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摘要目的：進(jìn)一步探索重組基因工程抗體在原核系統(tǒng)中有效的活性表達(dá)途徑。方法：在已構(gòu)建的抗HBx單鏈抗體(ScFv)的基礎(chǔ)上，利用粘粒載體構(gòu)建了抗HBx單鏈?zhǔn)删w抗體(phageantibody)，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。結(jié)果：該噬菌體抗體經(jīng)輔助噬菌體M13KO7誘導(dǎo)和噬菌體次要衣殼蛋白(PⅢ)融合表達(dá)，并組裝成噬菌體衣殼蛋白可溶性表達(dá)于培養(yǎng)液上清，經(jīng)ELISA和Western-blot的結(jié)果證實(shí)可溶性表達(dá)產(chǎn)物具有HBx抗原的特異性親和力。結(jié)論：?jiǎn)捂準(zhǔn)删w抗體的構(gòu)建表達(dá)成功，可望成為原核系統(tǒng)中表達(dá)篩選特異性抗體可變區(qū)及有效制備活性基因工程抗體的簡(jiǎn)捷途徑。

關(guān)鍵詞噬菌體展示技術(shù)基因工程抗體乙型肝炎X抗原

Expressionofrecombinantanti-HBxsinglechainphageantibody

ZHOUGe,LIUKang-Da,GONGYietal.

ZhongshanHospital,ShanghaiMedicalUniversity，Shanghai200032

QINHui-Lian,HEXi.

DepartmentofImmunology，ShanghaiMedicalUniversity，Shanghai200032

AbstractObjective:Tostudytheexpressionofrecombinantanti-HBxsinglechainphageantibody.Methods:Theanti-HBxsinglechainphageantibody(pScFv)wasconstructedforthestudyonactiveexpressionofgeneticantibodyinE.coli.Theanit-HBxScFvgenewasrecombinedwithphagemidvector(pCANTAB)andtransferredintohostbacteria.Results:Theanti-HBxpScFvwasinducedwithhelperphageM13KO7.ThesolubleexpressionproductsfusedwithphageminorcoatproteinwassecretedwhichwasdetectedspecificbindingaffinitybyWestern-blotandELISAassay.Conclusion:Thesuccessfulconstructionandexpressionofanti-HBxpScFvmightestablishthemethodfortheactiveselectingandpreparingthespecificantibodiesintheE.coliexpressionsystem.

KeywordsPhagedisplayRecombinantantibodyHBxAg

作為肝癌相關(guān)抗體，抗HBx單克隆抗體多年來(lái)一直被應(yīng)用于肝癌實(shí)驗(yàn)性治療和亞臨床治療的研究，并取得了一定的療效［1］。為了進(jìn)一步解決單克隆抗體在臨床治療中的HumanAnti-mouseAntibody(HAMA)反應(yīng)，前期我們構(gòu)建了原核表達(dá)的嵌合抗體和單鏈抗體［2，3］。雖然采用了金屬離子配體螯合純化技術(shù)解決了重組抗體的大量純化問(wèn)題，重組抗體的復(fù)性問(wèn)題限制了重組抗體進(jìn)入實(shí)驗(yàn)性研究的進(jìn)程。本研究試圖通過(guò)構(gòu)建噬菌體抗體融合表達(dá)載體來(lái)解決基因工程抗體可變區(qū)的活性原核表達(dá)，為基因工程抗體進(jìn)入實(shí)驗(yàn)性導(dǎo)向研究提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料HBx單克隆抗體輕，重鏈可變區(qū)基因由本組克隆制備［3］，單鏈抗體構(gòu)建載體pOPE-51及重組HBx抗原為德國(guó)癌癥中心提供(DKFZ，Heiderberg,Germany)，噬菌體抗體構(gòu)建載體PCANTAB，由中國(guó)科學(xué)院，上海生物化學(xué)研究所提供，限制性內(nèi)切酶為Gibco公司產(chǎn)品，PCR擴(kuò)增及DNA測(cè)序試劑為PE公司產(chǎn)品，酶標(biāo)抗His-tag抗體，酶標(biāo)抗噬菌體抗體為Pharmica公司產(chǎn)品。

1.2PCR擴(kuò)增單鏈抗體基因引物委托中國(guó)科學(xué)院，上海植物生理研究所合成序列如下：X+：5′-ACACAAGGCCCAGCTGGCCGAGTCAGGAGGAGG-3′；X-：5′-TCAATAGCGGCCGCATGATGGTGATGTATGC-3′。

1.3構(gòu)建抗HBx單鏈抗體組氨酸融合表達(dá)載體及其表達(dá)，鑒定，參見(jiàn)文獻(xiàn)［3］。

1.4PCR擴(kuò)增及電泳純化HBxScFv/His融合基因片段以HBxpOPE為模板(10ng),PCR擴(kuò)增引物各50pmol，dNTPs200μmol/L,1×PCRBuffer(KCl50mmol/L,Tris-Cl10mmol/LpH8.3,0.1%明膠)，在100μl的反應(yīng)體積中加入3U的TaqDNA聚合酶，于94℃45s，52℃15s，72℃45s(PE9600)，共30循環(huán)，取5μlPCR產(chǎn)物于瓊脂糖電泳鑒定。其余產(chǎn)物經(jīng)制備型凝膠回收特異性片段(GelpurificationKit,QIAGEN,Germany)于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5抗HBx噬菌體抗體的克隆構(gòu)建見(jiàn)圖1。

