導(dǎo)語：解析異位種植結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年超過100萬人診斷為結(jié)直腸癌［1］，近年來其發(fā)病率在歐洲躍居第1～2位［2］，我國居第4位［3］。影響患者預(yù)后的主要問題是腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，其中肝臟是結(jié)直腸癌血行轉(zhuǎn)移最主要的靶器官［4］。大約25％的患者在診斷結(jié)直腸癌時(shí)就已出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移［5、6］。手術(shù)切除結(jié)直腸腫瘤后仍有大約20％～50％的患者出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，其5年存活率約10％～58％［7］。研究和建立結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的動(dòng)物模型，特別是具有高轉(zhuǎn)移率的肝轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型，對(duì)研究結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的治療以及抗腫瘤藥物的篩選等具有重要意義。結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移種植性動(dòng)物模型主要有腫瘤細(xì)胞原位種植和異位種植，后者主要包括腫瘤細(xì)胞肝門靜脈注射（Intraportalinjection），脾臟種植（Intras－plenicinjection）兩種方式。雖然這兩種異位種植的?動(dòng)物模型應(yīng)用廣泛，關(guān)于它們形成結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移效率及效果的認(rèn)識(shí)還不統(tǒng)一［8］。早在20世紀(jì)80年代初就有學(xué)者進(jìn)行研究，迄今為止已有多種結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移異位種植動(dòng)物模型報(bào)道，各具優(yōu)缺點(diǎn)［9］。本研究對(duì)結(jié)腸癌異位種植動(dòng)物模型肝門靜脈注射法和脾臟種植法的肝轉(zhuǎn)移率及其效果進(jìn)行分析比較，為結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的預(yù)防和治療提供動(dòng)物模型。

1材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)材料

1．1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB／c小鼠共60只，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌雄各半。體重20～25g，周齡6～8周。合格證號(hào)：SCXK桂2003－0003。在II級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

1．1．2實(shí)驗(yàn)瘤株BALB／c小鼠結(jié)腸腺癌細(xì)胞株（CT26）由美國引進(jìn)，第二軍醫(yī)大學(xué)曹雪濤教授惠贈(zèng)。常規(guī)培養(yǎng)CT26細(xì)胞于含10％胎牛血清的RP－MI－1640營養(yǎng)液。取指數(shù)生長期的細(xì)胞（圖1），消化吹打成單細(xì)胞懸液，952g（1000rpm）離心5min，棄上清液，加適量不含血清的RPMI－1640營養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)／mL。圖1對(duì)數(shù)生長期CT26細(xì)胞（10×10）

1．2實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1脾臟種植不保留脾臟法造模30只BALB／c小鼠稱重后采用腹腔內(nèi)注射法麻醉，選用0．2％的戊巴比妥鈉，劑量控制在40～50mg／kg，小鼠麻醉成功后固定于手術(shù)臺(tái)上。常規(guī)皮膚消毒，取左側(cè)腋中線縱行切口進(jìn)腹腔，長約1cm，顯露柳葉狀脾臟，牽出腹腔外，用0．2mL注射器（31G針頭）從脾下極進(jìn)針，注入瘤細(xì)胞液0．2mL。拔針后酒精棉球按壓針眼約3min，促進(jìn)瘤細(xì)胞經(jīng)脾靜脈進(jìn)入肝臟，查無出血，結(jié)扎脾血管及胃短動(dòng)靜脈，切除脾臟，再次查無出血，依次間斷縫合肌肉、皮膚，關(guān)腹。術(shù)后繼續(xù)在Ⅱ級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

1．2．2肝門靜脈注射法造模30只BALB／c小鼠稱重后采用腹腔內(nèi)注射麻醉，選用0．2％的戊巴比妥鈉，劑量控制在40～50mg／kg，小鼠麻醉成功后固定于手術(shù)臺(tái)上。常規(guī)皮膚消毒，取腹正中切口進(jìn)腹腔，長約1cm，顯露肝門靜脈，用0．2mL注射器（31G針頭）從肝門靜脈與水平成30度進(jìn)針，注入瘤細(xì)胞液0．2mL。拔針后酒精棉球按壓針眼約15min，查無出血，依次間斷縫合肌肉、皮膚，關(guān)腹。術(shù)后繼續(xù)在Ⅱ級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

