400；單獨BMSCs:D:×400；

GFAP免疫細胞化學染色 E：×400; NSE免疫細胞化學染色F:×400；Rhodopsin免疫細胞化學染色G:×400；BMSCs+RA共培養(yǎng):H:7d×400。

圖1 RPE培養(yǎng)上清液+BMSCs+RA共培養(yǎng)

2.3 統(tǒng)計學結果分析

利用HPIAS-2000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)分別對兩種誘導條件下GFAP、NSE、Rhodopsin表達進行定量分析。

3 討論

BMSCs是目前備受關注的一群具有多向分化潛能的成體干細胞。具有高度可塑性，在一定誘導條件下具有向成骨細胞、成軟骨細胞、肌腱細胞、脂肪細胞以及基質細胞等中胚層細胞分化的能力。近年來，BMSCs 向神經細胞的分化研究受到了極大的關注。本試驗所用到的RA是一種維生素A的代謝產物，它可以影響脊椎動物的發(fā)育和許多類型細胞的分化。RA常被用來進行誘導多潛能干細胞向神經細胞分化的研究，但機制尚不明確。RPE 細胞可分泌多種細胞因子這些細胞因子, 包括PEDF、FGF、 TGF2β、IL21 等。其中PEDF是一種多效的神經營養(yǎng)因子。對中樞及外周神經系統(tǒng)的許多部位的神經元具有神經營養(yǎng)、神經保護和神經分化作用；bFGF能誘導體內視網膜的重建，刺激所有源自中胚層的細胞以及許多源自神經外胚層和內胚層細胞的增生；bFGF可介導神經元的分化、對光感受器具有重要的保護作用；TGF2β可在正常RPE 細胞中表達。可調控細胞生長、分化、細胞外基質合成。本試驗將三者共培養(yǎng)兩周，結果顯示：BMSCs可以高表達神經膠質細胞及神經元細胞特異性標志GFAP和NSE，同時我們還驚喜地發(fā)現誘導分化后的BMSCs表達光感受器細胞特異性標志Rhodopsin。這進一步證明了，BMSCs不僅可以向非間充質細胞轉化，還可以跨胚層由起始的中胚層向外胚層發(fā)育，這為臨床上進一步治療視網膜和視神經疾病奠定了基礎。

參考文獻：

[1] Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, et al. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons[J]. Journal of Neuroscience Research, 2000, 61( 4 ): 364 370.