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【摘要】目的觀察HPK1對SD大鼠全腦缺血/再灌注后海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的作用。方法采用四動脈結(jié)扎法建立大鼠全腦缺血模型,缺血15min后分別灌注30min、3h、6h、24h、3天和5天。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血/再灌注組、缺血/再灌注給藥組和缺血/再灌注溶劑對照組。缺血/再灌注給藥組再分為2組，分別腦室注射100g/L的HPK1AS-ODNs、HPK1MS-ODNs，每24h注射1次，連續(xù)3天，在最后一次注射24h后行四動脈結(jié)扎全腦缺血。使用免疫沉淀和焦油紫染色法等技術(shù)檢測相關(guān)信號蛋白的表達(dá)、活化水平及神經(jīng)元細(xì)胞的死亡。結(jié)果在大鼠海馬神經(jīng)元中有HPK1的表達(dá)，腦室注射AS-ODNs大鼠海馬CA1區(qū)存活錐體細(xì)胞明顯增多。結(jié)論HPK1反義寡核苷酸對缺血/再灌注引起的海馬神經(jīng)元凋亡具有保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】造血祖細(xì)胞激酶1;反義寡核苷酸;海馬；凋亡；大鼠

TheroleofHPK1inischemicbraininjury

LITing,ZHANGGuangyi*

(ResearchCenterforBiochemistryandMolecularBiology,JiangsuKeyLaboratoryofBrainDisease

Bioinformation,XuzhouMedicalCollege,Xuzhou,Jiangsu221002,China)

Abstract:ObjectiveToinvestigatetheroleofHPK1inthepyramidalcellsinCA1regionoftherathippocampusafterbrainischemia/reperfusion.MethodsTransientbrainischemia(15min)andreperfusionwasinducedbythefour-vesselocclusionmethod(4-VO)toestablishratbrainischemiamodel,followedbyreperfusionof0min,30min,3h,6h,24h,3dand5d,respectively.Ratswererandomlyassignedto4groups:sham-operationgroup,ischemia/reperfusiongroup,drugtestgroupandvehiclecontrolgroup.Thedrugtestgroupwasinjectedwith100g/LHPK1AS-ODNs，MS-ODNsintothecerebralventricle,every24hfor3days,and24hafterthefinaladministrationwassubjectedto4-VO.Immunoprecipitationandcresylfastvioletstainingwereemployedtodetecttheexpressionofrelevantmessageproteins,activationandthedeathofthehippocampalneurons.ResultsItwasfoundthatHPK1wasexpressedinrathippocampusneurons.ConclusionsAdministrationofHPK1antisenseoligodeoxynucleotidescansignificantlyprotecthippocampusneuronsfromapoptosiswithoutdose-dependence.

Keywords:HPK1;antisenseoligodeoxynucleotide;hippocampus;apoptosis;rat

造血祖細(xì)胞激酶1（hematopoieticprogenitorkinase1，HPK1orMAP4K1）是造血系統(tǒng)特異性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于哺乳動物Ste20相關(guān)蛋白激酶的MAP4K家族［1］。HPK1主要在造血組織和細(xì)胞中表達(dá)。大量研究結(jié)果表明，HPK1參與許多信號級聯(lián)反應(yīng)，包括MAPK(mitogen-activatedproteinkinase)信號、抗原受體信號、凋亡信號、生長因子信號以及細(xì)胞因子信號等。HPK1存在3種激活方式，即絲氨酸磷酸化、蘇氨酸磷酸化或酪氨酸磷酸化，Ling等［2］證明HPK1含有13個潛在的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，在造血系統(tǒng)內(nèi)當(dāng)其中某些酪氨酸磷酸化位點(diǎn)被ZAP-70(Zeta-chain-associatedproteinkinase70)激活后，HPK1將提供含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)錨定位點(diǎn)。當(dāng)HPK1的379位（小鼠）/381位（人類）酪氨酸殘基被磷酸化而激活后，HPK1具有了和SLP-76（SH2domain-containingleukocyteproteinof76kD）結(jié)合的能力。當(dāng)HPK1被完全激活后，它可以選擇性地激活JNK(c-JunNH2-terminalkinase)的MAPK信號通路［3］。1996年應(yīng)用PCR技術(shù)將HPK1從小鼠造血祖細(xì)胞中克隆出來后，研究表明HPK1主要在造血組織和細(xì)胞中表達(dá)，目前對于HPK1的研究主要集中在造血系統(tǒng)。本研究旨在探討HPK1是否存在于大鼠海馬神經(jīng)元中及其在缺血性腦損傷中的作用。

