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【摘要】目的探討一氧化氮(NO)對(duì)大鼠無(wú)心跳供體(NHBD)肺缺血再灌注損傷(IRI)的影響。方法大鼠隨機(jī)分為Ⅰ組:有心跳供體(HBD)組;Ⅱ組:NHBD-吸氧組;Ⅲ組:NHBD-吸氧＋NO組。Ⅰ組在處死的同時(shí)灌注4℃低鉀右旋糖苷液(LPD),Ⅱ組、Ⅲ組處死后維持輔助呼吸,放置室溫中30min再灌注LPD液。供肺置于4℃LPD液中4h后行原位左肺移植術(shù)。術(shù)后維持輔助呼吸1h。Ⅲ組通氣吸氧的同時(shí)吸入濃度為40×10-6的NO。結(jié)果與Ⅱ組比較,Ⅲ組肺順應(yīng)性、動(dòng)脈血氧分壓高,肺組織丙二醛含量低(P<0.05)。結(jié)論吸入低濃度NO可減輕大鼠NHBD肺缺血再灌注損傷。

【關(guān)鍵詞】一氧化氮;組織供者;肺移植;缺血;再灌注損傷;疾病模型,動(dòng)物

ABSTRACT:ObjectiveToevaluatetheeffectofinhalednitricoxide(NO)ontheischemia-reperfusioninjury(IRI)inratlungsfromnon-heart-beatingdonors(NHBD).MethodsSixtySprague-Dawleyratswererandomlydividedinto3groups:groupⅠ,heart-beatingdonor;groupⅡ,NHBDwith30minutesofwarmischemiatime(WIT)andoxygeninhaled;groupⅢ,NHBDwith30minutesofWITandoxygenandNOinhaled.ThedonorlungsofgroupⅠwereflushedwithlowpotassiumdextran(LPD)solutionat4℃afterasystoliawhilethelungsofgroupⅡandgroupⅢremainedventilatedattheroomtemperaturefor30minutesafterasystoliaandthenwereflushedwithLPDsolution.AllofthedonorlungsremainedinflatedwhentheywerestoredinLPDsolutionat4℃for4hours.Therecipientratsunderwentorthotopicleftlungtransplantation.Aftertransplantation1hour’sreperfusionandventilationwasmanipulated.ThedonorlungsofgroupⅢinhaledadditionalNOwiththeconcentrationof40×10-6atthetimeofventilation.ResultsComparedwiththegroupⅡ,thepulmonarycomplianceandtheoxygenpartialpressureofthearterialbloodarehigher,theMDAinthelunglower(P<0.05).ConclusionThelow-dosageofNOisaneffectivetreatmenttoattenuatetheacuteinjuryresultedfromtheischemia-reperfusionintheratlungsfromnon-heart-beatingdonors.

KEYWORDS:nitricoxide;tissuedonorslungtransplantation;ischemia;reperfusioninjury;diseasemodels,animal

肺移植是治療晚期肺部疾病的成熟方法。但肺移植例數(shù)卻一直得不到顯著提高,其中一個(gè)重要原因就是合適供體肺嚴(yán)重短缺。若能應(yīng)用無(wú)心跳供體(NHBD)肺,將極大緩解供肺來(lái)源緊張的狀況。先前筆者的研究已證實(shí)NHBD肺可作為供體肺［1］。但缺血再灌注損傷(IRI)限制了NHBD肺應(yīng)用。為減少IRI對(duì)NHBD肺造成的影響,保護(hù)NHBD肺的結(jié)構(gòu)和功能的完善,筆者探討一氧化氮(NO)對(duì)NHBD肺的保護(hù)作用。

1材料和方法

1.1動(dòng)物

健康雄性Sprague-Dawley大鼠60只,體質(zhì)量(350±12.5)g(上海第二醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部,合格證書:醫(yī)動(dòng)字第07-23-4號(hào))。

