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【摘要】目的研究吡格列酮對(duì)游離脂肪酸(FFA)誘導(dǎo)的小鼠胰島βTc3細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制。方法以βTc3細(xì)胞為研究對(duì)象,分為對(duì)照組及FFA組(0.25,0.5,1.0mmol/L)。檢測(cè)不同濃度FFA干預(yù)后βTc3細(xì)胞的增殖抑制率、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡率;檢測(cè)吡格列酮對(duì)FFA誘導(dǎo)的βTc3細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用。結(jié)果FFA干預(yù)后的βTc3細(xì)胞增殖抑制率隨FFA作用時(shí)間延長、濃度增加而進(jìn)行性增加。各濃度FFA干預(yù)24h后βTc3細(xì)胞周期于G1/S檢測(cè)點(diǎn)明顯阻滯,凋亡細(xì)胞比例增加。吡格列酮干預(yù)FFA誘導(dǎo)的βTc3細(xì)胞后24h,βTc3細(xì)胞周期阻滯減少,凋亡細(xì)胞比例明顯減少。結(jié)論FFA水平異常不利于胰島βTc3細(xì)胞生存,并可誘導(dǎo)βTc3細(xì)胞凋亡;吡格列酮有助于維護(hù)在FFA誘導(dǎo)下的胰島βTc3細(xì)胞的生存能力,并避免或減少其凋亡。

【關(guān)鍵詞】噻唑烷二酮類脂肪酸類菲酯化胰島糖尿病2型細(xì)胞凋亡

ABSTRACT:ObjectiveToinvestigatetheeffectsofpioglitazoneonFFAinducedapoptosisofβTc3cell,apancreaticβcelllineinvitro.MethodsβTc3wassubjecttodifferenttreatmentswithablankandthreekindconcentrationsofFFA,thatwere0.25,0.5and1.0mmol/LFFA.TheMethodofMTTwasusedtomeasuretheproliferationinhibitionratesforsuccessivethreedaysafterFFAintervention.Thechangesofcellcycleweredetected24hoursaftertreatmentbyaflowcytometry.TUNELwasusedtodeterminetheapoptosisrateofcells24hoursaftertreatment.TUNELandflowcytometrywereusedtodetermineinterventioneffectofPioglitazoneontheapoptosisofβTc3cellinducedbyFFA.ResultsInhibitionofβTc3wasincreasedwithprolongedtreatmentofFFAandincreasedFFAconcentrations.FlowcytometryanalysisshowedthatcellcycleofβTc3celltreatedwithFFAofalltheconcentrationwasblockedinphaseofG1/S.ThepercentageofβTc3cellapoptosissubstantiallyincreasedduetoFFAtreatment.NoobviousabnormalchangeofcellcycleofβTc3cellandasubstantiallydecreaseofpercentageofapoptosiscellsafterpioglitazoneintervention.ConclusionAbnormalFFAlevelisextremelyharmfulforsurvivalofβTc3cellculturedinvitro,butpioglitazonecouldmaintainthesurvivingabilityofinsulinβTc3celldamagedbyFFA.

KEYWORDS:thiazolidinediones;PPARgamma;fattyacids,nonesterified;diabetesmellitus,type2;apoptosis

福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2008年7月第42卷第4期程惠希等：吡格列酮對(duì)游離脂肪酸介導(dǎo)的βTc3細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用2型糖尿病是糖尿病的主要類型,但其發(fā)病機(jī)制尚未闡明。迄今的研究顯示,胰島β細(xì)胞功能缺陷和胰島素抵抗是2型糖尿病主要病理生理基礎(chǔ),而游離脂肪酸(freefattyacids,FFA)水平異?？赡転橹匾闹虏∫蛩?長期暴露于高FFA可引起人和鼠胰島β細(xì)胞脂質(zhì)過載,細(xì)胞增殖下調(diào)和凋亡增加,胰島素分泌減少[13]。

