導(dǎo)語(yǔ)：自生固氮菌的隔離鑒別一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

摘要：從非豆科作物根際土壤中分離篩選得到213個(gè)在無氮培養(yǎng)基上能良好生長(zhǎng)的菌株，通過酶活測(cè)定，從中篩選得到18株固氮能力較強(qiáng)的菌株，并對(duì)其中酶活最高的4株菌株進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明它們屬于固氮菌科的不同屬。利用它們可望制成適合于不同農(nóng)作物生長(zhǎng)的生物復(fù)合肥。

關(guān)鍵詞：自生固氮菌；固氮酶；微生物肥料

0引言

微生物肥料的一些作用和生態(tài)效益是化學(xué)肥料所不具備的[1]，施用微生物肥料，能提高土壤肥力，刺激作物生長(zhǎng)和抑制有害微生物的活動(dòng)，從而達(dá)到增產(chǎn)的目的[2]。此外，生產(chǎn)微生物肥料投資少，可利用農(nóng)副產(chǎn)品就地取材。因而，微生物肥料的生產(chǎn)吸引了許多研究者的興趣。本文報(bào)道從水稻、小麥、玉米和蔬菜等非豆科作物根際土壤中分離得到18株固氮能力較高的自生固氮菌，并對(duì)其中am65、bn72、cx58t、dy82四株固氮能力最高的菌株進(jìn)行了分類鑒定，結(jié)果表明它們屬于固氮菌科的不同屬。

1材料和方法

1.1菌種

采集水稻、小麥、玉米和蔬菜等農(nóng)作物的根際土壤土樣56個(gè)，從中分離獲得213株在無氮培養(yǎng)基上能良好生長(zhǎng)的菌株。

1.2分離培養(yǎng)基及分離方法

1.2.1富集培養(yǎng)基

蔗糖15g，磷酸二氫鉀0.8g，硫酸鎂0.2g，氯化鈉0.2g，碳酸鈣1g，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的鉬酸鈉、硼酸、硫酸錳、硫酸亞鐵(現(xiàn)配)水溶液各1mL，水1000mL，pH為6.5～7.0，在250mL三角瓶中，每瓶分裝30mL，滅菌備用。

1.2.2富集培養(yǎng)方法

取3～5g土樣用50mL水制成混濁液，吸取5mL懸浮液裝入盛有30mL富集培養(yǎng)液的250mL三角瓶中，100rpm，28℃，培養(yǎng)3～5天后，換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)4～5次后，稀釋分離。

1.2.3平板分離培養(yǎng)基

在富集培養(yǎng)基中加入2%瓊脂制成平板分離培養(yǎng)基，滅菌后，倒入無菌培養(yǎng)皿中備用。

1.2.4分離方法

取富集培養(yǎng)后的培養(yǎng)液，稀釋涂布平板分離培養(yǎng)基。28℃培養(yǎng)2天后，將在稀釋度較大的平板上，生長(zhǎng)較大的菌落移入斜面。培養(yǎng)后，保藏備用。

1.3固氮酶活性測(cè)定

1.3.1氣相色譜法

參考文獻(xiàn)[3]的方法，略加改變，將2mL乙炔氣體沖入試管斜面內(nèi)，塞上無菌橡皮塞，28℃，培養(yǎng)24h后，用氣相色譜儀測(cè)量固氮酶的活性，每種取4～5個(gè)重復(fù)，進(jìn)樣量100μL，按以下公式進(jìn)行計(jì)算酶活。

EA1=(58.0×Se×T×Pe)/(Sb×Te×P×t)

(μmol/h(斜面))

Se：乙烯峰面積;T：開氏絕對(duì)溫度(T=273.13K)

Pe：實(shí)驗(yàn)條件下的大氣壓強(qiáng)(Pa);

Sb：乙炔峰面積;Te：實(shí)驗(yàn)條件下的溫度(K);

P：絕對(duì)大氣壓強(qiáng)(P=101324.72Pa);

t=培養(yǎng)時(shí)間(t=24h)

1.3.2微量凱氏定氮法[4]用以下公式計(jì)算含氮量：

EA2=((V1-V2)×14×1000)/V(mg/L)

V1：樣品滴定時(shí)用去的0.01N標(biāo)準(zhǔn)硫酸溶液毫升數(shù);

V2：空白滴定時(shí)用去的0.01N標(biāo)準(zhǔn)硫酸溶液毫升數(shù);

14：是1個(gè)毫克當(dāng)量氮的毫克數(shù);