1.2主要儀器

動(dòng)物人工呼吸機(jī)(DH-140B型,浙江醫(yī)科大學(xué)醫(yī)療儀器實(shí)驗(yàn)廠);低鉀右旋糖苷液(LPD,福州嘉華制藥有限公司);NO監(jiān)測(cè)儀(英國(guó)MicroMedical公司);NO標(biāo)準(zhǔn)氣體(北京普萊克斯氣體有限公司);手術(shù)顯微鏡(SXP-1B型,上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠);血?dú)夥治鰞x(i-STAT便攜式,美國(guó)雅培公司);

1.3方法

1.3.1分組

大鼠隨機(jī)分為3組，供、受體各10只。Ⅰ組:有心跳供體(HBD)組;Ⅱ組:無(wú)心跳供體(NHBD)-吸氧組;Ⅲ組:NHBD-吸氧＋NO組。Ⅰ組在處死的同時(shí)灌注4℃LPD;Ⅱ組、Ⅲ組處死后維持輔助呼吸,放置室溫中30min再灌注LPD液。供肺置于4℃LPD液中4h后行原位左肺移植術(shù)。術(shù)后維持輔助呼吸1h。Ⅲ組通氣吸氧的同時(shí)吸入濃度為40×10-6的NO。

1.3.2取HBD肺

供體大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉50mg/kg。仰臥位,氣管插入16號(hào)穿刺針,連接動(dòng)物人工呼吸機(jī),吸入氧濃度(FiO2)50%,呼吸模式為持續(xù)容量控制,呼吸頻率80~90min-1,潮氣量1mL/100g,保持呼氣末正壓(PEEP)2~3cmH2O(1cmH2O=9.8Pa)。自左股靜脈注射肝素鈉500IU。5min后剪開胸骨及腹壁,剪斷腹主動(dòng)脈放血。心臟停跳的同時(shí)于肺動(dòng)脈主干插入20號(hào)穿刺針,結(jié)扎并固定,剪破左心耳,維持通氣的同時(shí)自穿刺針灌注4℃LPD液20mL,灌注壓25cmH2O,在肺吸氣末切下心肺組織,立即浸泡在4℃LPD液中5min,剪下膨脹的左肺,保存在4℃LPD液中4h。

1.3.3取NHBD肺

處死供體鼠后,室溫下維持通氣30min再灌注LPD液。NHBD-吸氧組吸入氣不含NO,NHBD-吸氧＋NO組吸入濃度為40×10-6的NO。

1.3.4左肺移植

受體鼠麻醉、插管后,右側(cè)臥位,經(jīng)左第5肋間切口充分暴露左肺門,盡可能靠近遠(yuǎn)心端剪除左肺。供肺包以冰水浸泡的濕紗布,放入左側(cè)胸腔,在手術(shù)顯微鏡下9-0錦綸線依次吻合左肺靜脈、左主支氣管、左肺動(dòng)脈,連續(xù)吻合主支氣管膜部,軟骨部間斷吻合,10-0錦綸線間斷吻合肺動(dòng)脈,連續(xù)吻合肺靜脈。左肺獲得再灌注后,間斷加大PEEP,使其充分膨脹。Ⅲ組受體在肺移植過(guò)程中維持NO通氣(濃度為40×10－6)。

1.4觀察指標(biāo)

左肺再灌注后1h,經(jīng)右第5肋間結(jié)扎右肺門,采集數(shù)據(jù)。

1.4.1肺順應(yīng)性

呼吸機(jī)直接讀取數(shù)據(jù)肺順應(yīng)性=潮氣量/(吸氣末壓-呼氣末壓)

1.4.2動(dòng)脈血?dú)?/p>

受體鼠結(jié)扎右肺門前后15,30min分別從頸動(dòng)脈放血0.3mL,測(cè)定動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)和二氧化碳分壓(PaCO2)。