過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisomeproliferatorsactivatorreceptorsgamma,PPAR)是一類由配體激活的核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄因子超家族成員,存在3種亞型,即PPARα、PPARβ和PPARγ。筆者既往研究顯示,PPARγ高表達(dá)可保護(hù)胰島βTC3細(xì)胞免于FFA介導(dǎo)的損傷[4]。噻唑烷二酮類藥物(thiazolidinedionecompounds,TZD)是PPARγ的高親和力配體,也是重要的抗糖尿病藥物。筆者應(yīng)用TZD類藥物——吡格列酮干預(yù)FFA對(duì)βTC3細(xì)胞的有害影響,以期進(jìn)一步分析FFA水平異常介導(dǎo)β細(xì)胞損害的機(jī)制及為吡格列酮的抗糖尿病作用提供參考。

1材料與方法

1.1材料

βTC3細(xì)胞源自轉(zhuǎn)基因小鼠的胰島素瘤細(xì)胞(福建醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)中心惠贈(zèng));RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)培養(yǎng),內(nèi)含10％小牛血清、2mmol/L的L谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素;油酸、棕櫚酸(美國Sigma公司);吡格列酮(江蘇德源藥業(yè)有限公司);甲基偶氮唑藍(lán)(MTT,廈門泰京生物有限公司);TUNEL試劑盒(瑞士Roche公司)。

1.2方法

1.2.1FFA制備

FFA貯備液中油酸與棕櫚酸的比例為2∶1。溶解所需劑量的油酸和棕櫚酸于99%乙醇10mL,振搖1h。每10mmol/LFFA加入0.4g/mLNaOH40μL,混勻,置于通風(fēng)櫥中過夜干燥。后加入蒸餾水10mL,加熱溶液至透明皂液樣時(shí),加入10%冷小牛血清40mL,混勻。經(jīng)0.22μmCA過濾器過濾消毒后貯存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2吡格列酮配制

吡格列酮5mg用二甲亞砜(DMSO)溶解,再用DMSO溶液稀釋配置成1mmol/L的母液,過濾除菌,4℃保存,使用前用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋,培養(yǎng)基中DMSO終濃度≤0.01％。

1.2.3MTT法測(cè)定FFA對(duì)βTc3細(xì)胞的影響

取對(duì)數(shù)生長期的βTc3細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板,溫育24h后吸去上清液,每孔加含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基180μL。繼續(xù)溫育24h后,藥物組每孔加不同濃度的FFA20μL,使其工作濃度分別為0.25,0.5,1.0mmol/L,對(duì)照組加等量的含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基。反應(yīng)結(jié)束前4h吸去培養(yǎng)上清液,每孔加5mg/mL的MTT溶液50mL。繼續(xù)培養(yǎng)4h后,吸去MTT溶液,每孔加入DMSO150μL充分溶解MTT還原產(chǎn)物。于酶標(biāo)儀上檢測(cè)490nm波長光密度值(D)。測(cè)定FFA干預(yù)后12,24,48h的細(xì)胞D值,繪制各組細(xì)胞生長曲線,取各組平均值計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。

1.2.4流式細(xì)胞儀測(cè)定βTc3細(xì)胞周期

取對(duì)數(shù)生長期的βTc3細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板,分別設(shè)置對(duì)照組、A組(FFA0.25mmol/L)、B組(FFA0.5mmol/L)、C組(FFA1mmol/L)。培養(yǎng)細(xì)胞24h后以0.25％的胰蛋白酶充分消化細(xì)胞,500～1000r/min離心5min,棄去培養(yǎng)液。PBS3mL洗滌1次,離心去PBS,加入預(yù)冷的70％乙醇固定,4℃1h。離心棄去固定液,PBS3mL重懸5min。400目篩網(wǎng)過濾1次,500～1000r/min離心5min,棄去PBS。用碘化丙啶1mL染液,4℃避光30min。于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)各組細(xì)胞周期。

