導(dǎo)語：骨骼肌細(xì)胞腦內(nèi)移植探索一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

腦移植是目前治療巴金森病的重要手段之一[1，2」。這一治療能否成功的關(guān)鍵是移植物能否在被移植的腦組織內(nèi)長(zhǎng)期存活并能不斷表達(dá)化學(xué)遞質(zhì)多巴胺或其前體。因此，選擇合適的組織細(xì)胞作為移植物對(duì)實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)十分重要。近10余年來許多學(xué)者〔，一5」將各種不同組織細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、皮膚細(xì)胞以及內(nèi)分泌細(xì)胞等，植人大鼠腦內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究?，F(xiàn)已有報(bào)道說明，移植胚胎腦組織細(xì)胞及自體腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞可在受體腦內(nèi)有較長(zhǎng)的存活期[6j。但用這些細(xì)胞進(jìn)行移植，都存在一定問題川。如自體腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞移植的患者自身會(huì)受到較大打擊，且細(xì)胞在腦內(nèi)存活受限制;用胚胎腦移植除了受免疫排斥外，還有很大的倫理道德問題?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，自體骨骼肌細(xì)胞具備作為移植物的優(yōu)越性困，即:該細(xì)胞成熟后不再分裂、取材容易而對(duì)患者打擊很小、培養(yǎng)易存活、易于接受外源性基因而容易改變遺傳特點(diǎn)等。對(duì)于用骨骼肌細(xì)胞進(jìn)行腦內(nèi)移植能否存活及是否有不良影響的研究在國內(nèi)尚未見報(bào)道。本研究擬將對(duì)這一問題進(jìn)行探索，以求為用骨骼肌細(xì)胞進(jìn)行腦內(nèi)移植治療包括巴金森病在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)疾患提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

將新生2一5d的SD大鼠麻醉后取出四肢骨骼肌，剪碎，用胰酶及膠原酶共同消化后制成細(xì)胞懸液。用Percoll梯度法純化細(xì)胞，以1xl護(hù)細(xì)胞密度放人35mm培養(yǎng)皿中，經(jīng)過5~7d的培養(yǎng)，使其中的干細(xì)胞(stemeells)發(fā)育為成肌細(xì)胞(myoblasts)和肌管細(xì)胞(myotubes)。部分培養(yǎng)皿中，加人熒光染料Diz(3.3，一dioctadeeyloxaearboeyanineperehlorate，M.p.Ine)以供原代肌細(xì)胞吞噬并被著色。將培養(yǎng)的成肌和肌管細(xì)胞按2:3比例混合后[0]，以大致lx106細(xì)胞數(shù)分兩點(diǎn)植人到體重220~2509的SD大鼠腦內(nèi)一側(cè)紋狀體中，總量為15川。共移植大鼠38只，其中有4只所用移植細(xì)胞為被DII染色的肌細(xì)胞。移植后動(dòng)物分別存活2周(n=6)、4周(n=8)、8周(n=8)、16周(n=8)、6個(gè)月(n一8)和12個(gè)月(n一4)，將動(dòng)物經(jīng)升主動(dòng)脈先灌注0.lmol/L磷酸緩沖液(PBS)Zooml，再灌人0.lmol/LPBS(pH7.4)配制含4%多聚甲醛和15%蔗糖的固定液。灌注后立即取腦并作冰凍額狀切片(厚20拌m)。切片分3組，一組分別用抗橫紋肌動(dòng)蛋白和肌紅蛋白抗體(DAKOCo.I-td)孵育12一24h(4c)，并用ABc法染色(試劑盒由vector公司提供)，再用Nissl法復(fù)染。其他兩組切片分別用Nissl法及HE染色。普通及熒光顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。另外將存活8周(n一2)及16周(n-2)的動(dòng)物不經(jīng)任何灌注直接斷頭取出腦內(nèi)移植物，經(jīng)胰酶消化后按上述體外培養(yǎng)方法重新進(jìn)行培養(yǎng)，并觀察記錄其存活、生長(zhǎng)情況。

結(jié)果

1.原代骨骼肌細(xì)胞體外培養(yǎng)

在倒置顯微鏡下觀察原代骨骼肌細(xì)胞體外培養(yǎng)狀況，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的前3d，這種細(xì)胞以成肌細(xì)胞的形式存在。細(xì)胞小，呈梭形。3d后細(xì)胞開始有排列現(xiàn)象，并逐漸形成管狀，細(xì)胞與細(xì)胞相互融合，此期細(xì)胞稱肌管細(xì)胞(圖1)，有時(shí)還可見到這些細(xì)胞有輕微的收縮現(xiàn)象。培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)用抗橫紋肌動(dòng)蛋白或肌紅蛋白的免疫組織化學(xué)染色后發(fā)現(xiàn)其免疫陽性細(xì)胞數(shù)占培養(yǎng)細(xì)胞總數(shù)的90%以上(圖2)。這些免疫陽性細(xì)胞呈明顯橫紋肌特征，即細(xì)胞內(nèi)有多個(gè)細(xì)胞核。

2.移植區(qū)的組織學(xué)檢測(cè)

