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【關(guān)鍵詞】料木黃酮；卵巢腫瘤；細(xì)胞系；細(xì)胞凋亡

Inhibitoryeffectsofgenisteinonproliferationinhumanovariancarcinomacellline3AOandrelatedmechanism

【Abstract】AIM:Toinvestigatetheeffectsofgenisteinonproliferationinhibitionandapoptosisinductioninhumanovariancarcinomacellline3AOandtoexploreitsanticancermechanism.METHODS:Afterculturedwithdifferentdosesofgenisteinfordifferenttimeperiods,thecellsweretestedbyMTTassay.Studyontheultrastructureof3AOcellswasperformedbytransmissionelectronmicroscope(TEM)aftertheadministrationofgenistein.ApoptosiswasdetectedbymeansofterminaldeoxynucleotidyltransferasemediateddUTPbiotinnickendlabeling(TUNEL)method.Apoptosisrateandcellcycledistributionof3AOcellsweremeasuredbyflowcytometry(FCM).Theexpressionofestrogenreceptorβproteinwasmeasuredbyimmunocytochemicaltechnique.RESULTS:After3AOcellsweretreatedwithdifferentconcentrationsofgenistein,doseandtimedependentgrowthinhibitionwasdemonstrated.Inhibitionpercentageincellsexposedto10mg/Land20mg/Lgenisteinfor72hwere,respectively,54.24%and65.99%.Also,genisteincouldblock3AOcellsintheG2/Mphaseofcellcycle,andatypicalsubdiploidapoptosispeakwasdemonstratedbeforeG1/G2phase.Moreovertheapoptosiswastimedependent.Thecharacteristicmorphologicalchangesofapoptosisingenisteintreated3AOcellswereobservedbyTEM.TUNELstainingrevealedapoptosispositivecells.GenisteincouldupregulatetheexpressionofERβ.CONCLUSION:Genisteincandoseandtimedependentlyinhibitgrowthandinduceapoptosisinovariancarcinomacellline3AOthepotentialpathwayofERβ.

【Keywords】genistein;ovarianneoplasms;cellline;apoptosis

【摘要】目的：研究植物雌激素染料木黃酮對(duì)人卵巢癌細(xì)胞系3ao細(xì)胞增殖的抑制作用和凋亡的誘導(dǎo)作用，探討其抗癌作用的機(jī)制.方法：應(yīng)用MTT法檢測(cè)不同濃度染料木黃酮對(duì)3AO細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，電鏡觀察藥物作用后細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變，TUNEL法確定凋亡，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期、定量分析凋亡，免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)雌激素β受體的表達(dá).結(jié)果：3AO細(xì)胞經(jīng)不同濃度染料木黃酮處理后，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，且這種抑制作用隨時(shí)間延長(zhǎng)及濃度增高而增強(qiáng)，10mg/L和20mg/L染料木黃酮作用72h后，抑制率分別達(dá)到54.24%和65.99%.染料木黃酮阻斷3AO細(xì)胞生長(zhǎng)于G2/M期，在G0/G1前出現(xiàn)典型亞二倍體凋亡峰，且凋亡呈時(shí)間依賴(lài)性.電鏡觀察到用藥后凋亡細(xì)胞典型的形態(tài)學(xué)特征.TUNEL法觀察到大量陽(yáng)性凋亡細(xì)胞.免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)到用藥后，ERβ表達(dá)明顯加強(qiáng).結(jié)論：染料木黃酮對(duì)3AO細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的呈時(shí)間及濃度依賴(lài)性的抑制作用，并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡.染料木黃酮可能通過(guò)雌激素β受體途徑發(fā)揮藥理作用，誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生凋亡.

【關(guān)鍵詞】染料木黃酮；卵巢腫瘤；細(xì)胞系；細(xì)胞凋亡

染料木黃酮是異黃酮類(lèi)化合物，化學(xué)名為4′，5，7三羥基異黃酮，它廣泛存在于包括大豆在內(nèi)的多種蔬菜和水果中［1］.實(shí)驗(yàn)研究顯示，染料木黃酮在乳腺癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有多重抑瘤效應(yīng)［2］，已成為國(guó)際抗癌藥物的研究熱點(diǎn).其主要防癌機(jī)制為調(diào)節(jié)雌激素受體、抑制細(xì)胞代謝關(guān)鍵酶活性、增加抗氧化酶的活性及抑制血管生成作用等［3-7］.因而，染料木黃酮對(duì)腫瘤的化學(xué)預(yù)防及治療作用受到人們的廣泛關(guān)注.卵巢癌是激素相關(guān)性腫瘤，是一種常見(jiàn)且惡性程度較高的婦科腫瘤.本實(shí)驗(yàn)采用人卵巢粘液性囊腺癌細(xì)胞系3AO，研究染料木黃酮對(duì)該細(xì)胞系增殖和凋亡的影響，為其應(yīng)用于卵巢癌的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1材料和方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞培養(yǎng)人卵巢粘液性囊腺癌細(xì)胞系3AO由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存，用含100mL/L新生牛血清(杭州四季青)的DMEM(美國(guó)Gibco)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，于37℃，含50mL/LCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞實(shí)驗(yàn).