1．3觀察指標(biāo)

小鼠蘇醒后常規(guī)飼養(yǎng)，每日觀察其飲及活動(dòng)情況，所有小鼠待其自然死亡，觀察生存期。小鼠死亡后均剖腹觀察腹腔內(nèi)腫瘤生長情況，肝轉(zhuǎn)移率及肝臟成瘤情況，肺轉(zhuǎn)移率，切取肝臟轉(zhuǎn)移瘤置于10％中性福爾馬林液中固定，石蠟包埋，HE染色，進(jìn)行常規(guī)病理組織學(xué)觀察。1．4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，卡方檢驗(yàn)比較計(jì)量資料的組間統(tǒng)計(jì)差別，t檢驗(yàn)比較計(jì)數(shù)資料的組間統(tǒng)計(jì)差異，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2．1大體觀察

兩組小鼠接種后大體觀察相似。術(shù)后10d內(nèi)BALB／c小鼠活動(dòng)如常，體形無明顯變化。10d后個(gè)別小鼠開始出現(xiàn)攝食量下降，行動(dòng)漸遲緩，消瘦，腹部漸膨隆，但尚無小鼠死亡。20d后小鼠進(jìn)一步消瘦，腹部膨隆明顯，嚴(yán)重者出現(xiàn)死亡，第一只小鼠自然死亡時(shí)間出現(xiàn)在肝門靜脈注射組術(shù)后第22d。術(shù)后第30～55d，大部分小鼠死亡，最后一只死亡時(shí)間出現(xiàn)在脾臟注射組術(shù)后58d。

2．2肝轉(zhuǎn)移率

兩組分別成功接種30只小鼠，肝門靜脈組29只有肝轉(zhuǎn)移灶形成，1只未發(fā)現(xiàn)肝臟表面及切面轉(zhuǎn)移灶，肝臟轉(zhuǎn)移率為96．7％。脾臟注射組24只小鼠發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移灶，肝臟轉(zhuǎn)移率為80％。兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0．044，表1）。

2．3肝轉(zhuǎn)移灶成瘤情況

肝轉(zhuǎn)移灶成瘤情況描述為：成瘤級(jí)別（高）－轉(zhuǎn)移灶布滿全肝；成瘤級(jí)別（中）－轉(zhuǎn)移灶占全肝1／2及以上；成瘤級(jí)別（低）－轉(zhuǎn)移灶占全肝低于1／2。肝門靜脈組成瘤級(jí)別高、中、低的小鼠數(shù)量分別為：14只、8只、6只；脾臟種植切脾組成瘤級(jí)別高、中、低的小鼠數(shù)量分別為：9只、6只、15只。兩組相比，肝門靜脈組肝臟轉(zhuǎn)移灶高轉(zhuǎn)移和中轉(zhuǎn)移例數(shù)均比脾臟種植組多（圖2）。

2．4生存時(shí)間

肝門靜脈組30只小鼠術(shù)后自然生存時(shí)間為22～55d，平均（34．6±8．7）d。脾臟種植切脾組30只小鼠術(shù)后自然生存時(shí)間為30～58d，平均（49．3±7．8）d。兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0．000）。

2．5肺轉(zhuǎn)移率

兩組分別成功接種30只小鼠，肝門靜脈組18只有肺轉(zhuǎn)移灶形成，肺轉(zhuǎn)移率為60％。脾臟種植切脾組12只發(fā)現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移灶，肺轉(zhuǎn)移率為40％。兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0．121）。2．6病理觀察鏡下見肝轉(zhuǎn)移灶癌細(xì)胞聚集成團(tuán)，伴有癌結(jié)節(jié)形成，癌細(xì)胞形狀不規(guī)則，分化差，異形性明顯，胞質(zhì)少，核大，深染不規(guī)則，核分裂像易見，符合低分化腺癌的結(jié)構(gòu)特征（圖3）。

