導(dǎo)語(yǔ)：抗前列腺特異抗原/抗CD3雙特異性單鏈抗體四聚體的活性研究一文來(lái)源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【關(guān)鍵詞】前列腺腫瘤；抗原,CD3；抗體親和力；四聚體

BiologicalactivityoftetramerofbispecificsinglechainantibodyagainsthumanprostatespecificantigenandCD3molecule

【Abstract】AIM:Tostudythebiologicalactivityoftetramerofbispecificsinglechainantibodyagainsthumanprostatespecificantigen(PSA)andCD3molecule.METHODS:Flowcytometry(FCM)wasusedtodetectthebindingactivityofbispecificsinglechainantibodytoCD3positivecelllineJurkatandprostatecarcinomacelllineLNCaP.Theefficacyoftheantibodiyinmediatingtumorcelllysisinvitrowasdeterminedbyusingthe51Crreleasetest.Forinvivoevaluationoftheantibodysactivity,anudemousemodelwasused.ThemicewereinoculatedwithLNCaPprostatecancercells.RESULTS:ItwasdemonstratedthatthetetramerofbispecificsinglechainantibodycouldbindtotheJurkatandLNCaPcellswithhighspecificity.Thepercentsofthecellsbondbytheantibodywere70.4%and81%,respectively.Invitro,withactivatedCTLsaseffectorcells,aspecificlysisofLNCaPcellsmediatedbytheantibodywasconfirmedby51Crreleaseassay.ThespecificlysisrateofLNCaPcellswaspositivelycorrelatedtotBsAbconcentrationoreffector/targetcellratio.Thehighestspecificlysisrateswere(80.3±5.2)%and(78.6±5.5)%infixedantibodyconcentrationgroupandfixedeffector/targetcellratiogroup,respectively.Invivo,theantibodycouldsuppressthetumorgrowthinnudemicesignificantlyascomparedtothegrouptreatedonlywithCTLsandtheuntreatedcontrolgroup(P<0.0001).CONCLUSION:ThetetramerofbispecificsinglechainantibodyagainsthumanprostatespecificantigenandCD3moleculehasagoodbiologicalactivityinbindingantigens,mediatinglysisofLNCaPcellsandinhibitingtumorgrowth.

【Keywords】prostaticneoplasms;antigens,CD3;antibodyaffinity;tetramer

【摘要】目的：研究抗前列腺特異抗原(PSA)/抗cd3雙特異性單鏈抗體四聚體的生物活性.方法：利用流式細(xì)胞儀和51Cr釋放試驗(yàn)評(píng)價(jià)雙特異性單鏈抗體四聚體的抗原親和活性和體外介導(dǎo)殺傷靶細(xì)胞的效果.利用裸鼠前列腺癌模型分析其在體內(nèi)介導(dǎo)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷的能力.結(jié)果：抗PSA/抗CD3雙特異性單鏈抗體四聚體可以特異性結(jié)合表達(dá)前列腺癌細(xì)胞和CD3陽(yáng)性的淋巴瘤細(xì)胞，陽(yáng)性結(jié)合率分別為70.4%和81%.在體外，有細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞存在時(shí)該四聚體可引起前列腺癌細(xì)胞的裂解，在抗體濃度固定組和效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞比例固定組，靶細(xì)胞裂解率分別隨著效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞比例和抗體濃度的增加而增加，最高裂解率分別可以達(dá)到(80.3±5.2)%和(78.6±5.5)%.與對(duì)照組比較，接種前列腺癌細(xì)胞的裸鼠在體內(nèi)注射激活的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的同時(shí)接受該四聚體的治療后，腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制(P<0.0001).結(jié)論：抗PSA/抗CD3雙特異性單鏈抗體四聚體具有良好的生物學(xué)活性，具有體外殺傷腫瘤細(xì)胞和體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用.

【關(guān)鍵詞】前列腺腫瘤；抗原，CD3；抗體親和力；四聚體

0引言

免疫治療因其可以調(diào)動(dòng)機(jī)體自身的免疫力，彌補(bǔ)患者免疫系統(tǒng)缺陷，達(dá)到治療腫瘤的目的而成為腫瘤治療方法中的重要組成部分.其中可以激活細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞并使其在腫瘤局部聚集的抗CD3/抗腫瘤特異性抗原雙特異性抗體倍受研究者矚目［1］.人p53基因表達(dá)產(chǎn)物以四聚體形式存在，其四價(jià)功能域表達(dá)產(chǎn)物可自動(dòng)裝配成四聚體.我們?cè)诔晒?gòu)建了人IgG3上游鉸鏈區(qū)/p53四價(jià)功能域融合基因［2］和制備抗前列腺特異抗原/抗CD3雙特異性單鏈抗體(BsAb)的基礎(chǔ)之上［3-4］，將四價(jià)功能域融合基因與雙特異性單鏈抗體基因拼接，制備雙特異性單鏈抗體的四聚體［5］，明顯提高了雙特異性單鏈抗體的親和力,改善了其生物活性.