1.2.5TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

(1)培養(yǎng)細(xì)胞并加不同濃度的FFA,24h后經(jīng)空氣干燥后用4%多聚甲醛溶液固定,PBS洗片后,與0.3%H2O2甲醇溶液室溫孵育。(2)PBS洗片,與通透液在冰浴中孵育2min。(3)PBS沖洗2次,滴加TUNEL反應(yīng)混合液50μL,對(duì)照組以PBS緩沖液取代TUNEL反應(yīng)混合溶液,在濕盒中37℃孵育60min。(4)PBS沖洗3次,加入轉(zhuǎn)化劑POD50μL,在濕盒中37℃孵育30min。PBS沖洗3次,加入DAB底物溶液,室溫孵育10min。DAB顯色凋亡陽性細(xì)胞后(凋亡陽性細(xì)胞核呈棕黃色),蘇木精對(duì)比染色陰性細(xì)胞核。每份樣品于高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野,計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞核,計(jì)算凋亡細(xì)胞百分率。

凋亡指數(shù)(%)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)吡格列酮對(duì)細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用

取對(duì)數(shù)生長期的βTc3細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板,設(shè)置FFA1mmol/L組和100μmol/L吡格列酮+FFA1mmol/L組。培養(yǎng)細(xì)胞24h后以0.25％胰蛋白酶充分消化細(xì)胞,離心、PBS洗滌、離心,收集細(xì)胞,PBS洗滌后過濾,于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)各組細(xì)胞周期。

1.2.7TUNEL法檢測(cè)吡格列酮對(duì)細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用

培養(yǎng)細(xì)胞,設(shè)置FFA1mmol/L組和吡格列酮100μmol/L+FFA1mmol/L組,24h后同前述方法檢測(cè)βTc3細(xì)胞凋亡,計(jì)算凋亡細(xì)胞百分率。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示,SPSS10.0軟件處理數(shù)據(jù)。組間差異采用方差分析,各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較采用Dunnettt檢驗(yàn),P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1MTT分析FFA誘導(dǎo)的βTc3細(xì)胞的增殖活性變化

不同濃度的FFA作用于βTc3細(xì)胞12,24,48h后,MTT法測(cè)定各組細(xì)胞D值。與對(duì)照組比較,FFA0.25mmol/L誘導(dǎo)12h后的細(xì)胞增殖活性無明顯降低(P＞0.05);0.5mmol/L和1mmol/LFFA誘導(dǎo)12h后的細(xì)胞增殖活性明顯降低(P<0.05);不同濃度FFA誘導(dǎo)24,48h后的細(xì)胞增殖活性與對(duì)照組比較均明顯降低,細(xì)胞增殖抑制率上升。FFA對(duì)于βTc3細(xì)胞的增殖抑制作用具有明顯的時(shí)間和濃度依賴性(表1)。表1FFA誘導(dǎo)后MTT檢測(cè)的增殖抑制率（略）

2.2流式細(xì)胞儀測(cè)定FFA誘導(dǎo)后24h細(xì)胞周期

0.25,0.5,1mmol/LFFA作用于βTc3細(xì)胞24h后,各濃度FFA對(duì)于細(xì)胞周期具有明顯的G1/S阻滯作用。隨濃度增加,G1期(DNA合成前期)細(xì)胞明顯增多,S期(DNA合成期)細(xì)胞明顯減少,FFA阻滯細(xì)胞周期具有明顯的濃度依賴性。與對(duì)照組比較,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。1mmol/LFFA誘導(dǎo)的βTc3凋亡明顯,加入100μmol/L的吡格列酮干預(yù)1mmol/L的FFA誘導(dǎo)的βTc3細(xì)胞24h后,吡格列酮干預(yù)組的βTc3細(xì)胞的細(xì)胞周期的G1/S阻滯作用明顯減少,與未干預(yù)組比較,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表3)。表2FFA誘導(dǎo)24h后βTc3細(xì)胞周期（略）表3吡格列酮和FFA對(duì)βTc3細(xì)胞周期的影響（略）