3討論

研究和建立具有高轉(zhuǎn)移率的結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型一直是結(jié)直腸癌研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)之一。目前，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型大體包括三種類型，基因工程模型，自發(fā)或誘發(fā)模型和種植性模型，而種植性模型目前應(yīng)用較為廣泛，根據(jù)種植的部位又可分為腫瘤細(xì)胞株原位和異位種植模型。原位移植模型是將腫瘤組織通過手術(shù)種植在體內(nèi)的相應(yīng)部位，從而進(jìn)行相應(yīng)部位腫瘤研究的方法。原位移植模型目前應(yīng)用較為廣泛，但對(duì)于研究結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的治療特別是藥物篩選而言，原位移植模型所達(dá)到肝轉(zhuǎn)移率還是不能令人滿意。結(jié)直腸癌異位種植模型腫瘤接種部位包括皮下、脾臟、肝臟、門靜脈和腸系膜靜脈等。皮下種植模型因皮下生長的腫瘤通常易被纖維膜所包裹，難以發(fā)生腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移，表現(xiàn)出極低的腫瘤轉(zhuǎn)移率［10］。肝臟種植模型是將結(jié)直腸癌細(xì)胞或組織塊直接種植于肝臟而形成轉(zhuǎn)移瘤。據(jù)國外研究報(bào)道，此法小鼠肝臟成瘤率也僅為80％［11］。脾臟和門靜脈接種均表現(xiàn)出極高的肝轉(zhuǎn)移率，國外研究報(bào)道均為100％［12、13］，然而他們所用的是裸小鼠。本研究采用具有免疫能力的BALB／c小鼠對(duì)比脾臟和肝門靜脈種植法的肝轉(zhuǎn)移率及肝臟成瘤效果。本研究中，肝門靜脈法具有更高的肝轉(zhuǎn)移率及肝臟成瘤效果，而脾臟種植切除脾臟法在生存時(shí)間和操作難易程度上表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)，兩者的肺轉(zhuǎn)移率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肝門靜脈法模型肝轉(zhuǎn)移率為96．7％，與國外報(bào)道結(jié)果相似［14］，比脾臟種植法高；同時(shí)在肝臟成瘤效果方面，肝門靜脈法有更多的例數(shù)出現(xiàn)全肝或肝臟一半以上的轉(zhuǎn)移，能更好地滿足各種檢測(cè)方法取材的需要；缺點(diǎn)為生存時(shí)間相對(duì)較短，并且實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)注意不能選擇過粗的針頭，否則容易引起拔針后門靜脈不容易止血而導(dǎo)致小鼠死亡，不能注射過多的腫瘤細(xì)胞，否則易出現(xiàn)肝血管栓塞造成小鼠死亡［15］。而脾臟種植切除脾臟法雖然肝轉(zhuǎn)移率稍低，但具有更長的生存時(shí)間及更易操作，較適合驗(yàn)證周期較長的藥物實(shí)驗(yàn)，同時(shí)，它很好地模擬了結(jié)直腸癌根治術(shù)后因血行轉(zhuǎn)移而發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的過程。本研究中的兩種異位種植模型均能達(dá)到很高的肝轉(zhuǎn)移，重復(fù)性好，但屬于實(shí)驗(yàn)性方法產(chǎn)生的肝轉(zhuǎn)移的最后階段，并非研究結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的全過程。在選擇動(dòng)物模型中注意實(shí)驗(yàn)方案選擇適合的模型。本研究建立并對(duì)比了兩種具有高轉(zhuǎn)移率的結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠模型，肝門靜脈法在肝轉(zhuǎn)移率成肝臟成瘤效果方面更具優(yōu)勢(shì)，適合對(duì)肝轉(zhuǎn)移率成取材要求較高的實(shí)驗(yàn)研究；而脾臟種植切除脾臟法則更適合驗(yàn)證周期較長的藥物實(shí)驗(yàn)。