導(dǎo)語(yǔ)：茵陳水溶性提取物體外抗巨細(xì)胞病毒效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究一文來(lái)源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【關(guān)鍵詞】茵陳；,,抗病毒作用；,,巨細(xì)胞病毒,

摘要：目的：探討茵陳水溶性提取物溶液體外抗人巨細(xì)胞病毒(HCMVAD169)的效應(yīng)。方法：采用細(xì)胞病變（CPE）抑制法觀察茵陳水溶性提取物溶液對(duì)HCMVAD169毒株的抑制作用，使用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞的損傷程度，并利用吸光度（A）值評(píng)價(jià)茵陳水溶性提取物溶液的抗HCMV的效應(yīng)。結(jié)果：茵陳水溶性提取物溶液半數(shù)中毒濃度(TC50)為904.49mg・L-1，半數(shù)有效濃度(IC50)為195.11mg・L-1mg・L-1，治療指數(shù)(TI)為4.64。茵陳水溶性提取物溶液具有抗HCMV的作用，且其作用隨藥物濃度的增高而增強(qiáng)。結(jié)論：體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，茵陳水溶性提取物是理想的抗HCMV中藥。

關(guān)鍵詞：茵陳；抗病毒作用；巨細(xì)胞病毒

巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus）是一種皰疹病毒科β屬的雙螺旋DNA病毒，在自然界廣泛存在。正常人中CMV的潛伏感染率很高,血清學(xué)檢查陽(yáng)性率達(dá)40%~90%。普通人群感染后并不表現(xiàn)出癥狀,但在免疫缺陷或免疫抑制人群中卻有極強(qiáng)的致病性,腎移植后有癥狀的臨床感染發(fā)病率是20%～60%,如果沒(méi)有有效治療,死亡率可高達(dá)90%。在器官移植術(shù)后,尤其在使用免疫抑制劑的情況下,受體感染CMV的機(jī)率更高［1］，甚至引起嚴(yán)重的CMV疾病。CMV病治療目前國(guó)內(nèi)外都以更昔洛韋作為首選［2］,而目前常用的更昔洛韋等幾種西藥都存在毒副作用大、價(jià)位高、長(zhǎng)時(shí)間使用耐藥等缺點(diǎn),臨床觀察表明在更昔洛韋耐藥病人中易產(chǎn)生嚴(yán)重的并發(fā)癥,包括異體移植物的喪失、持久的視力損害等的發(fā)生率高達(dá)80%［3］。而傳統(tǒng)的中藥制劑毒副作用小,價(jià)格低廉,服用方便，同時(shí)還有其他如抗菌、提高免疫力等效能。本研究所采用CPE和MTT方法觀察并測(cè)定茵陳水溶性提取物溶液對(duì)HCMVAD169毒株液的抗病毒效用，為發(fā)現(xiàn)有效藥物應(yīng)用于臨床防治巨細(xì)胞病毒感染提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

11材料

111人胚肺成纖維細(xì)胞(HEL)由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所微生物研究室提供。實(shí)驗(yàn)所用為413代細(xì)胞。細(xì)胞生長(zhǎng)液為RPMI1640溶液加10%新生小牛血清,200kU・L-1青霉素,200kU・L-1鏈霉素。細(xì)胞維持液為RPMI1640溶液加2%新生小牛血清,所加抗生素同生長(zhǎng)液。

112病毒HCMVAD169由山東醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所微生物研究室提供,按常規(guī)增殖至實(shí)驗(yàn)需求量,測(cè)定半數(shù)組織培養(yǎng)感染數(shù)量TCID50=10-3.71。

113藥物注射用更昔洛韋(GCV)購(gòu)于廣東陽(yáng)江制藥有限公司,批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20033717,粉劑,每支250mg。將GCV溶于注射用水中,配制成50g/L濃度,臨用時(shí)用維持液配成不同濃度的溶液。茵陳水溶性提取物由北京師范大學(xué)資源學(xué)院資源藥物工程研究中心提供，臨用時(shí)用維持液配成不同濃度的溶液。

114主要試劑MTT［3(4,6二甲基噻唑2xl)2,5乙苯基四唑溴鹽］、新生小牛血清、胰蛋白酶、Hank氏液、HEPES及二甲基亞砜(DMSO)均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司;RPMI1640粉劑購(gòu)自GIBCO。