1材料和方法

1.1材料抗PSA/抗人CD3雙特異性單鏈抗體四聚體(tBsAb)［5］由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存；前列腺癌細(xì)胞系LNCaP和CD3陽(yáng)性的淋巴瘤細(xì)胞系Jurkat購(gòu)買自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)收集所(ATCC,USA)；健康純種雌性Balb/c裸鼠（6~9wk）購(gòu)買自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心.FITC標(biāo)記的抗myc單克隆抗體(9E10)為第四軍醫(yī)大學(xué)免疫教研室謝鑫博士惠贈(zèng)；其它常規(guī)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純.

1.2方法

1.2.1抗體親和活性的鑒定前列腺癌細(xì)胞LNCaP和CD3陽(yáng)性的淋巴瘤細(xì)胞Jurkat分別用含100g/LFCS的RPMI1640調(diào)整細(xì)胞濃度為5×109～1×1010/L，兩種細(xì)胞懸液各取2份，40μL/份，分別加入純化后的抗體（tBsAb），調(diào)整抗體終濃度為20mg/L，再加50μL1∶20(用DPBS稀釋)滅活正常兔血清，4℃放置30min，用洗滌液洗滌2次，每次加洗滌液2mL，離心1000r/min，5min，棄上清，加入50μL1∶1500的FITC標(biāo)記的抗myc單克隆抗體，充分振搖，4℃放置30min，用洗滌液洗滌2次，每次加洗滌液2mL，離心1000r/min，5min，棄上清，加入1mL固定液，進(jìn)行流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè).用正常鼠IgG替代抗體，按上述方法處理后作為陰性對(duì)照.

1.2.2效應(yīng)細(xì)胞的制備利用密度梯度離心方法從正常人肝素化血液中提取外周血單核細(xì)胞（PBMC），加入低溫PBS重懸浮后，離心1000r/min，10min，棄上清，加入含有100g/LFCS,2mmoL/L谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640重懸浮.PBMC懸液移入250mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶，CO2孵箱孵育1d，將非貼壁細(xì)胞移入新的培養(yǎng)瓶，更換培養(yǎng)液，并加入終濃度150U/mL的IL2，孵育3d，再次更換培養(yǎng)液，并將IL2的終濃度調(diào)整為100U/mL.之后每3d更換培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)8wk后做為效應(yīng)細(xì)胞.

1.2.3細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)利用51Cr釋放試驗(yàn)鑒定雙特異性抗體介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的效果.靶細(xì)胞的標(biāo)記：將5×106LNCaP細(xì)胞和7400kBq（200μCi）Na2［51Cr］O4在37℃的50mL/LCO2孵箱中孵育1d，RPMI1640洗滌2次后，加入96孔培養(yǎng)板中（1×104/孔）.將靶細(xì)胞分為對(duì)照組和tBsAb組，對(duì)照組中應(yīng)用小鼠IgG.每組再分為抗體濃度固定組和效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞比例固定組.另設(shè)僅含標(biāo)記靶細(xì)胞的自然釋放對(duì)照孔及含有標(biāo)記靶細(xì)胞和10mL/LTritonX100的最大釋放對(duì)照孔.抗體濃度固定組的抗體濃度為30μg/L，效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞比例從0.5∶1至30∶1不等；效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞（E/T）比例固定組中E/T為20∶1，抗體濃度為0.1~300μg/L，相同實(shí)驗(yàn)條件重復(fù)4孔.50mL/LCO2孵箱，37℃放置4h.然后，經(jīng)過(guò)離心提取培養(yǎng)上清（150μL），γ計(jì)數(shù)器測(cè)量每份上清的cpm值.計(jì)算特異性釋放率：特異性釋放率(%)＝（實(shí)驗(yàn)孔cpm-自然釋放對(duì)照孔cpm）/(最大釋放對(duì)照孔cpm-實(shí)驗(yàn)孔cpm)×100%.

1.2.4裸鼠動(dòng)物模型四只健康裸鼠靜脈注射tBsAb和效應(yīng)細(xì)胞，驗(yàn)證抗體及效應(yīng)細(xì)胞毒副作用.將36只裸鼠隨機(jī)分成3組：非治療組、對(duì)照組和tBsAb組，非治療組不接受任何治療，對(duì)照組每日僅接受靜脈注射效應(yīng)細(xì)胞（1×107），tBsAb組靜脈注射1×107效應(yīng)細(xì)胞和200μgtBsAb.分別于裸鼠腹側(cè)皮下注射1×107LNCaP細(xì)胞，等腫瘤體積達(dá)到約100mm3時(shí)，開(kāi)始各組治療方案并計(jì)時(shí)，腫瘤體積每周測(cè)量1次，體積計(jì)算：寬2×長(zhǎng)×0.52.6wk后將裸鼠用CO2處死.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：利用SAS8.1統(tǒng)計(jì)軟件分析,統(tǒng)計(jì)圖利用SPSS13.0制作，采用重復(fù)測(cè)量方差分析.P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2結(jié)果

2.1流式細(xì)胞儀FMC顯示雙特異性抗體四聚體可以特異性結(jié)合前列腺癌細(xì)胞LNCaP和CD3陽(yáng)性的淋巴瘤細(xì)胞Jurkat，與LNCaP細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞的陽(yáng)性結(jié)合率分別為70.4%和81%(圖1).