1.6將構(gòu)建的pCANT-X轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，于含2%葡萄糖，100μg/ml氨卞青霉素(Amp)的LB培養(yǎng)液于30℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取雙鏈質(zhì)粒DNA，經(jīng)酶切鑒定篩選陽(yáng)性克隆，并測(cè)序鑒定［4］。

1.7單鏈?zhǔn)删w抗體的融合表達(dá)及純化陽(yáng)性克隆1%轉(zhuǎn)種含2%葡萄糖，100μg/ml氨卞青霉素(Amp)的LB培養(yǎng)液于30℃振蕩培養(yǎng)約3h(OD600=0.6)，加入總滴度為109的輔助噬菌體M13KO7，并于37℃靜置感染15min。離心收集菌體并重懸于3ml含50μg/ml卡那霉素(Kan)，100μg/mlAmp的LB中37℃培養(yǎng)液過(guò)夜。于10000r/min，4℃離心收集過(guò)夜培養(yǎng)上清，按每ml上清中加入150μlSA溶液(16%PEG6000，3.3mol/LNaCl)，4℃2h靜置，于10000r/min，4℃沉淀噬菌體，沉淀重懸于100μl的LB培養(yǎng)液中。

1.8抗HBx單鏈?zhǔn)删w抗體的ELISA鑒定取10μl純化的噬菌體單鏈抗體，按10倍稀釋至10-6，以M13KO7為對(duì)照，和已包被的HBxAg的酶標(biāo)板(由德國(guó)癌癥中心提供)室溫親和30min，以鼠抗噬菌體抗體(mAb,Pharmacia,USA)為一抗，HRP-羊抗鼠IgG(華美生物工程公司)為二抗，檢測(cè)抗HBx單鏈?zhǔn)删w抗體的親和活性。

3討論

1988年SmithGP建立噬菌體展示篩選技術(shù)以來(lái)［5］，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于特異性抗體可變區(qū)的篩選，在噬菌體載體中構(gòu)建單鏈或單區(qū)抗體，這種有活性表達(dá)的噬菌體抗體也已成為篩選特異性人源抗體的重要手段［6］。特異性抗體可變區(qū)在原核系統(tǒng)中的活性表達(dá)，在很大程度上推動(dòng)了抗體工程的發(fā)展［7］，但是以強(qiáng)表達(dá)操縱子調(diào)控的高效原核表達(dá)導(dǎo)致了抗體蛋白大量以包涵體形式存在面臨復(fù)性的難題。本研究嘗試采用構(gòu)建噬菌體單鏈抗體的方式探索以噬菌體為載體在原核系統(tǒng)中活性表達(dá)，制備單鏈基因工程抗體的可能。

我們的結(jié)果表明，設(shè)計(jì)的PCR引物可直接擴(kuò)增HBx單鏈抗體的編碼基因，在我們得到的5個(gè)不同克隆DNA序列分析結(jié)果中僅一例發(fā)生單基因突變，其余4例均為正常序列，這表明通過(guò)優(yōu)化的PCR條件，可直接利用PCR獲得可靠的目的基因用于表達(dá)。構(gòu)建的噬菌體單鏈抗體是以抗體重鏈可變區(qū)-十肽小側(cè)鏈柔性肽段-抗體輕鏈可變區(qū)以及3′端的六聚組氨酸尾組成插入噬菌體次要衣殼蛋白(基因Ⅲ產(chǎn)物，PⅢ)中融合表達(dá)。含有表達(dá)載體pCANTAB-HBx的大腸桿菌在輔助噬菌體M13KO7的感染下大量產(chǎn)生含有重組HBx單鏈抗體的噬菌體衣殼蛋白，并包裝可溶性分泌于培養(yǎng)液上清，其含量可高達(dá)3×1013pfu/ml。同時(shí)利用簡(jiǎn)單的PEG/NaCl沉淀的方法即可制備量和純度足以滿足用于動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)的活性單鏈抗體表達(dá)產(chǎn)物。此外，pCANTAB-HBx表達(dá)載體在適量的IPTG誘導(dǎo)下，激活的LacZ操縱子啟動(dòng)大量表達(dá)HBx單鏈抗體-PⅢ融合蛋白，并經(jīng)噬菌體PⅢ信號(hào)肽引導(dǎo)可溶性分泌于培養(yǎng)液中，可利用融合于單鏈抗體3′端的六聚組氨酸抗體檢測(cè)，以及Ni2+離子樹(shù)脂吸附純化［3］。由于目前的抗噬菌體單克隆抗體或抗血清針對(duì)的親和靶位多為噬菌體主要衣殼蛋白(PⅧ)，因而我們?cè)跈z測(cè)噬菌體抗體和檢測(cè)單鏈融合抗體時(shí)分別應(yīng)用了抗噬菌體和抗His-Tag抗體作為第一抗體。抗HBx噬菌體抗體的構(gòu)建，表達(dá)為抗體可變區(qū)基因活性表達(dá)提供了一種高效，簡(jiǎn)單的方法。同時(shí)噬菌體抗體所特有的基因型和表型的一一對(duì)應(yīng)特征，為抗體可變區(qū)全基因文庫(kù)的篩選提供了有力的手段［8］。

作者簡(jiǎn)介：周鉻，30歲，助理研究員，主要從事腫瘤導(dǎo)向研究；

秦慧蓮，女，46歲，教授，主要從事腫瘤免疫研究

作者單位：周鉻劉康達(dá)龔奕何進(jìn)(上海醫(yī)科大學(xué)附屬中山醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心，上海200032)

秦慧蓮何曦(上海醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，上海200032)

4參考文獻(xiàn)

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