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一、膠體金免疫結(jié)合試驗的檢測原理

膠體金免疫結(jié)合試驗的檢測原理是以微孔濾膜為載體,包被已知抗原或抗體,加入待檢標(biāo)本后,經(jīng)濾膜的毛細(xì)管作用使標(biāo)本中的抗體或抗原與膜上包被的抗原或抗體結(jié)合,再通過膠體金結(jié)合物達(dá)到檢測目的。根據(jù)檢測裝置的不同可分為金免疫滲濾試驗(GIFA)和金免疫層析試驗(GICA)。

1·GIFA:GIFA始于1985年[1],最初以酶作為標(biāo)記物。1989年發(fā)展了以膠體金為標(biāo)記物用于檢測艾滋病病毒抗體的滲濾試驗[2],確立了GIFA的基本技術(shù)。GIFA試劑盒有2個主要成分:一是金標(biāo)抗體結(jié)合物,另一是滲濾裝置。該裝置為一充滿吸水墊料的塑料小盒,在盒蓋中央的小孔下面放置了一片硝酸纖維素膜,膜上預(yù)包被抗原或抗體斑點。試驗時將標(biāo)本滴加在膜上,通過滲濾使抗原抗體在膜上發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng);再滴加金標(biāo)結(jié)合物,使其與對應(yīng)抗體抗原結(jié)合并顯色。陽性結(jié)果在膜上出現(xiàn)著色斑點。

GIFA檢測操作步驟與酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法相同。差別在于加樣、反應(yīng)和洗滌均通過滲濾完成。檢測全過程僅需數(shù)分鐘,但敏感度卻與需數(shù)小時完成的ELISA相仿。其原因在于:ELISA樣品中的待檢抗原需緩慢地擴散才能與吸附于固相表面的抗體反應(yīng),而在膜滲濾法中,抗體充滿了膜的微孔,待檢液體層層滲濾時抗原抗體緊密接觸形成免疫濃縮,從而提高了反應(yīng)效率。另外,以膠體金作為標(biāo)記物,不但減少了操作步驟,而且試劑可在室溫長期保存。

2·GICA:1990年Oskiowicz等[3]應(yīng)用硒作為標(biāo)記物建立了免疫層析試驗。其后一般均采用簡便的膠體金試驗。其檢測原理與GIFA相同,不同點在于液體的移動不是通過直向的穿流,而是基于層析作用的橫向流動。GICA是將各種反應(yīng)試劑以條帶狀固定在同一試紙條上,待檢標(biāo)本加在試紙條的一端,將一種試劑溶解后,通過毛細(xì)作用在層析條上滲濾、移行并與膜上另一種試劑接觸,樣品中的待測物同層析材料上針對待測物的受體(如抗原或抗體)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。層析過程中免疫復(fù)合物被截留、聚集在層析材料的一定區(qū)域(檢測帶),通過可目測的膠體金標(biāo)記物得到直觀的顯色結(jié)果。而游離標(biāo)記物則越過檢測帶,達(dá)到與結(jié)合標(biāo)記物自動分離之目的。GICA特點是單一試劑,一步操作,全部試劑可在室溫長期保存。這種新的方法將膠體金免疫檢測試驗推進(jìn)到一個嶄新的階段。

二、GICA試劑的制作

1·試劑:為試紙條形式。在試紙條的塑料片上依次粘貼如下組分:(1)吸水紙(加樣區(qū)),(2)玻璃纖維膜,膜上吸附著干燥的金標(biāo)抗體(流動帶),(3)硝酸纖維素膜,膜上包被著抗原或抗體條帶和能與標(biāo)記物直接起反應(yīng)的質(zhì)控物條帶(檢測帶),(4)吸水紙。以上各組份首尾互相銜接。因此在(1)處滴加液體標(biāo)本,液流即向(4)處移動。當(dāng)液體到達(dá)(2)處時,金標(biāo)抗體被溶解,同時與標(biāo)本中的抗原反應(yīng)形成復(fù)合物。液流繼續(xù)前移至(3)時,帶有金標(biāo)記的復(fù)合物被膜上的抗體捕獲,呈現(xiàn)紅色的線條。未結(jié)合的金標(biāo)抗體繼續(xù)前移至(4)處。