1.4.3肺組織丙二醛(MDA)含量

取1cm×1cm的肺組織,沖洗干凈,研磨成勻漿,按文獻(xiàn)［2］硫代巴比妥法測(cè)MDA含量。

1.4.4肺組織光鏡

LPD液灌注前取1cm×1cm右肺組織,結(jié)扎右肺門后0.5h取1cm×1cm左肺組織行光鏡組織學(xué)檢查(H-E染色×40)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以x±s表示,采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,組間比較采用One-wayANOVA方差分析。P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1肺組織順應(yīng)性、MDA含量及動(dòng)脈血氧分壓Ⅰ組與Ⅱ組比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Ⅲ組與Ⅱ組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1,2)。表13組實(shí)驗(yàn)大鼠肺順應(yīng)性和肺組織MDA含量比較（略）表23組實(shí)驗(yàn)大鼠動(dòng)脈血?dú)夥治霰容^（略）

2.2肺組織光鏡檢查

Ⅰ組和Ⅱ組肺泡間質(zhì)均有一定量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(P<0.05),Ⅲ組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)相對(duì)較輕(圖1)。

3討論

當(dāng)前,適宜肺供體的嚴(yán)重短缺極大制約了肺移植的開展。Egan等首次應(yīng)用無(wú)心跳供體肺于肺移植研究中,發(fā)現(xiàn)狗肺死后尸體原位熱缺血1h、取出冷保存4h、移植1h后仍可維持完善的氣體交換和血流動(dòng)力學(xué)功能［3］。本課題組早期研究顯示,與HBD移植肺相比,大鼠NHBD肺熱缺血30min,移植后肺的順應(yīng)性、肺能量代謝物含量,肺氣體交換功能維持正常［1］。本次研究顯示,Ⅱ組和Ⅰ組移植肺順應(yīng)性、血?dú)夥治龊头谓M織MDA含量差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

但是,供肺在保存過(guò)程中存在的IRI,不僅造成肺移植患者術(shù)后的早期死亡,而且增加了急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率,導(dǎo)致長(zhǎng)期存活受體的移植物失功［4］。NHBD肺還存在熱缺血過(guò)程,隨著熱缺血時(shí)間的延長(zhǎng),術(shù)后IRI更加嚴(yán)重［1,5］。移植肺發(fā)生IRI的過(guò)程中,內(nèi)源性NO明顯減少［6-7］。內(nèi)源性NO可對(duì)肺IRI產(chǎn)生明顯的保護(hù)效果。研究人員運(yùn)用多種方法處理實(shí)驗(yàn)對(duì)象,包括腹腔注射曲匹地爾、鼻飼氯匹格雷、肺保護(hù)液內(nèi)加入硝酸甘油(NTG)、左旋精氨酸等,以促進(jìn)機(jī)體內(nèi)源性NO的產(chǎn)生,減輕IRI,使肺功能顯著改善［8-12］。但所有這些實(shí)驗(yàn)都是在有心跳供體的肺移植中所取得的成果。

為了獲取結(jié)構(gòu)和功能保存更好的NHBD肺,本研究在前期工作的基礎(chǔ)上,給予采用外源性低濃度NO(40×10－6)于大鼠NHBD肺移植中,并貫穿于供肺保存、手術(shù)期間及術(shù)后1h整個(gè)過(guò)程。結(jié)果發(fā)現(xiàn),吸入NO組(Ⅲ組)和單純吸氧組(Ⅱ組)相比,吸氣末壓分別為(19.09±0.35)cmH2O和(21.37±0.61)cmH2O,肺組織順應(yīng)性分別為(0.179±0.0020)和(0.158±0.0058),兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示肺的IRI得到明顯改善。結(jié)扎右肺門后15,30min的PaO2也得到很大的提升,說(shuō)明移植肺氧合功能也有一定程度的提高;同時(shí)肺組織MDA含量顯著降低。MDA是氧自由基介導(dǎo)的細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物,是氧自由基致機(jī)體組織細(xì)胞損傷的重要指標(biāo),是器官IRI最主要的因素,檢測(cè)MDA是判斷是否發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的重要方法［2］。Ⅲ組MDA降低,提示IRI造成氧自由基對(duì)細(xì)胞的損害明顯緩解。這和肺組織病理切片上所觀察到的結(jié)果是一致的。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［13-15］。

筆者認(rèn)為,吸入低濃度外源性NO對(duì)NHBD肺的IRI具有一定的緩解作用。

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