1材料和方法

1.1實驗動物及材料清潔級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重250～300g，徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

anti-HPK1（一抗）由SantaCruz公司提供；二抗（驢抗羊）和標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白購自美國Sigma公司。醋酸纖維膜（NC膜）為AmershanBiosciences公司產(chǎn)品；NBT/BCIP為Promega公司產(chǎn)品；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

電動勻漿器購自美國Glas-Col公司，Z252MK臺式高速冷凍離心機(jī)購自德國HERMLE公司。

HPK1反義寡核苷酸序列（AS-ODNs）5′-AGGGTCCACGACGTCCATCC-3′、HPK1錯義寡核苷酸序列（MS-ODNs）5′-CACAGCGTCGTACCCGCAGT-3′由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2四動脈阻斷全腦缺血模型按Pulsinelli法［4］進(jìn)行。

1.3動物分組及處理隨機(jī)分組：①Sham組，手術(shù)不缺血；②腦缺血/再灌注組（I/R組），腦缺血15min后再灌注30min、3h、6h、24h、3天、5天；③溶劑對照組（TE組），腦室注射Tris-EDTA，連續(xù)3天，在最后一次注射24h后進(jìn)行缺血/再灌注；④錯義寡核苷酸組（MS組），腦室注射MS-ODNs，方法同TE組；⑤反義寡核苷酸組（AS組），腦室注射AS-ODNs，方法同TE組。

1.4腦室注射參照文獻(xiàn)［5］方法。

1.5海馬CA1區(qū)HPK1檢測

1.5.1樣品制備大鼠缺血15min再灌注30min、3h、6h、24h、3天和5天時，斷頭快速取腦，分離雙側(cè)海馬。按文獻(xiàn)［6］方法制備海馬CA1區(qū)組織總蛋白。

1.5.2蛋白含量測定按Lowry等［7］方法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.5.3免疫印跡法蛋白樣品（50μg/L）經(jīng)SDS-PAGE分離后，以半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至NC膜，室溫封閉4h(1﹪BSA,10mmol/LTris，10mmol/LNaCL，0.1﹪Tween20)，加入一抗，4℃過夜。用洗滌液洗膜，加入相應(yīng)二抗，37℃保溫2h，封閉液洗膜。以NBT/BCIP顯色，水洗終止反應(yīng)。

1.6缺血/再灌注5天海馬CA1區(qū)組織學(xué)觀察大鼠腦海馬CA1區(qū)組織學(xué)切片制備參照文獻(xiàn)［6］方法。

在高倍鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元，有清楚的細(xì)胞核、胞體著色良好的計為存活神經(jīng)元，神經(jīng)元存活程度以CA1區(qū)1mm長度內(nèi)成活的大錐體神經(jīng)元數(shù)量表示。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)以±s表示，2組間數(shù)據(jù)比較采用新復(fù)極差法，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（AZOVA）,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1大鼠腦缺血/再灌注不同時間的HPK1免疫印跡分析結(jié)果如圖1所示，在缺血/再灌注不同時間海馬CA1區(qū)都可以檢測到HPK1的表達(dá)。

2.2缺血/再灌注5天后海馬CA1區(qū)組織學(xué)觀察Sham組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞核圓而蒼白；I/R組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞胞體皺縮，細(xì)胞核固縮；AS組錐體細(xì)胞形態(tài)保持較好。圖2。

（焦油紫染色，×40，×400）AS組海馬CA1區(qū)存活的神經(jīng)元數(shù)量較I/R組、TE組、MS組明顯增多；I/R組、TE組、MS組海馬CA1區(qū)存活的神經(jīng)元數(shù)量相近（P＞0.05）。見圖3。