115主要儀器設(shè)備超級(jí)酶標(biāo)測(cè)試儀購(gòu)自美國(guó),型號(hào)規(guī)格550;二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)，型號(hào)規(guī)格Nu1700E。

12方法

121病毒感染性滴度的測(cè)定取經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng)后生長(zhǎng)良好的HEL細(xì)胞,加入96孔板中，每孔100mL(約1.5×105/孔),將培養(yǎng)板置于5%CO2培養(yǎng)箱中,37℃培養(yǎng)18小時(shí),待細(xì)胞長(zhǎng)成單層,將病毒原液以10倍遞次稀釋法［4］稀釋成9種不同濃度(10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7,10-8,10-9),每個(gè)稀釋度設(shè)8個(gè)孔,將9種不同濃度的病毒液分別接種到長(zhǎng)成單層HEL細(xì)胞的96孔板,每孔25μL,,置于5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi),37℃吸附1h后,棄上清,以Hank氏液洗3次,加維持液0.1mL/孔,同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照孔8孔,置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),每日檢查病毒生長(zhǎng)情況,在光學(xué)倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化并記錄特征性細(xì)胞病變(CPE)的孔數(shù),12d后記錄結(jié)果。用ReedMuench法［5］計(jì)算病毒的半數(shù)感染量(TCID50)。

ReedMuench法計(jì)算公式：TCID50=10-［（H－R）/（H－L）+E］

注：R為計(jì)算的死亡率，H為略高于50%的死亡率，L為略低于50%的死亡率，E為對(duì)應(yīng)H死亡率的負(fù)指數(shù)。

122藥物細(xì)胞毒性試驗(yàn)取生長(zhǎng)良好的HEL細(xì)胞,將細(xì)胞加入96孔板,每孔100μL(約1.5×105/孔),待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后,同步化24h,用未含抗生素的維持液將GCV(藥物對(duì)照組)稀釋成200,100,50,25,12.5,6.25，3.2mg・L-1等7個(gè)濃度;將茵陳水溶性提取物溶液亦稀釋成2000，1000，500，250，125，63，32mg.L-1等7個(gè)濃度,將各濃度藥物以每孔200μl加入培養(yǎng)板,每個(gè)濃度設(shè)4孔做實(shí)驗(yàn)孔,同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組各4孔。細(xì)胞MTT比色法：以CPE法觀察記錄藥物對(duì)HEL細(xì)胞的毒性結(jié)果后，每孔加入MTT染液20μL（5mg/ml）,置5%CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)4h,可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)形成甲贅結(jié)晶,棄染色液,每孔加入DMSO150μL,振蕩10min,直至紫藍(lán)色沉淀(甲贅)充分溶解后,在超級(jí)酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度(A)值,計(jì)算各藥物濃度時(shí)TC50及細(xì)胞的存活率。試驗(yàn)重復(fù)3次，取3次平均值作為試驗(yàn)結(jié)果。

123藥物體外對(duì)病毒增殖的抑制作用取生長(zhǎng)良好的HEL,以每孔100μL(約9.5×104個(gè)細(xì)胞/孔)的細(xì)胞懸液加入96孔板,5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h,細(xì)胞長(zhǎng)成單層,同步化24h后以每孔約100TCID50攻擊量攻擊細(xì)胞,于5%CO2培養(yǎng)箱中,37℃吸附1h,棄上清;將藥液以低于IC50作8個(gè)稀釋濃度分別加入細(xì)胞孔中,每孔150μL,每一稀釋度設(shè)8孔,同時(shí)設(shè)立細(xì)胞對(duì)照組、病毒對(duì)照組;更換維持液隔天1次;在5%CO2培養(yǎng)箱中,37℃培養(yǎng)約8d,待病毒對(duì)照組細(xì)胞病變達(dá)到70%~80%時(shí),每孔加入MTT20μL,繼續(xù)培養(yǎng)4h,吸棄上清,每孔加入DMSO150μL,振蕩10min,在超級(jí)酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度(A)值,按下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率及治療指數(shù)(TI)并采用用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS11.5的Probit回歸法計(jì)算半數(shù)有效濃度(IC50)。試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值作為試驗(yàn)結(jié)果。