V：發(fā)酵液樣品毫升數(shù)。

2結(jié)果和討論

2.1分離結(jié)果

從非豆科作物根際土壤中分離得到213個(gè)菌株，用氣相色譜法和微量凱氏定氮法測(cè)定它們的固氮酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，34株沒有固氮能力(含氮量<1mg/L)，161株有固氮能力(含氮量1～10mg/mL)，18株固氮能力較強(qiáng)(含氮量>10mg/mL)，其中am65、bn72、cx58和dy82四株菌產(chǎn)酶能力最高。表1對(duì)固氮能力較強(qiáng)的18株菌株的酶活測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。

表1：固氮酶活力測(cè)定結(jié)果(18株菌株)

表1中，EA1(μmol/h斜面)是用氣相色譜法測(cè)定各菌株的試管斜面的固氮酶活性值。按以下公式計(jì)算：EA1=(58.0×Se×T×Pe)/(Sb×Te×P×t)

雖然理論上，在固定條件下，乙炔還原活性與固氮酶對(duì)氮?dú)獾墓潭ɑ钚猿收嚓P(guān)，但在實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程中，會(huì)由于斜面的新鮮程度，斜面培養(yǎng)基中的某些組成等原因，而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，所以，每種菌都取5支對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的斜面做重復(fù)試驗(yàn)，以盡量減少誤差。EA2(mg/L)是將菌株接種到無氮培養(yǎng)液中，28℃，100rpm培養(yǎng)7天后，用微量凱氏定氮法測(cè)定最終發(fā)酵液的含氮量。按以下公式計(jì)算：EA2=((V1-V2)×14×1000)/V(mg/L)經(jīng)回歸分析[6]，EA1與EA2呈強(qiáng)正直線相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r=0.9527)，回歸方程為EA2=7.9560+0.5016×EA1，其結(jié)果與文獻(xiàn)[3]的有關(guān)報(bào)道相似。

2.2鑒定結(jié)果

2.2.1形態(tài)特征見表2所示。

表2形態(tài)特征

2.2.2生理生化特征見表3所示。

表3生理生化特征

表4褐球固氮菌、拜氏固氮菌和敏捷單孢菌模式種的特征[5]

2.2.3命名

根據(jù)以上形態(tài)和生理生化特征，參照[伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)](表4、表5列出了其中有關(guān)模式種的鑒別特征)，將以上四株菌命名如下：

am65：與固氮菌科，氮單胞菌屬的敏捷單胞菌相近，但甘露醇發(fā)酵及淀粉分解試驗(yàn)與模式種不同，暫定名為氮單胞菌am65(Azomonassp.am65)。

bn72：與固氮菌科，固氮菌屬的褐球固氮菌相同，定名為褐球固氮菌bn72(Azotobacterchroococ-cumbn72)。

cx58：為固氮菌科，拜葉林氏菌屬。兼有弗來明拜葉林氏菌和運(yùn)動(dòng)拜葉林氏菌的部分特征，其種的特征還有待于進(jìn)一步鑒定，暫定名為拜葉林氏菌cx58(Beijerinckiasp.cx58)。

dy82：與固氮菌科，固氮菌屬，拜氏固氮菌相同，定名為拜氏固氮菌dy82(Azotobacterbeijerinckiidy82)。

表5拜葉林氏菌屬內(nèi)運(yùn)動(dòng)拜葉林氏菌和弗來明拜葉林氏菌的特征[5]

注：+：少數(shù)細(xì)胞，絕大多數(shù)在幼齡時(shí)期;*：數(shù)字是代表在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株的百分?jǐn)?shù);

+(-)：大約所測(cè)定菌株的40%～50%為陽(yáng)性;++：生長(zhǎng)好;-/W：反應(yīng)陰性或弱。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳廷偉,葛誠(chéng).我國(guó)微生物肥料發(fā)展趨向[J].土壤肥料,1995,(6):16～20.

[2]李元芳.有效活菌數(shù)的測(cè)定方法允許差與判定[J].土壤肥料,1997,(4):43～44.

[3]程萍.固氮菌肥料生產(chǎn)菌株的酶活性測(cè)定[J].土壤肥料,1995,(1):44～46.

[4]無錫輕工業(yè)學(xué)院等合編.食品分析[M].北京:輕工業(yè)出版社,1991.216～219.

[5]布坎南RE,吉本斯NE等.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].第八版.北京:科學(xué)出版社,1984.12.

[6]潘維棟.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法[M].上海:教育出版社,1984.8.