導(dǎo)語：瘤細(xì)胞庫建立應(yīng)用管理論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

摘要目的：為了對流感病毒甲型和乙型、副流感病毒1、2和3型、呼吸道合胞病毒及腺病毒3、7型主要呼吸道病毒進(jìn)行快診。方法：從1986到1997年應(yīng)用雜交瘤單抗技術(shù)，制備出以上4類8種抗病毒單抗細(xì)胞庫，連同用于連接物的抗堿性磷酸酶單抗細(xì)胞株，共有117株單抗細(xì)胞株。將以上4類8種病毒單抗連接抗堿性磷酸酶單抗復(fù)合物，以兔抗鼠搭橋進(jìn)行APAAP橋聯(lián)快速診斷。結(jié)果：獲得滿意結(jié)果，此技術(shù)結(jié)果清晰，無內(nèi)源性酶干擾，只需1臺普通光學(xué)顯微鏡，2～3h可獲得準(zhǔn)確結(jié)果。本系列快速診斷試劑已獲得國家4項(xiàng)新藥證書及5項(xiàng)生產(chǎn)文號。結(jié)論：此抗主要呼吸道病毒單抗細(xì)胞庫，不僅可提供快診試劑，也可提供病毒亞型分析、病毒變異以及基因表達(dá)研究試劑。

關(guān)鍵詞主要呼吸道病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞庫

Establishmentandclinicalapplicationofthehybridomacellbankofmonoclonalantibodiesagainst8typesofmainrespiratoryviruses

DUANPei-Ruo,ZHANGLi-Li,HANHong-Yanetal.

DepartmentofClinicalExperiment,No.262HospitalofPLA,Beijing100088

AbstractObjective:The8types,4kindsofmainrespiratoryviruseswhichcausehumanrespiratorydiseases,includeinfluenza-A、B,parainfluenzavirus1、2、3,respiratorysyncytialvirusandadenovirus-3、7.Methods:Haddevelopedakittorapidlydiagnosethesevirusesfrom1986to1997.Bythetechniqueofhybridoma,hadprepared117hybridomacellstrainssecretingMcAbsofthese8types,4kindsofvirusesandofalkalinephosphatase.TheMcAbsformajunctionalcomplexplusalkalinephosphataseanti-alkalinephosphatase(APAAP)bridgedrapiddiagnosis.Results：Theresultofthekitiscredible,andnodisturbanceofPendogenousenzyme.Performingthediagnosis,onlyneedageneralopticalmicroscopeandcanfinishin2or3h.Thehybridomacellbankcanprovidenotonlythereagentsoftherapiddiagnosis,butalsothereagentsforanalysisofvirussubgroups,virusvariationandgeneexpression.Conclusion:Theserialreagentsoftherapiddiagnosishavebeengranted4newdrugcertificatesand5productioncertificatesbytheministryofHealthDepartmentofNationalHealth.

KeywordsMainrespiratoryvirusesMonoclonalantibodyHybridomacellbank

國內(nèi)外專著指出：對人類，尤其是嬰幼兒，威脅最大的為流感病毒甲（Influenza-A,FluA）和乙型（Influenza-B,FluB）、副流感病毒1、2和3型（Parainfluenzavirus1、2、3,PIV1、2、3）、呼吸道合胞病毒（Respiratorysyncytialvirus,RSV）及腺病毒3、7型（Adenovirus-3、7,Adv3、7），急性呼吸道病毒的實(shí)驗(yàn)診斷應(yīng)首先考慮以上這4類8種病毒［1，2］。從1986～1997年應(yīng)用淋巴細(xì)胞雜交瘤生物技術(shù)，完成了以上4類8種病毒單克隆抗體（Monoclonalantibody，McAb）雜交瘤細(xì)胞系的制備以及快速診斷橋聯(lián)試劑、抗堿性磷酸酶單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系的制備工作，共9大系117株單抗細(xì)胞株。此報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1第一抗體即4類8種抗病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系的建立

1.1.1病毒抗原來源均嚴(yán)格采用標(biāo)準(zhǔn)品。流感病毒甲型和乙型毒株購于首都病毒研究所流感中心［3，4］，副流感病毒1、2、3型毒株購于美國馬里蘭州ATCC國際毒株庫［5-7］，呼吸道合胞病毒long株由友誼醫(yī)院病毒室提供［8］，腺病毒3、7型毒株由預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所毒株庫提供［9］。