3討論

HPK1是一個97×103的絲/蘇氨酸蛋白激酶，它在淋巴細(xì)胞中對于調(diào)節(jié)JNK細(xì)胞信號通路起著重要的作用［1］。大量的研究結(jié)果證明，HPK1主要在造血組織和器官中表達(dá)。但在神經(jīng)系統(tǒng)中HPK1起著什么樣的作用至今未見報道（網(wǎng)絡(luò)檢索）。HPK1的N末端由1個Ste-20樣激酶結(jié)構(gòu)域、4個脯氨酸富集motif、1個caspase切割位點(diǎn)組成，C末端為1個Citron同源結(jié)構(gòu)域［2］。Hu等［8］發(fā)現(xiàn)造血祖細(xì)胞瞬時表達(dá)HPK1可以通過MLK3-MKK4/7-JNK信號通路激活JNK，但不能激活ERK或p38-MAPK信號通路。Kiefer等［1］報道HPK1可以通過它的第3和第4個脯氨酸富集區(qū)與MLK3的SH3結(jié)構(gòu)域相互作用。在體外實驗中，HPK1通過磷酸化MLK3的絲氨酸281位而激活MLK3繼而激活JNK。本室早期的研究結(jié)果也證實MLK3在大鼠瞬時腦缺血中發(fā)揮著重要作用，在缺血15min再灌注6h時其磷酸化水平達(dá)到高峰［5-6］。于是，我們提出HPK1是否也參與了腦缺血/再灌注所引起的神經(jīng)元死亡的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路呢？

因此，我們首先通過免疫沉淀技術(shù)檢測了在大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中HPK1的表達(dá)。結(jié)果證實在大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中存在HPK1的表達(dá)。既然HPK1在大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中有表達(dá)，那么它有何作用呢？為了回答這一問題，我們設(shè)計了HPK1的反義寡核苷酸（HPK1AS-ODNs），腦室注射HPK1AS-ODNs預(yù)處理組大鼠海馬神經(jīng)元與I/R組相比明顯降低了腦缺血/再灌注所誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元死亡。以上結(jié)果證明，HPK1存在于大鼠海馬神經(jīng)元，并且HPK1AS-ODNs對缺血/再灌注所引起的CA1區(qū)神經(jīng)元缺失有保護(hù)作用。

本實驗首次在整體水平證實HPK1存在于大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中，并且發(fā)現(xiàn)我們設(shè)計的HPK1的反義寡核苷酸對于對缺血/再灌注所引起的CA1區(qū)神經(jīng)元缺失有保護(hù)作用。這對今后我們進(jìn)一步研究HPK1在全腦缺血中的作用及其分子機(jī)制提供了新的思路。

【參考文獻(xiàn)】

［1］KieferF,TibblesLA,AnafiM,etal.HPK1,ahematopoieticproteinkinaseactivatingtheSAPK/JNKpathway［J］.EMBOJ,1996,15(24):7013-7025.

［2］LingP,YaoZ,MeyerCF,etal.Interactionofhematopoieticprogenitorkinase1withadapterproteinsCrkandCrkLleadstosynergisticactivationofc-JunN-terminalkinase［J］.MolCellBiolo,1999,19(2):1359-1368.

［3］ArnoldR,LiouJ,DrexlerHC,etal.Caspase-mediatedcleavageofhematopoieticprogenitorkinase1(HPK1)convertsanactivatorofNFkappaBintoaninhibitorofNFkappaB［J］.JBioloChem,2001,276(18):14675-14684.

［4］PulsinelliWA,BrierleyJB.Anewmodelofbilateralhemisphericischemiaintheunanesthetizedrat［J］.Stroke,1979,10(3):267-272

［5］GuZ,JiangQ,ZhangG.c-JunN-terminalkinaseactivationinhippocampalCA1regionwasinvolvedinischemicinjury［J］.Neuroreport,2001,12(5):897-900.

［6］PeiDS,SunYF,GuanQH,etal.Postsynapticdensityprotein95antisenseoligodeoxynucleotidesinhibitstheactivationofMLK3andJNK3viatheGluR6.PSD-95.MLK3signalingmoduleaftertransientcerebralischemiainrathippocampus［J］.Neuroscienceletters,2004,367(1):71-75.

［7］LowryOH,RosebroughNJ,FarrAL,etal.ProteinmeasurementwiththeFolinphenolreagent［J］.JBioloChem,1951,193(1):265-275.

［8］HuMC,WangY,QiuWR,etal.Hematopoieticprogenitorkinase-1(HPK1)stressresponsesignalingpathwayactivatesIkappaBkinases(IKK-alpha/beta)andIKK-betaisadevelopmentallyregulatedproteinkinase［J］.Oncogene,1999,18(40):5514-5524