2.1經(jīng)免疫組織化學(xué)染色的觀察:對(duì)移植后分別存活2周、4周、8周、16周及6個(gè)月的各例動(dòng)物腦切片行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示全部動(dòng)物移植部位均反應(yīng)陽性(圖3)。應(yīng)用抗橫紋肌動(dòng)蛋白及肌紅蛋白兩種抗體孵育，結(jié)果無明顯區(qū)別。在經(jīng)Nissl方法復(fù)染的切片上，發(fā)現(xiàn)在存活2周的動(dòng)物的移植物周圍有少量膠質(zhì)細(xì)胞增生，移植4周可見膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)有所增加。移植前經(jīng)nl處理的移植物在波長(zhǎng)4“一550nm下用熒光顯微鏡觀察，顯現(xiàn)強(qiáng)紅色(圖4)。隨著移植后時(shí)間延長(zhǎng)，各組動(dòng)物的移植區(qū)均未見明顯縮小或擴(kuò)大，亦未見腫瘤形成現(xiàn)象。另外，在存活12個(gè)月的4例動(dòng)物中，其中2例腦切片免疫組織化學(xué)染色后移植區(qū)呈陽性反應(yīng)，另外2例為陰性反應(yīng)。

2.2移植區(qū)組織的體外培養(yǎng):對(duì)移植后8周和16周動(dòng)物腦內(nèi)取出的移植區(qū)組織重行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)原代肌細(xì)胞重新生長(zhǎng)。但這些細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，早期呈梭形，到第10d后才出現(xiàn)細(xì)胞排列現(xiàn)象。12d后細(xì)胞逐漸形成肌管細(xì)胞并開始相互融合。用抗橫紋肌動(dòng)蛋白和肌紅蛋白抗體行免疫組織化學(xué)反應(yīng)，可見這些細(xì)胞呈陽性反應(yīng)(圖5)。

討論

本研究結(jié)果說明，新生大鼠的骨骼肌較易于在體外培養(yǎng)成活，它們可在培養(yǎng)一周內(nèi)表現(xiàn)出由成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌管細(xì)胞的發(fā)育過程。這與傳統(tǒng)的認(rèn)識(shí)[l0〕相一致。這些原代肌細(xì)胞植人大鼠紋狀體后能存活超過6個(gè)月以上，有些可達(dá)一年，說明骨骼肌細(xì)胞是一種能在腦內(nèi)長(zhǎng)期存活的外源性細(xì)胞，這已在一些研究中得到證實(shí)叫。盡管能在腦內(nèi)較長(zhǎng)期存活，但植人的骨骼肌細(xì)胞并不在腦內(nèi)繁殖而使移植區(qū)增大。這可能是由骨骼肌細(xì)胞核不含DNA而不產(chǎn)生有絲分裂所決定的。本研究中，存活8周與16周的移植物可被重新行體外培養(yǎng)，并同時(shí)再現(xiàn)從成肌細(xì)胞到肌管細(xì)胞的過程，說明能自我更新的骨骼肌干細(xì)胞在腦內(nèi)能長(zhǎng)時(shí)間存活，這提示被植人腦內(nèi)的骨骼肌在某種情況下仍有再更新的可能。這一機(jī)制應(yīng)更有助于延長(zhǎng)骨骼肌在腦內(nèi)的存活期。已有實(shí)驗(yàn)證明[l‘〕，植人的骨骼肌與神經(jīng)組織之間可能缺少血腦屏障，這有助于選擇骨骼肌作為腦內(nèi)移植的細(xì)胞。還有若干實(shí)驗(yàn)證明[9.’2〕，在體外培養(yǎng)成活的骨骼肌細(xì)胞，可以被轉(zhuǎn)人外源性基因并能得到較好表達(dá)。這些都說明骨骼肌細(xì)胞可能是一種非常有價(jià)值的、可作為行基因改造后作腦內(nèi)移植的細(xì)胞。也就是說，骨骼肌細(xì)胞可能是基因治療某些神經(jīng)系統(tǒng)疾患的有用工具。smith等〔‘習(xí)曾介紹過利用肌細(xì)胞移植治療某些肌源性疾病及代謝紊亂性疾病的成功經(jīng)驗(yàn)。另外一些報(bào)道表明，移植原代肌細(xì)胞對(duì)受體是安全的。如Law巨“習(xí)用成肌細(xì)胞進(jìn)行肌肉移植，移植物可長(zhǎng)期存活而未發(fā)現(xiàn)有腫瘤形成。Huard〔‘5〕將之對(duì)人移植后，經(jīng)臨床追蹤觀察也認(rèn)為是安全有效的。最近Jiao叫等也報(bào)道了將新生大鼠橫紋肌細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)基因后，移植到大鼠腦內(nèi)，可達(dá)至少6個(gè)月的存活期，本研究所見與其結(jié)果基本一致。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究對(duì)骨骼肌細(xì)胞轉(zhuǎn)人外源性基因，并作腦內(nèi)移植使其在腦內(nèi)表達(dá)，奠定了基礎(chǔ)。