2·GICA制作中須注意的幾個問題:GICA檢測的可靠性主要依賴于所用試劑的質(zhì)量。其中層析材料的選擇、處理以及受體固定是免疫層析條研制的關(guān)鍵技術(shù)。微孔濾膜:層析反應(yīng)是以濾膜為載體,所以濾膜的質(zhì)量致關(guān)重要。其吸附性能、過濾速度等均會影響檢測結(jié)果。有些濾膜很難達(dá)到各部分性質(zhì)均一的質(zhì)量,因此,應(yīng)仔細(xì)篩選優(yōu)質(zhì)濾膜?？蛇x擇的濾膜除硝酸纖維膜外還有尼龍膜、羧化纖維素膜、聚酯膜、純纖維素膜和玻璃纖維膜等多種類型,但硝酸纖維素膜(NCM)運用較多。這主要得益于NCM的2個特性:較高的蛋白吸附容量和良好的親水性。純纖維素膜和羧化纖維素膜也是免疫層析的常用材料,但一般要求預(yù)先對其作化學(xué)處理,使其具有與受體蛋白共價聯(lián)接的特性。

常用的處理方法有苯醌法[4]、溴化氰法[5]和碳二亞胺法[6]。受體:固定于濾膜的受體要求具備如下幾點性質(zhì):(1)與膜材料的結(jié)合穩(wěn)定性好;(2)有較高的生物活性,因而有足夠的配體捕獲容量;(3)有較高的純度,此為特異性檢測的基礎(chǔ);(4)對于以干態(tài)吸附于流動帶的標(biāo)記或非標(biāo)記受體,其可流動性是評價其性能優(yōu)劣的主要指標(biāo)。往往要求在流動帶加入高效助溶劑,從而使吸附于流動帶的受體具有快速溶解的特性。受體固定工藝:受體固定工藝應(yīng)簡單、有效。如大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)采用機械噴膜,保證制膜快速、穩(wěn)定、一致。受體包被量:篩選最佳的受體包被量是提高檢測敏感度的重要因素之一。在不影響所需靈敏度的前提下可提高固相抗原或抗體的濃度,擴展測定的線性范圍,以減少鉤狀效應(yīng)。

另外,有些檢測項目如血清肌紅蛋白、肌鈣蛋白和甲胎蛋白等陽性質(zhì)控的閾值高低與檢測的敏感性和特異性密切相關(guān)。這類檢測的質(zhì)控受體包被量還需解決具有臨床診斷意義的“檢測下限”即陰性或陽性分界的臨界值問題。包被濾膜剩余吸附位點的有效封閉:除上述幾點外,與此相關(guān)的其他內(nèi)容如篩選和純化抗體、制備標(biāo)記物和確定標(biāo)記物工作液濃度以及選擇助溶劑等,也是不容忽視的重要環(huán)節(jié)。

三、膠體金免疫結(jié)合試驗的應(yīng)用

膠體金免疫結(jié)合試驗可應(yīng)用于免疫學(xué)檢測的所有方面。但主要用于檢測正常體液中不存在的抗原性物質(zhì)(如診斷傳染病中的抗原或抗體),以及正常含量極低而在特殊情況下異常升高的物質(zhì)(如HCG、甲胎蛋白、C-反應(yīng)蛋白等)。近年來由于制備技術(shù)的改進(jìn)和試劑原料的提高,應(yīng)用范圍更加廣闊?，F(xiàn)國內(nèi)外有商品供應(yīng)及文獻(xiàn)報道的檢測項目有:

1·激素:應(yīng)用最廣的首推尿液檢測人絨毛膜促性腺激素(HCG)的早早孕診斷試劑。婦女受孕后10d,即預(yù)期月經(jīng)前2~4d,即可呈現(xiàn)陽性反應(yīng)。還有促黃體生成激素(LH)和促卵泡成熟激素(FSH)等。

2·傳染病病原的抗原和抗體:(1)肝炎病毒:甲型肝炎IgM抗體(抗HAV-IgM)、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎核心抗體(抗HBc-IgM、IgG)和丙型肝炎抗體(抗HCV)等。(2)其他病毒:艾滋病病毒抗體(抗HIV)、腎綜合征出血熱病毒抗體、乙型腦炎血清特異性抗體、傳染性單核細(xì)胞癥嗜酸性抗體、單純皰疹病毒抗體、巨細(xì)胞病毒抗體、風(fēng)疹病毒抗體、輪狀病毒(糞便)、登革熱病毒抗體、呼吸道合胞病毒(分泌物)和流感病毒A抗原(鼻咽部分泌物)等。