1.1.2動物免疫病毒采用Balb/c小鼠易感系統(tǒng)加脾攻擊方法進(jìn)行［3-9］，堿性磷酸酶采用皮內(nèi)半佐劑加靜脈免疫［10］。

1.1.3細(xì)胞融合按文獻(xiàn)［1］常規(guī)法進(jìn)行。

1.1.4陽性孔檢測用IFA熒光法以及間接反向ELISA。

1.1.5細(xì)胞株的鑒定所有的細(xì)胞株要求經(jīng)3次以上亞克隆，3次反復(fù)凍存，3個(gè)月的37℃環(huán)境下傳代，對52株單抗做Ig亞型分析，染色體分析，每株均要求作阻斷、替代、交叉、封閉以及穩(wěn)定性6種特異性鑒定［3-10］。

1.2第二抗體即兔抗鼠的制備按文獻(xiàn)［1］進(jìn)行。

1.3第三抗體即抗堿性磷酸酶（Alkalinephosphatase，AP）單克隆抗體細(xì)胞系及其復(fù)合物（APAAP）的制備動物免疫用的抗原系美國Promege公司產(chǎn)的精酶，采用反向間接ELISA檢測技術(shù)獲得抗堿性磷酸酶單克隆抗體細(xì)胞系，然后選擇單抗最適濃度結(jié)合抗原，制成APAAP復(fù)合物［11］。

1.4快速診斷兩種技術(shù)

1.4.1將8種抗呼吸道病毒單抗用于橋聯(lián)（APAAP)

快速診斷技術(shù)。

1.4.2將8種抗呼吸道病毒單抗用于間接熒光（IFA）快速診斷技術(shù)［7-9，12］。

1.5臨床應(yīng)用方法

1.5.1研究者的臨床應(yīng)用見文獻(xiàn)［6-9，11，13］。

1.5.2協(xié)作者的臨床驗(yàn)證見文獻(xiàn)［14-16］。

1.5.3國外產(chǎn)品應(yīng)用WHO標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證［6-9］。

2結(jié)果

2.18大系單抗細(xì)胞庫的建立和鑒定結(jié)果

2.1.1建立起一個(gè)比較完整的抗主要呼吸道病毒單抗雜交瘤細(xì)胞庫1986～1997年共獲8大系108株單抗細(xì)胞株：抗甲型流感11株；抗乙型流感6株；抗腺病毒3型14株；抗腺病毒7型7株；抗副流感1型18株；抗副流感2型5株；抗副流感3型22株；抗合胞病毒25株。以上8大系單抗雜交瘤細(xì)胞系的建立見文獻(xiàn)［3-11］。

2.1.2系列單克隆抗體Ig亞型和效價(jià)分析見表1。

2.1.3系列單抗的效價(jià)測定用于臨床快速診斷的以上52株單抗，平均結(jié)合病毒效價(jià)為8000～32000(+++，熒光法)，其連接物堿性磷酸酶單抗效價(jià)

表18種主要呼吸道病毒單克隆抗體Ig亞型分析

Tab.1AnalysisofIgsubtypesofMcAbsagainst8typesofmainrespiratoryviruses

McAbsNumber1)Igsubtypes

IgG1IgG2aIgG2bIgG3IgM

FluA11623

FluB5113

PIV16411

PIV25212

PIV3624

RSV871

Adv7532

Adv333

AP33

Total5215161218

Note:1)allofthe52cell-linesselectedwereusedfortherapiddiagnosis達(dá)2000萬（+++，反向間接ELISA），證實(shí)9大系列單抗均具有高度的敏感性和親和力，效價(jià)要高出動物抗血清20～600倍，且無抗細(xì)胞抗體混雜。

2.1.4單抗的特異性鑒定結(jié)果交叉試驗(yàn)：各株單抗分別與常見的9～12種呼吸道病毒抗原和相關(guān)病毒（腮腺炎病毒、麻疹病毒等）作交叉試驗(yàn)，結(jié)果無交叉反應(yīng)。阻斷試驗(yàn)：各株單抗分別以異種動物抗血清作阻斷，血清在1：2～1：8時(shí)，系列單抗被特異阻斷。替代試驗(yàn)：以1%小鼠血清替代系列單抗作已知陽性標(biāo)本，均為陰性。免疫印跡反應(yīng)（Westernblot）、結(jié)合表位鑒定：合胞病毒（8株）、副流感1、2、3型（16株）、腺病毒3、7型（8株），抗原經(jīng)還原處理后，單抗能清晰地與對應(yīng)病毒蛋白的表位結(jié)合［14］。單抗的純化和冰干：經(jīng)鹽析用DEAE-52離子交換層析后，比活性達(dá)95.2U/mg以上。將各株單抗按8個(gè)單位應(yīng)用效價(jià)稀釋后按8種抗病毒抗體分別混合組成診斷試劑，制成冰干品。