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑染料木黃酮購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，純度為98%，用分析天平稱(chēng)取染料木黃酮，用DMSO配成儲(chǔ)備液，置于-20℃冷凍保存.細(xì)胞給藥前，用DMEM培養(yǎng)液稀釋至所需濃度，并調(diào)整DMSO在各組培養(yǎng)液中的終濃度均為5.1mmo/L.TUNEL試劑盒購(gòu)于德國(guó)Roche公司;兔抗雌激素性β受體（estrogenreceptorβ,ERβ）購(gòu)于美國(guó)Chemicon公司;二抗,SP試劑盒及DAB試劑盒購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司.

1.1.3爬片制備對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于24孔板中進(jìn)行爬片，培養(yǎng)24h后細(xì)胞全部貼壁，實(shí)驗(yàn)分空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(染料木黃酮終濃度為10mg/L)，加入不同處理因素共孵育，于48h收集爬片，PBS洗滌2次，950mL/L乙醇固定爬片10min，晾干備用.

1.2方法

1.2.1形態(tài)學(xué)觀察倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察培養(yǎng)瓶中卵巢癌細(xì)胞在用藥前后的變化.

1.2.2四唑鹽(MTT)比色試驗(yàn)測(cè)定生長(zhǎng)抑制率對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期3AO細(xì)胞以每孔1×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板.細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24h后，加入染料木黃酮（終濃度分別為0.625，1.25，2.5，5，10，20mg/L）共孵育進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn).對(duì)照組只加培養(yǎng)液，DMSO溶劑對(duì)照組只加5.1mmol/LDMSO.每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔.與實(shí)驗(yàn)組平行設(shè)只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞的空白對(duì)照孔，比色時(shí)以此孔調(diào)零.酶連免疫檢測(cè)儀測(cè)定不同藥物濃度及不同時(shí)間下（24，48，72h）的吸光度值A(chǔ)490nm.以每組6個(gè)孔A490nm的平均值作為各組的平均A490nm值.記錄結(jié)果，計(jì)算染料木黃酮對(duì)3AO細(xì)胞的抑制率：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=（1-藥物組A490nm/對(duì)照組A490nm）×100%.IC50表示半數(shù)抑制濃度.

1.2.3透射電鏡下觀察細(xì)胞凋亡對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞加入10mg/L染料木黃酮共孵育，48h消化收集細(xì)胞，PBS洗2次，離心后加入4℃預(yù)冷的40g/L戊二醛固定，10g/L鋨酸后固定，梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，制成超薄切片，透射電鏡下觀察.

1.2.4TUNEL法檢測(cè)確定凋亡隨機(jī)選取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組爬片，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)流程操作，水化、封閉、滲透，滴加TUNEL反應(yīng)混合液，37℃暗濕環(huán)境中孵育60min，漂洗，加ConventerPOD液37℃濕盒孵育30min，DAB顯色，光鏡下觀察.細(xì)胞調(diào)亡有一項(xiàng)重要的特征為細(xì)胞內(nèi)的DNA會(huì)碎裂成片斷，TNUEL可以有效地去探測(cè)DN段的產(chǎn)生.因此其表達(dá)定位于胞核，陽(yáng)性反應(yīng)為核被染棕褐色.隨機(jī)取10個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值.

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，定量分析凋亡對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞貼壁后，與濃度為5，10mg/L的染料木黃酮共孵育，空白對(duì)照組不加藥，分別于12，24，48h離心收集細(xì)胞，PBS洗滌并制成單細(xì)胞懸液.①PI單染色法檢測(cè)細(xì)胞周期變化；②AnnexinVFITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率.

1.2.6免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)ERβ爬片依步驟處理后加入一抗，4℃過(guò)夜，次日滴加二抗，SP法染色，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS12.0進(jìn)行分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以x±s表示.組間A490nm比較用析因設(shè)計(jì)的方差分析，組間兩兩比較用SNK法.TUNEL法陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，采用兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，P<0.01差別有顯著意義.

2結(jié)果

2.1染料木黃酮對(duì)3AO細(xì)胞形態(tài)的影響倒置顯微鏡下可見(jiàn)，3AO細(xì)胞呈單層生長(zhǎng)，細(xì)胞呈橢圓形或多角形，胞核圓形或橢圓形，胞質(zhì)透亮.經(jīng)染料木黃酮處理后，細(xì)胞形狀變窄，胞質(zhì)透亮度下降，顆粒感增強(qiáng)，部分細(xì)胞胞突回縮變圓，脫落呈懸浮狀，并見(jiàn)細(xì)胞碎片.且這些變化隨染料木黃酮?jiǎng)┝康脑黾雍?a href="http://www.eimio.cn/lunwen/jiaoyue/yixue/200708/93291.html" target="_blank">作用時(shí)間的延長(zhǎng)而加重.至72h，細(xì)胞回縮成不規(guī)則圓形，可見(jiàn)大量細(xì)胞碎片.電鏡下可見(jiàn)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變.