3·性病病原:梅毒螺旋體抗體、淋球菌(分泌物)和泌尿生殖系沙眼衣原體(分泌物)等。

4·細(xì)菌:結(jié)核桿菌抗體、A族乙型溶血性鏈球菌(喉拭標(biāo)本)、沙門菌血清抗體和與慢性胃炎、消化道潰瘍密切相關(guān)且可能是胃癌發(fā)病的危險因素的胃幽門螺桿菌抗體等。

5·寄生蟲:弓形蟲抗體、包蟲體抗體、血吸蟲抗體、人囊蟲病、惡性瘧原蟲循環(huán)抗原和間日瘧原蟲、班氏絲蟲抗原及利什曼原蟲抗原等。

6·腫瘤標(biāo)記物:前列腺癌特異抗原(PSA);對消化道惡性腫瘤尤其是結(jié)腸癌有較高的診斷價值,并對輔助診斷胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌等也有重要意義的血清癌胚抗原(CEA);以及對肝癌的診斷有較高價值的甲胎蛋白(AFP);絨毛膜促性腺激素(HCG)還可對滋養(yǎng)層細(xì)胞腫瘤(葡萄胎、惡性葡萄胎、絨毛膜上皮癌等)具有診斷意義。

7·心血管病檢測標(biāo)志物:血清心肌鈣蛋白、肌紅蛋白和肌酸激酶同工酶的測定對急性心肌梗塞的診斷極為有利。

8·其他蛋白質(zhì):對臨床診斷消化道出血和普查篩選消化道腫瘤的重要檢測項目大便潛血(FOB);和對系統(tǒng)性紅斑狼瘡的診斷及臨床病情判斷意義較大的抗雙鏈DNA抗體;C反應(yīng)蛋白(CRP);尿白蛋白和對橋本甲狀腺炎的診斷有重要意義的甲狀腺微粒體抗體等。

9·其他:檢測血糖、尿糖;及檢測尿液中其他小分子物質(zhì)的試劑有苯丙胺、可卡因、大麻、嗎啡和海洛因等。

四、膠體金免疫結(jié)合試驗的應(yīng)用展望

1·進(jìn)一步提高檢測靈敏度。靈敏度的提高無疑會拓寬金免疫結(jié)合試驗的檢測范圍,而采用信號放大系統(tǒng)如生物素親和素系統(tǒng)[7]或免疫金銀染色法進(jìn)行銀加強[8],并結(jié)合一些相應(yīng)的簡單檢測儀器可能是最有希望的途徑之一。

2·實現(xiàn)檢測多元化?？刹捎迷谕荒ど献鞫喾N項目測定和多項目的組合測定2種方式。一次檢測可同時得到一組結(jié)果,這對于檢測某些具有聯(lián)檢意義的物質(zhì)具有很大的應(yīng)用價值。如HBsAg、艾滋病病毒抗體和抗原以及抗HCV的檢測組合對獻(xiàn)血者檢查更為方便。同時檢測抗弓形體、抗巨細(xì)胞病毒和抗風(fēng)疹病毒等的抗體在圍產(chǎn)期檢查中極為有用。

3·實現(xiàn)定量或半定量檢測。(1)根據(jù)顯色強度應(yīng)用簡單儀器進(jìn)行定量:GIFA可用反射光密度計對斑點顏色的強度進(jìn)行測定,可得到半定量的結(jié)果。(2)控制受體捕獲量:應(yīng)用多種不同靈敏度受體固定量的方式,通過觀察各自顯色情況,將待測物含量確定于某一濃度區(qū)間,以實現(xiàn)半定量檢測。

4·通用試劑的應(yīng)用。(1)在間接法檢測中用膠體金標(biāo)記葡萄球菌蛋白A代替抗人IgG標(biāo)記物,用于各種抗體的檢測[9]。有利于減少非特異性反應(yīng),穩(wěn)定檢測試劑的質(zhì)量。(2)鏈親和素固定濾膜檢測帶可作為通用固定受體,與各種生物素化抗體結(jié)合用于檢測相應(yīng)的抗原性物質(zhì)。由于鏈親和素的四價性使其固定于膜材料后,仍能對生物素化抗體保持較高的反應(yīng)活性,而且兩者的結(jié)合具有高度的穩(wěn)定性。