細(xì)胞存活率(%)=(試驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%

TI=TC50/IC50

124光學(xué)倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化細(xì)胞培養(yǎng)96h后，IC50下,光學(xué)倒置相差顯微鏡下觀察并比較各組的細(xì)胞形態(tài)。

13統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS11.5專業(yè)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,各試驗(yàn)組與病毒對(duì)照組間差異性采用t檢驗(yàn),P<0.05認(rèn)為有顯著差異。

2結(jié)果

21藥物的細(xì)胞毒性

GCV、茵陳水溶性提取物溶液分別在50mg・L-1，500mg・L-1以內(nèi)均未見(jiàn)明顯的細(xì)胞毒性作用,但經(jīng)較高濃度的藥物作用后,細(xì)胞死亡數(shù)增加,藥物有明顯的細(xì)胞毒性作用。GCV及茵陳水溶性提取物對(duì)HEL細(xì)胞毒性作用表現(xiàn)為:細(xì)胞變大變圓,顆粒增多,少量細(xì)胞聚集成團(tuán),培養(yǎng)液混濁,折光性增強(qiáng)以及吸光值明顯改變。注射用更昔洛韋200，100，50，25，12.5，6.25，3.2mg・L-1對(duì)HEL細(xì)胞的細(xì)胞存活率分別為4.15%，66.8%，82.6%，90.1%，97.8%，98%，99%；茵陳水溶性提取物溶液不同藥物濃度時(shí)(2000，1000，500，250，125，63，32mg.L-1)對(duì)HEL細(xì)胞的細(xì)胞存活率分別為18.6%，51.7%，81.8%，87.5%，90.8%，98%，100%。用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS11.5的Probit回歸法,計(jì)算藥物的半數(shù)毒性濃度TC50分別為98.8mg・L-1和904.49mg・L-1。

22GCV及中藥對(duì)巨細(xì)胞病毒增殖的抑制作用

HCMV對(duì)HEL的CPE的表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹,變大變圓,折光性改變,胞漿內(nèi)顆粒增多。將GCV以50,25,12.5,6.25，3.2mg・L-1;茵陳水溶性提取物溶液以500，250，125，63，32mg.L-1進(jìn)行抑制HCMV實(shí)驗(yàn),大于32mg.L-1濃度的茵陳水溶性提取物溶液均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制病毒對(duì)細(xì)胞的病變作用。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,5種不同濃度下茵陳水溶性提取物溶液均具有抗病毒作用,結(jié)果見(jiàn)表1。用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS11.5的Probit回歸法,計(jì)算出GCV、茵陳水溶性提取物溶液對(duì)HEL細(xì)胞的半數(shù)有效濃度(IC50)分別為9.6mg・L-1,195.11mg・L-1。同時(shí),采用前述的公式可計(jì)算出GCV、茵陳水溶性提取物溶液對(duì)HEL細(xì)胞的治療指數(shù)(TI)分別為10.29,4.64。

表1GCV和茵陳水溶性提取物溶液抗巨細(xì)胞病毒效應(yīng)（測(cè)定OD值）（略）

注：與病毒對(duì)照組比較，*P<0.05。

23茵陳水溶性提取物溶液及GCV抗巨細(xì)胞病毒作用的比較

在IC50下,檢測(cè)茵陳水溶性提取物溶液和GCV抗巨細(xì)胞病毒的作用。經(jīng)比較,發(fā)現(xiàn)茵陳水溶性提取物溶液的抗巨細(xì)胞病毒作用(A值)與GCV組比較差異均有顯著性(P<0.05),且GCV組的平均A值高,表明茵陳水溶性提取物溶液抗HCMV作用較GCV弱。結(jié)果在IC50下GCV(9.6mg・L-1)、茵陳水溶性提取物溶液(195.11mg・L-1)的抗巨細(xì)胞病毒作用(測(cè)得A值)分別為(0.711±0.003),(0.663±0.004),P<0.05。在IC50下,GCV和茵陳水溶性提取物溶液對(duì)HCMV的抑制率分別為58.7%和42%。