2.2兔抗鼠（二抗）及兔抗鼠熒光標(biāo)記免疫效價(jià)為1：32（+++，雙擴(kuò)法），兔抗鼠以熒光標(biāo)記純化，應(yīng)用效價(jià)為1：10稀釋。

2.3堿性磷酸酶單抗及復(fù)合物結(jié)果共獲單抗細(xì)胞株9株，單抗在16000U/ml時(shí)結(jié)合堿性磷酸酶抗原4U，成為APAAP復(fù)合物。

2.4系列呼吸道病毒單抗用于橋聯(lián)快速診斷的質(zhì)量指標(biāo)結(jié)果見表2。表2系國外快速診斷試劑和病毒分離、雙份血清、WHO-McAb標(biāo)準(zhǔn)品和IFA技術(shù)對照所得。以上結(jié)果證實(shí)系列單抗用于橋聯(lián)快速診斷的各項(xiàng)指標(biāo)符合生物試劑標(biāo)準(zhǔn)。

表2系列呼吸道病毒單抗用于快速診斷的質(zhì)量指標(biāo)

Tab.2ThequalityresultsofseriesofMcAbsusedintherapiddiagnosis

IndicatorViruses

FluPIVAdvRSV

Sensitivity(%)93.30100.0090.0093.50

Specificity(%)100.0099.0099.40100.00

Pseudo-positiveratio(%)01.000.580

Pseudo-negativeratio(%)6.70010.006.20

Positivepredictionvalue(%)93.70100.0090.0090.00

Negativepredictionvalue(%)100.0096.0098.40100.00

Grossuniformity(%)92.3099.0098.8096.00

Adjusteduniformity(%)92.3598.0094.5095.70

Youdenindex0.8900.9900.8970.930

2.5系列呼吸道病毒單抗用于橋聯(lián)快速診斷試劑申請的國家新藥證書和文號從1991～1994年經(jīng)申請和審批，共獲4項(xiàng)新藥證書和5項(xiàng)生產(chǎn)文號，它們是合胞病毒，(93)衛(wèi)藥證字S-05號，(93)衛(wèi)藥準(zhǔn)字(京星)S-02號；副流感1、3型，(94)衛(wèi)藥證字S-21號，(94)衛(wèi)藥準(zhǔn)字(京星)S-01號；副流感2型，(94)衛(wèi)藥證字S-25號，(94)衛(wèi)藥準(zhǔn)字(京星)S-03號；腺病毒3、7型，(94)衛(wèi)藥證字S-22號，(94)衛(wèi)藥準(zhǔn)字(京星)S-02號；流感A和B型，(94)衛(wèi)藥準(zhǔn)字(京星)S-01號。

3討論

急性病毒性呼吸道感染是人類最常見的傳染病，尤其是軍營、學(xué)校、幼兒園等人群聚集的地方，常在流行期呈幾十人甚至幾百人發(fā)病，人們往往很難弄清病毒病因。本研究用10年時(shí)間建立起比較完整的抗主要呼吸道病毒單抗雜交瘤細(xì)胞庫，連同連接物堿性磷酸酶單抗雜交瘤細(xì)胞株，此庫共有9大系117株細(xì)胞株，其中抗副流感1、2、3型和抗呼吸道合胞病毒G蛋白單抗等70株為國內(nèi)少見報(bào)道的細(xì)胞株。該庫的建立，不僅可不間斷地提供8種主要呼吸道病毒快速診斷試劑［14-17］，還可為國內(nèi)主要呼吸道病毒的亞型分析、病毒變異以及基因表達(dá)等提供研究試劑［18，19］。

本研究創(chuàng)立的抗主要呼吸道病毒橋聯(lián)診斷試劑，克服了內(nèi)源酶對結(jié)果的干擾，只需1臺普通顯微鏡即可觀察細(xì)胞內(nèi)病毒抗原存在，其結(jié)果清晰快速，2～3h可獲得準(zhǔn)確診斷結(jié)果［11，13，15，16］。我國是世界公認(rèn)流感病毒大流行株及變異株發(fā)源地，此試劑有較大的實(shí)用價(jià)值，本研究者曾3次在6h內(nèi)快速報(bào)道流感疫情［20，21］。系列診斷試劑經(jīng)國家生物制品鑒定所嚴(yán)格鑒定和審查，已獲4項(xiàng)國家新藥證書，5項(xiàng)生產(chǎn)批準(zhǔn)文號，它們是國內(nèi)首次按“藥品管理法”審批程序批準(zhǔn)的系列呼吸道病毒單抗橋聯(lián)快速診斷試劑。

作者簡介：段佩若，女，62歲，主任技師，主要從事醫(yī)學(xué)呼吸道病毒學(xué)研究

作者單位：(解放軍第262醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科，北京100088)

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