2.2染料木黃酮對(duì)3AO細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用MTT試驗(yàn)表明染料木黃酮對(duì)3AO細(xì)胞的抑制作用隨濃度的升高和用藥時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，經(jīng)計(jì)算IC50為10mg/L，藥物濃度與作用時(shí)間之間有交互作用（P<0.01，表1）.

2.3TUNEL法檢測(cè)確定凋亡光鏡下，10mg/L染料木黃酮作用48h后，出現(xiàn)大量陽(yáng)性凋亡細(xì)胞，核深染，成斑點(diǎn)狀或斑塊狀；而對(duì)照組細(xì)胞核幾乎無(wú)著色（圖1）.加藥組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量平均為14.32±2.56，而對(duì)照組中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量?jī)H為1.28±1.55，二者差異顯著（t=13.78，P＜0.01）.表1MTT法檢測(cè)染料木黃酮對(duì)3AO細(xì)胞增值的影響對(duì)照和各濃度各時(shí)間點(diǎn)組間比較；cP<0.01vs對(duì)照和各時(shí)間點(diǎn)組間比較.

2.4染料木黃酮對(duì)3AO細(xì)胞周期和凋亡率的影響流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，和對(duì)照組相比，染料木黃酮處理的3AO細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞周期中G2/M期細(xì)胞顯著增多，S期細(xì)胞顯著減少，表現(xiàn)出G2/M期阻滯；此外，10mg/L染料木黃酮給藥48h在G0/G1前出現(xiàn)典型亞二倍體凋亡峰.與對(duì)照組相比，5mg/L與10mg/L染料木黃酮作用12，24，48h后抑制率兩兩之間均差異顯著（P<0.01），藥物處理不同時(shí)間各組間抑制率亦均有顯著差異（P<0.01）.表明染料木黃酮誘導(dǎo)3AO細(xì)胞凋亡隨濃度增高和時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，其中10mg/L染料木黃酮作用48h后抑制率達(dá)38.1%.卵巢癌中，ERβ蛋白表達(dá)定位于胞核，陽(yáng)性反應(yīng)為核深染成深棕色.光鏡下可見(jiàn)染料木黃酮作用后，ERβ表達(dá)明顯增強(qiáng)（圖2）.

3討論

本實(shí)驗(yàn)采用了多種檢測(cè)細(xì)胞增殖活性及凋亡的方法，檢測(cè)了染料木黃酮對(duì)3AO細(xì)胞凋亡作用的量效和時(shí)效關(guān)系，較肯定地證明了一定濃度的染料木黃A:對(duì)照酮可誘導(dǎo)3AO細(xì)胞凋亡，抑制其增殖.MTT試驗(yàn)中，隨著染料木黃酮濃度的升高，3AO細(xì)胞的生長(zhǎng)均受到不同程度的抑制.當(dāng)劑量達(dá)10mg/L和20mg/L時(shí)，抑制作用明顯，表明染料木黃酮對(duì)3AO細(xì)胞的抑制作用隨濃度的升高和用藥時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng).作為一種植物雌激素，染料木黃酮結(jié)構(gòu)與17β雌二醇相似［8］，可與雌激素受體(ER)結(jié)合，結(jié)合后的潛在健康效應(yīng)表現(xiàn)為U型劑量效應(yīng)關(guān)系，表現(xiàn)為類(lèi)雌激素活性和抗雌激素活性.染料木黃酮的雌激素作用和抗雌激素作用，取決于劑量及機(jī)體甾體雌激素狀態(tài)，具有雙向調(diào)節(jié)平衡功能.此結(jié)論與李昱等結(jié)論不同［9］.

實(shí)驗(yàn)中觀察到染料木黃酮作用于3AO細(xì)胞系后，誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng).倒置顯微鏡下可見(jiàn)酷似凋亡的細(xì)胞，電鏡下可見(jiàn)典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變.TUNEL法更直觀地觀察到大量陽(yáng)性凋亡細(xì)胞.

卵巢癌是性激素依賴(lài)性腫瘤，雌激素有利于卵巢癌的發(fā)生，雌激素通過(guò)與ERα，ERβ的同二聚體及異二聚體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用.Rutherford等［10］發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌中，ERα/ERβmRNA的比率升高，ERα相對(duì)于ERβ的過(guò)表達(dá)是卵巢癌發(fā)生的標(biāo)志，而此結(jié)果系ERβ表達(dá)下調(diào)所致.本實(shí)驗(yàn)免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示：染料木黃酮作用后，ERβ表達(dá)明顯加強(qiáng).說(shuō)明染料木黃酮作為一種植物雌激素，當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)，與雌激素競(jìng)爭(zhēng)性與ERβ結(jié)合，表現(xiàn)為抗雌激素活性，從而誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用.因此染料木黃酮可能通過(guò)ERβ途徑發(fā)揮藥理作用.并且，染料木黃酮可能獨(dú)立的通過(guò)雌激素受體途徑抑制細(xì)胞增殖和因子的表達(dá).我們的發(fā)現(xiàn)揭示了染料木黃酮化學(xué)預(yù)防卵巢癌的可能機(jī)制，且染料木黃酮幾乎無(wú)毒性［11］，為染料木黃酮臨床治療卵巢癌提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù).

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