病毒抑制率=（藥物處理組OD值-病毒對(duì)照組OD值）/（細(xì)胞對(duì)照組OD值-病毒對(duì)照組OD值）×100%

24不同藥物致HEL的形態(tài)學(xué)變化

細(xì)胞培養(yǎng)96h后，IC50下,光學(xué)倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)：細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，增殖活躍，細(xì)胞成梭型緊密排列，有極少量圓形增殖細(xì)胞，見(jiàn)圖1；病毒對(duì)照組大量細(xì)胞變圓并脫離瓶壁，還可見(jiàn)到少量細(xì)胞碎片，僅少量細(xì)胞貼壁，無(wú)增殖細(xì)胞，見(jiàn)圖2；茵陳水溶性提取物+病毒組大部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，見(jiàn)一些圓型細(xì)胞在液體中漂浮，約45%細(xì)胞變成圓型或發(fā)生腫脹，其余貼壁細(xì)胞未見(jiàn)異常變化，見(jiàn)圖3；更昔洛韋+病毒組細(xì)胞均貼壁生長(zhǎng)，約20%細(xì)胞變成圓型或發(fā)生腫脹，其余細(xì)胞未見(jiàn)明顯異常變化，見(jiàn)圖4。4組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變形象表明茵陳水溶性提取物具有抗HMCV的效用，其對(duì)HMCV的抑制作用較更昔洛韋弱。

圖1細(xì)胞對(duì)照組(×40)（略）

圖2病毒對(duì)照組(×40)（略）

圖3茵陳+病毒組(×40)（略）

圖4更昔洛韋+病毒組(×40)（略）

3討論

中藥茵陳為菊科植物茵陳蒿(ArtemisiacapillarisThunb)或豬毛蒿(ArtemisiaScopariaWaldst.etKit.又名濱蒿)的干燥地上部分,首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,性微寒,味苦、辛。有清熱利濕,利膽退黃的功效。主要用于黃疸尿少,濕瘡瘙癢,傳染性黃疸型肝炎等癥,是臨床上常用的保肝中藥。近年來(lái)有關(guān)茵陳的化學(xué)成分及藥理作用的研究報(bào)道甚多,一些新的有效成分及藥理作用不斷被發(fā)現(xiàn),茵陳除具有利膽保肝的作用外,還具有抗病原微生物、抗癌、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化(AS)、興奮平滑肌等多方面的活性。復(fù)方茵陳一直都是解放軍302醫(yī)院乙型肝炎治療的首選藥物。

本研究的體外實(shí)驗(yàn)證明,茵陳水溶性提取物溶液能有效抑制HCMV在細(xì)胞內(nèi)的繁殖。其半數(shù)有效濃度為195.11mg・L-1,治療指數(shù)為4.64。與病毒組比較,有顯著性差異(P<0.05)。茵陳水溶性提取物溶液在半數(shù)有效濃度時(shí),表現(xiàn)出較強(qiáng)抑制病毒對(duì)細(xì)胞的病變作用,且隨藥物濃度的增高抑制作用增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)還顯示茵陳水溶性提取物溶液在32~500mg・L-1濃度時(shí)對(duì)巨細(xì)胞病毒均有明顯抑制作用，說(shuō)明該藥的有效濃度范圍寬，使用安全范圍大。

姚艷紅等［6］研究表明茵陳可抑制2.2.15細(xì)胞HBsAg和HbeAg的復(fù)制和表達(dá),對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制有抑制作用，該藥在抗HCMV國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。本研究表明,茵陳單體溶液能有效抑制HCMV在細(xì)胞內(nèi)的繁殖。姚艷紅等［6］研究認(rèn)為該藥抗乙肝病毒的作用機(jī)理可能是抑制細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制。該藥抗HCMV機(jī)制可能與之有相似之處，但仍需深入研究。

綜上所述,茵陳水溶性提取物溶液抗HCMV的效應(yīng)盡管比更昔洛韋弱，但其作為中草藥提取物有著價(jià)位低、毒副作用小、口服方便、長(zhǎng)期使用不易耐藥等特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了茵陳水溶性提取物溶液對(duì)HCMV有較明顯的抑制作用，待深入研究其抗病毒的作用機(jī)理和進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究取得療效后，該藥可推廣到臨床進(jìn)行預(yù)防HCMV感染和治療CMV病，對(duì)腎移植術(shù)后巨細(xì)胞病毒感染的防治也將取到積極作用。

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