A:Jurkat細(xì)胞陰性對(duì)照組;B:tBsAb與Jurkat細(xì)胞的結(jié)合；C:LNCaP細(xì)胞陰性對(duì)照組;D:tBsAb與LNCaP細(xì)胞的結(jié)合.

圖1FCM分析tBsAb分別與LNCaP和Jurkat的結(jié)合活性（略）

2.2體外介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用tBsAb可以有效的介導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞（T細(xì)胞）對(duì)靶細(xì)胞（LNCaP細(xì)胞）的殺傷，靶細(xì)胞裂解百分比在實(shí)驗(yàn)組（效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞比例固定組和抗體濃度固定組）和對(duì)照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0001）.在效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞比例固定組，隨著tBsAb濃度的不斷增加，特異性釋放率顯著增加（P<0.0001）；同樣，在抗體濃度固定組，隨著效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞比例的逐漸增加，特異性釋放率顯著增加P<0.0001,圖2).

A:效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比例固定組;B:抗體濃度固定組.

圖2tBsAb介導(dǎo)的特異性殺傷（略）

2.3裸鼠動(dòng)物模型4只接受靜脈注射tBsAb和效應(yīng)細(xì)胞的健康裸鼠無(wú)明顯異常表現(xiàn)，證實(shí)tBsAb和效應(yīng)細(xì)胞無(wú)明顯毒副作用，裸鼠可以耐受.36只入組裸鼠中，共33只完成6wk治療，3只死亡，其中1只死于感染，2只死亡原因不明，將死亡裸鼠實(shí)驗(yàn)資料剔除，最終每組實(shí)驗(yàn)裸鼠數(shù)目為非治療組（n=12），對(duì)照組（n=11）和tBsAb組（n=10）.重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果顯示：非治療組和對(duì)照組腫瘤體積逐漸增大，tBsAb組腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制，三組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0001，圖3).

圖3tBsAb的治療作用（略）

3討論

免疫治療因其可以調(diào)動(dòng)機(jī)體自身的免疫力，彌補(bǔ)患者免疫系統(tǒng)缺陷，達(dá)到治療腫瘤的目的而成為腫瘤治療方法中的重要組成部分.近年來(lái)，越來(lái)越多的研究結(jié)果顯示：腫瘤免疫治療是一種具有廣闊應(yīng)用前景的治療方法.由于抗免疫效應(yīng)細(xì)胞表面標(biāo)志物，如CD3,CD2,CD16和CD64等抗體可以有效激活效應(yīng)細(xì)胞，因此利用同時(shí)能識(shí)別免疫效應(yīng)細(xì)胞及腫瘤相關(guān)抗原的雙特異性抗體可以增加腫瘤部位效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量并激活效應(yīng)細(xì)胞，使其發(fā)揮細(xì)胞毒功能.

本實(shí)驗(yàn)室利用分子克隆的方法成功構(gòu)建了抗PSA/抗人CD3雙特異性單鏈抗體，試圖增加并活化前列腺癌組織周圍的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞，介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞對(duì)前列腺癌細(xì)胞的殺傷，達(dá)到治療前列腺癌的目的.但是，其親和力和腫瘤殺傷活性不理想［4］.之后我們利用p53四價(jià)功能域可以將P53分子自動(dòng)組裝成四聚體的特性，構(gòu)建了人IgG3上游鉸鏈區(qū)/p53四價(jià)功能域融合基因［2］，將其融合在BsAb基因的3''''端，構(gòu)建了抗PSA/抗人CD3雙特異性單鏈抗體的四聚體基因，并獲得真核表達(dá)，明顯提高了原雙特異性單鏈抗體的親和力［5］.

我們研究表明,tBsAb可以特異性識(shí)別靶細(xì)胞，與靶細(xì)胞的親和力明顯高于原雙特異性單鏈抗體（BsAb）.體外殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示tBsAb可以介導(dǎo)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷，介導(dǎo)殺傷效率明顯優(yōu)于BsAb［4］.同時(shí)，這一結(jié)果在裸鼠前列腺癌模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中得到進(jìn)一步證實(shí)：tBsAb基本可以達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的.當(dāng)然從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中還可以看出：只有當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞成倍于靶細(xì)胞，并且抗體濃度達(dá)到一定水平時(shí)，抗體介導(dǎo)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力才能得到發(fā)揮，并且這種能力的大小與效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞比例和抗體濃度程正相關(guān).

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