2.3TUNEL法檢測(cè)FFA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

0.25,0.5,1mmol/L的FFA作用于βTc3細(xì)胞24h后,TUNEL實(shí)驗(yàn)表明上述各濃度FFA均可誘導(dǎo)βTc3細(xì)胞凋亡,且呈明顯的濃度依賴性,與對(duì)照組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。加入100μmol/L的吡格列酮干預(yù)1mmol/L的FFA誘導(dǎo)的βTc3細(xì)胞24h后,βTc3細(xì)胞的凋亡細(xì)胞比例(40.30±3.40）%,較未干預(yù)組(77.20±2.30）%明顯減少,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖1)。

3討論

近年對(duì)2型糖尿病發(fā)病機(jī)制的研究已取得很大進(jìn)展,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為胰島β細(xì)胞的進(jìn)行性衰竭是2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展的決定因素。但β細(xì)胞功能缺陷的機(jī)制目前尚未完全闡明。肥胖者脂肪組織分解產(chǎn)生的FFA明顯增加,而FFA不僅參與了胰島素抵抗的發(fā)生,也被證實(shí)可損害β細(xì)胞功能,并可導(dǎo)致β細(xì)胞凋亡[2,5]。PPARγ是脂肪細(xì)胞分化的重要調(diào)節(jié)因子,也是新一代的抗糖尿病藥物TZD的作用靶分子。已知FFA可作為配體與PPARγ結(jié)合,激活PPARγ,使Caspases蛋白表達(dá)增高,引起細(xì)胞凋亡[2,6],但具體途徑不明。文獻(xiàn)顯示,β細(xì)胞也有PPARγ表達(dá)。筆者前期研究表明,高水平的FFA對(duì)βTc3細(xì)胞的生存能力有明顯的抑制作用,表現(xiàn)為細(xì)胞生存率降低或出現(xiàn)凋亡,進(jìn)一步提示FFA對(duì)胰島β細(xì)胞的損害可能是2型糖尿病患者胰島β細(xì)胞功能失代償?shù)脑蛑弧?/p>

本研究中,筆者應(yīng)用PPARγ的激動(dòng)劑——吡格列酮干預(yù)FFA對(duì)βTc3細(xì)胞的損害,結(jié)果顯示具有明顯的保護(hù)細(xì)胞免于FFA的損害,可使βTc3細(xì)胞的凋亡明顯減少,提示吡格列酮與PPARγ結(jié)合后,抑制FFA誘導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡,表明FFA與PPAR間的反應(yīng)可能參與胰島β細(xì)胞的凋亡。TZD還也可限制β細(xì)胞內(nèi)TG的堆積,改善這些組織的功能,并可使β細(xì)胞葡萄糖刺激的胰島素分泌有所恢復(fù),繼而預(yù)防β細(xì)胞的凋亡。TZD可增加前脂肪細(xì)胞的分化和成熟,增加脂肪細(xì)胞的數(shù)量,儲(chǔ)存更多的TG,減少循環(huán)中FFA水平及非脂肪組織FFA的流入,還可以降低非脂肪組織內(nèi)原有的脂肪高合成代謝,其關(guān)鍵酶表達(dá)下調(diào),從而降低細(xì)胞內(nèi)TG含量,對(duì)TG在β細(xì)胞內(nèi)堆積引起的β細(xì)胞功能障礙起到保護(hù)作用[7]。筆者既往研究發(fā)現(xiàn),TZD可抑制NFκB的活性保護(hù)β細(xì)胞免于TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[8],此次研究顯示吡格列酮保護(hù)βTc3細(xì)胞免于FFA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，是否與抑制NFκB的活性有關(guān)值得探討。

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